Tối ưu hóa quy trình lên men tạo màng mỏng cellulose vi khuẩn và khai thác ứng dụng mới

Màng BC do chủng này tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lí như:độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG – HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ nhận xét 1: PGS TS Đồng Thị Thanh Thu

Cán bộ nhận xét 2: PGS TS Phan Ngọc Hòa

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM

Thời gian bảo vệ: Ngày 11 tháng 5 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI: “TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG MỎNG CELLULOSE VI KHUẨN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG MỚI”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tối ưu quá trình tạo màng mỏng cellulose vi khuẩn từ nước dừa già, cho sản

phẩm có độ bền kéo cao

- Khảo sát khả năng ứng dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn làm màng bao bảo

quản dừa tươi sơ chế tối thiểu

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/08/2016

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/05/2017

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Tp HCM, ngày tháng năm 2017

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô PGS TS Nguyễn Thúy Hương, cô đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận này, ở cô tôi đã học được rất nhiều điều từ chuyên môn đến cách sống

Xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô đã chỉ dạy và truyền cảm hứng nghề nghiệp cho tôi

Con cảm ơn cha mẹ đã tạo điều kiện cho con học tập, cảm ơn gia đình đã luôn yêu thương và ủng hộ con Cảm ơn bạn bè, đặc biệt là các anh chị và các bạn lớp CH2014 đã động viên, giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

TÓM TẮT

Đề tài “Tối ưu quy trình lên men tạo màng mỏng cellulose vi khuẩn và định hướng ứng dụng” nhằm tạo sản phẩm màng mỏng cellulose vi khuẩn (BC) có độ bền kéo cao, làm tăng khả năng ứng dụng của sản phẩm và khảo sát ứng dụng làm màng bao bảo quản dừa tươi sơ chế tối thiểu Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, khi nuôi cấy

chủng khuẩn Gluconacetobacter intermedius trong môi trường thích hợp tỷ lệ nước

dừa 89,2%, hàm lượng khoáng ammonium sulfate (SA) 1,07%, diammonium phosphate (DAP) 0,34% và đường glucose 5,2% thì màng BC thu được sau quá trình lên men có độ bền kéo đạt 32,515 Gpa

Phương trình hồi quy từ phần mềm minitab như sau:

Y = -38206 + 463,9x 1 + 23476x 2 + 28060x 3 + 104,2x 4 - 2,257𝑥12 - 10947𝑥22

- 48311𝑥32 - 3,811𝑥42 - 34,4x1x2 - 48,6x 1 x 3 - 1,555x 1 x 4 + 8059x 2 x 3

+ 43,0x 2 x 4 + 84,2x 3 x 4

Với: Y là độ bền kéo màng BC (Gpa)

x 1 , x 2 , x 3 , x 4 lần lược là 4 yếu tố: tỷ lệ nước dừa, nồng độ khoáng SA, nồng độ khoáng DAP, nồng độ đường glucose

Màng BC thu được từ quá trình lên men tối ưu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng ứng dụng làm màng bao bảo quản dừa tươi sơ chế tối thiểu và thu được các kết quả ban đầu Ở nhiệt độ mát (20 – 250C), dừa tươi được bao bằng màng

BC vẫn giữ nguyên giá trị cảm quan và chất lượng sau 14 ngày bảo quản, các lô dừa bảo quản bằng BC kết hợp với benzoat natri ở nồng độ 0,1% có khả năng bảo quản tốt trong 21 ngày, ở nồng độ natri benzoat 0,2% và 0,3% cùng cho kết quả tốt sau 28 ngày bảo quản

ABSTRACT

The topic “Optimization of the fermentation producing bacterial cellulose thin films and the exploitation of its new applications” to create product : cellulose baterial (BC) membrane have high tensile strength, increases the applicability of the product and explores the application of packing film to preserve minimally pre-prepared fresh coconut The results showed that the Gluconacetobacter intermedius was cultured in the appropriate medium coconut water ratio 89.2%, ammonium sulfate (SA) 1.07% , diammonium phosphate (DAP) 0.34% and glucose 5.2%, the BC membrane obtained after fermentation had a tensile strength of 32,515 Gpa

The regression equation from the minitab software is as follows:

Y = -38206 + 463,9x1 + 23476x2 + 28060x3 + 104,2x4 - 2,257x12 - 10947x22

- 48311x32 - 3,811x42 - 34,4x1x2 - 48,6x1x3 - 1,555x1x4 + 8059x2x3

+ 43,0x2x4 + 84,2x3x4 With: Y is the BC membrane tensile strength (Gpa)

x 1 , x 2 , x 3 , x 4 comb are 4 factors: coconut water ratio, SA mineral concentration, DAP concentration, glucose concentration

The BC membrane obtained from optimum fermentation we conducted experiments to investigate the possibility of application to preserve minimally pre-prepared fresh coconut and obtain the initial results At cool temperatures (20 – 250C), minimally pre-prepared fresh coconut with BC membranes retain their sensory and quality values after 14 days of storage, BC combined with 0.1% sodium benzoate can guarantee quality minimally pre-prepared fresh coconut for 21 days at 0.2% and 0.3% sodium benzoate gave good results after 28 days of storage

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tp HCM, ngày 5 tháng 5 năm 2017

Nguyễn Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT II MỤC LỤC V DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII CÁC CHỮ VIẾT TẮT IX

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi sinh vật sản sinh cellulose 3

1.1.1 Các nhóm vi sinh vật có khả năng sản sinh cellulose 3

1.1.2 Vi khuẩn Gluconacetobacter 3

1.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng 4

1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 6

1.4 Đặc điểm của màng cellulose tạo bởi vi khuẩn Gluconacetobacter sp 8

1.4.1 Cấu trúc màng 8

1.4.2 Đặc tính màng 9

1.4.3 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với Gluconacetobacter sp 10

1.4.4 Quá trình sinh tổng hợp màng 10

1.5 Một số ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn 12

1.5.1 Y học 12

1.5.2 Thực phẩm 13

1.5.3 Mỹ phẩm 14

1.5.4 Các ngành công nghiệp khác 14

1.6 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn tổng hợp cellulose trong và ngoài nước 15

1.7 Tổng quan về dừa tươi 17

1.7.1 Thành phần cấu tạo của quả dừa 17

1.7.2 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Giống 19

2.2 Môi trường dinh dưỡng 19

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Các bước thí nghiệm 19

2.3.2 Chọn lọc chủng giống tạo màng cellulose vi khuẩn có độ bền kéo cao 20

2.3.3 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men 22

a Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng 22

b Thí nghiệm sàng lọc 22

c Leo dốc tìm vùng cực trị 23

d Thí nghiệm tối ưu 23

2.3.4 Xử lý màng cellulose vi khuẩn 24

2.3.5 Thử nghiệm ứng dụng màng cellulose vi khuẩn bảo quản dừa tươi sơ chế tối thiểu………25

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28

3.1 Các khảo sát tiền đề 28

3.1.1 Sàng lọc chủng giống tạo màng cellulose vi khuẩn có độ bền kéo cao 28

3.1.2 Tái định danh chủng khuẩn 29

3.1.3 Một số đặc điểm sinh học của G intermedius, đặc điểm đại thể và vi thể 29

3.2 Tối ưu hóa các điều kiện lên men tạo màng của chủng G intermedius 30

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng 30

a Khảo sát tỷ lệ nước dừa 30

b Khảo sát nồng độ khoáng ammonium sulfate (SA) 31

c Khảo sát nồng độ khoáng diammonium phosphate (DAP) 32

d Khảo sát nồng độ glucose 32

3.2.2 Tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng 33

a Sàng lọc các yếu tố 33

b Leo dốc tìm vùng cực trị 36

c Thí nghiệm tối ưu hóa 37

3.3 Thử nghiệm ứng dụng màng cellulose vi khuẩn bảo quản dừa tươi sơ chế tối thiểu42 3.3.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí 44

3.3.2 Đường tổng 44

3.3.3 Độ pH 45

3.3.4 Acid tổng 46

3.3.5 Vitamin C 47

3.3.6 Nhận xét cảm quan và biện luận tổng hợp 48

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sản sinh cellulose 3

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tổng hợp BC của Gluconacetobacter sp 6 Bảng 1.3 Một số thông số vật lý và hoá lý của nước dừa nạo và cứng nạo 18

Bảng 2.1 Tên và ký hiệu chủng giống 19

Bảng 2.2 Thành phần môi trường 19

Bảng 2.3 Nội dung và các bước thí nghiệm 20

Bảng 2.4 Các yếu tố dinh dưỡng được khảo sát 22

Bảng 2.5 Sơ đồ ma trận thực nghiệm các biến thực hiện thí nghiệm sàng lọc theo Placket Burmen 22

Bảng 2.6 Sơ đồ ma trận thí nghiệm CCD 24

Bảng 2.7 Các nghiệm thức bảo quản dừa tươi sơ chế tối thiểu 25

Bảng 3.1 Đặc tính màng của các chủng khuẩn 28

Bảng 3.2 Tổ hợp điểm tâm các điều kiện dinh dưỡng trong thí nghiệm sàng lọc và tối ưu hóa 33

Bảng 3.3 Các mức giá trị của các biến thực hiện thí nghiệm sàng lọc 34

Bảng 3.4 Kết quả ma trận thực nghiệm theo Plackett-Burman để tối ưu hóa khả năng tạo màng BC có độ bền kéo cao 34

Bảng 3.5 Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố ảnh hưởng 35

Bảng 3.6 Thí nghiệm leo dốc và kết quả 36

Bảng 3.7 Vùng chứa điểm cực trị 37

Bảng 3.8 Các mức giá trị của biến thí nghiệm RSM – CCD 37

Bảng 3.9 Thí nghiệm RSM – CCD 38

Bảng 3.10 Kết quả thực nghiệm kiểm chứng giá trị tối ưu 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 (a) Cấu trúc A-BC và (b) cấu trúc S-BC được chụp dưới kính hiển vi điện tử

quét 9

Hình 1.2 Mô hình cho các quy trình sinh tổng hợp cellulose của Gluconacetobacter sp 11

Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản hóa sản xuất BC sử dụng g1ucose hoặc fructose là nguồn cacbon 11

Hình 1.4 Tế bào vi khuẩn giải phóng cellulose ra môi trường ngoài 12

Hình 1.5 Thành phần cấu tạo của trái dừa 17

Hình 3.1 Màng BC của các chủng khảo sát A (Bk1), B ( Bk2), C (Bk3), D (Bk4), E (Bk5) 28

Hình 3.2 Hình ảnh vi thể và đại thể của chủng khuẩn Gluconacetobacter intermedius29 Hình 3.3 Đồ thị đường cong tăng trưởng của chủng G intermedius 30

Hình 3.4 Độ bền kéo của màng BC ở các tỷ lệ nước dừa 31

Hình 3.5 Độ bền kéo màng BC ở các nồng độ SA 31

Hình 3.6 Độ bền kéo màng BC ở các nồng độ DAP 32

Hình 3.7 Độ bền kéo màng BC ở các nồng độ gluose 33

Hình 3.8 Đồ thị Pareto thể hiện mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến độ bền kéo màng BC 35

Hình 3.9 Bề mặt đáp ứng của độ bền kéo theo từng cặp yếu tố ảnh hưởng 40

Hình 3.10 Các giá trị tối ưu theo mô hình 41

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn tổng vi khuẩn hiếu khí sau thời gian bảo quản 44

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn lượng đường tổng của dừa sau thời gian bảo quản 45

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn pH của dừa sau thời gian bảo quản 46

Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn lượng acid tổng của dừa sau thời gian bảo quản 47

Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn lượng vitamin C của dừa sau thời gian bảo quản 48

Hình 3.16 Mẫu dừa bảo quản: 1 (ĐC1), 2 (ĐC2), 3 (BC sau 14 ngày), 4 (BC sau 21 ngày) 49

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A-BC Cellulose vi khuẩn sản xuất dưới điều kiện động

S-BC Cellulose vi khuẩn sản xuất dưới điều kiện tĩnh

MỞ ĐẦU

Cellulose là một trong những chất hữu cơ phổ biến nhất trên hành tinh, là thành phần chính của chất xơ thực vật Cellulose không chỉ được tổng hợp bởi thực vật mà chúng còn được tổng hợp bởi vi sinh vật, được gọi là cellulose vi khuẩn (BC) Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng

được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn như: Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Aerobacter, Sarcina, Trong đó, Glucenacetobacter được biết đến là chủng có khả năng sản xuất cellulose năng suất lớn Màng BC do chủng này tạo ra có cấu trúc hóa

học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lí như:độ bền

cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao Do đó, cellulose vi khuẩn không ngừng được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghệ thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý môi trường [17,

26, 36]

Trong lĩnh vực thực phẩm có thể kể hàng loạt các ứng dụng mới của cellulose

vi khuẩn như: màng thực phẩm BC, vật liệu cố định nấm men dùng trong lên men rượu vang hay chất ổn định sữa chua uống Màng BC thu nhận bằng phương pháp lên men bề mặt, sau khi xử lý màng đạt giá trị cảm quan tốt, có độ chịu lực cao và không

bị biến tính khi xử lý nhiệt Trong lĩnh vực y tế màng mỏng BC được sử dụng như một màng trị bỏng, màng da nhân tạo che chắn tạm thời vết thương Trong đó, có thể kể đến sản phẩm của công ty Biofill Produtos Biotecnologicos ở Brazil: Biofill® và Gengiflex® là những sản phẩm có ứng dụng rộng rãi trong điều trị bỏng và cấy ghép nha khoa Tại Việt Nam, có thể nhắc đến màng trị bỏng Acetul từ màng BC tinh khiết phối hợp với hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u và tinh dầu tràm trà Úc Ngoài ra, BC còn được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác như: màng lọc nước, màng lọc vi sinh, vải nhân tạo,màng ngăn âm thanh, bao bì và giấy chất lượng cao [3, 9, 11, 15]

Việc ứng dụng màng mỏng BC trong các lĩnh vực nói trên, đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, nâng cao đặc tính phù hợp với ứng dụng và đòi hỏi cellulose thu được phải ở dạng màng mỏng đồng nhất, đồng thời

có độ bền kéo cao Nắm bắt được vấn đề đó, đã có rất nhiều nghiên cứu xoay quanh việc tạo ra màng mỏng vi khuẩn và ứng dụng của nó Tuy nhiên, chưa có đề tài nào đi sâu vào việc cho ra màng BC có độ bền kéo tối ưu, nhằm nâng cao khả năng ứng dụng của chúng

Đề tài “Tối ưu hóa quy trình lên men tạo màng mỏng cellulose vi khuẩn và khai thác ứng dụng mới” Nhằm giải quyết các mục tiêu và nội dung sau

Để đạt được hai mục tiêu này nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm

* Nội dung:

- Chọn lọc chủng vi khuẩn tạo màng BC có độ chịu lực tốt

- Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng lên men sản xuất màng BC có độ chịu lực cao

- Định hướng làm màng bao bảo quản dừa tươi sơ chế tối thiểu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi sinh vật sản sinh cellulose

1.1.1 Các nhóm vi sinh vật có khả năng sản sinh cellulose

Cellulose vi khuẩn được sản xuất bởi nhiều giống vi sinh vật khác nhau như:

Aerobacter, Gluconacetobacter (còn gọi là Acetobacter), Achromobacter, Agrobacterium, Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium và Sarcina Cấu

trúc cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau, là khác nhau

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sản sinh cellulose

Giống Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Acetobacter Lớp màng ngoại bào

Dãy cellulose

Giữ vi khuẩn trong môi trường hiếu khí

Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật

Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải

Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải

Acetobacter Lớp màng ngoại bào

đó, Gluconacetobacter sp được chọn để tập trung nghiên cứu và ứng dụng trong sản

xuất màng bacterial cellulose (BC) theo quy mô công nghiệp

1.1.2 Vi khuẩn Gluconacetobacter

a Phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey, Gluconacetobacter sp thuộc:

+ Lớp: Schizomycetes + Bộ: Pseudomonadales + Bộ phụ: Pseudomonadieae + Họ: Pseudomonadaceae + Chi: Gluconacetobacter [26]

b Đặc điểm hình thái

Gluconacetobacter sp là loại vi khuẩn hình que, hơi cong hay thẳng kích thước

0,6 – 0,8μm x 2 – 5 μm, thường đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hay không di động và không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, tuy nhiên kết quả nhuộm Gram có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường

Gluconacetobacter sp thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên tăng trưởng mạnh ở

vị trí bề mặt tiếp xúc giữa môi trường nuôi cấy và không khí

Khuẩn lạc của Gluconacetobacter sp có dạng hình tròn đều, kích thước lớn

khoảng 2 – 5 mm đường kính, bề mặt nhầy và trơn lán, rìa mép nhẵn, mỏng và sáng màu hơn phần giữa khuẩn lạc [26, 33]

c Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn Gluconacetobacter sp phát triển ở nhiệt độ 25 – 350C, ở nhiệt độ

370C sẽ không phát triển ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu

Gluconacetobacter sp sinh trưởng tốt trong môi trường pH thấp từ 4 đến 6, nhờ

vào đặc tính này có thể hạn chế sự tạp nhiễm các khuẩn lạ bằng cách bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy

Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào loài [9, 33]

d Đặc điểm sinh hóa

Một số đặc điểm sinh hóa của Gluconacetobacter sp.bao gồm:

- Phản ứng dương tính với catalase

- Oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O

- Vi khuẩn hiếu khí

- Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer

- Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton

- Chuyển hóa glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 – 2 đơn vị

- Tổng hợp cellulose và không tạo sắc tố nâu [7]

1.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Gluconacetobacter sp có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon để sản xuất BC

bao gồm: monosacarit (như glucose và fructose), disaccharides (như sucrose và maltose), và rượu (như như ethanol, glycerol, và mannitol) tùy thuộc vào chủng mà nguồn carbon nào được sử dụng là tốt nhất Theo Milda, Jay và James (1994) thì fructose cho năng suất cellulose tốt nhất, theo sau là sự kết hợp của fructose + sucrose, fructose + lactose và sucrose Sự hiện diện của glucose trong môi trường hoặc kết hợp với các loại đường khác sẽ cho lượng cellulose thấp hơn đáng kể Ngược lại, Masaoka

và cs (1993) đã sử dụng chủng Gluconacetobacter xylinum IFO 13693 để lên men thu

màng BC trên các môi trường sử dụng nguồn carbon là monosacharide 5 hoặc 6 carbon, oligosaccharide, tinh bột, rượu và acid hữu cơ Kết quả, glucose cho lượng BC cao nhất với năng suất là tối đa, tiếp đến là glycerol 93% và fructose 92% Ở một nghiên cứu khác của Ramana, Tomar và Lokendra Singh (2000) thì mannitol, sucrose

và glucose được chứng minh là nguồn carbon tối ưu cho việc sản xuất cellulose Tất cả các nguồn carbon khác như lactose, galactose, acid citric, tinh bột và maltose sẽ cho năng suất tổng hợp cellulose thấp Điều này cũng tương tự với báo cáo của Faranakvà

cs (2015) khi sử dụng sucrose và mannitol như một nguồn carbon khác sẽ cho khối lượng BC sản xuất là tối đa trong cả ba môi trường Hestrin–Schramm, Yamanaka và Zhou [22, 30, 37, 40, 43, 47]

Tuy nhiên, những nguyên liệu kể trên thường đắt tiền và đôi khi cho năng suất

BC thấp, do đó dẫn đến chi phí sản xuất BC cao làm hạn chế việc phát triển sản phẩm này ở quy mô công nghiệp Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung

về những nỗ lực để sản xuất BC từ nguồn carbon của các nguyên liệu thay thế là những phế phẩm rẻ tiền trong ngành nông nghiệp và công nghiệp, chẳng hạn như: nước thải chế biến thực phẩm, rỉ đường, nước ép trái cây, rơm rạ, các loại chất thải dệt may phát sinh trong quá trình sản xuất sợi và vải Việc sử dụng các nguồn carbon thay thế này, mang lại nhiều lợi ích bao gồm cả giảm chi phí sản xuất của BC, tiết kiệm tài nguyên thiên nhiên và giảm vấn đề ô nhiễm môi trường

Năm 2011, Feng Hong và csđã sử dụng sản phẩm thủy phân của chất thải dệt may bằng enzyme 1-allyl-3-methylimidazolium chloride ([AMIM]Cl) như một nguồn carbon thay thế cho glucose Kết quả, khi sử dụng sản phẩm thủy phân này sẽ cho trọng lượng khô và độ bền kéo của BC cao hơn nhiều khi sử dụng nguồn carbon từ glucose lần lượt là 83% và 79%, khả năng giữ nước và độ dày màng thì thay đổi không đáng kể giữa hai nguồn carbon [23]

1.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Cùng với nguồn carbon, Gluconacetobacter sp sử dụng nguồn nitơ như là một chất thiết yếu Ảnh hưởng của nitơ đến sự tổng hợp cellulose của Gluconacetobacter

sp được tóm tắt qua bảng 1.2

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tổng hợp BC của Gluconacetobacter sp

Nguồn nitơ Năng suất tổng hợp cellulose (g/l)

D Hữu cơ + hữu cơ

Peptone + yeast extract

2.38 ± 0.20 1.12 ± 0.18 1.75 ± 0.08

5.12 ± 0.10 3.88 ± 0.18 3.88 ± 0.20 1.25 ± 0.05

5.25 ± 0.30 4.75 ± 0.32 2.25 ± 0.15 2.12 ± 0.20

2.62 ± 0.22 2.94 ± 0.20 2.00 ± 0.20 3.00 ± 0.15 3.25 ± 0.18 2.62 ± 0.10 2.88 ± 0.12 3.50±0.14 1.56 ± 0.06

[40]

1.2.3 Các chất phụ gia

Các chất phụ gia như: carboxymethylcellulose (CMC), agar, tinh thể cellulose được xác định là làm tăng sản lượng BC sản xuất trong môi trường nuôi cấy kích động, với CMC cho hiệu quả cao nhất, trong khi sodium alginate lại dẫn đến sự sụt giảm sản lượng BC [31]

1.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

1.3.1 Ảnh hưởng của phương pháp lên men

Tùy thuộc vào định hướng ứng dụng của BC để thực hiện phương pháp lên men tĩnh hoặc động Phương pháp lên men khác nhau sẽ cho đặc tính hóa lý và cấu trúc BC khác nhau phù hợp với ứng dụng đó

Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy S-BC tạo ra trong điều kiện này có dạng màng dày hoặc mỏng tùy thuộc vào độ dày môi trường và thời gian nuôi cấy Các sản phẩm S-BC thương mại thông dụng như: thạch dừa Nata-de Coco, màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, màng lọc khuẩn hay màng bao thực phẩm

Khi nuôi cấy động (chìm) BC (A-BC) được tạo ra dưới dạng các khối hạt nhỏ

có hình dạng khác nhau như: hình sao, hình cầu, hình elip hoặc dạng sợi, chúng phân tán trong môi trường dưới dạng huyền phù A-BC có khả năng giữ nước cao hơn S-

BC, thích hợp ứng dụng làm các chất nhũ hóa, chất mang, mỹ phẩm Kiểu nuôi cấy này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động Tuy nhiên, sau thời gian lên men thường phát sinh các thể đột biến Cel- một cách ngẫu nhiên Các chủng Cel- này sẽ làm hiệu suất BC giảm đáng kể vì không có khả năng sản xuất BC nữa [25, 32, 49]

1.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Gluconacetobacter sp từ 25 – 300C Nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm Ở nhiệt độ 240C sản lượng cellulose tạo thành tăng 50% trong 72h nuôi cấy, tuy nhiên khi sản xuất ở quy mô công nghiệp không cho kết quả như mong muốn Ở nhiệt độ cao 370C chúng sẽ không phát triển ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu [28, 34]

1.3.3 Ảnh hưởng của pH

Vi khuẩn Gluconacetobacter sp phát triển tốt trong môi trường pH thấp, do đó

môi trường nuôi cấy cần được acid hóa nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho

Gluconacetobacter sp., đồng thời ngăn chăn sự phát triển của các vi sinh vật có hại

pH tối ưu cho sự phát triển của các loài Gluconacetobacter là giữa 5,4 và 6,3 Tuy

nhiên, không nhất thiết đây cũng là khoảng pH tối ưu cùng với việc sản xuất cellulose

của chúng Các nghiên cứu khác nhau về việc tổng cellulose bởi Gluconacetobacter

sp cho thấy, pH 4,5 cho năng suất cao nhất, tiếp theo là pH 5,5 Cellulose không được sản xuất ở pH 3,5 và tăng trưởng của vi sinh vật cũng bị ảnh hưởng bởi độ pH thấp Trong đó pH 4,5 là tốt nhất cho vi khuẩn phát triển và sản xuất Còn theo nhóm nghiên cứu của Hàn Quốc (1999) trong môi trường nuôi cấy động, pH 5 là thích hợp nhất cho

sự tăng trưởng tế bào và sản sinh cellulose, trong khi đó pH 4 thích hợp cho sản xuất acid gluconic [28, 29, 40]

1.3.4 Ảnh hưởng của oxy

Gluconacetobacter sp là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Trong quá trình lên men

cần cung cấp một lượng oxy tương đối lớn, đồng thời độ thông khí là một trong những yếu tố quyết định năng suất BC Do đó, điều kiện lên men sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao hơn lên men tĩnh Đối với hình thức lên men tĩnh, cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng khí

và lớp môi trường lên men mỏng nhằm mang lại hiệu quả lên men tốt hơn

Wanatabe và Yamanaka (1995) khẳng định, trong môi trường nuôi cấy tĩnh tại nồng độ oxy là 10% và 15% cho sản lượng BC cao hơn nhiều trong điều kiện khí quyển Tương tự, nhóm nghiện cứu người Hàn Quốc (1999) đã chứng minh rằng, sản lượng cellulose đạt cao nhất khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường fed-bacth có nồng độ oxy 10%

1.4 Đặc điểm của màng cellulose tạo bởi vi khuẩn Gluconacetobacter sp

1.4.1 Cấu trúc màng

BC là một chuỗi polymer mạch thẳng gồm các phân tử glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4 glucan Các sợi BC mới sinh ra sẽ liên kết với nhau tạo thành các sợi sơ cấp (subfibril), có kích thước khoảng 1,5nm, đây được xem là các sợi tự nhiên mỏng nhất Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi (microfibil), các

vi sợi này được bao bọc trong các bó (bundle) và cuối cùng tạo nên các dải sợi mảnh ribbon Những dải sợi ribbon được tạo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hydro khi chúng được đẩy ra ngoài

Hình thái vi mô của BC khác nhau tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy BC có thể được sản xuất bởi hai phương pháp nuôi cấy, cụ thể là phương pháp nuôi cấy tĩnh

và động Trong môi trường tĩnh một màng sền sệt đặt trưng của BC được tích lũy trên

bề mặt môi trường, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy Ngược lại, dưới điều kiện môi trường động, BC được sản xuất dưới dạng các khối hạt nhỏ có hình dạng khác nhau như hình sao, hình cầu, hình elip hoặc dạng sợi, chúng có kích thước khoảng 10μm – 1mm phân tán trong môi trường dưới dạng huyền phù

Cả hai dạng BC sản xuất ở hai điều kiện khác nhau đều cho cấu trúc đan xen như mắt lưới, bao gồm các sợi cellulose siêu mịn Các hình thái hiểu vi của cấu trúc mắt lưới là tương tự nhau cho cả hai dạng BC Tuy nhiên có một số sự khác biệt về hình thái học trong sợi và cấu trúc mắt lưới giữa hai dạng BC Các sợi BC sản xuất dưới điều kiện tĩnh (S-BC) có cấu trúc lỏng lẻo hơn Ngược lại, những sợi BC sản xuất dưới điều kiện động (A-BC) được uốn cong và đan xen với nhau dẫn đến một cấu trúc dày đặc hơn cấu trúc mắt lưới của S-BC Hơn nữa đường kính của sợi A-BC dường như nhỏ hơn so với S-BC, mắc dù rất khó để ước tính kích thước của mỗi tơ nhỏ một cách chính xác Hình thái như vậy của sợi có thể được hình thành do sự chảy hỗn loạn trong môi trường động [19, 32, 41, 49]

Hình 1.1 (a) Cấu trúc A-BC và (b) cấu trúc S-BC được chụp dưới kính hiển vi

điện tử quét [32]

Trong BC, hai dạng cellulose kết tinh thường gặp được ký hiệu là dạng I và II Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế Thông thường dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn, cellulose II chỉ được

tổng hợp bởi một số loài sinh vật như: tảo, nấm mốc, và vi khuẩn Gluconacetobacter

sp tổng hợp được cả hai loại cellulose I và cellulose II Cellulose I rất bền, được tổng hợp từ hầu hết thực vật, có thể chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II không thể chuyển hóa thành cellulose I Các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose I được sắp xếp song song nhau theo một trục, ngược lại các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose II được sắp xếp theo kiểu ngẫu nhiên, đối song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn liên kết hidro, do đó cellulose II là dạng sợi ổn định nhất về mặt nhiệt động học [45, 46]

1.4.2 Đặc tính màng

Màng BC có một số tính chất sau:

- Độ bền hóa học, độ bền cơ học cao, sức căng lớn

- Tuy BC và celluose thực vật (PC) có công thức hóa học tương tự nhau nhưng BC có một đặc trưng quan trọng nhất chính là sự tinh khiết về mặt hóa học BC là cellulose sinh học duy nhất không chứa lignin, hemicellulose

và pectin, do đó có thể phân hủy sinh học bởi một số nhóm vi sinh vật và dễ dàng tinh chế hơn so với PC Vì vậy, cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai

- Màng BC được cấu trúc từ các sợi BC siêu mịn tạo nên độ xốp cao, giúp màng có khả năng thẩm thấu tuyệt vời cả chất lỏng và chất khí với công suất hấp thụ nước hơn 90% trọng lượng khô của nó

- Khả năng chịu nhiệt tốt lên đến khoảng 1000C mà tính chất màng không bị ảnh hưởng

- Có tính kháng khuẩn cao [18, 36]

1.4.3 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với Gluconacetobacter sp

Màng cellulose được sản xuất bởi Gluconacetobacter sp đóng nhiều vai trò

quan trọng cho sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật trong tự nhiên

- Cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện cạn kiệt nguồn thức ăn

- Gluconacetobacter sp là vi sinh vật hiếu khí, sự tổng hợp và tiết cellulose

giúp duy trì chúng ở vị trí gần bề mặt môi trường lỏng giàu oxy Do đó, chỉ những tế bào gần ranh giới giữa lỏng và khí mới sản xuất cellulose

- Vì độ nhớt và khả năng giữ nước của cellulose giúp Gluconacetobacter sp

có khả năng chống chịu với những thay đổi bất lợi như: pH, vi sinh vật gây bệnh, sự có mặt của chất độc và ion kim loại nặng Trong khi đó, các chất dinh dưỡng có thể được cung cấp một cách dễ dàng bằng cách khuếch tán qua màng

- Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV 23% vi khuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1giờ khi bị chiếu tia UV [18, 34, 49]

1.4.4 Quá trình sinh tổng hợp màng

Quá trình sinh tổng hợp màng BC từ Gluconacetobacter sp gồm nhiều phản

ứng liên tiếp nhau, với sự tham gia hệ enzyme xúc tác Quá trình này được chia thành hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh

a Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên, từ cơ chất glucose qua phản ứng phosphoryl hóa tạo ra phosphate (Glc-6-P) với sự tham gia của enzyme glucokinase (GK) Glucose-6-phosphate sẽ tham gia vào phản ứng isomer hóa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzyme xúc tác phosphoglucomutase (PGM) Tiếp tục glucose-1-phosphate được enzyme UDP-glucose pyrophospholaye chuyển hóa thành UDP-glucose Cuối cùng, UDP-glucose (UDPG) được polymer hóa thành cellulose và tiết ra môi trường ngoại bào nhờ cellulose synthase, một phức hợp protein màng

glucose-6-Trong giai đọan polymer hóa UDPG thành cellulose thì acid diguanylic GMP) hoạt động như một chất kích thích của cellulose synthase màng, trong sự vắng mặt của c-di-GMP, cellulose synthase là không hoạt động Sự tổng hợp của c-di-GMP được xúc tác bởi cyclase diguanylate, từ hai phân tử GTP qua pppGpG trung gian tuyến tính Sự hoạt hóa của cellulose synthase được ngừng lại bởi các hoạt động của hai enzyme phosphodiesteases c-di-GMP A và phosphodiesteases c-di-GMP B (PDE-

(c-di-A và PDE-B) PDE-(c-di-A phân cắt các c-di-GMP để tạo thành pGpG, mà sau đó nhanh chóng được phân giải để sản xuất ra hai phân tử 5'-GMP Các hoạt động của PDE-A là một cách chọn lọc ức chế bởi ion Ca2+

Hình 1.2 Mô hình cho các quy trình sinh tổng hợp cellulose của Gluconacetobacter sp

[21]

Một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đường fructose

hiệu quả hơn sẽ đi theo con đường từ fructose chuyển hóa thành fructose-6-phosphate nhờ enzyme fructose hexokinase (FHK) Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase

có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hoá fructose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose [20, 21, 36, 44, 46]

Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản hóa sản xuất BC sử dụng g1ucose hoặc fructose là nguồn cacbon [36] FHK: fructose hexokinase; GHK: glucose hexokinase; GDH: glucose dehydrogenase; GADH: gluconate dehydorogenase; PGI: phosphoglucose isomerase; PGM: phosphoglucomutase; UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase; CSEs: cellulose synthesis enzyme; ASEs: acetan synthesis enzyme; Frc: fructose; Glc: glucose; GlcA: gluconate; keto GlcA: keto- gluconate; Frc-6-P: fructose-6-phosphate; Glc-6-P: glucose-6-phosphate; Glc-1-P: glucose-1-phosphate; UDP-Glc: uridine diphosphate glucose.

b Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan gồm các phân tử glucopyranose nối với nhau bằng liên kết 1,4 glucan Các chuỗi glucan này liên kết với nhau nhờ liên kết yếu Van Der Waals tạo thành lớp chuỗi glucan Các chuỗi glucan này nhanh chóng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi sơ cấp gồm 16 chuỗi glucan Các sợi sơ cấp kết hợp lại tạo thành các vi sợi, các vi sợi liên kết với nhau tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ nhỏ trên bề mặt tế bào vi khuẩn [38, 42]

β-Hình 1.4 Tế bào vi khuẩn giải phóng cellulose ra môi trường ngoài [38]

1.5 Một số ứng dụng của màng cellulose vi khuẩn

Màng BC do Gluconacetobacter sp sản xuất có cấu trúc hóa học đồng nhất với

cellulose thực vật nhưng nhờ quá trình sản xuất dễ dàng, diện tích hay bề dày lớp màng có thể chủ động điều khiển từ điều kiện nuôi cấy Bên cạnh đó, màng BC còn có một số tính chất hóa lý như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, khả năng phục hồi và độ tinh khiết cao Do đó, BC là màng sinh học có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

1.5.1 Y học

Do cấu trúc mạng lưới nano ba chiều độc đáo, BC có khả năng giữ nước cao, độ bền cơ học cao và khả năng kích ứng da thấp, tất cả đều cho phép màng BC có thể phục vụ như một giá đỡ tự nhiên cho sự tái sinh của các loại mô và được sử dụng như tấm da nhân tạo bao phủ tạm thời vết thương để chữa bỏng

Biofill® và Gengiflex® là sản phẩm của BC có ứng dụng rộng rãi trong phẫu thuật và cấy ghép nha khoa Các trường hợp bỏng mức độ hai, độ ba và loét đều có thể được điều trị thành công với Biofill®, như thay thế da tạm thời cho con người Những

ưu điểm sau đã được ghi nhận cho Biofill® trong hơn 300 phương pháp điều trị: giảm đau tức thời, giảm nhiễm trùng, dễ dàng kiểm tra vết thương nhờ đặc tính trong suốt của màng, khả năng hấp thụ dịch rỉ vết thương trong quá trình băng bó góp phần giảm thời gian và chi phí điều trị Gengiflex® cũng được phát triển để phục hồi nha chu

mô Tại Việt Nam, Nguyễn Văn Thanh và Huỳnh Thị Ngọc Lan (2005) trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu cho ra sản phẩm màng trị bỏng sinh học Acetul được làm từ màng mỏng BC tẩm dầu mù u và tinh dầu tràm trà Úc

Màng Acetul có nhiều ưu điểm như khả năng hút dịch tốt, độ bền cơ học cao, thông thoáng, có khả năng cản khuẩn 100%, không gây kích ứng da Màng có độ dày thích hợp, mềm mại, đảm bảo tính cảm quan và khả năng bám dính vào vết thương trong quá trình điều trị

Ngoài việc sử dụng như một vật liệu băng bó và chăm sóc vết thương, cellulose sản xuất từ vi khuẩn còn được sử dụng như mạch máu nhân tạo, với các đặc tính tốt hơn so với các vật liệu tổng hợp đang được sử dụng như: khả năng duy trì hình dạng tốt, chống ăn mòn, đặc biệt mạch máu được tạo từ cellulose vi khuẩn mang nguy cơ tổng hợp cục máu đông thấp, điều này có nghĩa là cellulose hoạt động rất tốt trong việc tiếp xúc với máu

Giác mạc nhân tạo: nhờ vào các thuộc tính của BC như cấu trúc các lỗ siêu nhỏ, tính chất cơ học đặc biệt đã giúp cho việc duy trì áp lực nội nhãn và khả năng nhìn thấy rõ ở một mức độ nhất định [3, 10, 24, 35, 38, 39]

1.5.2 Thực phẩm

Ứng dụng đầu tiên của BC trong sản xuất thực phẩm là thạch dừa (Nata de coco), đây được xem là món ăn truyền thống của Philippine và rất phổ biến ở nhiều quốc gia khác trong đó có Việt Nam Cùng với thạch dừa, BC còn được dùng như là thực phẩm chức năng giành cho người béo phì, phức hợp của cellulose vi khuẩn và

nấm Monascus sẽ là tiềm năng trở thành một thực phẩm mới như thịt chay hoặc hải

sản chay, chúng cung cấp hàm lượng chất xơ cao, ít calori và các chất dinh dưỡng lành mạnh Đặc biệt, BC còn được sử dụng như đường viền của kem, giữ cho chúng không tan chảy trong ít nhất 60 phút ở điều kiện nhiệt độ thường

Trong công nghiệp đồ uống, BC được dùng như chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức uống khác Bên cạnh đó, BC còn góp mặt trong một số loại thứ uống như trà Manchurian, nước uống Kvac, đặc biệt là trà Kombucha, một loại thức uống ít calori được cho là có khả năng phòng một số bệnh ung thư, giảm rủi ro của một số bệnh lý như bệnh tim mạch, huyết áp

Bên cạnh đó, BC cũng có những đóng góp không nhỏ trong công nghiệp lên men thực phẩm Chúng được dùng như giá thể hút và trữ môi trường để cố định tế bào

vi sinh vật hoặc enzyme Điều này giúp cho sự ổn định của vi sinh vật và enzyme tăng lên, chống lại những thay đổi của nhiệt độ và pH, đồng thời có thể tái sử dụng nhiều lần

Ngoài ra, việc dùng màng BC làm màng bao thực phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng và được quan tâm nhiều nhất trong ngành công nghiệp bao bì những năm gần đây Các loại vi khuẩn gây thối rữa là nguyên nhân chính làm cho thực phẩm

bị ôi thiu và giảm bớt thời gian sử dụng Từ đó chúng ta có nhiều cách để bảo quản sản phẩm như thanh trùng, khử trùng, dùng hóa chất để bảo quản chống vi sinh vật Tuy nhiên, một cách đơn giản ta có thể sử dụng cellulose vi khuẩn để ứng dụng làm màng bao chống vi sinh vật Một nghiên cứu do tác giả Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị

Tưởng An thực hiện, đã cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis trên chất mang BC

để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin và bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Theo

đó, chất chống vi sinh vật sẽ được kết hợp với màng, làm thành bức tường bảo vệ thực phẩm khỏi các tác nhân gây hại, đồng thời hạn chế được việc sử dụng hóa chất trong bảo quản, khi sử dụng sản phẩm màng có thể được loại bỏ dễ dàng và có khả năng phân hủy sinh học Kết quả cho thấy, có thể bảo quản thịt tươi đến 3 ngày bằng màng

BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/m vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN 7046:2002 [12, 24, 38, 48]

1.5.3 Mỹ phẩm

Các sản phẩm ứng dụng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực mỹ phẩm:

- Mặt nạ dưỡng da: có tác dụng dưỡng ẩm, cải thiện độ đàn hồi và giảm bã nhờn, đặt biệt không gây kích ứng với da Trong một số trường hợp, màng

BC kết hợp với tá dược vừa đủ có thể được sử dụng để điều trị một số tình trạng của da như: viêm da dị ứng và bệnh vẩy nến

- Kem dưỡng da: việc bổ sung các mảnh vụn BC không chỉ có tác dụng cải thiện sự thẩm thấu qua da của các hoạt chất có trong mỹ phẩm, mà còn làm tăng khả năng giữ ẩm cho da, hấp thụ bã nhờn cũng như tẩy tế bào chết trên

da

- Nhờ vào đặc tính trong suốt, giúp ánh sáng dễ dàng truyền qua đồng thời có khả năng hút nước giữ ẩm và không gây kích ứng sinh học, BC còn được dùng như một loại vật liệu mới cho kính áp tròng Ngoài ra, BC còn được sủ dụng như chất dưỡng ẩm cho môi, da, chăm sóc móng tay và giúp kéo dài mùi hương của nước hoa [24, 38]

1.5.4 Các ngành công nghiệp khác

Trong các ngành công nghiệp khác, BC còn có nhiều ứng dụng quan trọng như:

- Cellulose vi khuẩn được nghiên cứu như một chất kết dính cho giấy, nhờ các bó vi sợi (microfibil) cực nhỏ của chúng tạo nên một loại giấy chất lượng cao Tận dụng đặc tính đó, công ty Ajinomoto cùng với Mitsubishi Paper Mills Nhật Bản hiện đang tích cực phát triển cellulose vi khuẩn để sản xuất giấy, sản phẩm tạo ra có độ bền kéo tốt hơn sản phẩm thông thường Bên cạnh đó, Basta và Elsaied đã khẳng định rằng, việc kết hợp 5% BC với bột gỗ trong quá trình sản xuất giấy sẽ cải thiện đáng kể lượng cao lanh, sức mạnh và khả năng chống cháy của giấy

- Phim dẫn điện: việc kết hợp màng mỏng BC với các vật liệu dẫn điện như MWCNTs, GNPs, PANi làm tăng khả năng điện dẫn của chúng Đây có thể được sử dụng trong quang điện tử, bao gồm các điện cực, màn hình và thiết bị điện tử khác

- Cảm biến sinh học: nhờ vào cấu trúc xốp, khả năng hấp thụ tốt bao gồm cả chất khí và chất lỏng, cùng với sự hiện diện của các nhóm hydroxyl trong cấu trúc hóa học của nó, đã làm cho BC trở thành một vật liệu lý tưởng được

sử dụng như thiết bị cảm biến khí, khi kết hợp chúng như lớp màng phủ với

sự nghiên cứu rộng rãi về BC

1990, Saxena lần đầu tiên xác định được gene tổng hợp cellulose ở vi khuẩn

Gluconacetobacter sp., từ đó quá trình tổng hợp cellulose ở vi khuẩn này cũng được

Gluconacetobacter sp và sản phẩm BC của nó được tập trung chủ yếu vào sản xuất và

ứng dụng Có thể kể đến các nghiên cứu điển hình như:

2001, Cheng và cộng sự phát hiện rằng nuôi G xylinum trong bình lên men sục

khí cho sản phẩm cellulose cao hơn lên men thông thường Trong điều kiện này cellulose được tạo thành các viên có hình elip và hình tròn, chúng có khả năng vận chuyển oxy cao

2001, Son và Heo cho thấy trong điều kiện nuôi cấy lắc, sản lượng BC chủng

G xylinum sp A9 tăng lên đi kèm với sinh trưởng của tế bào Điều này có thể chứng

minh rằng mật độ tế bào tăng sẽ cho sản lượng BC tăng

2002, Ishida et al đã tạo ra chủng đột biến EP1 từ chủng hoang dại G xylinum

BPR2001 Với mong muốn chủng EP1 được tạo thành sử dụng triệt để nguồn uridine diphosphate glucose (UDP-GLC) trong con đường sinh tổng hợp cellulose, từ đó năng suất sản xuất BC tăng, bằng cách làm gián đoạn sự biểu hiện của gen ACEA mã hóa enzyme b-glucosyltransferase trong sinh tổng hợp acetan Tuy nhiên, không đúng như

kỳ vọng, sản lượng BC do EP1 sản xuất giảm trong môi trường động và tương đương với dòng mẹ BPR2001 trong môi trường tĩnh Khi EP1 được nuôi trong môi trường có

bổ sung acetan, khả năng sản xuất BC của nó được phục hồi đến mức giống như của chủng BPR2001 Điều này chứng tỏ rằng acetan và quá trình tổng hợp BC không liên quan trực tiếp trên cấp độ di truyền

2009, Kuan-Chen Cheng và cộng sự đã cải thiện sản xuất BC từ

Gluconacetobacter sp bằng cách sử dụng hệ thống màng sinh học PCS trong quá trình

lên men Việc sản xuất BC kết hợp màng sinh học PCS này sẽ cho năng suất cao hơn,

ổn định nhiệt hơn và BC tạo ra có sức bền cơ cao hơn

2012, Một phương pháp cải tiến cho sản xuất BC, được gọi là “phương pháp đa lên men” (multilayer fermentation method) được thiết lập bởi Fu et al Phương pháp cải tiến này được tạo ra bằng cách kết hợp cả hai quá trình nuôi cấy tĩnh và động BC tạo ra từ phương pháp này có cấu trúc nano tương tự như BC thông thường Tuy nhiên, phương pháp đa lên men hiệu quả hơn trong việc kiểm soát độ dày và tính đồng nhất của màng BC

2014, Keshka cho thấy rằng, sự hiện diện của vitamin C trong môi trường HS

sẽ làm tăng cường sản xuất BC của các chủng Gluconacetobacter sp., bằng cách giảm

nồng độ acid gluconic được sản sinh ra trong quá trình sản xuất của chúng

1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn tổng hợp cellulose ở nước ta tập trung chủ yếu vào những nghiên cứu sản xuất và ứng dụng Một loạt các nghiên cứu sản xuất và ứng dựng của màng BC có thể kể đến như:

Nguyễn Thúy Hương và cộng sự (2008) đã phát triển thêm một ứng dụng mới của màng BC, sử dụng màng BC làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật Bước đầu sử dụng màng mỏng BC hấp thụ bacterioncin bảo quản thịt tươi đến 3 ngày mà vẫn đảm bảo chất lượng Cũng trong năm đó, Nguyễn Thúy Hương đã cho thấy có thể sử dụng mật rỉ đường, nước mía và dịch trái cây thay thế môi trường truyền thống nước dừa để sản xuất BC

Nguyễn Thị Mỹ Lan và cộng sự (2009) đã thử nghiệm thành công phương pháp điều trị bỏng trên chuột, bằng cách sử dụng dịch paste tạo ra từ sự kết hợp của BC, Chitosan tan trong nước (WSC), Polyvinyl pyrolidone (PVP) và Nano bạc Kết quả, khi bôi dịch paste lên vết bỏng có thể rút ngắn thời gian lành hóa, vùng da tổn thương phục hồi lại như bình thường Thử nghiệm này đã góp phần trong việc điều trị cho các bệnh nhân bỏng

Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự (2012) đã thiết lập được điều kiện lên men tốt

nhất cho chủng vi khuẩn G xylinum BHN 2, màng BC do chủng này tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo độ thấu khí cao, hút nước tốt, do đó có thể ứng dụng trong điều trị bỏng

Phạm Văn Phiến và Nguyễn Thúy Hương (2013) đã thành công trong việc tối

ưu hóa quy trình lên men thu nhận BC từ môi trường rỉ đường và môi trường nước mía

Tóm lại, celluolose vi khuẩn được tạo ra bởi quá trình lên men tĩnh trải mỏng là một loại màng có nhiều đặc tính nổi bật, mang lại nhiều ứng dụng hữu ích cho con

người Do đó, việc phát triển sản xuất màng mỏng, nâng cao đặc tính ứng dụng cụ thể

là độ bền kéo là hết sức cần thiết

1.7 Tổng quan về dừa tươi

1.7.1 Thành phần cấu tạo của quả dừa

Về mặt thực vật học, dừa là loại quả khô đơn độc, được biết đến như là quả hạch có xơ Vỏ quả ngoài thường cứng, nhẵn, nổi rõ 3 gờ, lớp vỏ quả giữa là các sợi

xơ gọi là xơ dừa và bên trong nó là lớp vỏ quả trong hay gáo dừa hoặc sọ dừa, lớp vỏ quả trong hóa gỗ, khá cứng, có ba lỗ mầm có thể nhìn thấy rất rõ từ phía mặt ngoài khi bóc hết lớp vỏ ngoài và vỏ giữa (gọi là các mắt dừa) Thông qua một trong các lỗ này thì rễ mầm sẽ thò ra khi phôi nảy mầm Bám vào thành phía trong của lớp vỏ quả trong

là nội nhũ dạng anbumin dày hay còn được gọi là cùi dừa, nó có màu trắng và là phần

ăn được của hạt Khi quả dừa còn non, nội nhũ bên trong còn mỏng và mềm và có thể nạo dễ dàng Nhưng lý do chính để hái dừa vào giai đoạn này là để lấy nước dừa làm thức uống; những quả to có thể chứa tới 1 lít nước uống bổ dưỡng Khi quả đã già và lớp vỏ ngoài chuyển thành màu nâu (khoảng vài tháng sau) thì nó sẽ rụng từ trên cây xuống Vào thời điểm đó nội nhũ đã dày và cứng hơn, trong khi nước dừa sẽ có vị nồng hơn [1]

Hình 1.5 Thành phần cấu tạo của trái dừa [1]

1.7.2 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa

Đã từ rất lâu, dừa được biết đến với nhiều công dụng từ thân dừa, lá dừa, vỏ dừa, bông dừa đặc biệt là nước dừa Nước dừa được coi là một trong những loại nước giải khát rất phổ biến và được yêu thích từ nông thôn đến thành thị ở nhiều quốc gia khác nhau Trong nước dừa chứa nhiều chất khoáng (K, Na, Mg, Ca ) vitamin (vitamin C và các vitamin nhóm B), acid amin, enzyme và các yếu tố tăng trưởng Thành phần hóa học của nước dừa ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Nước dừa của các giống dừa khác nhau có chứa các hợp chất khác nhau, đồng thời thành phần hóa học cũng khác nhau trong các giai đoạn trưởng thành của quả [27]

Bảng 1.3 Một số thông số vật lý và hoá lý của nước dừa nạo và cứng nạo

Thông số vật lý và hoá lý (đơn vị) Dừa nạo Dừa cứng nạo

Chỉ số peroxyde (POV) Không phát hiện Không phát hiện

Tuy nhiên, để có thể xuất khẩu dừa tươi sang những thị trường nói trên đòi hỏi sản phẩm cần phải có thời gian bảo quản khá dài (4 – 6 tuần), trong khi đó hiện tại ở Việt Nam chưa có nhiều biện pháp bảo quản hiệu quả và tiết kiệm, chính vì thế vấn đề xuất khẩu dừa tươi vẫn còn hạn chế Do đó, việc tìm ra giải pháp bảo quản dừa tươi với thời gian bảo quản kéo dài mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng bên trong của quả và giá thành bảo quản thấp là hết sức cần thiết

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Giống

Các chủng giống tạo màng cellulose có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống của bộ môn Công Nghệ Sinh học - Đại học Bách Khoa tp HCM Chủng giống được nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng có thành phần chính là nước dừa và bảo quản ở nhiệt độ

3 – 50C Tên giống và ký hiệu được thể hiện chi tiết trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Tên và ký hiệu chủng giống

Ký hiệu mẫu Tên giống

2.2 Môi trường dinh dưỡng

Gồm các môi trường hoạt hóa, môi trường nhân giống và môi trường lên men Trong đó, các thành phần và nồng độ như nhau ở môi trường hoạt hóa và môi trường nhân giống, môi trường lên men có sự khác biệt

Diammonium phosphate (DAP) : 2g

Ammonium sulfate (SA) : 8g

Acid acetic : 5mL

Nước dừa già : 1L

Glucose : 20g Diammonium phosphate (DAP) : 2g Ammonium sulfate (SA) : 8g Acid acetic : 5mL Nước dừa già : 0,8L Nước cất : 0,2L

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các bước thí nghiệm

Bảng 2.3 Nội dung và các bước thí nghiệm 2.3.2 Chọn lọc chủng giống tạo màng cellulose vi khuẩn có độ bền kéo cao

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành lên men và tuyển chọn chủng khuẩn thông qua các chỉ tiêu:

- Khả năng tạo màng BC có độ bền kéo cao

- Tạo màng BC có độ đồng đều tốt

- Khả năng tạo màng, thông qua khối lượng khô của màng

Các chủng giống sau khi hoạt hóa và tăng sinh sẽ được bổ sung vào các khay lên men chứa cùng một loại môi trường lên men và nuôi cấy ở cùng điều kiện trong 72 giờ Sau thời gian lên men, tiến hành thu màng BC, thực hiện đánh giá chỉ tiêu của màng Thí nghiệm tiến hành với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại

thiểu

Từ lực kéo đứt và độ dày của màng xác định được ứng suất:

σ = 𝐹

4.𝑑

σ: Ứng suất (N/mm2) F: Lực kéo đứt (N) d: Bề dày của màng (mm)

Độ bền kéo được xác định tại Phòng thí nghiệm Khoa học vật liệu, Trường Đại học Bách Khoa, Tp HCM

Đo độ đồng đều của màng:

Độ đồng đều là một trong những chỉ tiêu quan trọng có liên quan đến chất lượng của màng, nhất là màng mỏng Độ đồng đều càng lớn chứng tỏ tính đồng nhất của màng càng cao, cho sản phẩm ứng dụng càng tốt Độ đồng đều của màng được tính như sau:

- Đo độ dày của màng ở 3 hoặc 5 vị trí đường chéo theo phương pháp ngẫu nhiên (mm)

- Tính độ dày trung bình của màng (mm): lấy tổng độ dày của màng đã đo chia cho số điểm được đo

- Tính khoảng biến động của độ dày trung bình (tính bằng mm – cùng đơn vị tính với đơn vị trung bình): là số chênh lệch ± 10% của độ dày trung bình

- Tính độ đồng đều: là % số điểm đã đo có độ dày nằm trong khoảng biến động trên Màng đồng nhất sẽ có độ đồng đều từ 80% trở lên

Yếu tố cố định: Môi trường và điều kiện nuôi cấy là như nhau đối với tất cả các chủng giống

Yếu tố thay đổi: Lần lượt thay đổi từng loại chủng giống nuôi cấy

Chủng khuẩn cho màng có các đặc tính tối ưu sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo và tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh học (quan sát vi đại thể, khảo sát đường cong sinh trưởng)

Quan sát hình thái đại thể vi thể của chủng tuyển chọn:

Trải đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng từ 48 – 72h để quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc

Nhuộm Gram, quan sát hình dạng, kích thước và sự liên kết của tế bào trên kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần

Khảo sát đường cong sinh trưởng: Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng

khuẩn bằng phương pháp đo độ đục của dịch huyền phù tế bào sau mỗi 2 giờ nuôi cấy, thông qua phương trình đường chuẩn của chủng

2.3.3 Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men

a Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng

Xác định độ bền kéo của màng BC được tạo thành ở các mức nồng độ dinh dưỡng khác nhau, từ đó xác định nồng độ dinh dưỡng lên men cho màng BC có độ bền kéo tối ưu

Thí nghiệm khảo sát với 4 yếu tố được thể hiện trong bảng 2.4 Mỗi yếu tố thực hiện khảo sát ở 4 mức và 3 lần lặp lại

Bảng 2.4 Các yếu tố dinh dưỡng được khảo sát

Từ các thí nghiệm đơn, ta chọn ra được tổ hợp các điều kiện dinh dưỡng mà tại

đó màng BC tạo ra có độ bền kéo cao để tiến hành thí nghiệm sàng lọc được thiết kế theo Plackett – Burman gồm 12 thí nghiệm Thí nghiệm được thiết kế với mức thấp (-1) và mức cao (+1) của từng yếu tố được liệt kê trong bảng 2.5 Từ thí nghiệm này ta sàng lọc mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến độ bền kéo để thuận lợi cho quá trình tối ưu hóa

Hàm đáp ứng được chọn là độ bền kéo của màng BC

Bảng 2.5 Sơ đồ ma trận thực nghiệm các biến thực hiện thí nghiệm sàng lọc

theo Placket Burmen

Hàm đáp ứng được chọn là độ bền kéo của màng BC

d Thí nghiệm tối ưu

Khi thí nghiệm đã tiến gần đến vùng tối ưu, mô hình bậc một sẽ không còn phù hợp để đánh giá thí nghiệm nữa Lúc này cần thiết kế thí nghiệm bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM ) để xác định cực trị cho hàm mục tiêu và biểu diễn chính xác quan hệ vào-ra

Thí nghiệm được thực hiện theo thiết kế trung tâm phức hợp (CCD – Central Composite Design) gồm 31 nghiệm thức với 5 mức giá trị (-2) (-1) (0) (1) (2) được thể hiện qua bảng 2.6

Hàm mục tiêu được lựa chọn là độ bền kéo của màng (Y) được biểu diễn dưới dạng phương trình bậc 2 tổng quát như sau:

Y= b 0 + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 3 x 3 + b 4 x 4 + b 12 x 1 x 2 + b 13 x 1 x 3 + b 14 x 1 x 4 + b 23 x 2 x 3 +

b 24 x 2 x 4 + b 34 x 3 x 4 + b 11𝑥12 + b 22𝑥22 + b 33𝑥32+ b 44𝑥42Trong đó: b1, b2, b3, b4 là các hệ số bậc 1

b11, b22, b33, b44 là các hệ số bậc 2 b12, b13, b14, b23, b24, b34 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố

x 1 , x 2 , x 3 , x 4 là các biến độc lập tương ứng: tỷ lệ nước dừa, nồng độ SA, nồng độ DAP, nồng độ glucose