Nghiên cứu chế biến sản phẩm sữa bột bổ sung nano curcumin

Nhiều phương pháp đã được giới thiệu nhằm cải thiện tính khả dụng của curcumin như: kết hợp với Polylacto-co-glycolic acid, bao gói trong liposome, hoặc cyclodextrin, kết hợp với piperin

-

PHAN THÀNH PHÁT

NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN SẢN PHẨM SỮA BỘT

BỔ SUNG NANO CURCUMIN

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 60 54 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2016

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Bích Lam

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Phan Ngọc Hòa

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Lê Trung Thiên

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 07 năm 2016

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

2 TS Hoàng Kim Anh

3 TS Lê Trung Thiên

4 TS Phan Ngọc Hòa

5 TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phan Thành Phát MSHV: 7140467

 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ lên quy trình sản xuất sữa bột có

bổ sung nano curcumin

 Khảo sát khả năng bảo vệ gan của sản phẩm sữa bột có bổ sung nano curcumin

Nội dung

 Đánh giá tác động của công thức phối trộn lên chất lượng của sản phẩm

 Đánh giá tác động của áp suất đồng hóa lên chất lượng của sản phẩm

 Đánh giá tác động của nhiệt độ đầu vào trong quá trình sấy phun lên chất lượngcủa sản phẩm

 Đánh giá khả năng bảo bệ gan trên mô hình chuột có sử dụng đồng thời CarbonTetrachloride (CCl4) là tác nhân gây tổn thương gan

-

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 06 năm 2016

Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

Luận văn Thạc sỹ này là sự cố gắng không mệt mỏi của cả một tập thể, là ước mong của tôi cho một đất nước ngày càng phát triển Trên con đường đầy gian nan này, tôi thật may mắn khi luôn nhận được sự giúp đỡ của mọi người…

Xin cảm ơn ba, mẹ đã tạo điều kiện và luôn hỗ trợ con trên con đường học vấn, hoàn thành ước mơ của mình

Xin cảm ơn cô TS Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và dạy bảo, giúp em

có thể hoàn thành tốt nhất luận văn này

Xin cảm ơn quý Thầy Cô bộ môn Công nghệ thực phẩm đã hết lòng giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho chúng em

Xin cám ơn cô Nhan, anh Ba Nhân Hai, anh Hải Nam, chị Thoa, chị Hoàng giáo chủ, chị Lan Chi, chị Vy, bạn Quân, bạn Quyền Tồn, Quyên Mai, Chi Cún, Tuấn

Vi Tiểu Bảo, Vinh, Khoa, Trâm, anh Tài, Huyền viện trưởng, Uyển, Phong đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Bách Khoa

Xin cảm ơn bạn Trường vì đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi

Cuộc đời còn dài, đam mê còn mãi, phải luôn học hỏi để tiến lên phía trước

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 06 năm 2016

Phan Thành Phát

Curcumin, 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione, a

hydrophobic polyphenol derived from the rhizome of the herb Curcuma longa, has a

wide spectrum of biological and pharmacological activities, including antioxidative, anti-inflammatory, antimicrobial, and anti-tumour abilities However, due to its low solubility, curcumin is poorly absorbed in human and animals Nano technology application is now a innovative, potential way to improve the bioavailability of curcumin In this thesis, we proposed a new method to apply nano curcumin as a functional food The product was prepared by spray drying method from skim milk-nano curcumin mixtures The optimal parameters for production were: 300 g skim milk/250 mL nano curcumin emulsion mixing formula (in 1 liter solution); homogenization pressure 300 bar; inlet temperature 180oC The product produced from these selected parameters contained 37.4% protein, 9.7% crude lipid, 2.66 mg/g curcumin, 4.5% moisture content; and the powder particles were shown to be sticky under SEM microcope Besides, nano curcumin-supplemented milk powder have shown the ability to attenuate oxidative CCl4-induced liver injury in Swiss Mus

musculus var albino mouse model Our study also suggests that the application of

nano curcumin is a effective and potental way in future

Curcumin, 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione,

là một hợp chất polyphenol kỵ nước có nhiều chức năng sinh học và dược học như khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng ung thư Tuy nhiên,

do tính chất hòa tan kém trong nước, curcumin được hấp thu rất kém ở cơ thể người

và động vật Việc ứng dụng công nghệ nano vào curcumin đang là một hướng đi mới, đầy tiềm năng trong việc giải quyết vấn đề đang gặp phải Trong luận văn này, chúng tôi đề xuất một phương pháp mới để ứng dụng nano curcumin làm thực phẩm chức năng Sản phẩm sữa bột bổ sung nano curcumin được sản xuất bằng phương pháp sấy phun từ hỗn hợp sữa gầy-nano curcumin Các thông số được lựa chọn cho quy trình sản xuất sản phẩm bao gồm: tỷ lệ phối trộn 300g sữa gầy/250 mL nhũ tương nano curcumin trong 1 L dung dịch; áp suất đồng hóa 300 bar; nhiệt độ đầu vào của tác nhân nhiệt 180oC Sản phẩm sữa bột được sản xuất theo điều kiện đã lựa chọn có hàm lượng protein 37.4%, lipid thô 9.7%, hàm lượng curcumin 2.66 mg/g sản phẩm, độ ẩm 4.5%; và các hạt bột có khuynh hướng kết dính với nhau khi quan sát dưới kính hiển vi SEM Bên cạnh đó, sữa bột bổ sung nano curcumin cũng cho thấy khả năng làm giảm tác động của hóa chất oxy hóa mạnh CCl4 lên sự tổn hại

gan trên mô hình chuột Swiss Mus musculus var albino Những kết quả từ nghiên

cứu này cũng cho thấy rằng việc ứng dụng nano curcumin là một hướng đi hiệu quả

và đầy tiềm năng trong tương lai

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Phan Thành Phát

ABSTRACT i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Curcumin và sự tổng hợp curcumin 2

2.2 Đặc tính cấu trúc của curcumin 3

2.3 Các phản ứng của curcumin 5

2.3.1 Phản ứng với ROS 5

2.3.2 Phân hủy hóa học và biến dưỡng 7

2.3.3 Phản ứng thêm Nucleophillic (Nucleophillic addition reaction) của curcumin 9

2.4 Hóa học về tương tác curcumin-ion kim loại 10

2.5 Sự vận chuyển curcumin vào trong cơ thể và tính chất sinh học của curcumin 12

2.5.1 Vận chuyển qua đường miệng 12

2.5.2 Vận chuyển qua tiêm dưới bụng 13

2.5.3 Vận chuyển qua tiêm tĩnh mạch 14

2.6 Sự hấp thu curcumin ở các cơ quan trong cơ thể 15

2.7 Sự biến dưỡng curcumin trong cơ thể 15

2.8 Tính sinh khả dụng của curcumin 18

2.8.1 Curcumin chưa được biến đổi (unformulated curcumin) 18

2.8.2 Kết hợp với Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) 18

2.8.3 Bao gói trong liposome 19

2.8.4 Bao gói trong Cyclodextrin 20

2.8.5 Kết hợp với piperine 20

2.8.6 Nano curcumin 21

3.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 23

3.3 Quy trình sản xuất sữa bột bổ sung nanocurcumin 24

3.4 Thiết kế thí nghiệm 25

3.5 Xây dựng đường chuẩn curcumin và định lượng curcumin 26

3.6 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi curcumin 26

3.7 Xác định khả năng hòa tan của curcumin và bột sản phẩm 26

3.8 Hiệu quả tương tác của protein-curcumin 27

3.9 Xác định hàm lượng protein, lipid thô, ẩm 28

3.10 Đánh giá hình thái bột sản phẩm 28

3.11 Đánh giá hoạt tính sinh học của sản phẩm 28

3.12 Xử lý dữ liệu 29

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 30

4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn sữa gầy:nano curcumin 30

4.2 Ảnh hưởng của áp suất đồng hóa 33

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun 37

4.4 Thành phần và tính chất của sản phẩm 40

4.5 Đánh giá hoạt tính sinh học của sản phẩm 42

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Thông số sản xuất sữa bột bổ sung nano curcumin 40 Bảng 4.2 Thành phần của sản phẩm sữa bột bổ sung nano curcumin 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Các vùng trên curcumin 2

Hình 2.2 Sự tổng hợp curcumin bằng phương pháp Pabon 3

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của curcumin 4

Hình 2.4 Các vị trí tấn công của curcumin với gốc tự do và sự khôi phục nhờ vào Ascorbic acid 6

Hình 2.5 Phản ứng Michael của curcumin với protein thiol và selenol 9

Hình 2.6 Cấu trúc của phức hợp 2:1 curcumin:kim loại 11

Hình 2.7 Sự biến dưỡng của curcumin 17

Hình 3.1 Quy trình sản xuất sữa bột bổ sung nano curcumin 24

Hình 3.2 Thiết kế thí nghiệm 25

Hình 3.3 Đường chuẩn curcumin 26

Hình 3.4 Đường chuẩn albumin 29

Hình 4.1 Thành phần và hiệu suất thu hồi của sản phẩm ở 3 công thức phối trộn 30 Hình 4.2 Hàm lượng bột sản phẩm hòa tan và curcumin hòa tan tại các thời điểm khác nhau ở 3 công thức phối trộn 31

Hình 4.3 Hiệu quả tương tác của protein-curcumin trong sản phẩm ở 3 công thức phối trộn 32

Hình 4.4 Thành phần và hiệu suất thu hồi của sản phẩm ở 3 áp suất xử lý 34

Hình 4.5 Hiệu quả tương tác của protein-curcumin trong sản phẩm ở 3 áp suất xử lý 35

Hình 4.6 Hàm lượng bột sản phẩm hòa tan và curcumin hòa tan tại các thời điểm khác nhau ở 3 áp suất xử lý 36

Hình 4.7 Thành phần và hiệu suất thu hồi của sản phẩm ở 3 nhiệt độ đầu vào 37

Hình 4.8 Hiệu quả tương tác của protein-curcumin trong sản phẩm ở 3 nhiệt độ đầu vào 38

Hình 4.9 Hàm lượng bột sản phẩm hòa tan và curcumin hòa tan tại các thời điểm khác nhau ở 3 nhiệt độ đầu vào 39

Hình 4.10 Hình ảnh của các hạt sữa bột có bổ sung NC khi quan sát dưới kính hiển

vi điện tử quét SEM 41

Hình 4.11 Sự kết dính của các hạt bột sau các thời gian phơi nhiễm với không khí khác nhau 42

Hình 4.12 Nồng độ ALT trong huyết thanh chuột 43

Hình 4.13 Nồng độ albumin trong huyết thanh 44

Hình 4.14 Hình thái mô học của gan chuột sau 30 ngày khảo sát 45

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AUC Area under curve CCl4 Carbon tetrachloride

CD Cyclo oligosaccharide COX-2 cyclooxygenase-2 FBS Fetal Bovine Serum iNOS inducible nitric oxide synthase

IP Intraperitoneal – tiêm dưới bụng

IV Intravenous – tiêm tĩnh mạch LHRH Luteinizing hormone-releasing hormone

NC nano curcumin NF-κB Nuclear factor- κB PEG Polyethylene glycol PGLA Poly(lacto-co-glycolic acid) ROS Reactive oxygen species THC Tetrahydrocurcumin TNF Tumour Necrosis Factor TMC-LC N-trimethyl chitosan chloride

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, con người không chỉ quan tâm đến nhu cầu về dinh dưỡng, mà còn quan tâm đến nhu cầu về sức khỏe Vì thế, những thực phẩm chức năng, những thực phẩm có thể phòng tránh bệnh tật ngày càng được nghiên cứu nhiều, trong đó phải

kể đến các loại thực phẩm giàu chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên Nghệ được biết đến như một phương thuốc được sử dụng rộng rãi ở châu Á để phòng trừ nhiều loại bệnh tật Thành phần quan trọng nhất trong nghệ là curcumin, đã được biết đến với khả năng chống oxy hóa, kháng viêm, chống ung thư, kháng khuẩn … Tuy nhiên khả năng hấp thu curcumin ở người và động vật là rất thấp, làm cho việc

sử dụng curcumin gặp nhiều trở ngại

Nhờ vào những tiến bộ về khoa học và kỹ thuật Nhiều phương pháp đã được giới thiệu nhằm cải thiện tính khả dụng của curcumin như: kết hợp với Poly(lacto-co-glycolic acid), bao gói trong liposome, hoặc cyclodextrin, kết hợp với piperine… Trong đó, việc ứng dụng công nghệ nano vào curcumin đang là một hướng đi mới, đầy tiềm năng trong việc giải quyết vấn đề đang gặp phải Hệ thống hạt nano curcumin có nhiều ích lợi đa khía cạnh trong sự dẫn truyền thuốc Mặc dù vậy, việc ứng dụng công nghệ nano vào sản phẩm cũng gặp không ít khó khăn vì quá trình sản xuất tạo sản phẩm có thể ảnh hưởng đến các tính chất vốn có của hạt nano Nhằm phát triển một hướng ứng dụng mới trong việc sử dụng nano curcumin, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu tạo sản phẩm sữa bột có bổ sung nano curcumin làm thực phẩm chức năng; theo phương thức kết hợp nano curcumin với sữa gầy, lựa chọn các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất sữa bột sản phẩm bằng phương pháp sấy phun và ứng dụng sản phẩm lên mô hình chuột gây tổn thường gan bằng tác nhân oxy hóa mạnh Carbon Chloride (CCl4) để đánh giá hoạt tính sinh học của sản phẩm

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Curcumin và sự tổng hợp curcumin

Curcuma longa L (nghệ) được trồng rộng rãi ở khu vực nhiệt đới và bán

nhiệt đới trên thế giới Quốc gia sản xuất nghệ lớn nhất là Ấn Độ, nơi được mệnh danh là ngôi nhà chữa bệnh trong hàng chục năm [1] Tùy thuộc vào nguồn gốc và điều kiện đất đai, củ nghệ có chứa 2 – 9% curcuminoids Curcuminoid là một nhóm hợp chất bao gồm curcumin, demethoxycurcumin, bis-demethoxycurcumin và curcumin vòng Trong số đố, curcumin là thành phần chính và curcumin vòng là thành phần chiếm tỷ lệ rất thấp

Hình 2.1 Các vùng trên curcumin A) b-diketo hoặc keto-enol; B) phenolic; C)

alkele linker Một thế kỷ sau khi curcumin được tách chiết từ nghệ, bài báo đầu tiên về sự tổng hợp curcumin đã được công bố bởi Lampe vào năm 1913 [2] Phương pháp này bao gồm 5 bước bắt đầu từ carbomethoxyferuloyl chloride và ethyl acetoacetate Later Pabon (1964) đã công bố một phương pháp đơn giản hơn cho việc tổng hợp curcumin với hiệu suất cao bằng cách sử dụng acetyl aceton và aromatic aldehydes với xúc tác B2O3, trialkyl borate và n-butylamine với một vài thay đổi từ phương

pháp của Pabon [3] Rao và Sudheer đã đề nghị việc sử dụng trifluoroboronite và sản xuất curcuminoid trifluorboronites có thể thủy phân trong methol tại pH 5.8 để thu nhận curcumin

Trong các phương pháp này, bước chủ yếu nhất là phản ứng của diketones với aromatic aldehyde thích hợp Để ngăn chặn sự tham gia của diketone trong quá trình kết tụ Knoevenagel , boron đã được thêm vào Một số amine sơ cấp

2,4-và thứ cấp cũng đã được sử dụng làm chất xúc tác để cung cấp base cần thiết cho sự khử proton của nhóm alkyl trên diketone Để loại bỏ nước được sản sinh ra trong quá trình ngưng tụ, cần thiết phải sử dụng alkyl borate để ngăn chặn sự giảm hiệu suất của phản ứng Curcumin từ phản ứng này có thể được phân tích bằng cách rửa

và tủa, theo sau đó là sắc ký cột Phản ứng tổng hợp curcumin theo phương pháp

của Pabon được thể hiện theo Hình 2.2

Hình 2.2 Sự tổng hợp curcumin bằng phương pháp Pabon 2.2 Đặc tính cấu trúc của curcumin

Curcumin là một phân tử đối xứng, cũng được biết đến với tên gọi diferuloyl methane Tên IUPAC của curcumin là (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-

methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione, với công thức hóa học là C12H20O6, và khối lượng phân tử 368.38 Nó có 3 trạng thái tồn lại trong cấu trúc: 2 hệ thống vòng acromatic có chứa nhóm o-methoxy phenolic, liên kết với một carbon có chứa

1 tiêu phần α,β-unsaturated β-diketone [4]

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của curcumin

Nhóm diketo có trạng thái tautomer keto-enol, làm cho nó có thể tồn tại ở các dạng các nhau tùy thuộc vào môi trường [5] Ở trạng thái tinh thể, nó tồn tại ở

dạng cis-enol, được ổn định bởi sự cộng hưởng của liên kết hydrogen và cấu trúc

bao gồm 3 nhóm tiểu phần nội liên kết thông qua 2 liên kết đôi Trong hầu hết các dung môi không phân cực và ít phân cực trạng thái enol thường ổn định hơn so với trạng thái keton Do sự kết hợp kéo dài (extended conjugation), đám electron π sẽ

bao bọc quanh phân tử Trong dung dịch, nó tồn tại ở trạng thái isomer cis-trans nơi

mà dạng trans có 2 nhóm phenolic-methoxy trên phía đối diện của khung xương curcumin ổn định hơn so với dạng cis, nơi nhóm phenolic methoxy ở cùng bên của

khung xương Moment lưỡng cực của curcumin là 10.77 D Curcumin là một phân

tử kỵ nước với giá trị logP khoảng 3.0 Nó hầu như không tan trong nước và tan dễ dàng trong các dung môi phân cực như DMSO, methanol, ethanol, acetonitrile, chloroform, ethyl acetate,… Curcumin ít tan trong các cung môi hydrocarbon như cyclohexane và hexane Dãy hấp phụ của curcumin có 2 band hấp phụ mạnh, một ở vùng khả kiến với đỉnh cực đại từ 410 đến 430 nm và band còn lại ở vùng UV với đỉnh cực đại ở vùng 265nm Hệ số hấp thụ mole (molar extinction coefficient) của curcumin trong methanol là 55,000 dm3.mol-1.cm-1 ở 425nm Curcumin là một acid Brönsted yếu, với 3 proton không ổn định, và 3 giá trị pKaS đã được ước tính theo 3

điểm cân bằng proton (Hình 2.3) Các phương pháp công hưởng từ hạt nhân (NRM)

và quang phổ hấp phụ đã được sử dụng để ước tính giá trị pKa Giá trị pKa đầu tiên

nằm trong vùng 7.5 đến 8.5 làm thay đổi curcumin từ vàng sang đỏ Phản ứng hóa học và khả năng hòa tan của curcumin dạng anion trong vùng pH base được gia tăng và dạng curcumin này tan trong nước tốt hơn so với dạng trung tính Giá trị hấp thu cực đại của curcumin deproton hóa toàn bộ (màu đỏ) trong pH kiềm (>10)

là 467nm và hệ số hấp thụ mole là 53,000 dm3.mol-1.cm-1 Hiện nay vẫn còn những tranh cãi về một trong số 3 nhóm như là enolic OH hoặc phenolic OH là acid nhất Mặc dù việc tính toán cho thấy rằng enolic OH là nhóm acid nhất, nhưng sự thay đổi phổ hấp thu phụ thuộc vào pH gây khó khăn cho việc phân biệt giữa 2 proton

Từ nghiên cứu H-NRM của Borsari và cs (2002), giá trị pKa được đề nghị là 12.5 cho sự deproton hóa của proton enolic và giá trị pKa còn lại là 13.6 cho proton phenolic [6] Tuy nhiên, những giá trị proton enolic này lại rất khác nhau giữa các báo cáo thực hiện bằng những phương pháp khác nhau

Dung dịch nước của curcumin có thể được chuẩn bị bằng cách thêm các chất hoạt động bề mặt, lipid, albumins, cyclodextrins, biopolymers… Dung dịch mixen

sử dụng chất hoạt động bề mặt là thích hợp nhất cho việc chuẩn bị dung dịch curcumin nồng độ cao trong nước [5] Tuy nhiên, khi sử dụng các chất hoạt động bề mặt trong hệ thống sinh học, cần phải cẩn thận tiến hành các thí nghiệm đối chứng

vì chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hướng đến các nghiên cứu sinh học

2.3 Các phản ứng của curcumin

Curcumin có 3 nhóm chức năng phản ứng: 1 nhóm diketone, và 2 nhóm phenolic [7] Phản ứng hóa học quan trọng có liên quan đến hoạt tính sinh học của curcumin là phản ứng cho hydrogen dẫn đến sự oxi hóa của curcumin, phản ứng thêm nucleophilic thuận nghịch (irreversible nucleophilic addition) và không thuận nghịch (phản ứng Michael), thủy phân, phân hủy và phản ứng enzyme Tất cả những phản ứng trên đều có vai trò trong các hoạt động khác nhau của curcumin

2.3.1 Phản ứng với ROS

Curcumin đã được nhận thấy là một chất có khả năng dò tìm hầu hết các gốc oxy hóa tự do (ROS – Reactive Oxygen Species), một đặc tính làm cho curcumin trở thành một chất có hoạt động chống oxy hóa trong tế bào ROS có chứa cả chất oxy hóa gốc tự do và chất oxy hóa phân tử [8] Các chất oxy hóa tự do tham gia vào

việc thu nhận hydrogen và các phản ứng vận chuyển electron Tất cả 3 vị trí hoạt động của curcumin đều có thể bị oxy hóa do sự chuyển electron hay khử - nhận hydrogen Trong suất phản ứng của gốc tự do, hydrogen dễ bị lấy đi nhất của curcumin là từ -OH của nhóm phenolic, dẫn đến sự hình thành các gốc phenoxyl,

được ổn định cộng hưởng thông qua cấu trúc keton-enol (Hình 2.4)

Ví dụ như phản ứng của gốc tự do peroxy với curcumin làm sản xuất gốc tự

do curcumin phenoxyl, ít phản ứng hơn so với gốc peroxyl và do đó dẫn đến sự bảo

vệ khỏi stress oxy hóa do ROS [9] Phản ứng hồi phục gốc tự do phenoxyl thành curcumin bởi các chất chống oxy hóa tan trong nước như ascorbic acid, giúp curcumin trở về với hoạt tính chống oxy hóa ban đầu Phản ứng của curcumin với các gốc tự do superoxide đã được nhận thấy hiệu quả như các chất chống oxy hóa tan trong lipid và phản ứng dẫn đến sự phân hủy superoxide do xúc tác mà curcumin đóng vai trò như là một superoxide dismutase [10]

Hình 2.4 Các vị trí tấn công của curcumin với gốc tự do và sự khôi phục nhờ vào

Ascorbic acid

Trong số những phân tử oxy hóa, phản ứng với peroxynitrite, hydrogen peroxide là những phản ứng thường thấy nhất Trong một vài mô hình sinh học, curcumin đã được nhận thấy có khả năng bảo vệ tế bào dưới điều kiện dư thừa sự sản sinh các phân tử oxy hóa này Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu làm rõ

phản ứng hóa học và nhận diện các sản phẩm của phản ứng với các chất oxy hóa trên Một số nghiên cứu đã công bố cho rằng curcumin có thể ngăn chặn sự hình thành nitrotyrosine và đóng vai trò quan trọng như là một chất chống oxy hóa với stress oxy hóa gây ra bởi peroxynitrite

2.3.2 Phân hủy hóa học và biến dƣỡng

Curcumin trải qua sự phân hủy hóa học trong dung dịch hữu cơ-aquerous và khi pH tăng, sự phân hủy này lại càng tăng thêm, làm cho đây trở thành một vấn đề trong sự ứng dụng curcumin [11] Hầu hết các phenol trong dung dịch chuyển thành polymer theo thời gian, nhưng sự phân hủy curcumin không phải do thông qua nhóm phenol mà được nhận thấy thông quan cấu tử α,β-unsaturated β-diketo Trong dung dịch hòa tan, 90% curcumin phân hủy trong vòng 30 phút Tuy nhiên, phần trăm phân hủy lại giảm khi gia tăng nồng độ Một vài sản phẩm quan trọng đã được

nhận thấy khi curcumin bị phân hủy Chúng là

trans-6(4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexanal, ferulic aldehyde, ferulic acid,

feruloylmethane và vanillin (Hình 2.3) Mặc dù vẫn chưa được hiểu rõ, sự phân hủy

curcumin bởi sự thủy phân được tin là thông qua nhóm diketo Tuy nhiên, sự phân hủy lại được giảm đáng kể khi curcumin tương tác với lipid, liposome, albumin, cyclodextrin, cucurbituryl, chất hoạt động bề mặt, polymer và các đại phân tử [5]

Vì vậy, một số nghiên cứu đã sử dụng các môi trường nuôi cấy có chứa 10% FBS (Huyết thanh thai bò – Fetal Bovine Serum), cũng như trong máu của người để làm

ổn định curcumin

Curcumin trải qua sự phân hủy nhanh hơn khi phơi nhiễm với ánh sáng mặt trời [12] Và do đó, sự nhuộm màu do curcumin/nghệ có thể nhanh chóng bị mất màu khi tiếp xúc vơi ánh sáng mặt trời Các sản phẩm không màu do sự phân hủy bởi ánh sáng của curcumin là vanillin, ferullic acid, cũng như các phenol, cho thấy

sự phân bố các sản phẩm tương tự như trong sự phân hủy do hóa học trong dung dịch Sự phân hủy do ánh sáng này bao gồm sự hình thành trạng thái kích thích của curcumin Một vài báo cáo cho rằng curcumin tạo ra oxygen nguyên tử và các chất ROS khác khi tiếp xúc với ánh sáng và đây là nguyên nhân dẫn đến hoạt động quang học của curcumin Trong các trường hợp này, sự phân hủy curcumin khi bị

kích thích ánh sáng phải trải qua 3 trạng thái kích thích Các nghiên cứu về quang học cho rằng thời gian tồn tại của 3 trạng thái kích thích của curcumin chỉ trong vài micro giây, cho thấy sự phân hủy diễn ra rất nhanh và cạnh tranh với sự hình thành oxygen nguyên tử Sự phân hủy do ánh sáng được tăng cường nếu có sự hiện diện của hạt nano TiO2,và phương pháp này có thể được sử dụng để khử bỏ màu nghệ từ vải cotton

Sự biến dưỡng của curcumin trong cơ thể chuột và người hình thành các sản phẩm khác nhau [13] 2 con đường chính trong sự biến đổi curcumin đã được nhận diện, bao gồm liên kết-Oxygen và khử Sản phẩm của liên kết-Oxygen là curcumin glucuronide và curcumin sulfate Sản phẩm khử là tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin và octahydrocurcumin Các sản phẩm phụ khác là dihydrocurcumin glucuronide, tetrahydrocurcumin glucuronide, ferulic acid và dihydroferulic acid Sự hình thành của các sản phẩm này có thể được xác nhân bởi phương pháp phân tích HPLC và khối phổ Mặc dù một số nghiên cứu đã báo cáo rằng các quá trình này diễn ra do các phản ứng enzyme, nhưng chính xác enzyme nào tham gia vào các phản ứng này vẫn đang được tranh luận Sự sulfone hóa curcumin nhờ enzyme phenol sulfur transferase ở người và sự hình thành các sản phẩm khử thông qua alcohol dehydrogenase đã được đề xuất Khi so sánh các sản phẩm biến dưỡng này với các sản phẩm phân hủy, có thể thấy rằng sự phân hủy thủy phân đơn giản được ngăn chặn trong các dịch sinh học (biofuild) Vì sự phân hủy có thể diễn ra thông qua cấu trúc β-keto, nên có thể giả định rằng trong các hệ thống này, curcumin không ở dạng tự do mà lở dạng liên kết với một vài protein hoặc các đại phân tử sinh học khác; và khi mà nhóm diketo có thể tham gia vào khả năng liên kết với protein [7], sự phân hủy do thủy phân là không thể xảy ra Có thể nhận ra rằng phản ứng enzyme đặc trưng diễn ra nhanh hơn nhiều, và không cho phép sự phân hủy do thủy phân chậm diễn ra, do đó quá trình biến đổi tiếp theo không thể cạnh tranh với phản ứng chính Đây cũng chính là một thách thức cho các nhà hóa học để hiểu được sự khác biệt giữa phản ứng phân hủy và phản ứng biến dưỡng theo phương diện các thông số động học và cũng để nhận diện cơ chế thiết yếu trong những phản ứng này

2.3.3 Phản ứng thêm Nucleophillic (Nucleophillic addition reaction) của

curcumin

Nhóm α,β-unsaturated β-diketo của curcumin tham gia vào phản ứng thêm nucleophilic Phản ứng này, cũng được biết đến với tên gọi phản ứng Michael, diễn

ra giữa keton chưa bão hòa như là chất nhận điện tử và anion –OH, -SH, -SeH như

là chất cho Đây là một phản ứng thêm vào vị trí 1,4 (1,4-addition reaction) và sự hình thành sản phẩm hầu hết là không thuận nghịch, nhưng chúng có thể được trở thành thuận nghịch dưới điều kiện oxy hóa và base Vì anion chỉ hoạt động như một nucleophile, điều kiện pH là rất quan trọng để phản ứng này diễn ra Ở pH sinh lý,

cả -OH và –SH ở dạng proton hóa, nhưng –SeH lại có thể dễ dàng trải qua sự khử proton, và do đó hoạt động như một nucleophile tốt hơn Phản ứng này đã được báo cáo là rất hữu ích cho việc giải thích hóa học về mặt sinh học của curcumin trong tế bào sống [14] Sự quan tâm đặc biệt đang dành cho phản ứng thiol sinh học như là glutathione có chứa nhóm –SH Thật sự rằng liên kết curcumin-glutathione đã được phân tách trong hệ nhiều thống khác nhau Sự hình thành sản phẩm bổ sung này có thể dẫn đến sự suy yếu của glutathione nội bào ở mức độ tế bào, và do đó dẫn đến

sự giảm sút trong hàng rào chống oxy hóa Mặc dù một vài báo cáo đã cho rằng đây là một phản ứng thuận nghịch, nhưng dưới điều kiện tế bào sống, phản ứng này

là thuận nghịch hay không vẫn chưa được xác nhận Sự thuận nghịch của phản ứng

có thể được mong đợi dưới điều kiện oxy hóa và ở pH base

Hình 2.5 Phản ứng Michael của curcumin với protein thiol và selenol, X= S hoặc

Se

Phản ứng tương tự đã được quan sát trong suốt sự ức chế thioredoxin reductase bởi curcumin [14] Thioredoxin reductase là một enzyme chủ chốt liên quan đến hệ thống cân bằng oxy hóa-khử trong tế bào Trung tâm hoạt động của enzyme này là selenocysteine Hợp chất selenol của selenocysteine, trở thành một

nucleophile ở pH sinh lý, dễ dàng trải qua sự thêm vào vị trí 1,4 (1,4-addition recation) với curcumin, hình thành liên kết cộng hóa trị Phản ứng này được cho là

có tác dụng với sự ức chế enzyme reuductase thioredoxin bởi curcumin

Hydrogen methyl của nhóm diketo/enol của curcumin cũng có thể hoạt động như một nucleophile và tham gia vào phản ứng Michael với electrophile mạnh hơn, nhưng phản ứng này có thể không hiệu quả trong các hệ thống sinh học

Sản phẩm của quá trình biến đổi curcumin theo con đường hóa được cho là phản ứng ngưng tụ/cộng hợp tạo dẫn xuất semicarbazone và dẫn xuất oxime của curcumin [15] Các sản phẩm ổn định này được điều chế độc lập và được dùng để khảo sát hoạt động chống ung thư Trong hầu hết các nghiên cứu này, các báo cáo cho rằng các dẫn xuất này có độc tính với tế bào ung thư hơn so với curcumin tự do Kết quả này làm liên tưởng đến khả năng rằng liên kết giữa glutathione và curcumin cũng có thể hoạt động như là tác nhân gây độc và đóng góp và hoạt tính chống ung thư của curcumin

2.4 Hóa học về tương tác curcumin-ion kim loại

Curcumin tạo thành phức hợp bền vững với hầu hết các ion kim loại Nhóm α,β-unsaturated β-diketo của curcumin là một tác nhân chelate hóa rất tốt Trong thập kỷ gần đây, nhiều nghiên cứu đã được công bố về sự tạo thành phức hợp kim loại-curcumin Nhìn chung, curcumin tạo thành phức hợp với kim loại theo tỷ lượng (stoichiometry) 2:1 Sự phối hợp với kim loại của curcumin diễn ra thông qua nhóm

enol, nơi mà proton enolic được thay thế bởi ion kim loại và cấu tử o-methoxy

phenolic vẫn duy trì nguyên vẹn trong phức hợp Liên kết kim loại-oxygen được đặc trưng bởi tín hiệu quang phổ hồng ngoại IR ở 455 cm-1 và đỉnh carboxyl trong phức hợp cho thấy có một sự dịch chuyển nhỏ khoảng 10 cm-1 trong sự phối hợp với kim loại Tuy nhiên, sự dịch chuyển này còn phụ thuộc vào ái lực và sự ổn định động học nhiệt của phức hợp đích Trong trường hợp phức hợp bền, sự công hưởng của proton gắn trên liên kết đôi của chuỗi alkyl cho thấy sự dịch chuyển giảm đáng

kể, trong khi proton enolic cho thấy sự dịch chuyển không đáng kể trong phổ 1NRM [6], và phổ 13C-NRM cho thấy sự dịch chuyển tăng/giảm của carbon gần vị trí phối hợp Một số nghiên cứu đã được công bố về sự hình thành phức hợp của

H-curcumin với các kim loại chuyển vị như Fe3+, Mn2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+,

Ru2+, Re2+,… Phức hợp giữa curcumin với các ion kim loại không chuyển vị và với các ion hiếm trên trái đất như Al3+, Ga3+, Sm3+, Eu3+, Dy3+, Y3+, Se2+ và các oxide kim loại như VO2+ cũng đã được tổng hợp Cấu trúc và tính chất vật lý của các phức hợp này phụ thuộc vào bản chất của ion kim loại, cũng như tỷ lượng của điều kiện phản ứng, quyết định sự ổn định và sự phản ứng tạo thành phức hợp Phức hợp ổn định 2:1 của vài kim loại chuyển vị có thể được chuẩn bị bằng cách trộn theo các tỷ lượng curcumin và muối kim loại trong dung môi hữu cơ phù hợp và hòa trộn trong vài giờ, phức hợp có thể được phân tách như một chất kết tủa, và được tinh chế bằng sắc ký cột và tinh thể hóa

Hình 2.6 Cấu trúc của phức hợp 2:1 curcumin:kim loại

Phức hợp curcumin-kim loại không chỉ biến đổi tính chất hóa-lý của curcumin, mà còn ảnh hưởng đến phản ứng sinh học của kim loại Nhìn chung sự tạo tạo phức hợp với curcumin làm giảm độc tính của kim loại và một số phức hợp curcumin tạo phức hợp với kim loại như Cu2+, Mn2+ hoạt động như một chất chống oxy hóa-dựa-vào-kim loại mới [16] Bởi vì phản ứng chuyển electron thuận nghịch với ion superoxide, phức hợp Cu2+, Mn2+ với curcumin hoạt động như enzyme superoxide dismutase Phức hợp curcumin-kim loại đã cho thấy có hiệu quả tốt trên khía cạnh bệnh Alzheimers, curcumin có thể đi xuyên qua hàng rào mạch máu của não và chelate các ion kim loại gây độc cho neuron Những bệnh nhân Alzheimer khi sử dụng thường xuyên nghệ trong khẩu phần ăn có thể giảm tình trạng bệnh Curcumin tạo phức hợp ổn định với tất cả kim loại có liên quan đến bệnh Alzheimer [17] Sự tương tác của curcumin với Al3+, ion có liên quan ban đầu đến sự phát triển

của bệnh Alzheimer đã được công bố trên nhiều nghiên cứu Curcumin tạo thành 3 dạng phức hợp khác nhau với Al3+, phụ thuộc và tỷ lượng của phản ứng Phức hợp 1:1 Al3+-curcumin cho thấy ái lực gắn với DNA thấp hơn so với Al3+ tự do, làm giảm sự phát triển của Al3+ gây tác động đến bệnh Alzhermer [18] Phức hợp Zn2+-curcumin cho thấy có hiệu quả chống ung thư, bảo vệ hệ tiêu hóa và kháng trầm

cảm ở chuột [19] Hoạt động kháng viêm khớp in vivo cũng đã được báo cáo với 5

dạng phức hợp Au3+-curcumin[20] Phức hợp vanadyl-curcumin (VO(Cur)2)2+ cho thấy hoạt tính chống oxy hóa và kháng thấp khớp [21]

Nhờ vào các điện tích dương, hầu hết các phức hợp với kim loại của curcumin có thể gắn với DNA tích điện âm [22] Một số báo cáo cho rằng do sự gắn kết này, phức hợp curcumin-kim loại gây tổn hại đến DNA và do đó cho thấy hoạt động tiền-oxy hóa của chúng Theo đó, phức hợp curcumin-kim loại cũng chó thể được khám phá như một tác nhân kháng khối u tốt hơn so với tự bản thân curcumin [23] Do đó, hiện nay vẫn còn những tranh cãi về việc phức hợp curcumin-kim loại hoạt động trong hệ thống sinh học như là một chất chống oxy hóa hay tiền-oxy hóa,

vì có một số phức hợp hoạt động như chất chống oxy hóa, nhưng một số khác lại hoạt động như chất tiền-oxy hóa Hoạt động chống oxy hóa/tiền-oxy hóa của phức hợp kim loại phụ thuộc vào vài yếu tố như là bản chất của ion kim loại, cấu trúc, sự ổng định và điện thế hóa điện của phức hợp Đánh giá về mặt sinh học của các phức

hợp này rất khó được thực hiện trong các hệ thống in vivo vì tính sinh khả dụng

(bioavailability) của hầu hết các phức hợp curcumin-kim loại là rất thấp Nhưng

một điều chắc chắn là phức hợp kim loại với curcumin in vivo đóng vai trò quan

trọng trong việc giảm độc tính gây ra bởi kim loại

2.5 Sự vận chuyển curcumin vào trong cơ thể và tính chất sinh học của

curcumin

2.5.1 Vận chuyển qua đường miệng

Hầu hết các nghiên cứu về curcumin được vận chuyển thông qua đường miệng (oral delivery) ở người và động vật Curcumin được vận chuyển qua đường miệng cho thấy một vài hiệu quả sinh học như là chống oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư, kháng tiểu đường,… Gần đây, nghiên cứu trên liều dùng 3mg curcumin

qua đường miệng cho thấy sự giảm stress oxy hóa [24] Sự bổ sung curcumin làm giảm stress oxy hóa gây ra bởi quá trình tập thể dụng bằng cách tăng khả năng chống oxy hóa trong máu [25] Curcumin được sử dụng qua đường miệng làm giảm các cytokine gây viêm như TNF (Tumour Necrosis Factor), COX-2 (cyclooxygenase-2), iNOS (inducible nitric oxide synthase) ở chuột cho thấy khả năng kháng viêm và ức chế ung thư ruột kết gây ra bởi dextran sodium sulfate [26] Các thử nghiệm lâm sàng cũng cho thấy sự hấp thu curcumin qua đường miệng có thể ức chế các phân tử gây viêm [27]

Curcumin cho thấy nhiều tác dụng có lợi trong một số loại ung thư ở bệnh nhanh Gần đây, nghiên cứu sử dụng 6.0 g curcumin hàng ngày trong suốt quá trình

xạ trị làm giảm tình trạng viêm da do phóng xạ ở bệnh nhanh ung thư vú [28] Trên

mô hình động vật, việc hấp thu qua đường miệng của curcumin cho thấy khả năng

ức chế ung thư phổi [29], da [30], đầu và cổ [31], miệng [32], ung thư tế bào gan [33], u tuyến vú, ung thư máu [34] Điều trị bằng cách cho hấp thu curcumin qua đường miệng cũng được nhận thấy hiệu quả trong bệnh tiểu đường Curcumin làm giảm sự không dung nạp glucose được cảm ứng bằng khẩu phần ăn giàu béo, và sự tổn thương do stress oxy hóa đến cơ [35] Curcumin cũng cải thiện quá trình làm lành vết thương ở chuột bị tiểu đường [36]

2.5.2 Vận chuyển qua tiêm dưới bụng

Tiêm dưới bụng (Intraperitoneal – IP) là tiêm một cơ chất vào trong khoang bụng Tiêm IP thường được sử dụng ở động vật hơn ở người Trong trường hợp sử dụng IP, tính sinh khả dụng của curcumin sẽ cao hơn so với qua đường ăn uống Curcumin được vận chuyển qua IP đã cho thấy khả năng ức chế chống lại triệu chứng nở to tim gây ra bởi lipopolysaccharide ở chuột [37] Nó cũng có khả năng làm giảm kích thước của khối u thần kinh đêm được cấy trong chuột nude và kéo dài thời gian sống của động vật [38] Một số nghiên cứu khác cho thấy curcumin được tiêm IP ngăn cản sự hình thành và phát triển của khối u, làm giảm các tế bào

ức chế tủy xương từ lách, máu và các mô u, làm giảm mức độ IL-6 trong huyết thanh và mô u ở mô hình người và chuột [39] Curcumin cũng được cho thấy làm cải thiện tình trạng tổn thương do xuất huyết não bằng cách ngăn chặng sự tổng

thường đến hàng rào máu-não trung gian qua metallo-proteinase và u não [40] Bên cạnh đó, curcumin cũng có tác dụng với bệnh hen suyễn bằng cách làm giảm sự phát triển của viêm và đáp ứng quá mức của cơ thể thông qua việc ức chế sự hoạt hóa con đường truyền tín hiệu NF-κB trong các tế bào phổ bị hen suyễn [41] Curcumin thông qua IP cũng có thể làm giảm quá trình tiến triển hình thành xơ sau gian đoạn viêm gây ra bởi thuốc bleomycin [42]

2.5.3 Vận chuyển qua tiêm tĩnh mạch

Rất nhiều công trình nghiên cứu cho thấy cucumin được tiêm tĩnh mạch (Intravenous – IV) có tính chất chống ung thư ở mô hình động vật Kim và công sự (2011) đã cho thấy rằng curcumin có hiệu quả chống khối u ở mô hình chuột ung thư ruột kết Họ cũng cho thấy rằng hạt nano albumin huyết thanh người (HAS) khi kết hợp với curcumin có hiệu quả trị liệu tốt hơn so với curcumin tự do mà không gây ra độc tính nào [43] Một vài nghiên cứu khác cho thấy rằng curcumin bao gói trong liposom làm ức chế sự phát triển của khối u đầu và cổ ở mô hình chuột và bằng ức chế con đường truyền tín hiệu NF-κB mà không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của con đường truyền tín hiệu pAKT [44] Shi và cs (2012) cũng cho thấy rằng liposomal curcumin khi kết hợp với phóng xạ làm cải thiện khả năng ức chế sự phát triển của khối u ở mô hình chuột ung thư phổi [45] Khả năng ức chế của curcumin khi kết hợp với trị liệu cisplastin là thông qua sự ức chế protein IKKβ ở tế bào chất

và nhân, làm ức chế con đường truyền tín hiệu gây ung thư NF-κB [46]

Một số dẫn xuất khác của curcumin khi liên kết với hormone LHRH (luteinizing hormone releasing hormone), [Dlys(6)]-LHRH-curcumin, khi tiêm qua tĩnh mạch làm giảm khối lượng và thể tích của khối u; trong khi curcumin tự do không có khả năng trên mô hình chuột ung thư tuyến tụy [47] Curcumin được bao gói với monomethoxy poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone)(MPEG-PCL) mixen cũng cho thấy hiệu quả chống ung thư mạnh hơn so với curcumin tự do, khi mixen curcumin/MPEG-PCL được tiêm qua da làm ức chế hình thành ung thư ruột

kết in vivo [48]

2.6 Sự hấp thu curcumin ở các cơ quan trong cơ thể

Sự hấp thu và phân bố curcumin ở các mô trong cơ thể đóng vai trò quan trọng trong hạt động sinh học của nó Mặc dù hầu hết curcumin được biến dưỡng trong gan và ruột, nhưng một lượng nhỏ curcumin vẫn được phát hiện duy trì trong các cơ quan Nghiên cứu của Ryu và cs (2006) đã cho thấy tính sinh khả dụng của curcumin ở các cơ quan khác nhau trong chuột [49] Tiêm qua tĩnh mạch [18F]-curcumin ở chuột được nhận thấy sự tích tụ kéo dài trong gan và lách trong khi sự hấp thu trong phổi lại giảm Não hấp thu [18F]-curcumin sau 2 phút tiêm, và hoạt tính phóng xạ nhanh chóng được loại bỏ trong não sau 30 phút Nghiên cứu sử dụng [18F]-curcumin và [18F]-piperine ở chuột cũng đã cho thấy sự gia tăng hấp thu [18F]-curcumin trong não 48% so với không có sử dụng piperine, mặc dù sự hấp thu ở các

cơ quan khác gần như không khác biệt Một nghiên cứu khác cho thấy rằng sự phân

bố curcumin trong ruột, lách, gan và thận lần lược là 177.04, 26.06, 26.90, 7.51 µg/g sau 1 giờ tiêm dưới bụng curcumin (0.1 g/kg) ở chuột; và chỉ có dạng vết được phát hiện trong não sau 1 giờ [50]

Nghiên cứu của Marczulo và cs (2009) cho thấy lượng curcumin phân bố nhiều hơn ở động vật [51] Trong nghiên cứu này, chuột được cho sử dụng curcumin qua đường miệng (340 mg/kg) và sau 2 giờ, sự phân bố ở các mô đã được đánh giá Curcumin được tìm thấy trong huyết tương (16.1 ng/mL), nước tiểu (2.0 ng/mL), ruột (1.4 mg/g), gan (3,671.8 ng/g), thận (206.8 ng/g), và tim (807.6 ng/g) Một nghiên cứu khác đánh giá sự phân bố của curcumin trong các mô bằng cách sử dụng thuốc có đánh dấu phóng xạ tritium Nghiên cứu này cho thấy rằng phóng xạ được phát hiện ở máu, gan, và thận lượng 400, 80 hoặc 10 mg [3H]-curcumin [52] Với lượng 400 mg, lượng sản phẩm gắn phóng xạ tồn tại trong mô sau 12 ngày Phần trăm curcumin được hấp thu (60 – 66%) vẫn duy trì ổn định bất kể liều ượng

sử dụng cho thấy rằng việc sử dụng curcumin với lượng nhiều không làm gia tăng hiệu quả hấp thu

2.7 Sự biến dƣỡng curcumin trong cơ thể

Rất nhiều nghiên cứu đã đánh giá rằng curcumin trải qua quá trình biến dưỡng ở các dạng khác nhau sau khi được sử dụng qua đường miệng ở động vật

Bởi vì sự biến dưỡng này, curcumin đã được cho rằng có tính sinh khả dụng thấp sau khi sử dụng ở động vật Tính sinh khả dụng của curcumin có thể thấp ở người, như đã được đề cập đến ở nhiều người cứu Sau khi được sử dụng, curcumin trải qua sự biến dưỡng O-conjugation thành curcumin glucuronide và curcumin sulfate;

và được khử thành tetrahydrocurcumin, hexahydrocurcumin, octa hydrocurcumin,

và hexahydrocurcuminol ở chuột in vivo (Hình 2.6) Curcumin bị khử cũng có thể

trải qua quá trình glucuronide hóa thành curcumin glucuronide, glucuronide, tetrahydrocurcumin-glucuronide, và curcumin sulfate Holder và cs (1978) cho rằng chất biến dưỡng chính ở mật của curcumin là glucuronide của tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin ở chuột Chất biến dưỡng phụ là dihydroferulic acid cùng với dạng vết của ferulic acid

dihydro-curcumin-Hình 2.7 Sự biến dưỡng của curcumin

Rất nhiều nghiền cứu cho rằng chất biến dưỡng của curcumin có hoạt tính chất oxy hóa, kháng viêm, và kháng ung thư Tetrahydrocurcumin (THC) ức chế quá trình peroxide hóa lipid gây ra bởi phóng xạ [53] và cảm ứng các enzyme chống oxy hóa in vitro [54] Một chất biến dưỡng khác là hexahydrocurcumin bị giảm khả năng ức chế sự biểu hiện của COX-2 so với curcumin [55] Hexahydrocurcumin cũng cảm ứng làm ngừng chu trình tế bào trong dòng tế bào ung thư ruột kết SW480 [56] Pan và cs (2000) cũng đã cho thấy một chất biến dưỡng khác là octahydrocurcumin có hoạt tính ức chế con đường truyền tín hiệu sinh ung thư NF-

κB giảm đi so với curcumin [57] Tuy nhiên, chất biến dưỡng này lại có hoạt tính dò

tìm gốc tự do lại cao hơn so với curcumin [58] Curcumin sulfate lại cho thấy có hoạt tính sinh học kém hơn curcumin trong việc ức chế viêm gây ra bởi prosraglandin E2 [55] Từ những nghiên cứu trên, có thể thấy rằng sự biến dưỡng curcumin tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau, và chúng có hoạt tính sinh học rất khác so với curcumin

2.8 Tính sinh khả dụng của curcumin

Có rất nhiều nghiên cứu cho thấy curcumin có tính chất rất kém về mặt hấp thu, phân bố sinh học, biến dưỡng và tính sinh khả dụng (bioavailability) Vì thế rất nhiều nghiên cứu hiện nay vẫn đang tiếp diễn nhằm tìm ra phương pháp tốt nhất để khắc phục vấn đề trên Để gia tăng tính sinh khả dụng, thời gian tồn tại lâu hơn, và kháng với các biến đổi do biến dưỡng, một số công thức biến đổi curcumin đã được tiến hành như là phức hợp với hạt nano, liposome, mixen, và phospholipid

2.8.1 Curcumin chƣa đƣợc biến đổi (unformulated curcumin)

Các nghiên cứu về dược học cho thấy rằng curcumin là một chất an toàn và hiệu quả trong việc điều trị và ngăn ngừa rất nhiều bệnh ở người Tuy vậy, curcumin lại có tính sinh khả dụng và hòa tan yếu trong môi trường nước Nghiên cứu của Wahlstrom và Blennow vào năm 1978 cho thấy rằn việc sử dụng qua đường miệng 1g/kg curcumin ở chuột Sprague-Dawley chỉ cho một lượng không đáng kể curcumin trong máu và điều này là do sự hấp thụ curcumin kém ở ruột [59] Trong một nghiên cứu khác của Shoba và cs (1998), curcumin được sử dụng qua đường miệng với liều 2g/kg ở chuột có nồng độ curcumin trong huyết thanh đạt cực đại là 1.35±0.23 µg/mL sau 0.83 giờ; trong khi đó ở người với liều tương tự lại không phát hiện được hoặc phát hiện với nồng độ cực kỳ thấp trong huyết thanh (0.006±0.005 µg/mL sau 1 giờ) [60] Sử dụng curcumin với liều 500 mg/kg qua đường miệng với chuột di chuyển tự do cho thấy sự hấp thu và tính sinh khả dụng của curcumin chỉ là 1% [61]

2.8.2 Kết hợp với Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)

Nhằm cải thiện dược động lực học của curcumin với sự tăng cường tính sinh

khả dụng, việc kết với của curcumin với PLGA đã được tiến hành Nghiên cứu in

vitro cho thấy rằng PLGA-curcumin có khả năng nhanh chóng và hiệu quả được

hấp thu hơn so với curcumin tự do Tiêm dưới da curcumin hoặc PLGA-curcumin (liều 2.5 mg/kg) cho thấy PLGA-curcumin có nồng độ trong huyết thanh gấp 2 lần

so với curcumin tự do [62] Các hạt nano PLGA và PLGA-PEG khi kết hợp với curcumin làm gia tăng thời gian bán hủy tương ứng 4 và 6 giờ, và nồng độ curcumin tăng 2.9 và 7.4 lần Khi so sánh với huyền phù curcumin trong nước, hạt nano PLGA và PLGA-PEG gia tăng tính sinh khả dụng của curcumin tương ứng 15.6 và 55.4 lần [63]

Sau khi sử dụng qua đường miệng, hạt nano PLGA-curcumin làm gia tăng tính sinh khả dụng 5.6 lần và có thời gian bán hủy dài hơn so với curcumin tự do

Sự cải thiện tính sinh khả dụng này là do sự cải thiện về tính chất hòa tan trong nước, tốc độ hấp thu trong ruột nhanh hơn, và gia tăng thời gian tồn tại trong khoang ruột [64] Nghiên cứu của Yallapa và cs (2010) cũng cho thấy rằng PLGA-curcumin cải thiện 2 – 6 lần sự hấp thu của tế bào khi tiến hành trên dòng tế bào buồng trứng A2780CP kháng thuốc cisplatin và dòng tế bào ung thư vú di căn MDA-MB-231 khi so sánh với curcumin tự do [65]

2.8.3 Bao gói trong liposome

Một công thức khác được thiết kế nhằm cải thiện tính sinh khả dụng của curcumin là liposomal curcumin (LC) Liposome được cho là một chất mang dược hiệu quả do khả năng của chúng giúp hòa tan các hợp chất kỵ nước và thay đổi tính chất dược động lực học Ở chuột sử dụng LC qua đường miệng, tính sinh khả dụng curcumin đã được nhận thấy Thêm vào đó, tốc độ và sự hấp thu nhanh hơn của curcumin cũng được nhận thấy khi so sánh với các dạng công thức khác Sử dụng

LC qua đường miệng cho giá trị nồng độ trong huyết thanh cao hơn và thời gian tồn tại nhiều hơn, cũng như có giá trị AUC (Area Under the drug Concentration) cao hơn [66]

Công thức kết hợp giữa liposome phủ với silica và kết hợp với curcumin (CUR-SLs) và liposomal curcumin cho thấy tính sinh khả dụng của CUR-SLs và liposomal curcumin gia tăng tương ứng 7.76 và 2.35 lần so với huyền phù curcumin

Sự bao phủ silica làm cải thiện độ ổn định của liposome và CUR-SLs cho thấy sự gia tăng 3.31 lần tính sinh khả dụng so với liposomal curcumin [67] Một nghiên

cứu khác cho thấy rằng curcumin kết hợp với liposome bao phủ bởi N-trimethyl chitosan chloride (TMC-LC) cho thấy các thông số dược động lực học khác biệt và

sự cải thiện tính sinh khả dụng, khi so sánh với liposomal curcumin và huyền phù curcumin Liposomal curcumin và TMC-LC cho thấy những đặc tính giống nhau

trong điều kiện in vitro [68]

2.8.4 Bao gói trong Cyclodextrin

Cyclic Oligosaccharide (CD) đã được sử dụng để cải thiện việc vận chuyển

và tính sinh khả dụng của curcumin thông qua việc bao gói curcumin Curcumin bao gói trong CD (CDC) cho khả năng hấp thu vào tế bào cao hơn và có thời gian tồn tại cao hơn trong dòng tế bào ung thư khi so sánh với curcumin tự do, cho thấy rằng CDC có các đặc tính ưu việt hơn [69] Thêm vào đó, sự cải thiện tính thấm của curcumin thông qua mô da của động vật cũng được nhận thấy trên curcumin bao gói trong CD Do đó, những nghiên cứu này cho thấy rằng CDC có thể cải thiện tính sinh khả dụng in vitro và in vivo và hiệu quả hóa trị khi so sánh với curcumin tự do

2.8.5 Kết hợp với piperine

Bên cạnh những hợp chất tự nhiên trên được sử dụng để gia tăng tính sinh khả dụng của curcumin, một trong số đó là piperine, một thành phần chính của tiêu đen, được biết đến có khả năng làm tăng tính sinh khả dụng của curcumin Hiệu quả của piperine lên dược động lực học của curcumin đã được cho thấy cao hơn ở người

so với ở chuột Ở người, tính sinh khả dụng của curcumin được gia tăng 2000% trong 45 phút sau khi được sử dụng cùng với piperine; trong khi ở chuột việc sử dụng 20 mg/kg piperine cùng với 2 g/kg curcumin chỉ làm gia tăng nồng độ curcumin trong huyết thanh 154% trong thời gian ngắn khoảng 1 – 2 giờ sau khi sử dụng Nghiên cứu này cho thấy rằng khi sử dụng, piperine cải thiện nồng độ, sự hấp thu và tính sinh khả dụng của curcumin ở cả chuột và người mà không có tác dụng phụ nào [60] Một nghiên cứu khác cho thấy rằng việc sử dụng 20 mg/kg piperine

và 2 g/kg curcumin qua đường miệng cải thiện tính sinh khả dụng của curcumin 20 lần ở chuột động kinh [70] Sự hấp thu curcumin ở ruột đã được nhận thấy là cao hơn khi sử dụng cùng với piperine, và sự tồn tại của curcumin trong mô cũng được

kéo dài [71] Dựa vào đó, hạt nano curcumin-piperine cũng như nano curcumin cũng được được nghiên cứu nhằm cải thiện các tính chất của curcumin [72]

2.8.6 Nano curcumin

Việc định nghĩa hạt nano rất đa dạng trong các lĩnh vực Trong lĩnh vực hình ảnh và chất bán dẫn, hạt nano được quy định có đường kính bé hơn 100µm [73], nhưng trong công nghiệp dược, hạt nano lại được định nghĩa là có kích thước từ vài nanometer đến 1µm [74] Kích thước hạt giảm, cùng với bề mặt tiếp xúc lớn hơn làm tăng tốc độ hòa tan của các hạt nano, và do đó cải thiển tính sinh khả dụng của chúng [75] Để chuẩn bị các dạng sản phẩm ở dạng rắn có thể sử dụng được, huyền phù nano cần phải được sấy khô và được chế biến sau đó (như dạng thuốc nén hoặc thuốc con nhộng) [42] Quá trình sấy các hạt nano có thể gây tress lên cấu trúc hạt

và dẫn đến sự kết tụ Tuy nhiên, các hạt kết tụ trong quá trình sấy phun có thể nhanh chóng phân tán và trở về kích thước cũ trong một khoảng thời gian ngắn khi hòa vào nước [76, 77]

Hệ thống hạt kích thước nano có nhiều ích lợi đa khía cạnh trong sự dẫn truyền thuốc Chúng có thể được sử dụng để 1) cung cấp cho tế bào hoặc mô sự dẫn truyền thuốc; 2) cải thiện tính khả dụng sinh học qua đường ăn uống [78, 79]; 3) làm giảm tác dụng phụ của thuốc hoặc gene trong mô đích [80]; 4) mang nhiều nhóm chức năng trên bề mặt hạt nano [81]; 5) hòa tan thuốc cho tiêm tĩnh mạch; 6) cải thiện tính ổn định của tác nhân trị liệu (như là chống lại sự biến đổi do pH hoặc

sự phân hủy enzyme); và 7) kiểm soát tốc độ giải phóng thuốc cho mô đích [82, 83]

Các hạt nano dựa trên công thức hình thành từ nhũ tương nano đã được

chuẩn bị nhằm cải thiện tính chất hòa tan của curcumin Nghiên cứu ex vivo cho

thấy rằng sự giải phóng curcumin từ nhũ tương nano cao hơn rất nhiều so với huyền phù curcumin Điều này cho thấy sự cải thiện tính hòa tan của curcumin ở trong nước [84] Một nghiên cứu khác cho thấy rằng sự bao gói curcumin thành hạt nano hydrogel làm cho sự phân tán curcumin trong nước đồng nhất hơn so với dạng tự do của curcumin Bên cạnh đó, đặc tính giải phóng in vitro cho thấy 95% curcumin được giải phóng từ hệ thống hạt nano-micro curcumin [85]

Dược động lực học của curcumin và các công thức nhũ tương curcumin khác

có chứa 20% curcumin cho thấy sự gia tăng 10 lần giá trị AUC trong 24 giờ và sự gia tăng 40 lần nồng độ khi so sánh với curcumin tự do ở chuột [86] Hạt nano apotransferrin chứa curcumin cho thấy lượng curcumin được giải phóng tăng đáng

kể, khoảng 50%, và vẫn duy trì trong huyết thanh trong suốt 6 giờ Ngược lại, curcumin hòa tan trong tế bào chất (sol-curcumin) đạt giá trị tối đa là 2 giờ Các hạt nano keo (colloidal), với tên gọi “theracurmin”, cho thấy giá trị AUC sau khi sử dụng qua đường miệng tăng hơn 40 lần so với bột curcumin ở chuột Ở người khỏe mạnh, liều dùng theracurmin 30 mg qua đường miệng làm tăng 27 lần giá trị AUC

so với bột curcumin [87] Nghiên cứu của Cheng và cs (2013) cho thấy rằng nano curcumin có nồng độ cao hơn trong huyết tương và có giá trị AUC tăng 6 lần so với curcumin bình thường Những dẫn chứng trên cho thấy rằng nano curcumin có khả năng cải thiện tính sinh khả dụng của curcumin ở cả động vật và người

Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu đề nghị các phương pháp khác nhau nhằm cải thiện tính sinh khả dụng của curcumin, nhưng hầu hết các phương pháp đó đều đòi hỏi kỹ thuật cao, thiết bị tốn kém, chi phí vận hành cao và giá thành sản phẩm đắc Việc sử dụng nano curcumin đang được quan tâm sử dụng bởi những đặc tính tương tự của nó trong việc cải thiện tính chất của curcumin, nhưng lại dễ dàng được sản xuất và có giá thành rẻ hơn rất nhiều

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu

 Hỗn hợp nano-curcumin (NC) (420 nm, 4g/L) trong nước cùng với chất nhũ hóa lecithin (50 g/L) được thu nhận từ Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, trường đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

 Sữa gầy được mua từ công ty TNHH Tín Phi 535/15B Nguyễn Tri Phương, P8, Q10 Tp Hồ Chí Minh

 Curcumin (95% tinh sạch) có nguồn gốc từ Ấn Độ, được nhập khẩu từ công

ty Thiện Nguyên (Việt Nam)

 Giấy lọc Quantitative filter paper (Hangzhou special paper industry Co., Ltd, Trung Quốc)

 Flavourzyme 1000 LAPU/g (Novozymes, Đan Mạch)

 Aceton (Trung Quốc)

3.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

 Thiết bị đồng hóa hai cấp (APV, Đan Mạch)

 Thiết bị sấy phun Labplant SD06 Spray Dryer (Keison Products company, UK)

 Cây sấy ẩm MF-50 Moisture Analyzer (A&D company, Nhật Bản)

 Máy đo quang phổ hồng ngoại

 Máy ly tâm

3.3 Quy trình sản xuất sữa bột bổ sung nanocurcumin

Hình 3.1 Quy trình sản xuất sữa bột bổ sung nanocurcumin

Sữa gầy được pha loãng với nước cất và phối trộn với nhũ tương curcumin theo các tỉ lệ khác nhau để thu nhận 1 L hỗn hợp Hỗn hợp này được đồng hóa với thiết bị đồng hóa hai cấp (300 bar và 60 bar, tương ứng với cấp 1 và cấp 2)

nano-và tiến hành sấy phun (nhiệt độ đầu nano-vào 180oC, áp lực đầu phun 3 bar, lưu lượng 10 vòng/phút) để tạo sản phẩm sữa bột bổ sung nano curcumin Các thông số công nghệ trong quá trình sản xuất được thay đổi tùy thuộc vào điều kiện thí nghiệm

Nhũ tương Nano curcumin Sữa gầy

Pha loãng

Phối trộn

Đồng hóa

Bột sản phẩm Sấy phun

Chọn tỷ

lệ phối trộn

Hiệu suất thu hồi curcumin Hiệu suất thu hồi chất khô Khả năng hòa tan của curcumin Khả năng hòa tan của sản phẩm Hiệu quả tương tác protein-curcumin

Hiệu suất thu hồi curcumin Hiệu suất thu hồi chất khô Khả năng hòa tan của curcumin Khả năng hòa tan của sản phẩm Hiệu quả tương tác protein-curcumin

Nồng độ enzyme ALT Nồng độ albumin Đánh giá mô học

3.5 Xây dựng đường chuẩn curcumin và định lượng curcumin

Phương pháp định lượng curcumin đươc tiến hành theo Wang và cs (2009) với một số thay đổi [88] Curcumin trước tiên được dựng đường chuẩn bằng cách pha loãng curcumin với các thể tích aceton khác nhau để thu các dung dịch có nồng

độ xác định; sau đó các dung dịch được xác định độ hấp thu tại bước sóng 425nm Giá trị OD425nm theo các nồng độ curcumin được đồ thị hóa để thu nhận đường chuẩn curcumin

Hình 3.3 Đường chuẩn curcumin 3.6 Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi curcumin

Do sự tương tác mạnh của curcumin và protein trong sữa [89-91], quá trình

xử lý với protease đã được tiến hành để giải phóng hoàn toàn curcumin Dung dịch

30 LAPU Flavourzyme (Novozymes, Đan Mạch) trong nước được bổ sung vào 0.5g bột sản phẩm và ủ trong 1 h tại 50oC Hỗn hợp sau đó được ly tâm ở 5000 rpm trong

10 phút và loại bỏ dịch nổi 40 mL aceton được bổ sung vào phần cặn ly tâm, tiến hành vortex để thu nhận dung dịch đồng nhất và xác định giá trị OD425nm Hiệu suất thu hồi curcumin (CY – Curcumin yield) được xác định theo công thức:

( )

với mC1 là hàm lượng curcumin trong 1 g sản phẩm; mC2 là lượng curcumin trong hỗn hợp trước sấy phun; mP là khối lượng bột sản phẩm (g)

3.7 Xác định khả năng hòa tan của curcumin và bột sản phẩm

Khả năng hòa tan của curcumin được tiến hành theo phương pháp của Donsì

và cs [92] Theo đó, becher chứa 0.5 g bột sản phẩm được bổ sung nhẹ nhàng 5 mL