Khảo sát sự ảnh hưởng của đường và chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tổng hợp glucan của hệ sợi nấm linh chi ganoderma lucidum trong nuôi cấy lỏng

--- CAO PHƯƠNG THẢO KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐƯỜNG VÀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT LÊN SỰ TỔNG HỢP GLUCAN CỦA HỆ SỢI NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum TRONG NUÔI CẤY LỎNG Chuyên

-

CAO PHƯƠNG THẢO

KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐƯỜNG VÀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT LÊN

SỰ TỔNG HỢP GLUCAN CỦA HỆ SỢI NẤM LINH CHI

Ganoderma lucidum TRONG NUÔI CẤY LỎNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2017

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS HOÀNG MỸ DUNG

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày 28 tháng 07 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

2 Thư ký hội đồng: TS PHAN THỊ HUYỀN

3 Ủy viên phản biện 1: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

4 Ủy viên phản biện 2: TS HOÀNG MỸ DUNG

5 Ủy viên hội đồng: TS VÕ ĐÌNH LỆ TÂM

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN T HẠC SĨ

NGÀNH: Công nghệ Sinh học

1 Đầu đề luận văn: Khảo sát sự ảnh hưởng của đường và chất điều hòa sinh

trưởng thực vật lên sự tổng hợp glucan của hệ sợi nấm linh chi Ganoderma lucidum trong nuôi cấy lỏng.

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

Nội dung 1: Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng sinh và tổng hợp polysaccharide nội bào của hệ sợi nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự

gia tăng sinh khối và tổng hợp β – glucan của hệ sợi nấm Linh chi Ganoderma

lucidum

3 Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 15/08/2016

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 5/6/2017

5 Họ và tên người hướng dẫn chính: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn

TP.HCM, ngày … tháng … năm20…

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

MS: 60 42 02 01

TRƯỞNG KHOA

(Ký và ghi rõ họ tên)

Luận văn: “Khảo sát sự ảnh hưởng của đường và chất điều hòa sinh trưởng thực

vật lên sự tổng hợp glucan của hệ sợi nấm linh chi Ganoderma lucidum trong nuôi cấy lỏng” được thực hiện từ tháng 8/2016 đến tháng 6/2017 Trong suốt quá trình học

tập và thực hiện luận văn tại trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên và giúp đỡ để hoàn thành tốt luận văn

Xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Bách Khoa TPHCM, các giảng viên khoa Kỹ thuật Hóa học nói chung và bộ môn Công nghệ Sinh học nói riêng đã tạo điều kiện học tập, đã tận tình truyền đạt kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện luận văn tại trường

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến Cô Lê Thị Thủy Tiên, người Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn Cảm ơn

cô đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Xin cám ơn đến các thầy cô, các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện, hướng dẫn tôi sử dụng các thiết bị, hỗ trợ tôi trong những lúc cần thiết

Cám ơn chị Thủy, anh Tuân, các em Quỳnh, Quế Anh, Hạnh, Hưng,…và các bạn

đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Cám ơn Ba Mẹ và gia đình đã ở bên cạnh, ủng hộ và nuôi dưỡng tôi Gia đình luôn là chỗ dựa, là động lực để tôi phấn đấu và trưởng thành

Cuối cùng xin gửi lời chúc sức khỏe, thành công và hạnh phúc đến tất cả mọi người

TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2017

Học viên Cao Phương Thảo

Nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum là một loại nấm dược liệu được xếp vào

loại “thượng dược” với tác dụng điều hòa miễn dich, kháng tế bào ung thư, điều hòa lượng đường trong máu… Những tác dụng này chủ yếu xuất phát từ hoạt tính của nhóm polysaccharide của nấm Linh chi

Hiện nay có trên 200 loại polysaccharide thu nhận từ nấm Linh chi, trong đó

β – glucan là thành phần chủ yếu và đóng vai trò quan trọng bởi khả năng tăng cường

hệ thống miễn dịch tự nhiên ở người

Kỹ thuật nuôi trồng nấm Linh chi trong môi trường lỏng ngày càng phát triển mạnh ở một số quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ Kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian thu nhận sản phẩm Kỹ thuật này không những rút ngắn thời gian thu nhận sản phẩm β – glucan từ nấm Linh chi mà còn cải thiện hàm lượng β – glucan so với

kỹ thuật nuôi trồng cổ điển

Nghiên cứu của chúng tôi trong luận văn này nhằm khảo sát ảnh hưởng của các loại đường (glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose) và chất điều hòa sinh trưởng thực vật (gibberellin, auxin và cytokinin) đến sự tăng sinh và tổng hợp β – glucan của

hệ sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng Kết quả thu được như sau: lactose 80 g/L

là nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sự tích lũy IPS của hệ sợi nấm (sinh khối đạt GA3 ức chế sự tăng sinh và tổng hợp β – glucan ở tất cả các nồng độ khảo sát (1 – 5 mg/L) Ngược lại, BA 1 mg/L có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của hệ sợi nấm Linh chi hiệu quả nhất (35,45 ± 0,10g DW/L), đồng thời cải thiện khả năng sinh tổng hợp β – glucan (151,80 ± 0,46 mg/g DW) Thời gian thu nhận sản phẩm β – glucan tốt nhất là vào ngày thứ 11 của quá trình nuôi cấy

β – glucan is intracellular polysaccharide (IPS), extracted form Ganoderma lucidum

mycelium that can enhance human immune respond This study aimed to stimulate

the production of β – glucan in Ganoderma luidum mycelium through optimating the

carbonhydrates and plant growth regulators in submerged culture The results showed that the stimulation or inhibition of IPS production as well as β – glucan biosynthesis could be adjusted depend on the type and concentration of carbonhydrates and plant growth regulators The supplement of lactose 80 g/L and BA 1 mg/L in medium could cause the highest IPS production (644.48 ± 0.37 mg/g DW) and β – glucan increased

up to 151.80 ± 0.46 mg/g DW, that rased twice as much as without plant growth regulators Furthermore, the optimation of other environmental elements were figured out were completely dark and 150 rpm on rotary shaker This result could be used as premise for production of β – glucan in pilot

Tôi tên Cao Phương Thảohọc viên ngành Công Nghệ Sinh Học, khóa 2014 đợt 2, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan:

Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, số liệu là kết quả nghiên cứu thực

sự của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 6 năm 2017

Học viên thực hiện

Cao Phương Thảo

1.1 Tổng quan về nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Nguồn gốc 2

1.1.3 Phân bố 2

1.1.4 Đặc điểm hình thái và chu kỳ sống 3

1.1.5 Thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đặc tính dược lý của nấm Linh chi đỏ 5

1.2 Polysaccharide của nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum 8

1.2.1 Cấu trúc 8

1.2.2 β - glucan 8

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu β - glucan trong và ngoài nước 8

1.2.2.2 Hoạt tính 10

1.2.2.3 Glucan trong nấm Linh chi đỏ 11

1.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY NẤM LINH CHI 11

1.3.1 Giới thiệu chung về nuôi cấy tế bào 11

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy lỏng nấm Linh chi 12

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy lỏng nấm Linh chi 13

1.3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 13

1.3.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và hình thành polysaccharide 14

1.3.3.3 Tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình nuôi cấy nấm 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu và vật liệu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Vật liệu 18

2.1.3 Môi trường dinh dưỡng 18

2.1.3.1 Môi trường PGA (Potato glucose agar) 18

2.2.1 Cấy giống và giữ giống 20

2.2.2 Giai đoạn tiền nuôi cấy 20

2.2.3 Tiến hành thí nghiệm 21

2.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát đường cong sinh trưởng và sự tích lũy polysaccharide nội bào của hệ sợi nấm Linh Chi G lucidum 21

2.2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự gia tăng sinh khối và tổng hợp polysaccharide nội bào của hệ sợi nấm Linh Chi G lucidum 21

2.2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sự gia tăng sinh khối và tổng hợp IPS ở hệ sợi nấm Linh Chi G lucidum 22

2.2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của loại và nồng độ đường lên sự gia tăng sinh khối và tích lũy IPS của hệ sợi nấm Linh Chi G lucidum 22

2.2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát sự gia tăng sinh khối và sự tích lũy β – glucan của hệ sợi nấm Linh Chi G lucidum theo thời gian 23

2.2.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự gia tăng sinh khối và sự tổng hợp β - glucan của hệ sợi nấm Linh Chi G lucidum trong nuôi cấy lỏng 23

2.2.3.7 Xác định đường kính tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét SEM 24

2.3 Phương pháp phân tích 24

2.3.1 Phương pháp phân tích hóa sinh 24

2.3.2 Phương pháp phân tích kết quả 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27

3.1 Đặc điểm nấm Ganoderma lucidum trong nuôi cấy chìm 27

3.2 Khảo sát quá trình tăng sinh và hình thành polysaccharide nội bào 28

3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự sinh trưởng và tích lũy IPS của nấm Linh chi đỏ G.lucidum 31

3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự gia tăng sinh khối và tổng hợp IPS của Ganoderma lucidum 32

3.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của loại và nồng độ đường lên sinh trưởng và tích lũy IPS của hệ sợi nấm G.lucidum 34

3.5.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của glucose 34

3.5.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của sucrose 36

3.5.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của lactose 37

3.5.6 So sánh tác động tích cực của lactose và sucrose lên sự gia tăng sinh khối và tích lũy IPS của hệ sợi nấm Linh chi đỏ 38

3.6 Thí nghiệm khảo sát sự tăng sinh và tích lũy β - glucan ở thành tế bào sợi nấm Linh Chi 39

3.7 Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp β – glucan của hệ sợi nấm Ganoderma lucidum 40

3.7.1 Ảnh hưởng của BA 40

3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ GA3 41

3.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của IAA 43

So sánh sự gia tăng sinh khối và tổng hợp β - glucan của hệ sợi nấm G.lucidum 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 48

Hình 1.1 Chu trình sống của nấm Đảm 4

Hình 1.2 Nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum 4 Hình 1.3 Chu kì sinh trưởng của nấm Linh chi đỏ Ganoderma luidum (nguồn:

en.wikipedia.org ) 5

Hình 1.4 Cấu trúc của phân tử β – glucan 8

Hình 1.5 So sánh mức độ tăng trưởng giữa Pleurotus florida và Agaricus bisporus

trong ba môi trường khác nhau 17 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19

Hình 2.2 Giống G.lucidum 7 ngày tuổi nuôi cấy trên môi trường PGA chuẩn bị

cho giai đoạn tiền nuôi cấy 20

Hình 2.3 Quy trình xác định hàm lượng β - glucan trong sợi nấm G.lucidum 26 Hình 3.1 Hệ sợi tơi nấm Ganoderma lucidum sau 3 ngày (Hình A) và 7 ngày (Hình

B) nuôi cấy trên môi trường PGA 27

Hình 3.2 Cụm sinh khối tế bào nấm G.lucidum sau giai đoạn tiền nuôi cấy 2 28 Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng nấm G.lucidum theo thời gian 29

Hình 3.4 Sự tích lũy IPS theo thời gian 30 Hình 3.5 Hình dạng và kích thước của sinh khối sợi nấm Linh chi ở các tốc độ lắc khác nhau sau 11 ngày nuôi cấy 33 Hình 3.6 So sánh ảnh hưởng của các loại đường với nồng độ thích hợp nhất lên

sinh khối và hàm lượng IPS của hệ sợi G.lucidum sau 11 ngày nuôi cấy 38

Hình 3.7 Sự gia tăng và tích lũy β – glucan của hệ sợi Linh chi theo thời gian 40 Hình 3.8 So sánh sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng lên sinh khối

của hệ sợi nấm G.lucidum 44

Hình 3.9 Biểu đồ so sánh sự ảnh hưởng của chất điều hòa dinh trưởng thực vật lên

sự tích lũy β - glucan trong G.lucidum 45 Hình 3.10 Sợi nấm Ganoderma lucidum khi chưa xử lý với chất điều hòa sinh

trưởng thực vật 45

Hình 3.11 Sợi nấm G lucidum khi được xử lý với BA 1mg/L 46

Bảng 1.1 Các thành phần cơ bản trong nấm Linh chi đỏ 6 Bảng 1.2 Các thành phần hóa học trong nấm Linh Chi đỏ có tác dụng chữa

bệnh 7 Bảng 2.1 Loại và nồng độ đường được sử dụng trong thí nghiệm 6 22

Bảng 2.2 Loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng trong thí nghiệm 6 24 Bảng 2.3 Thể tích các chất trong hỗn hợp phản ứng 25

Bảng 3.1 Sự gia tăng sinh khối và sự tích lũy IPS của hệ sợi nấm G.lucidum theo

Bảng 3.4 Sự ảnh hưởng của glucose đến sự tăng sinh và tích lũy IPS ở G.lucidum

sau 11 ngày nuôi cấy 35

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của fructose đến sự tăng sinh và tích lũy IPS ở G.lucidum sau 11 ngày nuôi cấy 35 Bảng 3.6 Sự ảnh hưởng của maltose đến sự tăng sinh và tích lũy IPS ở G.lucidum

sau 11 ngày nuôi cấy 36

Bảng 3.7 Sự ảnh hưởng của sucrose đến sự tăng sinh và tích lũy IPS ở G.lucidum

sau 11 ngày nuôi cấy 37

Bảng 3.8 Sự ảnh hưởng của lactose đến sự tăng sinh và tích lũy IPS ở G.lucidum

sau 11 ngày nuôi cấy 37 Bảng 3.9 Sự gia tăng sinh khối và hàm lượng β - glucan tích lũy theo thời gian 39 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BA lên sự gia tăng sinh khối và tổng hợp β - glucan

của hệ sợi nấm Linh chi sau 11 ngày nuôi cấy 41

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IAA lên sự gia tăng sinh khối và tổng hợp β-Glucan của hệ sợi nấm Linh chi sau 11 ngày nuôi cấy 43

BA benzyladenine

EPS (exreacellular polysaccharide) polysaccharide ngoại bào

IPS (intracellular polysaccharide) polysaccharide nội bào

PGA (Khoai tây, glucose, agar) potato glucose agar

Trải qua hàng thập kỷ, β  glucan đã được các nhà khoa học biết đến như một thành phần của thực vật Trong hơn hai mươi năm nay, chất này đã được nghiên cứu

về các tác dụng sinh học có lợi đối với động vật có vú Nó đã được biết một cách rộng rãi trong cộng đồng khoa học như là chất kích thích hoạt động miễn dịch mạnh nhất từng được biết đến, là một chất phòng chống rất mạnh mẽ khối u lành tính và ác tính, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa làn da và còn nhiều lợi ích khác Hiện nay, chưa có thuốc đặc hiệu chữa trị ung thư Các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là áp dụng các liệu pháp miễn dịch nhờ sử dụng các chất từ thiên nhiên, đặc biệt là β – glucan để kích hoạt, điều hòa hệ thống miễn dịch

β glucan có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, các β – glucan từ nấm

có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifier, BRM) Trong

đó nấm Linh chi đỏ được coi là một trong những nguồn thu nhận β  glucan có dược

tính cao nhất Nấm Linh chi tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc

xưa còn gọi là nấm Lim Trong thư tịch cổ, nấm Linh chi còn được gọi với cái tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung

Quy trình nuôi trồng nấm Linh chi thu quả thể trên giá thể mùn cưa hay gỗ gặp những vấn đề như: thời gian thu nhận quả thể từ 4 – 6 tháng, quá trình nuôi trồng phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, thành phần dinh dưỡng bổ sung, nhiệt độ, độ ẩm… Những vấn đề này dẫn tới chất lượng quả thể thu nhận không đồng đều, khó kiểm soát

Theo nghiên cứu của Miyazaki và cộng sự (1981), Sone và cộng sự (1985), Chen và cộng sự (2004), polysaccharide (glucan) chiết xuất từ quả thể hay sợi nấm nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc rắn đều có hoạt tính sinh học tương tự nhau

Chính điều này đã dẫn đến việc áp dụng phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro vốn đã

thành công ở nhiều đối tượng sinh vật vào việc thu nhận glucan ở hệ sợi tơ

Ganoderma lucidum

Đối tượng nghiên cứu trong luận văn là nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum,

với những nội dung chủ yếu sau:

- Khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (cường độ ánh sáng, tốc

độ lắc) lên sự gia tăng sinh khối và tổng hợp IPS của hệ sợi nấm G.lucidum nuôi cấy lỏng

- Khảo sát sự ảnh hưởng của loại và nồng độ đường lên sự gia tăng sinh khối

và tổng hợp IPS của hệ sợi nấm G.lucidum

- Khảo sát sự ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên

sự gia tăng sinh khối và sinh tổng hợp β – glucan ở hệ sợi nấm G.lucidum

Những đóng góp mới của luận án:

Lần đầu tiên khảo sát khả năng tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên

sự sinh tổng hợp β – glucan ở hệ sợi nấm Ganoderma lucidum trong điều kiện nuôi

cấy lỏng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum

1.1.1 Vị trí phân loại

Nấm Linh chi đỏ có tên khoa học là Ganoderma lucidum Trong thư tịch cổ,

nấm Linh chi đỏ còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, nấm Trường Thọ, vạn niên

nhung,… Linh chi đỏ thuộc nhóm nấm Đảm (Basidiommycota) và rất đa dạng về

chủng loại Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay

trên toàn thế giới đã có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có

liệu có chất xơ, đặc biệt trên các cây thuộc họ Fabales Nấm Linh đỏ xuất hiện nhiều vào mùa mưa Tuy nhiên, không phải thân cây nào nấm Linh chi đỏ cũng mọc được, chính vì thế loại nấm này rất hiếm ở dạng tự nhiên (Lê Xuân Thám 1998) [4]

Cho đến nay, nấm không còn phân bố giới hạn trong phạm vi những nước Châu Á mà mang tính toàn cầu [4]

1.1.4 Đặc điểm hình thái và chu kỳ sống

Ở giai đoạn chưa hình thành quả thể thì sợi nấm của các loài nấm lớn được coi là nấm sợi và được nghiên cứu về các mặt sinh lý, sinh hóa, di truyền,… như các

nấm sợi khác (Asperillus, Penicillium,…) [9]

Các sợi nấm có chiều ngang tương tự như đường kính nấm men (2,5 – 10 µm) Mỗi tế bào nấm sợi bao gồm thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong

là tế bào chất với nhân phân hóa Màng nhân có cấu tạo 2 lớp và trên màng có nhiều

lỗ nhỏ Trong nhân có hạch nhân Bên trong tế bào nấm còn có không bào, ti thể, mạng lưới nội chất, bào nang, thể màng biên,… Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp nón, không tăng trưởng và có tác dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn sợi nấm Đây là phần mà chỉ có chất nguyên sinh mà không có nhân Dưới nữa là phần tạo ra thành tế bào Các sợi nhỏ trên thành tế bào xếp ngang (chéo góc với trục sợi nấm) Dưới nữa

là phần tăng trưởng, có cấu trúc sợi dạng mạng lưới Ngọn nấm cũng tăng trưởng được nhờ phần này Dưới nữa là thành phần cứng hay còn gọi là phần thành thục của sợi nấm [9]

Trên môi trường thạch, sợi nấm không ngừng phân nhánh và phát triển thành một hệ sợi nấm (mycelium), sau 3 -5 ngày có thể tạo thành khuẩn lạc (colony) Vào giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc sẽ tự kết mạng (anastomosis) giữa các sợi với nhau, làm cho khuẩn lạc là một hệ thống liên kết mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ sợi nấm Hiện tượng kết mạng chỉ gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp [9, 12]

Nấm sinh sản hữu tính bằng bào tử đảm mọc bên ngoài đảm Bào tử đến tuổi

sẽ thoát ra khỏi đảm phát tán vào môi trường xung quanh Khi gặp điều kiện thuận lợi các bào tử sẽ nảy mầm cho ra các sợi nấm đơn nhân (hypha) Các sợi nấm mọc ra

từ các bào tử khác nhau tự tìm kiếm các sợi nấm tương thích và liên kết với nhau tạo

thành các sợi nấm song nhân, các sợi nấm song nhân phát triển thành một hệ sợi nấm,

ăn sâu vào trong thân cây Sau khi các sợi nấm này đã phát triển đầy đủ, gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ bện lại với nhau tạo nên quả thể nấm

Hình 1.1 Chu trình sống của nấm Đảm

Quả thể là cơ quan sinh sản của nấm Quả thể là nơi tập trung các đầu ngọn sợi nấm, đó là thụ tầng (hymenium) Chính ở đây hai nhân của tế bào sẽ nhập lại thành một Sau đó sẽ chia thành bốn nhân con hình thành các bào tử hữu tính gọi là bào tử đảm Khi tai nấm hình trưởng thành bào tử được phóng thích, chúng nảy mầm

và chu trình lại tiếp tục (Mark Stengler, 2005) [20] Quả thể nấm Linh chi gồm 2 phần: cuống nấm và mũ Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên, hình trụ, đường kính 0,5 - 3 cm Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt nấm

Hình 1.2 Nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum (nguồn: en.wikipedia.org)

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm, màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam- vàng đỏ

- đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng láng Mũ nấm có đường kính 2 - 15 cm, dày 0,8 - 1,2

cm, phần đính với cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm

Hình 1.3 Chu kì sinh trưởng của nấm Linh chi đỏ Ganoderma luidum (nguồn:

Bảng 1.1 Các thành phần cơ bản trong nấm Linh chi đỏ [14]

Thành phần khác (K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu,

vitamin, amino acid, enzyme, hợp chất

alkaloid…) Trong nấm Linh chi đỏ có hai hợp chất được quan tâm nhiều nhất, một trong những chất có giá trị rất cao trong y học và được nghiên cứu nhiều nhất là polysaccharide Hàng loạt nghiên cứu chứng minh rằng polysaccharide của nấm Linh chi đỏ có khả năng chữa bệnh viêm gan mãn tính thông qua khả năng ức chế quá trình dịch mã của DNA polymerase của virus viêm gan siêu vi B (HBV), từ đó ngăn chặn

sự hoạt động của virus này [19] Hikino H và cộng sự từ năm 1985 từ đến 1989 đã chứng minh được nhiều polysaccharide làm tăng mức insulin trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường [31] Polysaccharide còn có tác dụng kích hoạt con đường tổng hợp interleukine 2 và DNA polymerase ở chuột già tuổi Điều này mở ra hướng mới về khả năng làm trẻ hóa tế bào, kéo dài tuổi thọ của nấm Linh chi đỏ [30, 33]

Ngoài các polysaccharide tồn tại ở dạng tự do, trong nấm Linh chi đỏ còn có các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn dịch Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu

lực chống khối u rất rõ, đặc biệt các polysaccharide ở G.lucidum [5]

Bảng 1.2 Các thành phần hóa học trong nấm Linh Chi đỏ có tác dụng chữa bệnh [34]

Nhóm chất Thành phần

hoạt chất

Dược tính Nguồn thu

chống virus

Bào tử nấm

Thư giãn cơ, giảm đau

Quả thể

Polysaccharide β -D-glucan Chống khối u

Kích thích hệ miễn dịch Giảm lượng đường huyết

Quả thể

Triterpenoid Ganoderic acid Chống dị ứng , bảo vệ

gan ức chế tổng hợp cholesterol

Triterpenoid Ganoderic acid

Chống dị ứng, bảo vệ gan

ức chế tổng hợp cholesterol

Hệ sợi nấm

Triterpenoid Ganodermic acid

T-O

Ức chế tổng hợp Cholesterol

Hệ sợi nấm

1.2 Polysaccharide của nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum

1.2.1 Cấu trúc

Hình 1.4 Cấu trúc của phân tử β glucan

Các polysaccharide được tạo nên do sự liên kết giữa các phân tử glucose với nhau bằng liên kết 1β βhay β glycoside (hình 1.4) Có trên 200 loại

polysaccharide được thu nhận từ Ganoderma lucidum như galactan, β  glucan, ganoderan A, B, C, D… chia làm 2 loại chính là galactan và glucan Trong nấm

Ganoderma lucidum, polysaccharide tồn tại ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên kết

với protein, phân bố chủ yếu trong vách tế bào [2]

1.2.2 β - glucan

β  glucan là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử

D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside [2] Vòng 6 D - glucose có thể gắn với phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D - glucose Hình 1.4 thể hiện cấu trúc của một phân tử β – glucan điển hình

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu β - glucan trong và ngoài nước

Từ những năm 1970, hoạt tính sinh học của polysaccharide đã thu hút sự chú

ý của các nhà khoa học trong lĩnh vực y học và hóa sinh Trong số những hoạt tính sinh y học quan trong nhất là tác dụng trên hệ miễn dịch dẫn đến hiệu ứng kháng khối u

Đặc tính làm lành vết thương của nấm đã được biết đến hàng ngàn năm nay, với báo cáo đầu tiên về khả năng y học của chúng được ghi nhận khoảng 3000 năm trước công nguyên và β glucan được coi như là hợp chất chính tạo nên đặc tính y học này Mối quan tâm về β – glucan bắt đầu từ những năm 1900 khi lần đầu tiên phát hiện nấm có khả năng bất hoạt serum complement Điều này dẫn đến việc sản xuất zymosan từ thành tế bào nấm men gồm các phức hợp carbohydrate – protein Những nghiên cứu về sau cho thấy tiêm trực tiếp zymosan vào tĩnh mạch có thể hoạt hóa hệ miễn dịch, kích thích đáp ứng bảo vệ của tế bào chủ Mặc dù zymosan có nhiều thành phần khác nhau (glucan, mannan, kitin, protein, lipid, β - glucan được xác định như một thành phần có hoạt tính sinh học Vì vậy zymosan được sử dụng

nhiều trong nghiên cứu chức năng miễn dịch cả in vitro và in vivo

Báo cáo đầu tiên vào năm 1976 về hoạt tính kháng u của polysaccharide, hỗn hợp này được tách từ vi khuẩn vào năm 1943 [11] Nhưng polysaccharide thu nhận

từ vi khuẩn có những tác dụng phụ không mong muốn Bên cạnh đó, rất nhiều polysaccharide không có hiệu ứng độc được phát hiện có thể thay thế vi khuẩn như nấm men, nấm ăn, tảo, địa y, thực vật Những nghiên cứu về polysaccharide có nguồn gốc khác vi khuẩn cho thấy glucan có tác động kích thích hệ miễn dịch và không độc với tế bào

Trong những năm 1970-1980, những polysaccharide (glucan) kháng khối u như: lentinan, schizophyllan và PSK/Krestin đã được tách ra từ 3 nguồn nấm khác

nhau Lentinus edodes, Schizolyllum commune và Coriolus versicolor Tất cả các

glucan này đều được bán để sử dụng trong y học ở Nhật Bản Sau đó, người ta đã phát hiện ra rằng hiệu lực kháng khối u của glucan là kết quả kích thích tế bào miễn dịch chứ phải độc tính trực tiếp của glucan lên tế bào u Từ những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật Bản đã thử tách chiết βglucan từ nấm lớn, từ đó trở thành hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản

Trong 50 năm qua, rất nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu đã góp phần to lớn vào việc tách chiết, định tính, định lượng các thành phần khác nhau của β  glucan Những nghiên cứu này cho thấy các β  glucan kích thích các tế bào khác

nhau trong hệ miễn dịch hoạt động hiệu quả hơn Glucan có tính chất điều hòa miễn dịch rất lớn dẫn đến khả năng kháng khối u, kháng viêm và làm lành vết thương Trong 10 năm qua các bác sĩ và các nhà khoa học trong nhiều lĩnh vực đã chútâm hơn đến việc sử dụng glucan để giải quyết rất nhiều vấn đề, ví dụ bệnh nhân

dị ứng với thuốc, nhiễm nấm và ung thư Tất cả những thách thức này thường khó giải quyết và các bệnh này thường có điểm chung là đáp ứng miễn dịch không đầy

đủ Vì vậy bổ sung βglucan để tăng cường đáp ứng miễn dịch ở cơ thể bệnh nhân

Các nghiên cứu cho thấy khả năng điều hoà hoạt động hệ miễn dịch của β – glucan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh của phân tử, độ dài polymer và cấu trúc bậc 3 của nó Nói chung, các β glucan có khối lượng phân tử lớn (như zymosan)

có thể hoạt hóa trực tiếp bạch cầu, kích thích hoạt tính thực bào, gây độc tế bào và kháng khuẩn của chúng Ngoài ra, chúng còn kích thích các histamin, cytokine và chemokine như IL-8, IL-1L-6, và TNF-11] Trong khi đó, những βglucan

có trọng lượng phân tử trung bình hoặc thấp có hoạt tính sinh học in vivo nhưng hiệu

quả sinh học tế bào ít rõ ràng hơn

Một nhân tố khác đóng góp cho hoạt tính sinh học của βglucan là sự bền vững của chúng trong cơ thể động vật có vú Các tế bào động vật có xương sống không có các enzyme (1-3)-  - glucanase nên không thể phân hủy những carbohydrate này, chuyển hóa của chúng rất chậm thông qua các phản ứng oxi hóa

[11] In vivo, việc thải loại β - glucan phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng,

glucan khối lượng phân tử thấp được tiết ra ngoài qua cầu thận và glucan lớn được giữ lại trong gan và bị phân hủy bởi tế bào Kupffer và quá trình này có thể kéo dài vài tuần [11]

1.2.2.2 Hoạt tính

Trong các hợp chất polysaccharide của Ganoderma lucidum,βglucan đóng vai trò quan trọng nhất vì chúng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch ở người [17] Đặc biệt khi βglucan tạo phức với protein sẽ có tác dụng chống ung thư rõ rệt [33]

Đại học Havard (1980) đã nghiên cứu cơ chế tăng cường miễn dịch của βglucan Kết quả cho thấy rằngβglucan có cấu trúc không gian và hình dạng như một chiếc chìa khóa liên kết vừa khớp với thụ thể trên bề mặt của các tế bào miễn dịch quan trọng trong cơ thể như: đại thực bào, lympho bào, bạch cầu trung tính,…[28]

Khi có mặt của βglucan, các tế bào như đại thực bào, lympho bào, bạch cầu đơn nhân sẽ tăng cường sản xuất hiệu quả các chất như nhân tố hoại tử khối u (INF

- interleukin – 1   chất truyền tín hiệu giữa các tế bào bạch cầu Interleukin –

6 hay các interferon làm tăng hoạt tính thực bào của đại thực bào và tính độc của tế bào lympho với các tế bào đích Các chất độc có thể làm giết chết tế bào ung thư hoặc làm cho tế bào ung thư bị yếu đi, nhờ đó các tế bào trong hệ miễn dịch có thể tấn công và tiêu diệt các tế bào ung thư này [17]

1.2.2.3 Glucan trong nấm Linh chi đỏ

Polysaccharide nói chung và β glucan nói riêng có thể được thu nhận từ quả thể, từ hệ sợi nấm thu nhận khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và rắn Glucan còn được thu nhận từ bào tử của nấm Linh chi Tất cả đều có hoạt tính giống nhau trong điều trị bệnh [14, 28] Mặc dù β - glucan chỉ là thành phần nhỏ trong quả thể và bào

tử nấm Linh chi, nó lại là thành phần chính của hệ sợi nấm Ganoderma [13]

Trong nuôi cấy lỏng hệ sợi nấm Linh chi, polysaccharide được thu nhận từ 2 nguồn: sinh khối và dịch môi trường sau nuôi cấy Các polysaccharide quan trọng (glucan) chứa trong sợi nấm Các polysaccharide này gọi là polysaccharide nội bào (intracellular polysaccharide – IPS)

1.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY NẤM LINH CHI

1.3.1 Giới thiệu chung về nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào bao gồm sự tăng trưởng và duy trì các loại tế bào đơn trong

điều kiện in vitro [7] Nuôi cấy tế bào là quá trình thực hiện trên các đối tượng tế

bào động vật, thực vật hay vi sinh vật để sản xuất sinh khối, các hợp chất có hoạt tính sinh học hoặc để làm mô hình thực nghiệm để khảo sát các tác động của hóa chất, làm nguyên liệu ghép tế bào và cơ quan [7]

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy lỏng nấm Linh chi

Nuôi cấy lỏng gồm hai dạng, nuôi cấy trong môi trường lắc và nuôi cấy trong môi trường tĩnh Quá trình nuôi cấy nấm Linh chi thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường long và lắc liên tục với mục tiêu thu nhận

hệ sợi nấm Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào luôn được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng Sự thông khí được thực hiện nhờ máy lắc hoặc các phương pháp và thiết bị thông khí khác

Trong thu nhận các hợp chất chuyển hóa từ hệ sợi nấm, cách tốt nhất là kỹ thuật nuôi cấy tế bào chìm Trong điều kiện nuôi cấy này, vi sinh vật phát triển dưới dạng cụm tế bào (pellet) hay dạng sợi (mycelia) Vì môi trường bị xáo trộn bởi tác động của máy lắc hoặc thiết bị khuấy trộn, các thành phần sợi nấm hướng ra ngoài chống lại lực tác động làm cho hình dạng của tế bào thay đổi liên tục từ dạng sợi phân tán đến kết lại với nhau thành cụm (compact pellet)

Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy chìm hơn hẳn so với phương pháp nuôi trồng thu quả thể nấm Linh chi Phương pháp này làm giảm thời gian thu nhận sản phẩm đích Nếu thời gian thu nhận quả thể nấm mất từ 3 – 5 tháng với phương pháp nuôi cấy truyền thống, thì chỉ mất từ 2 – 3 tuần để thu acid ganoderic và polysaccharide bằng phương pháp nuôi cấy lỏng Môi trường nuôi cấy lỏng đòi hỏi chi phí năng lượng lớn để khuấy trộn môi trường dinh dưỡng và cung cấp oxy Tuy nhiên, môi trường lỏng hoạt động như một hệ thống đồng nhất và kiểm soát quá trình nuôi cấy rất dễ dàng bằng cách sử dụng nhiều cảm biến để điều khiển Chính vì vậy, nuôi cấy nấm Linh chi bằng phương pháp lỏng giúp sản xuất lượng sinh khối đạt tiêu chuẩn đồng đều và có thể sản xuất các sản phẩm thứ cấp theo mong muốn, việc tinh sạch sản phẩm dễ dàng hơn so với nuôi ở môi trường rắn Do đó, nuôi cấy nấm Linh chi trong môi trường lỏng có tiềm năng công nghiệp quan trọng

Tùy thuộc vào sinh lý phát triển của nấm và mục đích thu nhận sản phẩm mà người ta chọn kỹ thuật nuôi cấy nấm dược liệu bằng những điều kiện nuôi cấy lỏng khác nhau Lợi thế của việc nuôi cấy lỏng là dễ dàng hơn trong việc kiểm soát các điều kiện môi trường như nhiệt độ, tốc độ khuấy trộn, oxy hòa tan và pH Tuy nhiên,

sự tăng sinh khối có tác động lớn lên tốc độ chuyển hóa và sự tiết sản phẩm Sợi nấm

có thể bao quanh cánh khuấy, gây tắc và lan vào đường ống bổ sung dinh dưỡng, cũng như làm tăng độ nhớt của môi trường nuôi cấy, dẫn đến sự hạn chế về chuyển động của sinh khối và oxy

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy lỏng nấm Linh chi

1.3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Carbohydrate là thành phần chính của khung tế bào và đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng quan trọng cho sự tăng trưởng và phát triển của nấm (Xiao và cộng sự, 2006) [29] Nguồn carbon được sử dụng để tổng hợp các hợp chất quan trọng nhất: carbohydrate, amino acid, acid nucleic, lipid,… Carbohydrate chiếm nửa trọng lượng khô ở sinh khối nấm Đồng thời cũng là nguồn cung cấp năng lượng cho quá

trình trao đổi chất Đặc biệt, trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp tế bào tổng

hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia và tăng sinh khối [6]

Lượng IPS thu được thường tương quan với sinh khối vì IPS được trích ly từ sinh khối, tuy nhiên vẫn có trường hợp khi thay đổi thành phần dinh dưỡng, lượng IPS thu được (tính theo lượng tích lũy trong 1 đơn vị sinh khối và lượng thu được trong một đơn vị thể tích môi trường nuôi cấy) vẫn cao hơn, mặc dù đó không phải

là trường hợp sinh khối đạt cao nhất Như trường hợp Lyphyllum decastes, sinh khối

đạt cao nhất trong môi trường có lactose, tuy nhiên IPS tích lũy được trong tế bào nhiều nhất khi sử dụng glucose [14]

Qua khảo sát ảnh hưởng của bốn loại đường sucrose, lactose, maltose và

glucose lên quá trình nuôi cấy Ganoderma lucidum CCGMC 5.616, Tang và cộng

sự (2002) đã chọn được lactose 50g/L là nguồn carbon cho sinh khối cao nhất và hệ sợi tơ nấm phát triển yếu nhất trong môi trường có sucrose Khi kiểm tra lượng đường còn sót lại sau quá trình nuôi cấy các tác giả nhận thấy, sucrose hầu như không được tế bào sử dụng trong khi ba loại đường hầu như hết hoàn toàn Tuy nhiên, chính môi trường có chứa sucrose lại làm cho hàm lượng polysaccharide (extracellular polysaccharides - EPS) cao hơn so với các trường hợp còn lại [26] Dựa trên kết quả nghiên cứu này, Lee và cộng sự (2003) đã tiến tới thử nghiệm sử dụng whey - phụ phẩm quá trình sản xuất phomat để làm cơ chất cung cấp nguồn carbohydrate chính

trong nuôi cấy chủng G.lucidum KCTC 6283 (Hàn Quốc) và kết quả thu được tương

đương với trường hợp sử dụng lactose, với hàm mục tiêu là sinh khối, IPS và EPS [21]

1.3.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và hình thành polysaccharide

- Ánh sáng

Ánh sáng không cần thiết cho quá trình sinh trưởng của nấm Tuy nhiên, cường độ ánh sáng quá mạnh sẽ kiềm chế sự sinh trưởng của sợi nấm, có trường hợp gây chết sợi nấm Ánh sáng có thể phá vỡ một số vitamin và enzyme cần thiết, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của sợi nấm

- Độ thông khí

Hàm lượng oxygen và carbonic ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của sợi nấm Oxygen cần thiết cho quá trình hô hấp của hệ sợi nấm Nồng độ khí carbonic tăng cao trong không khí sẽ ức chế quá trình tăng sinh nấm [4] Do đó, chế

độ thông khí hay khuấy trộn rất cần thiết trong nuôi cấy hệ sợi nấm in vitro Hầu hết

các chất dinh dưỡng đều có khả năng hòa tan cao trong nước, trong khi oxygen hòa tan rất kém trong các môi trường nuôi cấy, do đó khuấy trộn chủ yếu giúp sự phân tán của các bong bóng khí, tạo huyền phù các tế bào vi sinh vật và tăng cường sự truyền nhiệt, truyền sinh khối trong môi trường [6]

Sự tăng độ nhớt của môi trường trong quá trình nuôi cây ảnh hưởng lớn đến

sự phát triển sinh khối và tiết ra polysaccharide Khi nuôi cấy Ganoderma lucidum

trong các bình Erlen, Yang và Liau thử nghiệm thay đổi tốc độ lắc từ 50 đến 250 vòng/phút Kết quả thu được như sau, sinh khối thu nhận được cao nhất ở 100 vòng/phút, trong khi lượng EPS cao nhất ở 150 vòng/phút Các tác giả giải thích tốc

độ lắc mạnh làm EPS tiết ra không bám được trên thành tế bào, điều này kích thích

tế bào sinh thêm EPS, tuy nhiên cơ chế kích thích chưa được nghiên cứu Ở tốc độ lắc lớn hơn 150 vòng/phút, hàm lượng polysaccharide thu được lại giảm dần, có thể

do ảnh hưởng của ứng suất cắt (shear stress) của các dòng chảy xoáy tạo ra trong quá trình nuôi cấy Ứng suất cắt được sinh ra do quá trình nổ của các bóng khí trong dung dịch Sự nổ này tạo nên các lực tác động lên cụm tế bào Ứng suất cắt ảnh

hưởng trực tiếp đến hình thái và kích thước của các cụm tế bào, từ đó ảnh hưởng đến sinh khối và polysaccharide thu được [31]

Hệ sợi vi sinh vật lại càng nhạy cảm hơn với suất ứng cắt trong các bioreactor khuấy đảo so với các hệ thống nuôi cấy khác Quá trình lắc với tốc độ thấp là cần thiết để giảm suất ứng cắt trượt có hại Tuy nhiên, hầu hết các hệ thống nuôi cấy hệ sợi nấm công nghiệp có độ nhớt lớn mà nhu cầu oxygen lại cao nên cần xác định được tốc độ khuấy đảo tốt nhất cho mỗi đối tượng để thu được sản phẩm và hàm lượng sản phẩm mong muốn [30]

- Tỷ lệ giống cấy

Tỷ lệ giống cấy là một yếu tố quan trọng trong nhiều quy trình nuôi cấy tế bào Không giống như những loài nấm sợi khác có thể tạo bào tử dễ dàng, đối với

các loài nấm lớn như Ganoderma, trong nuôi cấy chìm, không cấy chuyền hay cấy

giống bằng bào tử mà sử dụng chính hệ sợi tơ Có 2 phương pháp bổ sung giống gồm sử dụng hệ tơ phát triển trên môi trường đĩa thạch hoặc sử dụng hệ tơ phát triển trong môi trường lỏng [30] Tuy nhiên, pha sinh trưởng của hệ sợi tơ nấm lấy từ đĩa thạch khá dài (hơn 7 ngày); do đó, để tiết kiệm thời gian nuôi cấy thường kết hợp cả

2 phương pháp nhằm đảm bảo lượng giống đủ nhiều cho khảo sát

Tỷ lệ giống ban đầu bổ sung vào chủ yếu ảnh hưởng đến hình thái và kích thước của tế bào, từ đó dẫn đến sự khác nhau về tăng trưởng của tế bào và khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa, nhất là các hợp chất nội bào [19, 27, 32] Khi thay đổi lượng giống bổ sung, Xu và cộng sự thấy có sự khác nhau về kích thước

của các cụm tế bào trong nuôi cấy Aspergillus awamori [18].

Ở Ganoderma lucidum, hàm lượng IPS thu được nhiều nhất khi kích thước

cụm tế bào nhỏ hơn 1,2 mm3, kích thước cụm tế bào càng lớn (từ 1,2 mm3 đến 1,6

mm3), hàm lượng IPS thu được càng giảm Sự khác biệt này có thể do ảnh hưởng của việc hạn chế dinh dưỡng ở mỗi tâm cụm tế bào (Fang và cộng sự, 2002) [15]

Thí nghiệm của Fang và cộng sự (2002) khảo sát lượng giống bổ sung trong khoảng từ 0,070 – 0,670 g DW/L cho thấy lượng giống bổ sung càng cao, mặc dù sinh khối thu được thấp nhưng kích thước các cụm tế bào càng nhỏ dẫn đến hình thành lượng lớn IPS và EPS [22]

1.3.3.3 Tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình nuôi cấy nấm

Năm 2013, Farahnaz Mahdipour và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng với môi trường sinh dưỡng khác nhau trên hai chủng nấm

Agaricusbis porus và Pleurotus lorida [13] Bước đầu tiên sẽ chọn môi trường dinh

dưỡng thích hợp cho Agaricusbis porus và Pleurotus lorida Bước thứ hai là khảo

sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng với những nồng độ khác nhau Chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng là: auxin tự nhiên 3- indole acetic acid (IAA), tổng hợp 1-naphthalene acid acetic (NAA) Môi trường dinh dưỡng dùng trong nuôi cấy: YPDA (yeast + potato + dextrose + agar), YEPSDA (yeast + extracts + potato + dextrose + agar), PDA (potato + dextrose + agar), MEA (malt extract + agar) Nồng độ IAA sử dụng trong nghiên cứu này là 0, 5, 10, và 20 mg/L, và nồng độ sử dụng cho NAA là 0, 1, 5, và 10 mg/L Đường kính của sợi nấm phát triển trong các thí nghiệm đã được quan sát thấy trong những ngày khác nhau sau khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, từ ngày thứ ba và hai ngày một lần; ngày 3, 5, 7, 9, 11, 13 và

15 Và độ dài của sợi nấm được đo để đánh giá kết quả khi áp dụng các môi trường

và chất điều hòa sinh trưởng khác nhau Kết quả cho thấy vào những ngày 3, 5, 7, 9,

11, 13 và 15, đường kính khuẩn lạc Pleurotus florida tăng trưởng ít hơn cho Agaricus

bisporus Đường kính khuẩn lạc của cả hai loài đều đạt tối đa vào ngày thứ 15 của

quá trình nuôi cấy

Môi trường MEA thích hợp cho Agaricus bisporus YEPDA thích hợp cho

Pleurotus florida, 10 mg/L IAA và 5 mg/L NAA tốt nhất cho sự tăng trưởng của Agaricus bisporus Đường kính khuẩn lạc ở ngày 3, 5, 7, 9, 11 và 13 sau khi bổ sung

chất điều hòa sinh trưởng lần lượt là 0,66, 1,65, 2,36, 3,01, 3,71, 4,23cm là tối đa ở ngày 15 là 6,73cm (Maniruzzaman (2004))

Maniruzzaman (2004) khi quan sát Pleurotus florida nhận thấy các sợi nấm

tăng trưởng tốt nhất ở IAA 5ppm và NAA 0ppm

Như vậy, chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi

nấm Agaricus bisporus và Pleurotus florida

Hình 1.5 So sánh mức độ tăng trưởng giữa Pleurotus florida và Agaricus

bisporus trong ba môi trường khác nhau

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu và vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Hệ sợi Linh chi đỏ Ganoderma lucidum được lưu trữ và phân phối bởi Công

ty Trách nhiệm Hữu hạn Một thành viên Nấm Trang Sinh (Trang Sinh Mushroom

Co Ltd)

2.1.2 Vật liệu

Các hóa chất trong môi trường nuôi cấy:

- Nguồn cung cấp carbon: glucose, lactose, sucrose, maltose (Ấn Độ)

- Nguồn cung cấp nitrogen: cao nấm men (Himedia, Ấn Độ), peptone (Trung Quốc)

- Khoáng: KH2PO4, MgSO4.7H2O (Trung Quốc)

2.1.3 Môi trường dinh dưỡng

2.1.3.1 Môi trường PGA (Potato glucose agar)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Giai đoạn tiền nuôi cấy

Xây dựng đường cong sinh truởng

- Giai đoạn 1: 1 tuần

- Giai đoạn 2: 4 ngày

Sợi nấm Linh chi đỏ

Ganoderma lucidum

Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ lắc

2 tuần

Xây dựng đường cong sinh truởng mới

2 tuần

2.2.1 Cấy giống và giữ giống

Hệ sợi Ganoderma lucidum được cấy và duy trì trên môi trường PGA (potato

glucose agar) Cấy chuyền và ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày Bảo quản ở nhiệt độ

40C Việc cấy chuyền được thực hiện sau mỗi 1 tháng để duy trì giống

2.2.2 Giai đoạn tiền nuôi cấy

Đây là giai đoạn chuyển hệ sợi nấm từ môi trường thạch sang môi trường lỏng Giai đoạn tiền nuôi cấy trong môi trường lỏng của hệ sợi nấm gồm 2 giai đoạn:

Hình 2.2 Giống G.lucidum 7 ngày tuổi nuôi cấy trên môi trường PGA chuẩn

bị cho giai đoạn tiền nuôi cấy

1cm

m