Khảo sát quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase từ tuyến tụy lợn và lipase từ candida rugosa

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng những chế phẩm enzyme thương mại để thực hiện các phản ứng thủy phân, thay thế cho các loại xúc tác hóa học đang trở nên phổ biến bởi vì điều kiện phản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Phan Ngọc Hòa

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

MSHV: 7140464 Nơi sinh: Hồ Chí Minh

Họ và tên học viên: Hà Huy Khoa

Ngày, tháng, năm sinh: 18/04/1991

Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm Mã số: 60540101

I TÊN ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN DẦU DỪA BẰNG ENZYME

LIPASE TỪ TUYẾN TỤY LỢN VÀ LIPASE TỪ CANDIDA RUGOSA

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Khảo sát nguyên liệu dầu dừa và enzyme lipase tuyến tụy lợn và lipase từ Candida

rugosa

2 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase bao

gồm: nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH

3 Quy hoạch thực nghiệm quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase

4 Khảo sát các thông số động học của enzyme và quá trình thủy phân dầu dừa sử

dụng enzyme lipase

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 28/1/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 11/7/2016

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Phan Ngọc Hòa

Em xin được cảm ơn các anh chị, bạn bè cùng học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm đã luôn quan tâm giúp đỡ em trong thời gian thực hiện luận văn

Con xin được cảm ơn ba mẹ và gia đình luôn ở bên cạnh và động viên con vượt qua những trở ngại trong việc học tập và cuộc sống

Xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc nhất

TP Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 6 năm 2016

Học viên thực hiện

Hà Huy Khoa

ABSTRACT

In this study, the hydrolysis of coconut oil using two kinds of lipase, one was Porcine

Pancreas Lipase (PPL), and other was lipase from Candida Rugosa (LCR), was

investigated The Response Surface Methodology (RSM) was then used to optimize the conditions of hydrolyzed reaction for maximizing the specific enzyme activity For PPL, the hydrolysing conditions included pH 8.0, temperature of 40°C and enzyme concentration of 0.01% w/w Under these conditions, the enzyme activity reached to 2.425,2 ±59,1U/mg protein For LCR, the hydrolysing conditions included

pH 7.5, temperature of 40°C and enzyme concentration of 0.1% w/w The enzyme activity in this case reached to 27.032 ± 122,9 U/mg protein

The coconut oil hydrolysis reactions kinetic at optimal conditions was determined The reaction kinetic equation was 𝑃𝑠𝑝 = 12,6 × (1 − 𝑒−0.035𝑡) in case PPL and was

𝑃𝑠𝑝 = 112,4 × (1 − 𝑒−0,04𝑡) in case LCR The enzyme lipase kinetics with fivedifferent substrate concentrations were also investigated The results for PPL included km constant of 401,34 ± 6,82, maximum reaction rate vmax of 0.7 ± 0.015 and kcat constant of 0.0014 ± 0.000032 The results for LCR were 38,34 ± 3,4; 4,86 ± 0.034 and 0.0113 ± 0.000079, respectively

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Luận văn nghiên cứu về quá trình thủy phân dầu dừa sử dụng hai loại enzyme lipase: Porcine Pancreas Lipase từ tụy tạng heo (PPL) và lipase thu nhận từ nấm men

Candida Rugosa (LCR) Phương pháp hoạch định thực nghiệm đáp ứng bề mặt

(RSM) đã được sử dụng để xác định điều kiện thủy phân thích hợp để hoạt độ riêng của các loại lipase đạt cao nhất Đối với PPL, các điều kiện thuỷ phân thích hợp bao gồm pH 8,0, nhiệt độ 40oC và nồng độ enzyme 0,01% w/w Với những điều kiện phản ứng này, hoạt độ riêng của PPL đạt giá trị 2.425,2 ± 59,1 U/mg protein Đối với LCR, các điều kiện thuỷ phân thích hợp lần lượt là pH 7,5; nhiệt độ 40oC và nồng độ enzyme 0,1% w/w Với những điều kiện này, hoạt độ riêng của LCR đạt giá trị 27032 ± 122,9 U/mg protein

Động học phản ứng thủy phân dầu dừa tại điều kiện tối ưu đã xác định ở trên đã được thực hiện Phương trình động học phản ứng thủy phân với enzyme PPL là 𝑃𝑠𝑝 =12,6 × (1 − 𝑒−0.035𝑡) và với enzyme LCR là 𝑃𝑠𝑝 = 112,4 × (1 − 𝑒−0,04𝑡) Động họcenzyme lipase ứng với những nồng độ cơ chất khác nhau cũng đã được khảo sát Kết quả thu được đối với enzyme PPL gồm hằng số ái lực km là 401,34 ± 6,82, tốc độ phản ứng tối đa vmax là 0.7 ± 0.015 và hằng số tốc độ kcat là 0.0014 ± 0.000032 Các kết quả tương ứng đối với enzyme LCR lần lượt là 38,34 ± 3,4; 4,86 ± 0.034 và 0.0113

± 0.000079

Chương 1 TỔNG QUAN 12

1.1 Dầu dừa 12

1.1.1 Giới thiệu chung về dầu dừa 12

1.1.2 Thành phần của dầu dừa và so sánh với các loại dầu thực vật khác 14

1.1.3 Ứng dụng của dầu dừa trong công nghệ thực phẩm 15

1.2 Enzyme lipase 15

1.2.1 Phân loại lipase 16

1.2.2 Cấu tạo của lipase 17

1.2.3 Cơ chế xúc tác phản ứng của enzyme lipase 18

1.2.4 Enzyme Lipase Porcine Pancreas (PPL) 20

1.2.5 Enzyme Lipase từ Candida Rugosa (LCR) 23

1.2.6 Các phương pháp xác định hoạt độ của enzyme lipase 24

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase 25

1.3 Ứng dụng của enzyme lipase và các công trình nghiên cứu 27

1.3.1 Ứng dụng của enzyme lipase 27

1.3.2 Các công trình nghiên cứu sử dụng enzyme lipase để thủy phân dầu béo 29

1.4 Mục đích nghiên cứu 31

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị 32

2.1.1 Nguyên liệu 32

2.1.2 Hóa chất 33

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 34

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 36

2.3 Các quá trình dùng trong nghiên cứu 37

2.3.1 Quá trình tạo nhũ dầu 37

2.3.2 Quá trình thủy phân 38

2.4 Bố trí thí nghiệm 39

2.4.1 Khảo sát nguyên liệu 39

2.4.2 Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase 39

2.4.3 Quy hoạch thực nghiệm 42

2.4.4 Khảo sát các thông số động học của enzyme lipase 42

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 43

Mục lục

2.6 Các phương pháp phân tích 44

2.6.1 Xác định chỉ số acid [39] 44

2.6.2 Xác định chỉ số peroxide [39] 44

2.6.3 Xác định hàm lượng chất khô [39] 44

2.6.4 Xác định hàm lượng protein trong enzyme [39] 44

2.6.5 Xác định hoạt độ và hoạt độ riêng của enzyme [18] 44

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45

3.1 Khảo sát nguyên liệu 45

3.1.1 Dầu dừa 45

3.1.2 Enzyme lipase 45

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt độ riêng của enzyme lipase 46

3.2.1 Procine Pancreas Lipase 46

3.2.2 Lipase từ Candida Rugosa 50

3.3 Quy hoạch thực nghiệm 55

3.3.1 Procine Pancreas Lipase 55

3.3.2 Lipase từ Candida Rugosa 58

3.3.3 Tổng kết 63

3.4 Khảo sát động học 63

3.4.1 Xác định phương trình động học của quá trình thủy phân nhũ dầu của enzyme lipase 63

3.4.2 Xác định các thông số động học của enzyme lipase 66

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

4.1 Kết luận 68

4.2 Kiến nghị 68

Chương 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1.1 Dầu dừa thô 12

Hình 1.2 Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hòa tan và không tan trong nước 19

Hình 1.3 Cấu trúc mô phỏng của PPL 21

Hình 1.4 Cấu trúc trung tâm hoạt động của PPL 21

Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng thủy phân được xúc tác bởi PPL 22

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của lipase từ Candida rugosa [24] 23

Hình 1.7 Trình tự acid amin của lipase từ Candida rugosa [18] 24

Hình 2.1 Sản phẩm dầu dừa của công ty Lương Quới 32

Hình 2.2 Thiết bị đồng hóa cơ và đồng hóa áp lực cao 34

Hình 2.3 Quy trình tạo nhũ dầu trong nước 37

Hình 2.4 Quá trình thủy phân nhũ dầu dừa 38

Hình 2.5 Phương trình Lineweaver – Burk 43

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng của enzyme PPL 47

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt độ riêng của enzyme PPL 48

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ riêng của enzyme PPL 49

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ riêng của enzyme PPL 50

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dầu đệm đến hoạt độ riêng của enzyme LCR 51

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt độ riêng của enzyme LCR 52

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ riêng của enzyme LCR 53

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ riêng của enzyme LCR 54

Hình 3.9: Mức độ ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH và tương tác giữa chúng đến hoạt độ riêng của enzyme PPL 57

Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ riêng khi thay đổi đồng thời nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH đối với enzyme PPL 58

Hình 3.11: Mức độ ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH và tương tác giữa chúng đến hoạt độ riêng của enzyme LCR 61

Hình 3.14 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ riêng khi thay đổi đồng thời nồng độ enzyme, nhiệt độ và pH 62

Hình 3.13 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng PPL 64

Hình 3.14 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng LCR 66

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần acid béo có trong dầu dừa 14

Bảng 1.2 So sánh thành phần của dầu dừa với các loại dầu thực vật khác 14

Bảng 1.3: Đặc tính lý và hóa của dầu dừa thô [7] 15

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 33

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 2.3: Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa cơ dùng trong nghiên cứu 35

Bảng 2.4: Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa áp lực cao dùng trong nghiên cứu 35

Bảng 2.5: Thông số cố định và biến đổi của thí nghiệm 1 40

Bảng 2.5: Thông số cố định và biến đổi của thí nghiệm 2 40

Bảng 2.6: Yếu tố cố định và biến đổi của thí nghiệm 3 41

Bảng 2.7: Yếu tố cố định và biến đổi của thí nghiệm 4 41

Bảng 3.1: Tính chất của dầu dừa nguyên liệu 45

Bảng 3.2 Các biến số trong ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme PLL.55 Bảng 3.3: Ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme PPL 55

Bảng 3.4 Kết quả giải bài toán quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme PPL 56

Bảng 3.5: Các biến số trong ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme LCR 59 Bảng 3.6: Ma trận quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme LCR 59

Bảng 3.7 Kết quả giải bài toán quy hoạch thực nghiệm đối với enzyme LCR 60

Bảng 3.8 Điều kiện tối ưu và hoạt độ riêng của enzyme ứng với điều kiện thủy phân xác định từ các phương trình hồi quy 63

Bảng 3.9 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng PPL (µmol acid béo/mL mẫu) 64

Bảng 3.10 Lượng acid béo sinh ra theo thời gian khi thủy phân dầu dừa bằng enzyme LCR (µmol/mL mẫu) 65

Bảng 3.11 Các thông số động học ứng với hai loại enzyme PPL và LCR 67

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc sử dụng những chế phẩm enzyme thương mại để thực hiện các phản ứng thủy phân, thay thế cho các loại xúc tác hóa học đang trở nên phổ biến bởi vì điều kiện phản ứng ôn hòa và độ tinh sạch của các sản phẩm cao

Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật (mô dự trữ của hạt dầu, hạt ngũ cốc), động vật (Porcine

pancreas), vi sinh vật (Candida Rugosa, Candida cylindracea, Aspergillus niger,…)

Lipase là một trong những chế phẩm enzyme có nhiều ứng dụng nhất trong việc xúc tác phản ứng thủy phân các loại dầu để thu nhận acid béo

Dầu dừa là loại chất béo được thu nhận từ cơm dừa bằng nhiều phương pháp khác nhau Trên thế giới, sản lượng dầu dừa nằm 2015 – 2016 đạt 5,4 triệu tấn và chiếm 2,5% tổng sản lượng dầu thực vật trên toàn thế giới [1] Tại Việt Nam, nguyên liệu dừa được trồng nhiều ở các tỉnh Bình Định, Khánh Hòa, Bến Tre, Cà Mau, Tây Ninh…và trong đó thì Bến Tre cho sản lượng dừa lớn nhất [2] Bến Tre cũng là nơi cung cấp nhiều loại dầu dừa cho thị trường Việt Nam Bên cạnh những ứng dụng trong thực phẩm, dầu dừa còn được chú ý do chứa nhiều acid béo có giá trị sinh học cao, đặc biệt là acid lauric, chiếm 50% tổng lượng acid béo của dầu dừa Ngoài ra dầu dừa còn chứa những loại acid béo khác như myristic, caprylic… [1]

Tùy thuộc vào nguồn gốc thu nhận của chế phẩm enzyme lipase mà hoạt độ xúc tác phản ứng thủy phân dầu béo sẽ rất khác nhau Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ dùng hai loại enzyme lipase là Porcine Pancreas lipase có nguồn gốc từ động vật và

lipase từ Candida rugosa có nguồn gốc từ vi sinh vật để tiến hành phản ứng thủy

phân nguyên liệu là dầu dừa Bến Tre Với mục đích tìm hướng ứng dụng và so sánh khả năng xúc tác phản ứng thủy phân của hai loại chế phẩm enzyme, chúng tôi sẽ xác định các điều kiện phản ứng thủy phân để hoạt độ riêng của các enzyme là cao nhất, đồng thời với việc khảo sát động học phản ứng enzyme

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Dầu dừa

Dầu dừa chứa các loại acid béo có độ dài mạch trung bình (từ C8 đến C18), acid béo no chiếm tỷ lệ cao (khoảng 90%) Acid lauric chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 48%), đứng thứ hai là acid myristic (khoảng 16%) Ở Việt Nam, dầu dừa thường được thu nhận từ cơm dừa của giống dừa Bến Tre

1.1.1 Giới thiệu chung về dầu dừa

Dầu dừa là loại dầu ăn được (edible oil) được chiết xuất từ cơm dừa của trái dừa trưởng thành Dầu dừa có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như chế biến thực phẩm, sản xuất dược phẩm Do có hàm lượng acid béo no cao nên dầu dừa

có thời gian bảo quản khá dài (khoảng 6 tháng ở 24oC) [3] Tuy nhiên tỷ lệ acid béo

no cao lại sẽ ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của dầu dừa vì thiếu những acid béo không no thiết yếu

Hình 1.1 Dầu dừa thô

1.1.1.1 Phân loại

Có thể phân dầu dừa thành 2 nhóm: dầu dừa thô và dầu dừa tinh luyện

 Dầu dừa thô

Dầu dừa thô hay dầu dừa nguyên chất là loại dầu ít trải qua quá trình xử lí nhất

Do vậy, dầu dừa thô chứa khá nhiều tạp chất bên cạnh thành phần triglyceride như

monoglyceride, digglyceride, các chất màu, chất thơm,…Chỉ số acid của dầu thô nằm trong khoảng 6 – 10 [1]

Phương pháp khô: Cùi dừa khô được tách khỏi vỏ bằng nhiệt độ cao của lò lửa,

lò nung [4] Những miếng dừa khô sau đó được ép hay được trích ly bằng dung môi Sản phẩm thu được là dầu dừa và phần bã giàu protein và chất xơ Tỷ lệ thu hồi dầu khi sử dụng phương pháp này khá cao (khoảng 90%), chất lượng dầu khá ổn định, tuy nhiên màu dầu vàng sậm

Phương pháp ướt: Sử dụng cơm dừa nạo tươi thay cho dừa sấy khô Người ta sử

dụng protein trong dừa để tạo ra một hệ nhũ tương dầu và nước [5] sau đó là phá vỡ

hệ nhũ để thu hồi dầu Trước đây, phương pháp phổ biến là đun hệ nhũ trong thời gian dài, điều này làm cho dầu bị đổi màu và không có hiệu quả kinh tế cao Ngày nay, người ta thường sử dụng phương pháp ly tâm kết hợp một số phương pháp tiền

xử lý như xử lý lạnh, gia nhiệt, xử lý acid,… Phương pháp ướt cho hiệu quả kém hơn

so với phương pháp khô do năng suất thấp hơn 10 – 15%, tỷ lệ hư hỏng cao hơn Phương pháp ướt cũng đòi hỏi chi phí về trang thiết bị, năng lượng và chi phí vận hành cao [6]

Dầu dừa nguyên chất là loại dầu dừa thô được sản xuất bằng phương pháp khô và qua quá trình khử màu, mùi, nên sản phẩm có màu sáng và trong suốt

 Dầu dừa tinh luyện

Dầu dừa tinh luyện hay còn gọi là dầu dừa RBD (Refined, Bleached, Deodorized)

là loại dầu thu được từ quá trình tinh luyện dầu thô Quy trình tinh luyện dầu bao gồm: thủy giải để trung hòa acid béo tự do, gia nhiệt để vô hoạt enzyme và sấy khô dầu, khử mùi bằng hơi quá nhiệt, khử màu bằng than hoạt tính Dầu tinh luyện gần như không chứa tạp chất gì khác ngoài triglyceride Chỉ số AV của dầu tinh luyện phải dưới 0,3 [1]

Ngoài hai loại dầu dừa đã trình bày trên, dầu dừa còn có thể qua quá trình hydro hóa

hoặc tách phân đoạn

Dầu dừa hydro hoá: Trong quá trình hydro hóa, các acid béo không no sẽ được

cộng hợp với hydro, giảm hoàn toàn hay một phần số nối đôi có sẵn, dẫn đến làm tăng nhiệt độ nóng chảy Nguyên liệu của quá trình hydro hóa dầu thường là dầu tinh luyện có nhiệt độ nóng chảy 24oC Dầu dừa hydro hóa có nhiệt độ nóng chảy 36 –

40oC Nhược điểm của loại dầu này là chứa một lượng acid béo dạng trans không có lợi cho sức khỏe

Dầu dừa tách phân đoạn: Quá trình tách phân đoạn dựa vào nhiệt độ nóng chảy

sẽ tạo ra nhiều phân đoạn dầu dừa giàu các loại acid béo khác nhau và sẽ được sử dụng cho những mục đích khác nhau

1.1.2 Thành phần của dầu dừa và so sánh với các loại dầu thực vật khác

Thành phần acid béo của dầu dừa theo TCVN 7597:2013 được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần acid béo có trong dầu dừa

sẽ tạo nên một mùi ôi khó chịu khi dầu dừa bị thủy phân khi bảo quản hoặc chế biến

Bảng 1.2 So sánh thành phần của dầu dừa với các loại dầu thực vật khác

Loại dầu

Hàm lượng acid béo no, % tổng chất béo

Hàm lượng acid béo không no một nối đôi, % tổng chất béo

Hàm lượng acid béo không no nhiều nối đôi, % tổng chất béo

cọ, bắp đều có tỷ lệ acid béo no trong khoảng 10 – 20% [1]

1.1.2.1 Tính chất vật lý của dầu dừa

Theo TCVN 7597:2013 về dầu thực vật thì dầu dừa dùng làm thực phẩm cần có những tính chất vật lý và chỉ số chất lượng như trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Đặc tính lý và hóa của dầu dừa thô [7]

1.1.3 Ứng dụng của dầu dừa trong công nghệ thực phẩm

Do hương vị thơm ngọt đặc trưng, dầu dừa thường được đưa vào một số sản phẩm đặc biệt như càri vùng Nam Á, bánh nướng, bánh ngọt, sauce trái cây [8], tạo mùi thơm cho bắp rang [9]

Một số ứng dụng khác của dầu dừa có thể kể đến là việc thay thế dầu đã được hydro hóa để sản xuất bánh nướng và bánh kẹo [10] Dầu dừa được hydro hóa được

sử dụng trong bột kem tách béo hay các sản phẩm thức ăn nhẹ như bắp rang Dầu dừa

đã hydro hóa được bán tại Đức bởi công ty Copha Tại Úc, dầu dừa còn là thành phần chính trong các món ăn nhẹ

Năng lượng cung cấp bởi 100g dầu dừa là 862kcal, ngoài ra còn có vitamin E 0,09mg, vitamin C 0,05mg và sắt 0,04mg [1]

Hầu hết lipase chỉ xúc tác thủy phân tại một số vị trí nhất định trên mạch glycerol của lipid (A1, A2 hay A3), điển hình là lipase trong tụy tạng của người là loại enzyme giúp phân cắt chất béo trong chế độ ăn uống, chuyển đổi các triglyceride thành monoglyceride và 2 acid béo [14]

Trong môi trường tự nhiên cũng tồn tại một số loại lipase như phospholipase [15] haysphingomyelinases [16] Một số lipase được tiết ra bởi các vi sinh vật gây nhiễm

trùng Đặc biệt, Candida albicans có một lượng lớn các loại lipase khác nhau giúp duy trì độc lực của C.albicans trong mô của con người [17]

1.2.1 Phân loại lipase

Lipase từ thực vật: Ở thực vật, lipase được tìm thấy ở mô dự trữ hạt dầu, hạt ngũ

cốc trong quá trình nảy mầm của hạt Hầu hết các lipase không hoạt động trong thời

kỳ ngủ đông, ngoại trừ lipase được tìm thấy ở hạt đậu caston [18] Lipase thực vật ít được tách chiết dạng thương phẩm vì hoạt độ yếu và không ổn định

Lipase từ động vật: Động vật là một nguồn phong phú của enzyme lipase Nguồn

lipase động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng Lipase tụy lợn ưu tiên xúc tác thủy phân liên kết ester của các acid béo với hơn 12 nguyên tử carbon và chủ yếu tác động vào vị trí C-1 của glycerol Lipase từ tụy lợn bao gồm một chuỗi duy nhất 450 acid amin và trọng lượng phân tử của protein là vào khoảng 50.084Da [18], [19]

Lipase chiết từ dạ dày cừu cũng là một loại lipase động vật phổ biến Loại lipase này

ưu tiên xúc tác thủy phân acid béo chuỗi ngắn trong chất béo từ sữa và đặc biệt được

sử dụng trong việc tạo thành hương thơm của phomat [18]

nhiên cho đến nay, chỉ có một vài lipase Streptomyces đă được xác định hoạt độ

Ngoài ra, người ta cũng đã tìm thấy lipase có trong một số loài vi khuẩn khác như

Pseudomonas cepacia có hoạt độ ngay ở nhiệt độ cao, trong môi trường kiềm và kỵ

nước [18]

Nấm mốc: Lipase được tìm thấy ở một số loài như Aspergillus, Rhizopus (tách từ quả dừa), Rhizopus oryzae (phân lập từ dầu dừa), Pythiumnltimum (trong dung dịch hữu

cơ, không có nhũ tương) và Mucor sp humicola lamuginosa [18]

Nấm men: Candida rugosa là một nguồn sản xuất lipase quan trọng Các đặc tính xúc tác cấu trúc hoá sinh của lipase trong loài nấm men Candida rugosa đă được công bố trên nhiều tài liệu Có ít nhất 7 loài Candida rugosa có khả năng sản xuất lipase trong

đó có 4 loài đă được xác định đặc tính và 3 loài đă được dùng để sản xuất enzyme thương phẩm [18]

1.2.2 Cấu tạo của lipase

1.2.2.1 Khối lượng phân tử

Cũng như các loại enzyme khác, lipase có thể thu được từ mô và các cơ quan của động vật hay vi sinh vật Các loại enzyme lipase đều có những tính chất chung, song chúng cũng khác nhau về một số tính chất như tính đặc hiệu cơ chất hay mức độ phân giải cơ chất, khối lượng phân tử, thành phần acid amin và điều kiện hoạt động Sự khác nhau này xuất hiện không chỉ ở các loại khác nhau mà còn giữa những chủng trong cùng một loài

Khối lượng phân tử của lipase dao động khá nhiều giữa các chủng vi sinh vật:

Candida rugosa có hai đồng phân là LipA (58kDa) và LipB (62kDa); Geotrichum candidum khoảng 60.000 Da; Aspergillus niger là 97.000 Da; Penicillium crustosum

là 29.300 Da; C Paralipolytica là 55.900 Da Lipase được sản xuất từ P camemberti

là một glucose-protein có khối lượng phân tử 38 kDa [18]

1.2.2.2 Trình tự acid amin và cấu trúc không gian

 Trình tự acid amin

Thành phần acid amin của lipase từ các nguồn khác nhau cũng khác nhau, nhưng nhiều trình tự acid amin được suy ra từ trình tự của lipase tách dòng, từ đó cho thấy

có sự tương đồng giữa những cấu trúc không gian của lipase Chẳng hạn như trình tự

20 acid amin đầu tiên của lipase từ động vật có vú giống với vùng N- của lipase từ P camemberti giống một phần với lipase từ Humicola lanuginosa và Aspergillus niger nhưng lại khác so với lipase 1 từ P.cyclopum So sánh tiếp đầu N của lipase 1 của P expansium và P solium thì ta thấy ngoài 20 acid amin đầu khác nhau ra thì còn lại là

giống nhau

Đối với lipase từ Candida rugosa thì sự sắp xếp trình tự N của những protein thể hiện

sự tương đồng giữa lipase 2 và lipase 3 nhưng không tương đồng với lipase 1 Sự quyết định trình tự N- trên 19 acid amin chỉ là sự tương đồng cao với những lipase tương tự

Nói chung là có rất ít những lipase có trình tự giống nhau hoàn toàn, ngoại trừ khu vực xung quanh tâm hoạt động Khi ta so sánh trình tự acid amin xung quanh tâm hoạt động của ba nhóm enzyme là protease, lipase, cutinase với enzyme esterase, người ta thấy sự tồn tại của trình tự GxGxG ở vị trí serin Ngoại lệ duy nhất được tìm thấy là sự thay thế alanin cho glycin thứ hai trong subtilisin Không một trình tự nào

được tìm thấy quanh vùng gốc histidin hoặc aspartic (glutamic) của trung tâm hoạt động trừ trường hợp của các enzyme tương đồng từ các loài họ hàng rất gần [18]

 Cấu trúc không gian

Đã có rất nhiều thí nghiệm được thực hiện nhằm tìm hiểu cấu trúc không gian của lipase Trong đó thì cấu trúc ba chiều của lipase được coi là cơ sở để hiểu được phản ứng động học, đặc hiệu cơ chất và tiên đoán được những đặc điểm sinh hóa và hoạt

động của lipase tại bề mặt pha dầu nước Lipase từ Rhizomun miehei là enzyme thủy

phân đầu tiên có cấu trúc bậc 3 được xác định bởi tinh thể học tia X

Phương pháp tia X đã có thể phát hiện cấu trúc α/β của enzyme, liên hết β song song làm cầu nối với cấu trúc xoắn ốc α để hình thành cấu trúc phức tạp Các cầu disunfua được tìm thấy có tác dụng làm tăng tính ổn định cho cấu trúc gấp nếp của lipase Trong cấu trúc này, protein hình cầu chứa một nhân kỵ nước tạo nên một chuỗi không cực ở cạnh, có ý nghĩa quan trọng trong sự ổn định phân tử Bên cạnh đó thì cũng tồn tại vài nhóm có phân cực và những phân tử được liên kết Sự có mặt của phân tử nước

đã làm tăng lực liên kết Vander Wall và lực phân tán trong nhân, vì vậy sự ổn định cấu trúc không gian của enzyme được tăng lên

Nhóm quan trọng nhất tạo thành trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba Asp…His…Ser Đối lập với protease, trung tâm hoạt động của lipase không nằm ở

bề mặt ngoài mà nằm dưới chuỗi xoắn bề mặt Vị trí hoạt động của mọi lipase đều có Ser, His và Asp (hoặc Glu) và hoàn toàn bị che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo bởi một hoặc hai chuỗi xoắn Bề mặt mang trypsin hoàn toàn không cực và tác động qua lại với đầu kỵ nước bao quanh trung tâm hoạt động Trong hầu hết cấu trúc của lipase, đầu serin hoạt động trong chuỗi pentapeptide có trình tự Gly – X1 – Ser – X2 – Gly

và cấu trúc này cũng được tìm thấy ở protease Serin [18]

1.2.3 Cơ chế xúc tác phản ứng của enzyme lipase

Khi cơ chất kết hợp vào enzyme, do kết quả của sự phân cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng hơn

Quá trình tạo thành phức enzyme – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua 3 giai đoạn:

E + S → ES → P + E

- Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme cơ chất ES không bền Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

- Giai đoạn 2: Khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ

- Giai đoạn 3: Tạo thành sản phẩm, enzyme được giải phóng dưới dạng tự do [20]

Cơ chế tác dụng của lipase: Tâm ái nhân của lipase sẽ tương tác với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân Sự tạo thành phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm đứt các liên kết và quá trình thủy phân được

dễ dàng thuận lợi

Một cơ chế khác liên hệ tính xúc tác của enzyme với sự khuyết electron của liên kết

bị thủy phân là enzyme làm tăng sự khuyết electron bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí gần gũi với liên kết bị thủy phân Nhờ vậy mà

sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết dễ dàng hơn hoặc khiến cho 1 trong 2 nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân

AB + H2O → AOH + BH Dưới tác dụng của enzyme lipase, khi hợp chất AB kết hợp với enzyme thì liên kết A-B bị kéo căng, kèm theo sự chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liên kết A-B và gắn nhóm OH- của nước vào phần B của phân tử Sau khi hoàn thành phản ứng, enzyme được giải phóng dưới dạng tự do [21]

1.2.3.1 Cơ chế động học xúc tác của lipase

Lipase có nhóm serin, histidin và acid aspastic ở trung tâm hoạt động của nó Với các

cơ chất không tan trong nước, hoạt độ của lipase đạt được cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước Quá trình đó được gọi là quá trình hóa phân pha (Hình 1.2)

Hình 1.2 Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hòa tan và không tan trong nước

Trong đó:

- E: Lipase hòa tan không hoạt động

- E*: Lipase hòa tan dạng hoạt động

- Es*: Lipase hoạt động có hấp phụ

- Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ

- Sw: Cơ chất tan trong nước

- S: Cơ chất không tan trong nước

- E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase-cơ chất

Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng ester hóa và phản ứng ester được ưu tiên Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất

1.2.4 Enzyme Lipase Porcine Pancreas (PPL)

1.2.4.1 Cấu trúc của enzyme PPL

Enzyme lipase porcine pancreas là một protein hình cầu bao gồm một chuỗi đơn của

449 acid amin

Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định Vùng N – terminal là một mắt lưới của xoắn α và các sợi song song β, là đoạn amino acid 1 – 336 Bộ ba xúc tác ser, asp và his lần lượt ở tại vị trí amino acid 153, 177 và 264 Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này tương tác với colipase Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử khoảng 10 kDa (Hình 1.3)

Cấu trúc tinh thể của enzyme PPL có một vài chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác Vị trí

của các võng cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba xúc tác Vùng võng rộng nhất trong số các vùng võng được hình thành là do cầu nối disulfide giữa cys238 và cys262 Một võng khác được hình thành bởi phần 76 – 85 (gọi là “nắp”), thuộc vùng N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt động Nắp được mở ổn định bởi các liên kết hydro giữa nắp và colipase Khi nắp này mở, cho phép cơ chất đi vào tiếp xúc với tâm hoạt động (Hình 1.4) [18]

Hình 1.3 Cấu trúc mô phỏng của PPL

Hình 1.4 Cấu trúc trung tâm hoạt động của PPL

1.2.4.2 Cơ chế hoạt động của enzyme PPL

Khi một phân tử triacylglycerol đến trung tâm hoạt động, nó đi vào tiếp xúc với bộ

ba xúc tác ser 152, his 263 và asp 176 Nguyên tử oxy của asp 176 liên kết với nguyên

tử nitơ của His 263 bằng liên kết hydro, làm cho nguyên tử nitơ khác trong vòng thơm của his 263 hình thành liên kết hidro với nguyên tử hydro của nhóm hyroxyl trong ser 152 Liên kết hydro thứ hai này kéo hydro ra xa từ liên kết cộng hóa trị với oxy của nó một cách tương đối, khiến cho liên kết cộng hóa trị của chúng trở nên lỏng lẻo Lúc này, trung tâm xúc tác sẵn sàng hoạt động Quá trình xúc tác phản ứng thủy phân lipid trải qua 2 bước như sau:

- Bước 1: dựa trên phản ứng thế ái nhân của serin và của carbon glycerol thứ nhất của chuỗi ở bên cạnh serin Tác nhân ái nhân là nhóm OH- của serin mang điện tích

âm tác động vào trung tâm tích điện dương của carbon glycerol thứ nhất, làm cho liên kết giữa carbon glycerol thứ nhất và nguyên tử oxy của ester yếu đi Oxy trong liên kết ester trở thành nhóm linh động và nó nhận thêm một proton H+ vào từ nhóm OH-

của serin để trung hòa điện tích âm Khi oxy nhận được H+, sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành Lúc này, phần đang chứa glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của serin, tuy nhiên liên kết này phải bị phá vỡ để enzyme duy trì chức năng của

nó

- Bước 2: liên quan đến sự hình thành và di chuyển của diglyceride từ nửa đang chứa glycerol Để giải phóng ra phân tử glycerol, cần một nhóm hydroxyl để liên kết với carbon đầu tiên của glycerol và một ion H+ để thêm một proton trở lại vào oxy của Serin Thông qua tương tác hydro, phân tử nước bị phân ly thành H+ và OH- Do sự hình thành cầu nối hydro giữa H+ với OH- của hai phân tử nước khác nhau, ion hydronium (H3O+) được hình thành Ion hydronium có một moment lưỡng cực rất lớn

và hoạt động như một tác nhân ái nhân lên carbon glycerol đầu tiên Thời điểm này, oxy của serin rời khỏi nhóm Chuỗi bên cạnh tích điện âm của serin nhanh chóng thêm một proton vào bởi ion H+ từ nước Lúc này, sản phẩm diglyceride được hình thành Liên kết hydro giữa nitơ thơm của histidin và nhóm hydroxyl trên serin được phục hồi trở lại và trở về cấu trúc ban đầu của nó, sẵn sàng cho phản ứng khác

Phản ứng thủy phân tiếp theo xảy ra để xúc tác diglyceride vừa mới hình thành một acid béo và một monoglyceride Cơ chế trong trường hợp này giống hai bước như với thủy phân triglyceride, ngoại trừ các tấn công ái nhân lên carbon thứ ba của glycerol

Cơ chế này cho ra một monoglyceride và acid béo mới từ trung tâm hoạt động, và enzyme chuẩn bị tiến đến triglyceride khác [22]

Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng thủy phân được xúc tác bởi PPL

1.2.5 Enzyme Lipase từ Candida Rugosa (LCR)

1.2.5.1 Cấu trúc của enzyme LCR

Cấu trúc không gian của lipase chia ra hai vùng riêng biệt Vùng N-terminal bao gồm xoắn  và  chứa amino acid 1-336, trong đó bộ ba xúc tác Ser, Asp và His ở vi trí

153, 177 và 264.Vùng C-terminal hầu hết là các nếp gấp  chứa acid amin 337-449 tương tác đặc hiệu với colipase Colipase là một cofactor protein nhỏ với trọng lượng phân tử 10 kDa

Cấu trúc của LCR có một vài chỗ võng bề mặt bao phủ bộ ba xúc tác.Các chỗ võng

sẽ cản trở sự tiếp cận của cơ chất đến vị trí xúc tác Cấu trúc nắp được cố định bởi cầu nối disulfide giữa Cys60 và Cys97 và sự tương tác giữa Glu96 và Arg97 Một chỗ võng khác thuộc vùng N-terminal, hình thành bởi amino acid 76-85 cũng có tác dụng bao phủ trung tâm hoạt động [23] [24]

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của lipase từ Candida rugosa [24]

Hình 1.7 Trình tự acid amin của lipase từ Candida rugosa [18]

1.2.6 Các phương pháp xác định hoạt độ của enzyme lipase

Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (gọi là hoạt độ) của enzyme Trong phản ứng có enzyme xúc tác,

sự hoạt động của enzyme được biểu hiện bằng cách làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng Theo những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng Để xác định hoạt độ của enzyme ở các dịch chiết hoặc ở chế phẩm người ta thường dùng các phương pháp vật

lý hoặc hóa học Các phương pháp so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt, chuẩn độ được dùng phổ biến trong nghiên cứu định lượng các phản ứng enzyme Có thể chia ra ba nhóm phương pháp sau:

- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một lượng chế phẩm enzyme xác định

- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định

- Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

1.2.6.1 Đơn vị hoạt độ enzyme

Hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme đã đưa ra khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) vào năm 1961 Đơn vị hoạt độ enzyme (U) là lượng

enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 micromole (1mmol) cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 U = 1mmol cơ chất (10-6 mol)/ phút

Từ năm 1972 người ta lại đưa thêm khái niệm Katal (Kat) Katal là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1 Kat = 6.107 U

Và 1 U =1/60 microkatal Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn cần phải đánh giá độ sạch của nó Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzyme là hoạt

độ riêng

Hoạt độ riêng : của một chế phẩm enzyme là số đơn vị hoạt độ enzyme/ 1mg protein

(U/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 mL dung dịch enzyme Thông thường hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry Khi biết khối lượng phân tử của enzyme thì có thể tính hoạt độ phân tử

Hoạt độ phân tử: là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme

trong một đơn vị thời gian Hoạt độ phân tử lớn có nghĩa là phản ứng được xúc tác xảy ra rất nhanh Như vậy, hoạt độ phân tử chính là khả năng xúc tác: hoạt độ phân

tử càng cao thì khả năng xúc tác càng lớn Ví dụ người ta xác định được hoạt độ phân

tử cao của một số enzyme tinh khiết như catalase (5,6 x106) acetyl - cholinesterase (3,0 x 106), β-amylase (1,2 x 106)

1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase

1.2.7.1 Nhiệt độ và pH hoạt động

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới hoạt độ của enzyme lipase Tùy theo nguồn gốc mà mỗi enzyme sẽ có nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu là khác nhau Càng rời xa khoảng tối ưu thì enzyme hoạt động càng kém hay bị ức chế

 Nhiệt độ

Tốc độ phản ứng tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 10oC, nếu enzyme bền ở nhiệt độ cao thì khi phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao hiệu suất phản ứng có thể tăng lên rất nhiều Do đó, độ bền với nhiệt là một tính chất mong muốn của enzyme lipase

Lipase bền nhiệt được tách chiết từ nhiều nguồn vi sinh vật như P.flourescens, Bacillus sp., B.stearothermophilus, Geotrichum sp., Aeromonas sobria, B.coagulans, B.cereus và P.aeruginosa Một trong những enzyme bền với nhiệt đáng chú ý được

tách từ loài Bacillus sp., có hoạt độ tối đa ở 60oC và giữ được 90% hoạt độ khi ủ 15 giờ Hoạt độ của enzyme này vẫn giữ 100% hoạt độ ban đầu khi ủ ở 75oC trong 30 phút Thời gian bán hoạt động của enzyme là 8h ở 75oC [18]

Độ bền nhiệt của lipase có liên quan tới cấu trúc của nó, độ bền nhiệt bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, sự có mặt của ion kim loại, do đó đã có nhiều thí nghiệm thực hiện gây đột biến lipase để cải thiện độ bền nhiệt So với enzyme tự nhiên, độ bền nhiệt và hoạt động của nhiều lipase tái tổ hợp có thể được nâng cao đáng kể [25], [26], [27]

 pH

pH tối ưu của lipase tái tổ hợp LipA chủng Ralstonia sp M1 là 10,75 và enzyme có

độ bền ở dải pH kiềm từ 8,0 đến 10,5 Lipase tự nhiên chủng Ralstonia sp M1 cũng

có pH tối ưu tương tự, là pH10 và bền ở dải pH rộng hơn từ 7.5 đến 11 [18]

Lipase từ Acinetobacter sp RAG-1 bền ở dải pH từ 5,8 đến 9,0 với hoạt độ tối đa ở

pH 9.0 Lipase từ Acinetobacter sp SY-01 có hoạt độ tối đa ở pH 10 và bền ở dải pH

từ 9 đến 11 Lipase từ B.thermocatenulatus BTL2 cho thấy hoạt độ tối đa ở pH trong

khoảng 7.5 – 9.0 và độ bền ở dải pH từ 7 đến 11 [18]

Độ bền pH và pH tối ưu là một trong những cơ sở khi chọn lipase để xúc tác phản ứng mong muốn Ví dụ như lipase có độ bền ở dải pH kiềm chính là một trong những điều kiện khi chọn loại lipase này làm phụ gia trong bột giặt [18]

1.2.7.2 Chất hoạt hóa và chất kìm hãm

 Chất hoạt hóa

Chất này làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme Các chất này có bản chất hoá học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn Tuy nhiên mỗi chất hoạt hóa lại tác động hoạt hóa ở từng mức độ khác nhau,

có khi chất hoạt hóa cho loại lipase từ nguồn gốc này lại không hoạt hóa lipase từ

nguồn gốc khác Ví dụ như hoạt độ enzyme lipase từ Pseudomonas aeruginosa

KKA-5 giảm 20-30% khi có sự xuất hiện của ion Na+, K+, Cu+, tuy nhiên khi có sự xuất hiện của Ca2+ ủ trong 72h thì hoạt độ enzyme lipase lúc này tăng 56% [28]

 Chất kìm hãm

Ngược lại với chất hoạt hóa, chất này làm giảm hoạt độ xúc tác của enzyme, hoặc trong một số trường hợp nó làm ngăn chặn sự xúc tác Cơ chế hoạt động của các chất kìm hãm này có thể được giải thích theo 2 hướng:

- Chất kìm hãm protein được hấp phụ lên bề mặt và gây ra sự thay đổi các tính chất của bề mặt đó

- Sự tác động trực tiếp của chất kìm hãm với lipase và cạnh tranh với cơ chất Các chất kìm hãm này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, hoặc là các protein Khi tham gia phản ứng nó có thể làm thay đổi vị trí trung tâm hoạt động của enzyme hoặc nó có thể tác động vào tính chất của bề mặt phân pha dầu nước [29]

1.3 Ứng dụng của enzyme lipase và các công trình nghiên cứu

1.3.1 Ứng dụng của enzyme lipase

1.3.1.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm người ta sử dụng lipase để cải biến các triacyglycerol, nâng cao chất lượng các loại dầu thực vật rẻ tiền, chất lượng thấp bằng cách thay thế các acid béo no bởi các acid béo không no, trong dung môi hiếm nước [18]

Đối với thực phẩm được chế biến từ sữa, lipase được sử dụng rộng rãi để làm tăng mùi vị, làm tăng độ chín của phomat, hoặc chế biến những sản phẩm như phomat và phân giải lipid Những acid béo tự do mạch ngắn (chủ yếu là C4, C6) được thuỷ phân

ra do tăng lipase vào sữa béo dẫn đến sự tăng hương vị đặc trưng cho sữa Trong khi

đó nếu các acid béo mạch trung bình (C12, C14) được tạo ra sẽ có xu hướng tạo ra mùi vị tựa như xà phòng cho sản phẩm Thêm vào đó những acid béo tự do này có thể tham gia vào các phản ứng hoá học đơn giản với vi sinh vật dẫn đến việc tổng hợp những gia vị có mùi thơm khác nhau Những nguồn lipase dùng cho việc tăng hương vị ở phomat trên mô của những loài động vật nhai lại (dê non, cừu, bê) Một

số chế phẩm lipase được sử dụng làm tăng mùi vị và làm chín phomat được thu từ

một số chủng như M.miehei, A.niger hay A oryzae [18]

Một nghiên cứu của Yuji Shimada và cộng sự (1998) về sản xuất γ -linolenic acid

(GLA) bằng cách thủy phân dầu cây lưu ly bởi enzyme lipase từ candida rugosa

Mức độ thủy phân là cao nhất với 80% với thời gian là 15h [30]

Lipase được sử dụng để làm tăng những chất béo nhờ việc chuyển ester hoá tới một triglyceride có giá trị cao, bơ cocoa, có một hỗn hợp 1,3-2-oleoyl-glycerol chưa no (palmitic, streraic và oleic) có thể được chế xuất từ loại dầu rẻ tiền chiết xuất ở tổng hợp thân cây cọ (1,3-dipalmitoy 1-2-oleoyl-glycerol) với tritearrin hay stearic lần lượt

là 1, 3 số lipase đặc trưng [Mastuao và cộng sự, 1981], trong khi phương pháp chuyển đổi ester hoá hoá học dưới những điều kiện kiềm có thể dẫn đến sự tạo thành sản phẩm mang tính ngẫu nhiên và tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn Bằng việc

sử dụng phương pháp chuẩn bị giống khác nhau (acid palmitic hầu như không có trong hai vị trí với 1, 3- dioleoyl- 2palmitoyl-glycerol) có thể được thay thế bằng

những chất thay thế sữa béo được chiết xuất phần nhiều từ cây cọ, dầu palmitoyl glycerides với những acid béo không no Triglycerides cùng với acid octanoic và acid decanoic ở vị trí 1,3- và một acid béo cần thiết ở vị trí 2- có thể được sản xuất theo cách này dành cho những bệnh nhân không đủ dịch tuỵ hoặc kém hấp thụ [18] Tomoko Okada và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mòi Thái Bình Dương để sản xuất acid béo - 3 Lipase vi sinh

vật thương mại có sẵn là Candida rugosa, Candida cylindracea, Mucor javanicus, và Aspergillus niger đã được sử dụng cho thủy phân dầu cá mòi ở 37°C [31]

1.3.1.2 Trong công nghiệp dược và hóa chất

Trong những năm gần đây enzyme ngày càng được sử dụng nhiều và rộng rãi trong

y học, để sản xuất một số thuốc và dùng trực tiếp để chữa bệnh Ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt ở Nhật Bản hàng năm người ta đã sản xuất một lượng lớn chế phẩm enzyme vi sinh vật có độ tinh khiết cao trong đó có mặt của lipase [18]

Trong dược phẩm lipase được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất thuốc chữa bệnh cho người và các loại hoá chất bảo vệ thực vật (thuốc trừ sâu, trừ cỏ) Gần đây hơn, trong lĩnh vực hoá học tinh khiết, người ta đã dùng lipase để tạo các chất trung gian tổng hợp qua quá trình thuỷ phân lập thể chọn lọc, ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu Pyretinoidic [18]

Ngoài ra trong phòng thí nghiệm các lipase cũng được nhà hoá học hữu cơ dùng làm công cụ tổng hợp một số chất khác như phân giải Racemic epoxiester nhờ lipase của

Rhizopus arhisus Với mong muốn có thể sản xuất một loại thuốc làm giãn động mạch

vành, người ta dựa vào tính chất chọn lọc thuỷ phân của lipase trong môi trường dung môi hữu cơ [18]

Các lipase có thể xúc tác ester hoá, chuyển đổi ester hoá và ester hoá tương tác trong các dung môi hữu cơ với lượng nước thấp, ứng dụng chính của các lipase trong hoá hữu cơ là sự phân giải các hỗn hợp enantiomeric Có một vài nhóm phân tử liên quan đến sự truyền tính trạng dấu hiệu làm gia tăng những căn bệnh dị ứng, viêm là những lipid hay lipid analogues Sự truyền tín hiệu ở giữa và trong nội bào ở sinh vật liên quan gần gũi với những loại lipid đơn lẻ như phosphatidylinositol, lipase cũng như photpholipase đều có thể được sử dụng để tổng hợp trên phạm vi lớn [18]

1.3.1.3 Trong công nghiệp thuộc da

Quá trình thuộc da yêu cầu phải bỏ lớp chất béo dưới da Sử dụng phối hợp lipase với các enzyme thuỷ phân khác như protease đã mở ra con đường mới cho công nghiệp thuộc da Một quá trình enzyme mới cho sản xuất từ da sống đến thuộc da bao gồm việc giặt, rũ lông và rửa sạch trong bể nước có pH khoảng 8-13 chứa một enzyme ưa

kiềm Rõ ràng cần sử dụng phối hợp lipase với các protease kiềm hay trung tính và một chất hoạt động bề mặt khác Tại Nga, đã có bằng sáng chế sử dụng chế phẩm enzyme để thuộc da cừu với các đặc tính ưu việt hơn như độ bền, độ co giãn tăng và giảm cứng [18]

1.3.1.4 Trong công nghiệp mỹ phẩm

Lipase được ứng dụng nhiều trong công nghiệp mỹ phẩm để sản xuất các chất hoạt động bề mặt và các hợp chất thơm Những thành phần chủ yếu trong mỹ phẩm và nước hoa được điều chế bằng phản ứng ester hoá glycerol được xúc tác bởi lipase Việc chuyển ester hoá của 3,7- dimethyl 4,7- octadien- 1- ol bởi lipase từ nhiều nguồn

vi sinh vật khác nhau để điều chế oxide hoa hồng là một hương liệu quan trọng trong sản xuất nước hoa [18]

1.3.1.5 Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa

Hiện nay thị trường lớn nhất cho các loại lipase là việc sử dụng nó như những chất cấu thành trong các loại bột giặt ở công nghệ giặt khô Ngày nay lipase được dùng trong bột giặt để thuỷ phân các vết dầu mỡ mà con người tiết ra quần áo, chăn đệm trong điều kiện nhiệt độ thấp và pH cao với những chất hoá học có hoạt độ bề mặt Một số lipase ở dạng thương phẩm đã được sử dụng trong ngành thuốc tẩy là Lipase humicola của Novo Nordisk, lipolase hoặc lipase P.glumace của Unilever được sử dụng trong ngành công nghiệp tẩy rửa Những lipase dùng làm bột giặt cho những hộ gia đình giữ ổn định với các protease và hoạt động có hiệu quả trong điều kiện kiềm [18]

1.3.2 Các công trình nghiên cứu sử dụng enzyme lipase để thủy phân

dầu béo

Shimada và cộng sự (1998) sản xuất γ -linolenic acid (GLA) bằng cách thủy phân dầu

cây lưu ly bởi enzyme lipase từ candida rugosa trên hai yếu tố ảnh hưởng là thời gian

và nồng độ enzyme/cơ chất Nghiên cứu được thực hiện ở 35oC với thời gian là 15h cho kết quả như sau: với nồng độ enzyme là 100 U/g mẫu thì cho mức độ thủy phân

là cao nhất với 80% với thời gian là 15h và sau 8h phản ứng thì mức độ thủy phân tăng không đáng kể, trong khi đó hàm lượng GLA sinh ra là 45% với nồng độ enzyme

là 20 U/g mẫu trong 4h và không tăng thêm khi tăng nồng độ enzyme và thời gian phản ứng [30]

Ting và cộng sự (2006) nghiên cứu khả năng thủy phân của LCR trên dầu đậu nành cho thấy kết quả tối ưu cho enzyme hoạt động là từ 6,5-7,0 trong đó cao nhất là tại

pH 7,0 Sau 5 giờ, mức độ chuyển hóa của enzyme đạt cao nhất 88% [32]

Okada và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng lipase xúc tác thủy phân dầu chiết xuất từ cá mòi Thái Bình Dương để sản xuất acid béo - 3 Lipase vi sinh vật thương

mại có sẵn là Candida rugosa, Candida cylindracea, Mucor javanicus, và Aspergillus niger đã được sử dụng cho thủy phân dầu cá mòi ở 37°C khuấy từ liên tục trong 1,5; 3; 6 và 9 giờ Dầu cá mòi được thủy phân nhanh chóng trong 1,5 giờ đầu tiên Sau

đó, quá trình thủy phân chỉ tăng ít trong suốt khoảng thời gian 3, 6 và 9 giờ Phân tích thành phần acid béo bằng sắc ký khí cho thấy dầu cá mòi trước khi thủy phân chứa 26,86 % acid eicosapentaenoic (EPA) và 13,62 % acid docosahexaenoic (DHA)

(w/w) Lipase từ candida rugosa là hiệu quả nhất trong sản xuất acid béo  -3 Với

Candida rugosa 250 U, hàm lượng EPA tăng lên đáng kể từ 26,87% đến 33,74 % sau

1,5 h và duy trì ở mức tương đối ổn định sau 3; 6 và 9 giờ ( 33,45 % , 34,45 % và

33,17 %) Candida rugosa 500U cho kết quả tương tự Lượng DHA cũng tăng đáng

kể sau 1,5 h từ 13,63 % đến 23,12% với Candida rugosa 250 U và 23,78 % với Candida rugosa 500 U Nồng độ DHA không có sự khác biệt đáng kể sau 1,5 h và

thời gian phản ứng lâu hơn [31]

Serri và cộng sự (2008) nghiên cứu thủy phân dầu cám bằng lipase từ candida rugosa

để sản xuất acid béo tự do và glycerol với các thông số như thời gian, nhiệt độ, pH

và tốc độ khuấy Quá trình thuỷ phân tối ưu với thời gian 90 phút, nhiệt độ 45°C, pH 7,5 và tốc độ khuấy 200 rpm [33]

Quá trình thủy phân dầu cọ từng được nghiên cứu bởi Serri và cộng sự (2008) bằng

cách sử dụng lipase từ candida rugosa Dầu cọ giống với dầu dừa là đều chứa các

acid béo bão hòa mạch trung bình và có hàm lượng acid lauric hơn 40% Phản ứng được thực hiện trong đệm phosphate 1N với pH và nhiệt độ tối ưu tìm được là 7,5 và

45oC Các thông số còn lại như thời gian phản ứng là 90 phút, nồng độ dầu là 0,1 g /

ml, enzyme là 7,46 kLU/ml và tốc độ khuấy 200 rpm [33]

Một nghiên cứu của Tangkam và cộng sự (2008) về khả năng xúc tác của các enzyme

lipase từ candida rugosa trên dầu dừa tinh khiết ở 40oC, tỉ lệ dầu/nước là 1:1, tỉ lệ enzyme/dầu là 3,3% (w/w) cho kết quả thủy phân đạt 60-70% sau 2 giờ [34]

Uyanik và cộng sự (2011) nghiên cứu cải thiện hoạt độ xúc tác của LCR trên cơ chất Naproxen methyl ester bằng phương pháp cố định enzyme cho kết quả hoạt độ cao nhất của LCR tự do tại pH 7,0 [35]

Theo nghiên cứu của Sui và cộng sự (2012) về cố định enzyme lipase từ LCR lên chất mang là hạt sắt từ nano hoạt hóa với acid gluconic, khi khảo sát ảnh hưởng của

pH đến hoạt độ thủy phân của enzyme lipase tự do và cố định, cho kết quả pH tối ưu của LCR tự do là 7,5 trong khi của LCR cố định là 8,5 [36]

Bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu sản xuất các acid béo có DHA bằng cách

thủy phân dầu cá ngừ sử dụng lipase từ candida rugosa Quá trình thủy phân dầu cá

theo nghiên cứu này tối ưu tại nhiệt độ 35ºC, pH 7,0, tỉ lệ dầu/nước là 1:10 (w/v) và

tỉ lệ dầu/dung môi là 1:1 (w/v) [37]

Từ các tài liệu tham khảo, có thể thấy việc thủy phân dầu dừa bằng enzyme là một giải pháp công nghệ tiên tiến: độ chọn lọc cao, chế độ phản ứng nhẹ nhàng, độ tinh khiết sản phẩm cao Tuy nhiên, mỗi enzyme có khả năng xúc tác khác nhau và đòi hỏi điều kiện phản ứng khác nhau, vì vậy cần phải nghiên cứu để xác định được điều kiện và khả năng xúc tác của từng enzyme Trong tất cả các nghiên cứu trên, các thí nghiệm nhằm xác định điều kiện thủy phân thích hợp đều được xây dựng trên phương pháp cổ điển là tối ưu một biến Phương pháp này có ưu điểm là nhanh chóng và dễ làm, tuy nhiên không nêu rõ được sự tương tác giữa các yếu tố khảo sát đến mục tiêu khảo sát Trong nghiên cứu này, em sẽ kết hợp phương pháp tối ưu một biến và tối

ưu đa biến theo mô hình của Box-Hunter với 20 thông số biến đổi, nhằm tìm ra điều kiện tối ưu và tìm ra sự ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố là nồng độ enzyme, nhiệt

độ, pH đến hàm mục tiêu là hoạt độ riêng Em cũng sẽ tiến hành khảo sát các thông

số động học và xác định phương trình động học enzyme để tìm ra sự tương tác giữa enzyme và cơ chất

1.4 Mục đích nghiên cứu

- Khảo sát quá trình thủy phân sử dụng hai loại enzyme lipase là lipase porcine

pancreas (PPL) có nguồn gốc từ động vật và lipase từ Candida rugosa (LCR) có

nguồn gốc từ vi sinh vật nhằm tìm ra thông số thích hợp cho quá trình thủy phân dầu dừa với hàm mục tiêu là hoạt độ riêng của enzyme

- Khảo sát các thông số động học của enzyme để giải thích sự khác nhau về hoạt độ riêng

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị

- Trạng thái: trong suốt, không tạp chất

- Màu sắc: màu trong suốt

- Mùi vị: mùi dừa nhẹ

- Hạn sử dụng: 24 tháng kể từ ngày sản xuất

2.1.1.2 Enzyme lipase

 Enzyme Lipase Porcinee Pancreas

Enzym lipase porcine pancreas, Type II, ký hiệu L3126, sản xuất bởi công ty Sigma Aldrich (Mỹ), nhập khẩu và phân phối bởi công ty trách nhiệm hữu hạn Khoa Học Hợp Nhất

Theo thông tin từ nhà cung cấp, 1 đơn vị hoạt độ (UI) sẽ thủy phân ra 1 µmol acid béo trong 1 giờ tại pH 7,7; nhiệt độ 37oC Nếu sử du ̣ng cơ chất là dầu olive, hoạt độ riêng của enzyme PPL nằm trong khoảng 100 – 400 UI/mg protein Nếu sử dụng cơ chất là triacetin tại pH 7,4, nhiệt độ 37oC, hoạt độ riêng của enzyme PPL nằm trong khoảng 30 – 90 UI/mg protein

Enzyme PPL được bảo quản trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 2 – 8oC và được kiểm tra hoạt độ định kỳ mỗi tháng để kiểm tra sự thay đổi hoạt độ của chế phẩm enzyme theo thời gian

 Enzyme lipase từ Candida Rugosa

Enzyme lipase từ Candida rugosa là chế phẩm dạng bột thu từ loài nấm men cùng

tên do hãng Sigma (Mỹ) cung cấp

Chế phẩm có hoạt độ riêng là 1135 U/mg protein (sử dụng trên cơ chất là dầu ô liu)

ở pH 7.2, nhiệt độ 37°C

Enzyme LCR được bảo quản trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 2 – 8oC và được kiểm tra hoạt độ định kỳ mỗi tháng để kiểm tra sự thay đổi hoạt độ của chế phẩm enzyme theo thời gian

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất được sử dụng trong nguyên cứu được dùng để kiểm tra nguyên liệu, pha đệm và chuẩn độ Phần lớn hóa chất có xuất xứ từ Trung Quốc, Việt Nam (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Phosphate 1N

Phosphate 1N

3 Phenoltalein 1% Trung Quốc Chất chỉ thị màu

chỉ số AV

6 Coomassie brilliant blue G-250 Hàn Quốc

Kiểm tra hàm lượng protein của enzyme

7 Protein chuẩn Bovine serum

Kiểm tra hàm lượng protein của enzyme

11 Na2S2O3 0,01N Trung Quốc Kiểm tra PoV

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Bên cạnh những dụng cụ thí nghiệm thông thường có xuất xứ từ Trung Quốc như erlen, becher, cốc đong, ống đong, bình định mức, burette, pipette, bảng 2.2 trình bày một số thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2 Máy đồng hóa áp lực cao Đan Mạch

4 Micropipet EMCLab Ấn Độ

2.1.3.1 Thiết bị đồng hóa cơ và đồng hóa áp lực cao

Hình 2.2 Thiết bị đồng hóa cơ và đồng hóa áp lực cao

 Thiết bị đồng hóa cơ

Thiết bị đồng hóa cơ sử dụng trong nghiên cứu là thiết bị Heidolph Diax 900 được sản xuất bởi hãng Labexchange (Đức) Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa cơ được trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3: Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa cơ dùng trong nghiên cứu

 Thiết bị đồng hóa áp lực cao

Thiết bị đồng hóa áp lực cao sử dụng trong nghiên cứu được sản xuất bởi hãng APV – SPX (Đan Mạch) Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa áp lực cao được trình bày ở bảng 2.4

Bảng 2.4: Thông số kỹ thuật của thiết bị đồng hóa áp lực cao dùng trong nghiên cứu

Lượng mẫu nhỏ nhất để kiểm tra 100 mL

Vật liệu bao quanh pittong PVDF/EPDM

2.2 Sơ đồ nghiên cứu

Khảo sát sơ bộ các yếu tố

ảnh hưởng đến hoạt độ riêng của enzyme lipase

Quy hoạch thực nghiệm quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase

Nồng độ enzyme Nhiệt độ

- Hoạt độ, hoạt độ riêng

- Nghiên cứu 2 loại enzyme:

Porcine Panrea Lipase (LPP) và Candida Rugosa Lipase (LCR)

Hình 2.3: Sơ đồ nghiên cứu