Cố định tế bào bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate chitosan để lên men nattokinase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC HỒ THỊ HIỀN CỐ ĐỊNH TẾ BÀO BACILLUS SUBTILIS NATTO BẰNG PHỨC CHẤT MANG ALGINATE-CHITOSAN ĐỂ LÊN MEN... TRƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HỒ THỊ HIỀN

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO BACILLUS SUBTILIS NATTO BẰNG

PHỨC CHẤT MANG ALGINATE-CHITOSAN ĐỂ LÊN MEN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SỸ

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số: 60420201

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO BACILLUS SUBTILIS NATTO BẰNG PHỨC

CHẤT MANG ALGINATE- CHITOSAN ĐỂ LÊN MEN

NATTOKINASE

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Học viên thực hiện: Hồ Thị Hiền – MSHV: 13310298

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Hồ Thị Hiền MSHV: 13310298

Ngày, tháng, năm sinh: 13/05/1987 Nơi sinh: Tỉnh Hà Tĩnh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

“Cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate – chitosan để lên men nattokinase”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tối ưu hóa quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang

alginate - chitosan

- Khảo sát quá trình lên men nattokinase bởi tế bào cố định

- Khảo sát số lần tái sử dụng tế bào cố định

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 17/08/2015

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/03/2016

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Tp HCM, ngày … tháng … năm 2015

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

2 TS Phan Ngọc Hòa

3 TS Nguyễn Hữu Phúc

4 PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

5 TS Hoàng Anh Hoàng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – người Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này Tôi đã học được nhiều điều quý báu ở cô

về kiến thức, nhiệt huyết, tình yêu thương và tinh thần trách nhiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn bạn các bạn học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 2013

và các bạn sinh viên đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình thân yêu đã luôn khích lệ và ủng

hộ tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần để tôi hoàn thành chương trình cao học

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể hoàn thành luận văn này

TÓM TẮT

Nattokinase là một enzyme thủy phân huyết khối mạnh, có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh về tim mạch Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kết hợp phức

chất mang alginate – chitosan để cố định tế bào Bacillus subtilis natto nhằm mục đích

lên men nattokinase Sáu thông số ảnh hưởng đến hiệu suất cố định tế bào đã được sàng lọc bởi ma trận Plackett-Burman bao gồm: nồng độ alginate, nồng độ chitosan,

pH chitosan, nồng độ CaCl2, mật độ giống bổ sung, thời gian lắc khi bổ sung chitosan Kết quả quá trình tối ưu đã xác định được hai yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định

tế bào là nồng độ alginate (2,5%), mật độ giống bổ sung (khoảng 5,86 triệu tế bào/ml) Với hai yếu tố tối ưu, các yếu tố khác được giữ ở mức giá trị trung tâm thì hiệu suất cố định tế bào đạt 90,73% Từ kết quả tối ưu các thông số của quá trình cố định, chúng tôi tiến hành ứng dụng tế bào cố định vào lên men nattokinase Sau 24 giờ lên men, hoạt

độ enzyme nattokinase đạt 71,80 ± 0,19 FU/ml Tế bào Bacillus subtilis natto cố định

được tái sử dụng 6 lần và ở lần tái sử dụng thứ 6 hoạt tính enzyme nattokinase thu được chỉ giảm 2,7% so với lần tái sử dụng thứ nhất

ABSTRACT

Nattokinase is a potent fibrinolytic enzyme with the potential for fighting cardivascular

disease In this study, Bacillus subtilis natto were immobilized in the alginate –

chitosan complex for fermentation of nattokinase enzyme Six factors affecting the efficiency of immobilization cells were screened by Plackett – Burman design including: concentration of alginate, concentration of chitosan, pH of chitosan, concentration of CaCl2, added cells density, shaking time after supplementing chitosan Results of optimization have identified two factors affecting the efficiency of cell immobilization They are concentration of alginate (2.5%) and added cells density (approximately 5.86 million colonies per milliliter) With these two factors optimized and others kept at the normal level, immobilization efficiency reached 90.73% After

Bacillus subtilis natto had been immobilized by optimization of parameters, we

conducted application for fermenting nattokinase For 24 hours of fermentation,

nattokinase enzyme activity reached 71.80 ± 0.19 FU/ml Immobilized Bacillus subtilis

natto cells were reused 6 times and on the 6th time of reuse, nattokinase enzyme activity only decreased 2.7% in compared with the 1st reuse

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Hồ Thị Hiền

Nutrion agar (Môi trường dinh dưỡng agar): NA

Nutrion broth (Môi trường dinh dưỡng lỏng): NB

Response surface methodology (Phương pháp đáp ứng bề mặt): RSM

Central Composite Designs (Thiết kế cấu trúc có tâm): CC

Fibrinolytic unit (Đơn vị thủy phân fibrinolytic): FU

Colony-forming units per milliliter (Số đơn vị khuẩn lạc trong 1 ml mẫu): CFU/ml Standard Deviation (Độ lệch chuẩn): SD

Elementary mode analysis (Phương thức phân tích cơ bản): EMA

Statistical Analysis Systems (Hệ thống phân tích thống kê): SA

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis natto 4

Hình 1.2: Cấu trúc bậc 1 của nattokinase 7

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của nattokinase 8

Hình 1.4: Các hiệu ứng sinh lý của nattokinase lên fibrin 8

Hình 1.5: Cấu tạo của alginate 13

Hình 1.6: Quá trình tạo tế bào cố định trong gel alginate calcium bằng phương pháp bẫy nhốt 14

Hình 1.7: Sự hình thành gel giữa alginate và Ca2+ 14

Hình 1.8: Công thức hóa học của chitosan, với n trong khoảng 700 – 4500 16

Hình 1.9: Liên kết giữa alginate và chitosan 17

Hình 1.10: Hạt gel alginate – chitosan dưới kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.11: Minh họa quá trình cố định tế bào bằng phức chất mang alginate – chitosan 18 Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc của chủng giống 41

Hình 3.2: Hình thái của chủng giống 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các đặc tính của nattokinase 6

Bảng 2.1: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 28

Bảng 2.2: Bố trí các biến, giá trị theo các mức khảo sát trong ma trận Plackett-Burman 33 Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman 33

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khởi đầu và thí nghiệm trung tâm 34

Bảng 2.5: Bảng bố trí thí nghiệm CCD (central composite Design) 35

Bảng 3.1: Đặc điểm của chủng giống Bacillus subtilis natto 41

Bảng 3.2: Hiệu suất cố định trong thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định 46

Bảng 3.3: Các mức của các biến trong thí nghiệm và sự ảnh hưởng của các biến lên hiệu suất cố định 47

Bảng 3.4: Hiệu suất cố định của các thí nghiệm khởi đầu 48

Bảng 3.5: Các mức ảnh hưởng của hai yếu tố khảo sát 49

Bảng 3.6: Kết quả phân tích phương sai của hai yếu tố khảo sát 49

Bảng 3.7: Hiệu suất cố định chủng Bacillus subtilis natto trên phức chất mang alginate-chitosan trong ma trận thực nghiệm RSM-CCD 50

Sơ đồ 1.1: Phân loại kỹ thuật cố định tế bào 9

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 29

Sơ đồ 2.2: Quá trình tạo hạt gel chứa tế bào cố định trên phức chất mang alginate – chitosan 32

Đồ thị 3.1: Biến động sinh trưởng của chủng giống 42

Đồ thị 3.2: Đồ thị biểu diễn sự tương tác giữa nồng độ alginate và giống bổ sung đến hiệu suất cố định tế bào 52

Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase 54

Đồ thị 3.4: So sánh hoạt độ enzyme khi lên men tế tự do và tế bào cố định 56

Đồ thị 3.5: Khảo sát tái sử dụng chế phẩm tế bào cố định 59

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Bacillus subtilis natto 4

1.1.1 Nguồn gốc 4

1.1.2 Đặc điểm phân loại và hình thái 4

1.2 Đại cương về nattokinase 5

1.2.1 Giới thiệu chung về nattokinase 5

1.2.2 Cấu trúc của nattokinase 7

1.2.3 Tác dụng và cơ chế tác dụng 8

1.3 Cố định tế bào 9

1.3.1 Các phương pháp cố định tế bào 9

1.3.2 Yêu cầu và phân loại chất mang 11

1.3.3 Chất mang alginate và chitosan 12

1.3.4 Bản chất liên kết giữa alginate và chitosan 17

1.3.5 Trạng thái của tế bào cố định 18

1.3.6 Ưu điểm và nhược điểm của tế bào cố định 19

1.4 Một số công trình nghiên cứu về hướng của đề tài 21

1.4.1 Các công trình trong nước 21

1.4.2 Các công trình trên thế giới 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 27

2.2 Vật liệu 27

2.3 Nội dung thí nghiệm 29

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 30

2.4 Các phương pháp phân tích 37

2.4.1 Phương pháp vi sinh 37

2.4.2.Các phương pháp khác 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 41

3.1 Khảo sát một số đặc điểm của chủng giống 41

3.1.1 Đặc điểm đại thể, vi thể, sinh lý và sinh hóa 41

3.1.2 Biến động sinh trưởng và khả năng trao đổi chất của chủng giống 42

3.2 Tối ưu quy trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate – chitosan 44

3.2.1 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định 44

3.2.2 Tối ưu hóa quá trình cố định chủng giống Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate - chitosan 48

3.3 Ứng dụng chế phẩm Bacillus subtilis natto cố định trên phức chất mang alginate – chitosan để lên men nattokinase 53

3.3.1 Biến động của quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase theo thời gian 53

3.3.2 So sánh quá trình lên men nattokinase bởi tế bào tự do và tế bào cố định 55

3.3.3 Khảo sát số lần tái sử dụng chế phẩm tế bào cố định 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nattokinase [EC 3.4.21] là một serin protease ngoại bào có khả năng làm tan huyết khối mạnh, được xem là một tác nhân có tiềm năng trong việc điều trị hiệu quả bệnh tắc nghẽn mạch máu [1,2] Enzyme này đã được phát hiện từ các nguồn thực phẩm khác nhau như: Natto của Nhật [1], Doen-jang của Hàn Quốc hay từ Dauchi của Trung Quốc [3] và

các loài vi sinh vật khác nhau mà quan trọng nhất đó là các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong các thực phẩm lên men truyền thống từ đậu nành [4] Trong đó, chủng Bacillus subtilis natto là chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nattokinase cao nhất

[1] Nattokinase có khả năng tiêu hủy fibrin bằng con đường trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua quá trình hoạt hóa các yếu tố sinh plasminogen [5] So với các loại protein khác

có khả năng làm tan huyết khối như streptokinase, lumbrokinase thì nattokinase được xem

là yếu tố có nhiều ưu việt hơn vì khả năng phân hủy fibrin cao hơn, thời gian tác dụng dài hơn và giá thành rẻ hơn [6]

Kỹ thuật cố định enzyme và tế bào bằng phương pháp bẫy nhốt trong gel đang được ứng dụng rộng rãi và đạt hiệu quả cao trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và xử lý môi trường [7] Trong số các chất mang sử dụng trong quá trình cố định tế bào thì alginate và chitosan được sử dụng nhiều do các chất mang này đều có ưu điểm nhẹ, dễ thực hiện và an toàn đối với người sử dụng [8] Tuy nhiên, cố định tế bào trong alginate có sự bất lợi đó là khi tế bào trong hạt gel cố định phát triển mạnh thì dễ dẫn đến hiện tượng hạt gel bị vỡ, tế bào cố định sẽ thoát ra khỏi mạng gel, lẫn vào môi trường lên men và số lần tái sử dụng hạn chế Bên cạnh đó, quá trình cố định tế bào bằng phương pháp bẫy nhốt trong mạng lưới gel chitosan có một số nhược điểm là do kích thước lỗ gel nhỏ nên làm hạn chế sự khuếch tán chất dinh dưỡng và sản phẩm trao đổi chất qua lại giữa môi trường lên men và tế bào cố định trong hạt gel Đối với hạt gel alginate thường

có độ ổn định không cao trong môi trường có chứa citrate và phosphate mà các chất này

thường được sử dụng như dung dịch đệm trong môi trường lên men Để khắc phục nhược điểm này thì tế bào sau khi cố định bằng calcium alginate sẽ được bao quanh bởi màng chitosan Sự kết hợp giữa nhóm amino của chitosan và nhóm cacbonat của alginate sẽ tạo nên độ bền cho mạng lưới gel, điều này sẽ giúp hạn chế sự thất thoát tế bào và tăng số lần tái sử dụng của hạt gel chứa tế bào cố định [9,10] Ngoài ra, với ưu điểm về khả năng kháng khuẩn của chitosan trong môi trường lên men và ổn định ở nhiệt độ cao sẽ tạo điều

kiện thuận lợi cho tế bào Bacillus subtilis natto phát triển mạnh [11].Do vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate - chitosan để lên men nattokinase”

2 Mục tiêu nghiên cứu

 Mục tiêu tổng quát: Thu nhận nattokinase

 Mục tiêu cụ thể:

- Tối ưu hóa quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang

alginate – chitosan

- Khảo sát quá trình lên men nattokinase bởi tế bào Bacillus subtilis natto cố định

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu tập trung vào:

- Cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate - chitosan

- Tiến hành lên men chế phẩm cố định để xác định hoạt độ enzyme nattokinase tạo thành

4 Nội dung nghiên cứu

 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto

 Tối ưu hóa quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang

alginate – chitosan

 So sánh quá trình lên men nattokinase bởi tế bào cố định và tế bào tự do

 Khảo sát số lần tái sử dụng của tế bào cố định

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, tỷ lệ mắc các bệnh về tim mạch liên quan đến huyết khối là rất cao Do đó, nhu cầu sử dụng các loại thuốc làm tan huyết khối

là rất lớn Nattokinase là một trong những loại enzyme được xem là ưu việt nhất trong việc sử dụng điều trị và ngăn ngừa tình trạng tắc nghẽn mạch máu Tuy nhiên, việc sản xuất nattokinase chỉ mới dựa trên việc tối ưu hóa môi trường, điều kiện lên men và sản xuất nattokinase tái tổ hợp Việc kết hợp những ưu điểm của tế bào cố định với các phương pháp tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men sẽ nâng cao được hiệu suất thu hồi enzyme sau quá trình lên men đồng thời sẽ tiết kiệm được chi phí sử dụng chủng

giống Bacillus subtilis natto sử dụng trong lên men sản xuất nattokinase

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bacillus subtilis natto

1.1.1 Nguồn gốc

Bacilus subtilis natto được giáo sư Swamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 Bacillus subtilis natto có nhiều trong cỏ khô, đậu nành Ngoài ra, vi khuẩn

này cũng phát triển trong các loại đậu, các thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, thực vật

khác nhau như tảo biển, cá, tôm, cua [12,13] Bacillus subtilis natto không được thừa nhận như một loài độc lập, tuy nhiên khi sử dụng các chủng Bacillus subtilis khác để lên men môi trường đậu nành chín thì cũng không tạo thành natto giống như Bacillus subtilis

natto [14]

1.1.2 Đặc điểm phân loại và hình thái

Hình 1.1:Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis natto [15]

Bacillus subtilis natto là trực khuẩn Gr(+), hiếu khí, nội bào tử hình que, có kích

thước dưới 1µm, các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định, bề mặt hơi nhăn lan rộng trên bề mặt thạch nên trong quá trình nuôi cấy có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [13]

Bacillus subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí nên trong quá trình nuôi cấy cần phải

cung cấp oxy, nó có thể phát triển trong môi trường có nồng độ oxy >3% Nhiệt độ tối ưu

là 390C - 430C, ở 550C tế bào ngừng sinh trưởng, nhiệt độ tối ưu cho bào tử nảy mầm là

400C Bacillus subtilis natto phát triển ở pH trung tính, sự nảy mầm và phát triển bị ức chế

khi pH ≤ 4,5 [13]

Bacillus subtilis là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydrat

cacbon: glucose, fructose, saccarose trong đó saccarose là cần thiết cho vi khuẩn phát

triển và tạo ra chất nhớt cho sản phẩm Bacillus subtilis natto cũng cần có biotin, trong

môi trường nuôi cấy không có biotin thì các tế bào sinh dưỡng không phát triển được và bào tử cũng không nảy mầm được Môi trường nuôi cấy chứa vitamin B thích hợp cho sự phát triển của bào tử [15,16]

1.2 Đại cương về nattokinase

1.2.1 Giới thiệu chung về Nattokinase

Nattokinase được bác sĩ Hyroyuki Sumi phát hiện vào năm 1980 khi ông tiến hành nghiên cứu khả năng làm tan cục máu đông của các loại thực phẩm Ông đã sử dụng khoảng 173 mẫu thực phẩm cho nghiên cứu của mình và phát hiện ra dịch chiết từ một loại sản phẩm truyền thống của Nhật Bản lên men từ đậu nành là loại thực phẩm có khả năng làm tan cục máu đông nhanh và mạnh nhất Khi lấy dịch chiết xuất từ natto nhỏ lên trên cục huyết khối nhân tạo (sợi huyết) trong một đĩa Petri và giữ ở 37°C, cục huyết khối xung quanh natto hoà tan dần dần và hoàn toàn tan trong 18 giờ Bác sĩ Hyroyuki Sumi đặt tên là enzyme "nattokinase" có nghĩa "enzyme trong natto" Nattokinase là enzyme có khả năng chống đông máu mạnh hơn cả các urokinase Enzyme này đã được chứng minh

là an toàn và được sử dụng ở Nhật Bản trong hơn 20 năm qua, có khả năng tăng cường và kéo dài tác dụng trong huyết tương khi sử dụng enzyme này thông qua đường miệng [17]

Bảng 1.1:Các đặc tính của Nattokinase [5]

Tên protein Tên đề nghị: Subtilisin NAT, EC=3.4.21.62

Sinh vật Bacillus subtilis subsp.natto

Nhận dạng phân loại 86028 [NCBI]

Dòng phân loại Bacteria> Firmicutes>Bacillales> Bacillaceae> Bacillus

Thuộc tính của protein

Chiều dài chuỗi 275 AA

Trạng thái chuỗi Hoàn chỉnh

Xử lý chuỗi Trình tự hiển thị tiếp tục được xây dựng tới lúc trưởng thành

Sự tồn tại của protein Bằng chứng ở mức độ protein

Chú thích chung

Chức năng Subtilisin là một protease ngoại bào, xúc tác thủy phân

protein và các peptide amides Subtilisin NAT cũng có tác dụng thủy phân fibrinolytic

Hoạt động xúc tác Thủy phân protein với độ đặc hiệu rộng rãi cho các liên kết

peptide

Cấu trúc tiểu đơn vị Monomer

Vị trí dưới tế bào Chưa khám phá ra

Chuỗi tương tự Thuộc về họ peptide S8

Đặc tính hóa sinh Tham số động học:

Km=0.48mM cho Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA

1.2.2 Cấu trúc của nattokinase

Nattokinase (subtlisin NAT, NK) là một loại enzyme có khả năng phân hủy sợi huyết, được phân lập từ một loại thực phẩm truyền thống của Nhật Bản có tên là “Natto” Nattokinase là một serine protease gồm 275 acid amin, có khối lượng phân tử là 27,7 kDa [12]

Nattokinase là một protease serin, trung tâm hoạt động là bộ 3 xúc tác gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His 64 và nhóm cacboxyl của Asp 32 Cơ chất đặc hiệu của nattokinase là cơ chất đặc hiệu chung của subtilisin: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Nattokinase ổn định trong khoảng pH từ 6 - 10 và nhiệt độ 30 - 600C, mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 700C Enzyme này có điểm đẳng điện là pI = 8 [12]

Hình 1.2:Cấu trúc bậc 1 của nattokinase [12]

Hình 1.3:Cấu trúc hóa học của nattokinase [12]

1.2.3 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Hình 1.4: Các hiệu ứng sinh lý của nattokinase lên fibrin [5]

Nattokinase có đặc điểm sinh học giống như plasmin, phân hủy fibrin trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua 3 con đường (hình 1.4)

- Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp (A)

- Nattokinase tăng cường plasmin thông qua hoạt hóa prourokinase (nội sinh) thành urokinase (B)

- Nattokinase làm tăng nồng độ t-PA (tissue plasminogen activators- yếu tố hoạt hóa plasminoge) (C) [5,18]

1.3 Cố định tế bào

Cố định tế bào là sự giới hạn về vật lý hoặc định vị của các tế bào nguyên vẹn ở một khu vực không gian nhất định nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác của chúng và có thể sử dụng nhiều lần Carel và cộng sự (1985) đã phân loại các phương pháp cố định tế bào thành 4 nhóm chính [20,21]

Sơ đồ 1.1:Phân loại kỹ thuật cố định tế bào [20]

1.3.1 Các phương pháp cố định tế bào

1.3.1.1 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang

Đây là phương pháp cố định dựa vào tương tác bề mặt giữa tế bào và chất mang nhờ các lực liên kết như lực liên kết tĩnh điện, liên kết cộng hóa trị, tương tác kị nước Các lực

Cố định tế bào không cần chất mang

Nhốt bằng phương pháp cơ học sau màng chắn

này rất yếu nhưng khi các liên kết được hình thành với số lượng lớn là cơ sở để gắn kết vi sinh vật vào chất mang

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, tế bào cố định sẽ phục hồi trở lại tế bào tự do và tế bào ít hoặc không bị ảnh hưởng bởi kỹ thuật cố định

Nhược điểm: tế bào dễ bị tách khỏi chất mang, làm tăng hàm lượng tế bào tự do trong môi trường lên men Do đó, kỹ thuật này làm hạn chế số lần tái sử dụng so với các

kỹ thuật cố định khác

Các loại chất mang sử dụng cho kỹ thuật này là: cellulose, gỗ, mùn cưa [20]

1.3.1.2 Cố định tế bào trong lòng chất mang

Kỹ thuật cố định tế bào trong khung mạng xốp là kỹ thuật cố định mà tế bào được đưa vào trong mạng xốp (tạo gel) để giảm sự khuếch tán của tế bào vào môi trường xung quanh, nhưng vẫn cho phép sự trao đổi các chất dinh dưỡng cùng các sản phẩm trao đổi chất giữa môi trường và tế bào cố định

Bẫy trong cấu trúc sợi và vi gói là hai phương pháp cụ thể của kỹ thuật này Hai phương pháp này có đặc điểm như sau:

Bẫy là phương pháp mà đối tượng cố định được bẫy trong màng hoặc bên trong cấu trúc sợi nên đối tượng được giữ chặt và hạn chế được sự di chuyển tự do trong màng hoặc trong cấu trúc sợi

Ưu điểm: đối tượng được cố định có thể sẽ tránh khỏi các tác động từ điều kiện bên ngoài

Nhược điểm: do đối tượng được giữ chặt trong chất mang nên khi cố định có thể làm cho đối tượng bị bất hoạt, dẫn đến khả năng chuyển hóa cơ chất chậm và chi phí cố định cao

Các chất mang thích hợp thường được dùng cho phương pháp này là: alginate, carrageenan, chitosan, collagen, gelatin, polyvinyl alcohol…

Khác với phương pháp bẫy, vi gói là phương pháp mà đối tượng được cố định trong lòng chất mang nhưng đối tượng vẫn có thể di chuyển tự do trong không gian này

Ưu điểm: đối tượng được bảo vệ tránh khỏi những ảnh hưởng của các nhân tố bên ngoài, kỹ thuật này giúp tăng khả năng chuyển hóa cơ chất và có thể tránh làm cho đối tượng cố định bị bất hoạt

Nhược điểm: khi sinh khối tạo ra nhiều, độ bền của màng sẽ giảm làm cho tế bào có thể thoát ra khỏi mạng gel và phát triển như tế bào tự do

Các chất mang được dùng để vi gói: chitosan, gelatin, k-carrageenan…[20]

1.3.1.3 Cố định tế bào không sử dụng chất mang

Đây là kỹ thuật có sự hiện diện của một số hóa chất, các tác động về mặt vật lý hoặc hóa học nhờ hình thành liên kết cộng hóa trị giữa tế bào dẫn đến sự tự gắn kết của nhiều

tế bào lại với nhau tạo nên một cụm tế bào lớn có cấu trúc phức tạp hơn

Ưu điểm: dễ tạo lại tế bào tự do

Nhược điểm: đối tượng cố định có thể bị bất hoạt, biến tính, do có sự hiện hiện của một số hóa chất nên sản phẩm tạo ra có thể không đảm bảo an toàn và tính ổn định không cao Do đó phương pháp tự kết tụ ít được sử dụng trong kỹ thuật cố định [20]

1.3.1.4 Nhốt bằng phương pháp cơ học sau màng chắn

Phương pháp này có thể được thực hiện bằng hai cách, sử dụng màng vi xốp và sử dụng màng vi bao

Ưu điểm: Môi trường lên men không bị lẫn tế bào nên sản phẩm tạo thành có thể được thu hồi mà không cần lọc

Nhược điểm: Khả năng khuếch tán cơ chất và sản phẩm kém

Màng có thể bị bám bẩn do sự hấp thụ cơ chất lên bề mặt màng [20]

1.3.2 Yêu cầu và phân loại chất mang

1.3.2.1 Yêu cầu về chất mang

Yêu cầu thứ nhất là chất mang phải có bề mặt lớn để tế bào có thể gắn vào, dễ điều khiển và tái sinh Kế đó là chất mang phải đảm bảo khả năng sống của tế bào cũng như mọi hoạt động của tế bào được ổn định và yêu cầu tiếp theo là chất mang phải có độ xốp đồng đều cao đảm bảo cho sự trao đổi tự do của cơ chất Một đòi hỏi quan trọng nữa là

chất mang phải có tính ổn định cơ học, hóa học, nhiệt, sinh học và không dễ dàng bị giảm giá trị bởi enzyme, dung môi, sự thay đổi áp suất Song song đó, kỹ thuật cố định trên chất mang phải dễ thực hiện và có hiệu quả về kinh tế Những chất được sử dụng làm chất mang để cố định thường không có phản ứng với môi trường dinh dưỡng, vi sinh vật và sản phẩm tạo thành và đặc biệt là đảm bảo an toàn cho người sử dụng Chất mang không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do dư lượng còn lại

1.3.2.2 Phân loại chất mang

Chất mang hữu cơ: polymer tổng hợp như là polyvinylalcohol, polyacrylamide, polyacrylic, được dùng để cố định enzyme và tế bào bằng phương pháp nhốt trong lòng chất mang

Polymer sinh học: gelatin, keratin, albumin dùng trong cố định tế bào bằng phương pháp vi gói trong gel Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tinh bột, chitin, chitosan, alginate, carrageenan cũng được dùng để cố định tế bào

Chất mang vô cơ: oxit kim loại (nhôm oxit, mangan oxit, magie oxit, ), gốm, chất mang này có đặc điểm là có cấu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ có thể điều chỉnh được, khả năng cố định tốt với tế bào và enzyme [22,23]

1.3.3 Chất mang alginate và chitosan

1.3.3.1 Chất mang alginate và phương pháp cố định bẫy nhốt

Alginate là một copolyme loại block cấu tạo từ các gốc β-D-manuronat và guluronat bằng liên kết (1-4) glucosit, được tìm thấy trong loài rong nâu Phân tử alginate được tạo thành bởi liên kết của 3 loại block khác nhau là block polyguluronat, block polymannuronat và block xen kẽ có độ dài ngắn khác nhau và trình tự sắp xếp khác nhau Chính điều đó tạo nên tính chất đặc thù của alginate và được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau từ thực phẩm, mỹ phẩm, in vải, giấy cho đến dược phẩm và các nghiên cứu nuôi cấy mô động vật có vú [24,25,26]

α-L-Hình 1.5:Cấu tạo của alginate [21]

Trong những năm gần đây, việc cố định tế bào trong gel alginate calcium bằng phương pháp bẫy (entrapment) đã trở thành kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi Phạm vi sử dụng ngày càng rộng, từ các vi khuẩn cho tới tế bào của động vật có vú Việc ứng dụng rất đa dạng, kỹ thuật chuẩn bị đơn giản Quy trình chung là trộn lẫn dung dịch alginate natri và dịch huyền phù chứa tế bào cần cố định Dịch huyền phù thu được sẽ được cho nhỏ giọt vào dung dịch tạo gel như CaCl2, các hạt gel alginate calcium sẽ hình thành và có dạng hình cầu Trong mỗi hạt gel, tạo thành một mạng lưới (matrix) bao quanh các tế bào, cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp, thuận tiện cho việc khuếch tán cơ chất vào và khuếch tán sản phẩm ra khỏi hạt gel Bằng cách này người ta có thể dễ dàng khống chế các phản ứng, tách sản phẩm ra khỏi bình phản ứng và sản xuất liên tục [2]

Cấu trúc khối của alginate

Alginate polymer

Hình 1.6:Quá trình tạo tế bào cố định trong gel alginate calcium bằng phương pháp bẫy nhốt [26]

Hình 1.7: Sự hình thành gel giữa alginate và Ca2+ [20]

Trong hai thập niên qua, khoa học đã có những thành tựu đáng kể trong đó có lĩnh vực có liên quan đến alginate là công nghệ sinh học Với kỹ thuật cố định tế bào trên gel alginate, công nghệ sinh học đã công nghiệp hóa được một số công nghệ cao như sản xuất

liên tục các loại rượu bằng việc cố định các tế bào nấm men, sản xuất acid hữu cơ, các chất kháng sinh và các hocmôn bằng việc cố định các vi khuẩn đồng thời nuôi cấy mô tế bào của động thực vật, các kháng nguyên dòng vô tính đơn,…Ngoài tác dụng cố định, alginate cũng được dùng trong một số thực phẩm hạn chế tăng trọng, acid alginic và muối của nó có thể làm chất ổn định trong kem ly, làm cho kem mịn và có mùi thơm, chịu nóng tốt, thời gian khuấy trộn ngắn Gel alginate natri 0,1% cho vào sữa bò chống được hiện tượng các chất không hòa tan kết tủa, nồng độ 0,1% dùng để làm trong rượu vang Alginate cũng được ứng dụng trong sản xuất bơ, fomat, nước giải khát cũng như các mặt hàng đông lạnh

Các ứng dụng của kỹ thuật cố định tế bào đã phát triển mạnh mẽ và được công nghiệp hóa ở các nước phát triển với nhiều thành tựu đáng kể Tuy nhiên, ở nước ta với nguồn rong nâu phong phú cho alginate có tính chất tạo gel và cố định tế bào tốt nhưng các ứng dụng còn rất ít Việc ứng dụng alginate làm chất mang để sản xuất ethanol theo phương pháp lên men liên tục là ứng dụng có thể nghiên cứu triển khai trong công nghiệp tại nước ta [25,26]

1.3.3.2 Chất mang Chitosan

a) Giới thiệu về chitosan

Chitosan là một polysaccharide gồm các phân tử β-(1,4)-D-glucosamine Chitosan là thành phần quan trọng trong vỏ của động vật giáp xác, bộ xương ngoài của côn trùng và thành tế bào của nấm, có tác động tạo khung vững chắc và ổn định

Chitosan là dẫn xuất quan trọng của chitin, được thu nhận bằng cách khử acetyl của chitin khi xử lý với dung dịch KOH hay NaOH đậm đặc Vì vậy, chitosan là một polymer đồng trùng hợp của N-acetyl-D-glucosamine và D-glucosamine, chứa một lượng tối đa 30% các nhóm acetyl [28,29,30]

Hình 1.8:Công thức hóa học của chitosan, với n trong khoảng 700 – 4500 [27]

Có 2 chỉ số quan trọng của chitosan là mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình, độ deacetyl hóa là độ chuyển hóa chitin thành chitosan Thông thường các chitosan

có độ deacetyl hóa 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa khoảng 45 – 55% tan tốt trong nước nên gọi là chitin tan Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan

là một đại lượng có ý nghĩa thống kê, được xác định thông qua độ nhớt dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ 10.000 – 50.000 tùy theo mỗi loại chitosan khác nhau Hai chỉ số này ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan [27]

b) Tính chất của chitosan

- Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây bệnh như

E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm Candida albicans

1.3.4 Bản chất liên kết giữa alginate và chitosan

Các polysaccharit sinh học như là alginate và chitosan hiện nay đang được chú trọng nghiên cứu vì chúng có nhiều khả năng ứng dụng trong lĩnh vực vi gói tế bào, vận chuyển thuốc và kỹ thuật mô Một yếu tố có thể phát triển vật liệu sinh học sử dụng alginate và chitosan là khả năng liên kết giữa nhóm cacboxyl của alginate và nhóm amino của chitosan thông qua liên kết ion giữa hai nhóm này tạo nên một cấu trúc 3 chiều Hình dạng của liên kết này không phụ thuộc vào tỉ lệ giữa khối G/M trong cấu trúc của alginate Khả năng điều chỉnh đặc tính hóa lý của sự liên kết giữa alginate và chitosan được thực hiện thông qua điều chỉnh các nhóm chức Alginate có đặc tính bị co rút lại trong môi trường có pH thấp và hòa tan trong môi trường pH cao Ngược lại, chitosan hòa tan trong môi trường pH thấp và không tan trong môi trường pH lớn hơn 7 Trong phương pháp cố định tế bào bằng cách vi gói trong phức hợp alginate – chitosan, kích thước thực tế của hạt phần lớn phụ thuộc vào tỷ lệ giữa alginate và chitosan, khối lượng phân tử của các polymer này và pH của dung dịch [30]

Hình 1.9: Liên kết giữa alginate và chitosan [20]

Hình 1.10: Hạt gel alginate – chitosan dưới kính hiển vi điện tử [20]

Hình 1.11: Minh họa quá trình cố định tế bào bằng phức chất mang alginate – chitosan

[30]

1.3.5 Trạng thái của tế bào cố định

1.3.5.1 Sự phát triển của tế bào trong hạt gel

Việc cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang alginate sẽ được bao quanh bởi một mạng lưới lưới gel làm hạn chế sự di chuyển của tế bào vi sinh vật trong hạt gel Với nồng độ alginate khoảng 2% thì kích thước lỗ trên hạt gel khoảng từ 5nm đến 200nm, kích thước này nhỏ hơn kích thước của hầu hết các loại vi sinh vật nên tế bào vi sinh vật

sẽ được nhốt bên trong hạt gel Một số tác giả đã nghiên cứu sự phát triển của vi sinh vật bên trong mạng lưới hạt gel Điển hình là Willaert và Baron (1993) đã nghiên cứu sự phát triển của tế bào nấm men khi cố định trong chất mang alginate có nồng độ 2% bằng cách quan sát dưới kính hiển vị trực tuyến Ban đầu, tế bào nấm men được phân bố đồng đều bên trong hạt gel Khi tế bào bắt đầu phân chia, số lượng tế bào trong hạt gel tăng lên tạo nên một lực đẩy cơ học đẩy mạng lưới gel ra xa và một mật độ tế bào dày đặc đã được hình thành trong gel Khi mật độ tế bào trong hạt gel càng lớn, tế bào sẽ bao quanh bề mặt hạt gel tạo nên lực đẩy cơ học có thể phá vỡ mạng lưới hạt gel và tế bào thất thoát ra môi trường Sự thất thoát này sẽ tạo nên những lỗ hổng trên hạt gel và có thể làm thất thoát một phần hoặc toàn bộ tế bào trong hạt gel ra ngoài môi trường [9,10,21]

Tế bào tự do

Bẫy nhốt trong gel aliginate

Vi gói bằng chitosan

1.3.5.2 Sự vận chuyển cơ chất và sản phẩm qua mạng lưới hạt gel

Trong quá trình lên men bằng tế bào cố định, một số tác giả đã chứng minh rằng kích thước hạt gel ảnh hưởng đến động học của quá trình lên men tế bào cố định Cahon và công sự (1995) đã chỉ ra rằng, sự giảm bớt kích thước hạt gel từ 1,3mm đến 0,75mm là nguyên nhân dẫn đến sự tăng lên của khả năng tạo thành sản phẩm Đồng thời sinh khối tế bào trong hạt gel cố định cũng tăng gấp đôi và hiệu suất cố định tăng 50% Tương tự, một

số tác giả khác cũng đã ghi nhận rằng, kích thước của hạt gel chứa tế bào cố định có ảnh hưởng tới sự phân phối không đồng nhất của sinh khối tế bào trong hạt gel trong suốt quá trình lên men Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, 95% sinh khối tập trung phía ngoài cùng của hạt gel và chiếm diện tích khoảng 300µm so với diện tích của hạt gel Rõ ràng hiện tượng xuất hiện một chuỗi không đồng dạng về điều kiện tăng trưởng của tế bào trong hạt gel Nguyên nhân chính của điều kiện phát triển không đồng dạng trong hạt gel dà do sự giới hạn về khả năng vận chuyển của cơ chất và các sản phẩm thải ra từ quá trình trao đổi chất qua màng của hạt gel Sự vận chuyển này xuất hiện chủ yếu thông qua quá trình

khuếch tán [21,32]

Trong quá trình lên men tế bào cố định, cơ chất được tiêu thụ và tạo ra các sản phẩm thải bên trong mạng lưới hạt gel Các chất dinh dưỡng hòa tan trong môi trường lên men sẽ di chuyển từ bên ngoài vào bên trong hạt gel theo cơ chế khuếch tán từ nơi có nồng độ cao sang nơi có nồng độ thấp Nếu khả năng tiêu thụ của vi sinh vật hoặc sự tạo thành các sản phẩm hòa tan tăng lên tới một mức độ nhất định thì quá trình vận chuyển này sẽ bị giới hạn Quá trình vận chuyển này xuất hiện thông qua hoạt động của 3 giai đoạn: Sự phân phối, sự phân tán và sự khuếch tán Hai giai đoạn đầu là sự chuyển động bên trong chất lỏng [20]

1.3.6 Ưu điểm và nhược điểm của tế bào cố định

1.3.6.1 Ưu điểm

Chất mang dùng để cố định tế bào có thể đóng vai trò như một chất bảo vệ chống lại

ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH, dung môi, hoặc thậm chí là kim loại nặng Bên trong

chất mang mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích cao hơn nên thời gian phản ứng ngắn hơn và loại bỏ sự tăng trưởng của những tế bào vi sinh vật không có lợi Khi tế bào được

cố định trong chất mang thì khả năng hấp thu cơ chất tăng, năng suất được cải thiện và quá trình này có thể tiến hành liên tục Do chất mang có khả năng chịu được nồng độ cơ chất cao, nên giảm được sự ức chế của sản phẩm cuối Sản phẩm tạo ra dễ dàng hơn, giảm được các công đoạn tách, chiết và lọc, kéo theo giảm giá thành, giảm chi phí vốn và cũng giảm nguy cơ bị nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao, nhờ đó mà thời gian sản xuất ra sản phẩm ngắn hơn Thêm vào đó, ta thấy tế bào cố định có thể tái sử dụng được nhiều lần Do đó, phương pháp này giúp giảm chi phí ở giai đoạn chuẩn bị giống, năng suất tăng và quá trình bảo quản cũng như lưu thông được thuận lợi, dễ dàng hơn [22, 33]

1.3.6.2 Nhược điểm

Khi sử dụng tế bào cố định, trong môi trường sản xuất, có xảy ra hiện tượng rửa trôi

tế bào ra khỏi chất mang Một điểm nữa là tế bào cố định đòi hỏi cung cấp nhiều nguồn dinh dưỡng, năng lượng để đảm bảo sự sinh trưởng, phát triển bình thường

Khi lên men bằng tế bào cố định có thể xảy ra hiện tượng phân hủy sản phẩm để cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng cần cho tế bào Vì vậy, hiệu suất sử dụng tế bào

cố định có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do

Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất, quá trình cố định

có thể sẽ gây cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm từ môi trường ra vào tế bào, nghĩa

là tế bào cố định có khả năng trao đổi chất kém hơn tế bào tự do

Đối với những cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có điều kiện tiếp xúc với

tế bào vi sinh vật cố định Vì thế, hoạt lực của những tế bào cố định có thể sẽ thấp so với những tế bào tự do Bài toán tối ưu hóa kỹ thuật cố định sẽ giải những nhược điểm này

Từ những vấn đề trên ta thấy có các chỉ tiêu sau để đánh giá hiệu quả của tế bào cố định

- Khả năng sống của tế bào trong chất mang, lượng tế bào còn sống sót và hoạt động sau một thời gian nhất định, khả năng chuyển hóa cơ chất và thành phần dinh dưỡng đi vào, sản phẩm trao đổi chất đi ra

- Độ bền cơ học của chất mang, sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt độ, lực tác động của môi trường và của lực khuấy, lực thổi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật [21,22,23]

1.4 Một số công trình nghiên cứu về hướng của đề tài

1.4.1 Các công trình trong nước

Ở Việt Nam hiện nay cũng đã có một số công trình nghiên cứu của trường đại học Dược Hà Nội, trường đại học Khoa học tự nhiên đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh và trường đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh về vấn đề phân lập các chủng

Bacillus subtilis có khả năng lên men thu nattokinase hàm lượng cao, tối ưu hóa thành phần môi trường lên men chủng Bacillus subtilis để thu nattokinase tái tổ hợp bằng

phương pháp đáp ứng bề mặt và nghiên cứu tối ưu môi trường lên men để thu enzyme

nattokinase Chưa có hướng nghiên cứu về vấn đề cố định tế bào Bacillus subtilis natto

nhằm mục đích lên men nattokinase

 Trần Quốc Tuấn và cộng sự (2014) đã tiến hành tối ưu hóa thành phần môi trường

lên men chủng Bacillus subtilis thu nhận nattokinase tái tổ hợp bằng phương pháp đáp

ứng bề mặt Từ 6 yếu tố ban đầu, chọn ra 3 yếu tố ảnh hưởng là peptone đậu nành, MgSO4 và NaCl bằng thiết kế ma trận Plackett-Burman Sử dụng phương pháp đáp ứng

bề mặt Box-Behnken đã tối ưu thành phần môi trường cho hoạt tính nattokinase cao nhất với 10g/l peptone từ đậu nành, 0,88g/l MgSO4 và 5g/l NaCl Hoạt tính tối đa đạt được là

152FU/ml sau 16 giờ nuôi cấy chủng Bacillus subtilis DB 104 tái tổ hợp Kết quả làm tiền

đề cho nghiên cứu thu nhận nattokinase với quy mô pilot 10 lít để có thể sử dụng làm thực phẩm chức năng [33]

 Hoàng Thị Khánh Hồng (2012) đã nghiên cứu biểu hiện và tiết enzyme nattokinase

tái tổ hợp ở Bacillus subtilis Tác giả đã phân lập được chủng Bacillus subtilis từ sản

phẩm natto thương mại làm nguồn thu nhận gen mã hóa thích hợp cho nattokinase Thiết lập thành công hệ thống vector biểu hiện mang gen mã hóa nattokinase nhân bản được

trong E.coli và hoạt động ở Bacillus subtilis gồm hệ thống vector cho phép sát nhập casset

biểu hiện vào bộ gen (pAX01-aprE) và hệ thống vector tồn tại độc lập với tế bào

(pBG01-aprE) Biểu hiện và tiết vượt mức nattokinase tái tổ hợp ở chủng Bacillus subtilis được

loại bỏ các serin protease quan trọng Nattokinase tái tổ hợp sơ bộ được chứng minh là có hoạt tính phân hủy fibrin gấp 5-10 lần so với chủng tự nhiên sau 3 giờ cảm ứng và hoạt tính bền trong suốt thời gian nhân nuôi 25 giờ Nghiên cứu này là cơ sở thuận lợi cho tinh chế và thu nhận nattokinase sạch, không tạp nhiễm các serin protease có hoạt tính subtilisin [34]

 Lê Thị Bích Phượng và cs (2012) thuộc Viện công nghệ sinh học nhiệt đới đã thực

hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase” Trong nghiên cứu này, hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 đã được chọn lọc có

khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme tan huyết khối nattokinase Trên môi trường đậu nành, chiều dày môi trường 2,5 cm, ở nhiệt độ phòng và thời gian lên men 40 giờ thu được nattokinase (470 FU/g), chiếm khoảng 70-85% so với hoạt tính protease tổng [35]

 Nguyễn Thúy Hương và cs (2014) tiến hành đề tài tối ưu hóa môi trường lên men

để thu nhận sinh khối Bacillus subtilis natto và bước đầu khảo sát hoạt độ enzyme

nattokinase thu được Các tác giả đã sử dụng ma trận thực nghiệm Plackett Burman để tiến hành sàng lọc 6 yếu tố trong môi trường lên men bao gồm: glucose, soybean peptone, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2 Kết quả cho thấy, hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến sinh khối tế bào là soybean peptone và CaCl2 Tiến hành thí nghiệm tối ưu với hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm mục tiêu đã tìm được thông qua ma trận Plackett Burman, các yếu tố còn lại được giữ ở mức trung tâm Thực hiện thí nghiệm tối ưu với bề mặt đáp ứng cấu trúc có tâm (RMS – CCD) Kết quả thực nghiệm tối ưu thành phần môi

trường lên men gồm (g/l): glucose 5,625, soybean peptone 13, K2HPO4 2,15, MgSO4.7H2O 0,875, NaCl 5, CaCl2 0,05 Với môi trường lên men tối ưu trên, lượng sinh khối tế bào thu được 3,033 ± 0,243 g/l, hoạt độ enzyme nattokinase là 31,06 ± 0,297 FU/ml Kết quả hoạt độ enzyme thu được khi lên men trên môi trường tối ưu này cao hơn 30% so với hoạt độ enzyme thu được khi lên men trên môi trường NB [36]

1.4.2 Các công trình trên thế giới

 Hiroyuki Sumi và cộng sự (2009) khảo sát tăng nattokinase và Vitamin K2 trong natto với acid Dipicolinic làm chất cảm ứng Đề tài đã chứng minh được khi thêm acid

dipicolinic vào dung dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis natto thì diện tích fibrin hòa

tan bởi nattokinase và các hoạt động amidase của nattokinase dựa trên PhepNA tăng lên Ví dụ trong quá trình sản xuất natto từ đậu nành, việc bổ sung 10 - 64mM acid dipicolinic làm tăng hoạt động amidase hơn 10 lần Nồng độ vitamin K2 cũng tăng 4 lần khi bổ sung 10mM acid dipicolinic vào môi trường lên men natto [37]

Suc-Ala-Ala-Pro- Young-Han Cho và cs (2010) với nghiên cứu sản xuất nattokinase bằng phương

pháp lên men gián đoạn và lên men bán liên tục sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis Trong

nghiên cứu này nattokinase đã được sản xuất theo hai phương pháp là lên men theo mẻ và lên men bán liên tục Với việc bổ sung các hỗn hợp môi trường chứa các chất (peptone, yeast extract, tryptone) ở các nồng độ khác nhau Khi bổ sung dịch chiết nấm men vào môi trường nuôi cấy với nồng độ từ 5g/l đến 100g/l, kết quả cho thấy với nồng độ dịch

chiết nấm men bổ sung là 50g/l thì sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis diễn ra

mạnh nhất, đồng thời enzyme nattokinase thu được sau 12 giờ lên men cũng có hoạt độ cao nhất Với nồng độ dịch chiết nấm men bổ sung vào là 5g/l đến 20g/l thì hoạt lực của enzyme nattokinase rất thấp Ngược lại, khi bổ sung dịch chiết nấm men với nồng độ từ

70g/l đến 100g/l thì sự sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis bị ức chế và quá trình

sinh tổng hợp nattokinase cũng bị ức chế Ảnh hưởng của pepton lên sự sinh trưởng của tế

bào vi khuẩn Bacillus subtilis và quá trình sinh tổng hợp nattokinase cũng đã được xác

định khi tiến hành bổ sung pepton với nồng độ từ 5g/l đến 100g/l Kết quả cho thấy rằng,

ở tất cả các nồng độ pepton khảo sát thì sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis tăng đến thời điểm 8 giờ lên men và sau 8 giờ lên men thì sự sinh trưởng của Bacillus subtilis bắt đầu giảm Hoạt độ enzyme nattokinase đạt mức cao nhất khi bổ sung

pepton với nồng độ 50g/l Đối với trypton, nồng độ bổ sung cũng từ 5g/l đến 100g/l và kết quả thu được là bổ sung nồng độ trypton 50g/l thì enzyme nattokinase thu được có hoạt

độ cao nhất sau 10 giờ lên men Với nồng độ trypton cao hơn 50g/l thì sự sinh trưởng của

tế bào và quá trình sinh tổng hợp nattokinase bị ức chế Đặc biệt ở nồng độ trypton bổ

sung là 100g/l thì không có sự sinh trưởng của tế bào Bacillus subtilis và quá trình sinh

tổng hợp nattokinase không xuất hiện Từ các dữ liệu về động học của quá trình lên men này chỉ ra rằng, quá trình tạo sản phẩm nattokinase liên quan đến sự tăng trưởng của tế

bào Bacillus subtilis trong quá trình lên men Để thu nhận lượng nattokinase tối đa thì cần

phải thu hoạch trước pha ổn định Trong lên men bán liên tục, điều chỉnh pH theo các giai đoạn của quá trình lên men Nattokinase thu được ở thời điểm 22 giờ lên men là 7100 unit/ml, cao gấp 2,1 lần so với lượng nattokinase cao nhất thu được trong lên men theo

mẻ [38]

 Dja-Shin Wang và cộng sự (2006) khảo sát quá trình tối ưu để lên men sản xuất nattokinase bằng phương pháp đáp ứng bề mặt Các tác giả đã chứng minh được việc lên men sản xuất nattokinase có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: nhiệt độ, tốc độ lắc, thời gian lên men, thể tích môi trường lên men Quá trình tối ưu hóa các yếu tố cho quá trình lên men sản xuất nattokinase được thực hiện bởi phương pháp đáp ứng bề mặt qua 3 bước Bước đầu tiên tìm các yếu tố quan trọng cho quá trình lên men thông qua L8 orthogonol array experiment Yếu tố lựa chọn nhiệt độ (370C hoặc 450C), tốc độ lắc (110rpm hoặc 150rpm), thể tích môi trường (80ml hoặc 120ml) Brix của nước chiết cám lúa mì (1,50 hoặc 30), Brix của nước chiết thịt (10 hoặc 20), nồng độ glucose (0,6% hoặc 1,2%) và thời gian lên men (24 giờ hoặc 36 giờ) Bước thứ 2 là thiết lập các phương trình hồi quy giữa các yếu tố và giữa hai yếu tố có ý nghĩa thống kê (ví dụ thể tích môi trường lên men và thời gian lên men) Tìm giải pháp tối ưu cho thể tích môi trường lên men và

thời gian lên men dựa vào phương pháp đáp ứng bề mặt phản ứng của phương trình hồi quy Theo phân tích thì điều kiện tối ưu cho thể tích môi trường lên men là 80ml và thời gian lên men là 37,08 giờ Dự đoán hoạt độ của enzyme thu được là 459,11 FU/ml [39]

 Hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về con đường sinh tổng hợp nattokinase của

chủng Bacillus subtilis natto được công bố Tuy nhiên, các nhà khoa học của trường đại học King Mongkut’s của Thái Lan đã xây dựng mô hình mạng lưới tương tác của Bacillus subtils bằng cách sử dụng công cụ phân tích dựa trên các con đường sinh tổng hợp cơ bản

Công cụ phân tích này đã được sử dụng để xây dựng mạng lưới những ảnh hưởng khi thay đổi các điều kiện của môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme

nattokinase của chủng Bacillus subtilis Dựa vào các con đường sinh tổng hợp, với giả

thuyết sự tổng hợp nattokinase đạt năng suất cao nhất dưới các điều kiện về cơ chất và hàm lượng oxy cần cung cấp từ đó tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và môi trường để thu nattokinase Sau đó tiến hành lên men theo mẻ để thu nhận nattokinase với các cơ chất và

hàm lượng oxy đã được tối ưu [40] Mô hình về mạng lưới chuyển hóa của Bacillus subtilis đã được xây dựng bằng cách kết hợp chặt chẽ tất cả các con đường chuyển hóa

trung tâm cho sự sinh trưởng của tế bào, sản xuất các sản phẩm lên men, sinh tổng hợp nattokinase và năng lượng sinh ra Bao gồm các con đường: glycolysis, pentose phosphate, lên men, đồng hóa, phosphoryl hóa, và chu trình TCA Bằng cách sử dụng hai loại cơ chất khác nhau là glucose và glycerol Tất cả các tương tác trong mô hình này đều được định

vị trong hai vùng là nội bào và ngoại bào Mạng lưới các phản ứng có chứa 50 chuyển hóa nội bào và 13 chuyển hóa ngoại bào

Mô hình con đường sinh tổng hợp nattokinase cũng được xây dựng tương tự phương pháp trên Đánh giá lý thuyết về khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ hai cơ chất khác nhau là glucose và glycerol Kết quả từ mô hình đánh giá cho thấy rằng, hàm lượng nattokinase thu được khi sử dụng cơ chất là glycerol cao hơn 9% so với sử dụng glucose Đồng thời mô hình cũng chỉ ra khi sử dụng cơ chất là glycerol thì lượng sinh khối thu được cũng cao hơn khi sử dụng glucose, hàm lượng sản phẩm phụ của quá trình lên men

cũng ít hơn Từ những dữ liệu của mô hình EMA, tiến hành lên men bằng Erlen và Biorector để thu nhận nattokinase [41]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng 116B2 của Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dài từ tháng 07/2015 đến tháng 03/2016

2.2 Vật liệu

- Giống: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto được cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ

sinh học, Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh

Giống sau khi đã được chọn lọc trên đĩa Petri sẽ cấy ria trên ống thạch nghiêng có chứa môi trường thích hợp Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ sẽ được đưa vào giữ lạnh ở nhiệt độ 4°C và cấy chuyền mỗi tháng một lần để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển

- Alginate có nguồn gốc từ Nhật Bản

- Chitosan có nguồn gốc từ viện thủy sản Nha Trang

2.2.1 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường giữ giống: - Môi trường nhân giống