Nghiên cứu khảo sát phương pháp phân tích formaldehyde trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò uv

ii NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Kim Pha MSHV: 1879002 Ngày, tháng, năm sinh: 15/03/1991 Nơi sinh: Campuchia Chuyên ngành: Công thuật hóa học Mã số: 60520301 - Tiếng Việt:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

KIM PHA

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

FORMALDEHYDE TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG ĐẦU DÒ UV/VIS KẾT HỢP TẠO DẪN

XUẤT TRƯỚC CỘT

i

Công trình được hoàn thành tại: Trung tâm Thí nghiệm Công nghiệp Campuchia

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Kiều Anh

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Trương Thị Tố Oanh

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Đinh Văn Phúc

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 01 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS TS Nguyễn Quang Long

2 Phản biện 1: TS Trương Thị Tố Oanh

3 Phản biện 2: TS Đinh Văn Phúc

4 Ủy viên 1: TS Trần Thị Kiều Anh

5 Ủy viên 2: TS Đặng Bảo Trung

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trường Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ii

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Kim Pha MSHV: 1879002

Ngày, tháng, năm sinh: 15/03/1991 Nơi sinh: Campuchia

Chuyên ngành: Công thuật hóa học Mã số: 60520301

- Tiếng Việt: Nghiên cứu khảo sát phương pháp phân tích formaldehyde

trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò UV/vis kết hợp

tạo dẫn xuất trước cột

- Tiếng Anh: Determination of formaldehyde in food by high performance

liquid chromatography ultraviolet-visible detector using pre-column derivatisation

- Khảo sát phương pháp phân tích formaldehyde trên thiết bị HPLC – UV

- Đánh giá phương pháp phân tích

- Phân tích một số mẫu thực

Tp HCM, ngày tháng 01 năm 2020

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

nnnnn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRƯỞNG KHOA

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chương trình cao học và viết luận văn thạc sĩ này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ

Trước hết tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Trần Thị Kiều Anh – Bộ Môn Kỹ Thuật Hóa Lý Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, người đã dành rất nhiều thời gian để trực tiếp chỉ báo, hướng dẫn tận tình và truyền đạt kiến thức cũng như lời khuyên có ích cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Xin cảm ơn quý thầy cô tại Khoa Kỹ Thuật Hóa Học đã tận tâm truyền đạt những kiến thức bổ ích trong suốt những năm học tập tại trường

Lời cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã hỗ trợ về tinh thần cũng như vật chất, đã luôn động viên trong thời gian qua để tôi hoàn thành luận văn này Mặc dù tôi đã có nhiều có gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình

và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quí báu và thông cảm của quý Thầy Cô và các bạn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Formaldehyde có nhiều tên gọi khác nhau như formol, formalin, methanal

có công thức hóa học CH2O, là một chất có thể gây ung thư cho con người Formaldehyde có thể được bổ sung vào thực phẩm để kéo dài thời hạn sử dụng Với

sự phổ biến việc sử dụng formaldehyde trong thực phẩm, sự thiếu phương pháp chính xác để xác định và có mục đích giúp cơ quan quản lý thực phẩm, phương pháp sắc

ký lỏng là một phương pháp phù hợp để xác định định lượng formaldehyde trong một

số loại thực phẩm đang lưu hành trên thị trường Campuchia như cá, hải sản, bún, rau

và trái cây vì phương pháp có độ nhạy cao và có tin cậy Trong nghiên cứu này, formaldehyde trong mẫu cá, hải sản và bún được chiết xuất bằng Acetonitrile, formaldehyde trong rau và trái cây được chiết xuất bằng nước, sau đó tạo dẫn xuất với 2.4 DNPH 0.3 % trong 25 phút trước khi đi phân tích bằng phương pháp HPLC – UV Phương pháp được đánh giá có hiệu suất thu hồi 99.47 – 106.83 %, giới hạn phát hiện 0.0349 mg/Kg, giới hạn định lượng 0.1056 mg/Kg và độ lệch chuẩn tương đối 1.86 – 3.80 %

v

ABSTRACT

Formaldehyde has many different names such as formol, formalin, methanal with the chemical formula CH2O, a substance that can cause cancer to humans It maybe added to foods to extend the shelf life For popular to use of formaldehyde in food, the lack of an accurate method for identification and the have purpose of helping food management organization, high performance liquid chromatography is an appropriate method for the determination of quantitative content The amount of formaldehyde in some foods currently circulating in the Cambodian market such as fish, seafood, noodle, vegetables and fruits, method have high sensitive and reliability In this study, formaldehyde in sample (fish, seafood and noodle) were extracted with Acetonitrile,

in vegetables and fruits were extracted with water, then derivatised with 2.4 DNPH 0.3 % for 25 minutes before HPLC – UV analysis The method was validated with recovery 99.47 - 106.83 %, limit of detection 0.0349 mg/Kg, limit of quantitative 0.1056 mg/Kg and relative standard deviation 1.86 – 3.80 %

vi

LỜI CẢM ĐOAN

Tôi cảm đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Kim Pha

vii

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iv

ABSTRACT v

LỜI CẢM ĐOAN vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT xii

DANH SÁCH BẢNG BIỂU xiii

DANH SÁCH HÌNH VẼ xv

viii

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG II TỔNG QUAN 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ FORMALDEHYDE 3

2.1.1 Tính chất của formaldehyde 3

2.1.2 Độc tính của formaldehyde 3

2.1.2.1 Tiếp xúc ngắn hạn 4

2.1.2.2 Tiếp xúc lâu dài 5

2.2 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 5

2.2.1 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao 5

2.2.1.1 Nguyên lý hoạt động 6

2.2.1.2 Thiết bị sắc ký lỏng 6

2.2.2 Khái niệm về phương pháp HPLC 10

2.2.2.1 Các thông số cơ bản của sắc ký 10

2.2.2.2 Các thông số pha động 16

2.2.3 Isocratic và Gradient 18

2.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 18

2.2.5 Ứng dụng của HPLC phân tích HCHO trong thực phẩm 21

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 24

3.1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 24

ix

3.1.1 Thiết bị 24

3.1.2 Dụng cụ 25

3.1.3 Hóa chất 26

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26

3.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26

3.2.2 Chuẩn bị mẫu thực 26

3.2.3 Thuyết minh lựa chọn phương pháp phân tích 27

3.2.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 28

3.2.5 Phương pháp nghiên cứu 28

3.3 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 29

3.3.1 Xử lý mẫu 29

3.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 29

3.3.1.2 Quy trình tạo dẫn xuất HCHO và 2.4 DNPH 0.3 % 30

3.3.1.3 Khảo sát thể tích 2.4 DNPH 0.3 % sử dụng 30

3.3.1.4 Khảo sát thời gian tạo dẫn xuất 30

3.3.2 Điều kiện sắc ký 31

3.3.2.1 Điều kiện sắc ký lựa chọn ban đầu 31

3.3.2.2 Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký 31

3.4 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 32

x

3.4.1 Tính đặc hiệu / độ chọn lọc (specifcity/ selectivity) 32

3.4.2 Khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn (Linearity) 33

3.4.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 34

3.4.4 Độ chính xác (Accuracy) 34

3.4.5 Độ ổn định 38

3.5 PHÂN TÍCH MẪU THỰC 39

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

4.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN TẠO DẪN XUẤT 40

4.1.1 Khảo sát thể tích 2.4 DNPH sử dụng 40

4.1.2 Khảo sát thời gian tạo dẫn xuất 41

4.2 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 41

4.2.1 Khảo sát bước sóng hấp thu 41

4.2.2 Khảo sát nồng độ pha động 43

4.2.2.1 Khảo sát pH của pha động 43

4.2.2.2 Khảo sát tỷ lệ pha động 44

4.2.3 Khảo sát tốc độ dòng của pha động 46

4.2.4 Khảo sát nhiệt độ cột phân tích 46

4.2.5 Tổng kết điều kiện sắc ký 47

4.3 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 48

xi

4.3.1 Tính đặc hiệu /tính chọn lọc 48

4.3.2 Khoảng tuyến tính của đường chuẩn 53

4.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 54

4.3.4 Độ chính xác của phương pháp 55

4.3.4.1 Độ chụm 55

4.3.4.2 Độ đúng 58

4.3.5 Độ ổn định 60

4.3.5.1 Độ vững 60

4.3.5.2 Độ chắc chắn 61

4.4 PHÂN TÍCH MẪU THỰC 63

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC PHỤ LỤC 69

xii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile Acetonitril

DNPH Dinitrophenylhydrazine

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IARC International Agency for Research

R Recovery Hiệu suất thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam WTO World Trade Organization Tổ chức Thương mại Thế giới

xiii

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Ứng dụng của HPLC phân tích HCHO trong thực phẩm 21

Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 3.2: Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 3.3: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 26

Bảng 3.4: Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian (độ tái lập) 35

Bảng 4.1: Kết quả khảo sát thể tích 2.4 DNPH 0.3 % sử dụng 40

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát thời gian tạo dẫn xuất của phương pháp 41

Bảng 4.3: Kết quả peak có pH của pha động khác nhau 44

Bảng 4.4: Kết quả peak dẫn xuất ứng với tỷ lệ % MeOH: H2O khác nhau 45

Bảng 4.5: Kết quả peak dẫn xuất ứng với tỷ lệ % ACN: H2O khác nhau 45

Bảng 4.6: Kết quả peak dẫn xuất ứng với tốc động dòng của pha động khác nhau 46 Bảng 4.7: Kết quả peak có nhiệt độ cột khác nhau 47

Bảng 4.8: Diện tích peak formaldehyde từ nồng độ 0.1 – 10 g/mL 53

Bảng 4.9: Kết quả phân tích nồng độ chuẩn của formaldehyde 0.5 g/mL 54

Bảng 4.10: Kết quả tính độ lặp lại của dung dịch chuẩn 56

Bảng 4.11: Kết quả phân tích định lượng mẫu cá biển thêm chuẩn 2 g/mL của người phân tích thứ 1 57

xiv

Bảng 4.12: Kết quả phân tích định lượng mẫu cá biển thêm chuẩn 2 g/mL của người

phân tích thứ 2 58Bảng 4.13: Kết quả phân tích định lượng mẫu tép thêm chuẩn 2 g/mL 59

Bảng 4.14: Kết quả phân tích độ vững của phương pháp với dung dịch chuẩn 10

g/mL 60Bảng 4.15: Độ chắc chắn của mẫu cá biển thêm chuẩn 2 g/mL được phân tích trong

ngày thứ 1 61Bảng 4.16: Độ chắc chắn của mẫu cá biển thêm chuẩn 2 g/mL được phân tích trong

ngày thứ 2 62Bảng 4.17: Kết quả phân tích định lượng HCHO trong một số mẫu thực 63

xv

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Hình 2.1: Công thức cấu tạo formaldehyde 3

Hình 2.2: Nguyên lý hoạt động của HPLC 6

Hình 2.3: Sắc ký đồ HPLC của một hỗn hợp hai thành phần 10

Hình 2.4: Sắc ký đồ HPLC thể hiện mức độ tách của hỗn hợp hai thành phần 14

Hình 2.5: Hệ số phân giải trong HPLC 15

Hình 2.6: Hệ số đuôi thể hiện đường cao và chân của peak 16

Hình 2.7: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ tín hiệu nhiễu 20

Hình 3.1: Phản ứng giữa Aldehyde với 2.4 DNPH 30

Hình 4.1: Kết quả đo độ hấp thu sử dụng máy quang phổ UV/vis 43

Hình 4.2: Sắc ký đồ của các mẫu (a) – (g) 52

Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn giữa diện tích và nồng độ dung dịch chuẩn 53

1

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

Hiện nay, tất cả các nước trên thế giới ngày càng quan tâm về an toàn sức khỏe nên việc sản xuất thực phẩm, sản phẩm nông nghiệp hoặc trái cây, rau sử dụng trong nước hoặc xuất khẩu phải có vệ sinh an toàn thực phẩm cao

Từ ngày 11/01/2007, Việt Nam đã trở thành thành viên của Tổ chức Thương mại Thế giới (WTO), do vậy mọi ngành sản xuất sản phẩm thực phẩm phải nỗ lực sản xuất sản phẩm thực phẩm có chất lượng cao để đạt yêu cầu quốc tế nói chung và nhu cầu trong nước nói riêng

Trong quá trình sản xuất sản phẩm thực phẩm, sử dụng hóa chất là một nhu cầu tất yếu, vì nó không chỉ cải thiện cấu trúc sản phẩm, kéo dài thời gian bảo quản

mà nó còn tạo nên sự hấp dẫn, tác động trực tiếp vào cơ quan cảm giác và mang lại

sự ngon miệng cho người tiêu dùng Tuy nhiên bên cạnh những lợi ích đó, thì hóa chất cũng đem lại rất nhiều tác hại đối với sức khỏe của người tiêu dùng Thế nên đã

có hàng loạt những hóa chất bị nhà nước cấm sử dụng Tuy nhiên, do sự thiếu hiểu biết, thiếu kiến thức về an toàn thực phẩm mà không ít các nhà sản xuất đã sử dụng quá nhiều các hóa chất Thậm chí bất chấp pháp luật, bất chấp sức khỏe của người tiêu dùng để sử dụng các chất đã bị cấm sử dụng trong thực phẩm để thu được lợi nhuận cao

Có rất nhiều hóa chất được nhà nước bị cấm sử dụng trong thực phẩm trong

đó có formaldehyde Formaldehyde là một trong những hóa chất được sử dụng khá phổ biến nhưng nó là loại hoá chất rất độc hại đến sức khỏe con người Nó dễ dàng kết hợp với các loại protein (thường là các loại thực phẩm) tạo ra những hợp chất bền, không mùi xấu nhưng rất khó tiêu hóa Vì thế nó bị lợi dụng để kéo dài thời gian bảo quản của thực phẩm như: phở, bún, hủ tiếu, trái cây Khi cơ thể con người tiếp xúc với formoldehyde dù hàm lượng cao hay thấp mà kéo dài cũng gây ra nhiều tác hại nghiêm trọng như ngộ độc, viêm loét, nôn mửa, tiêu chảy Hiện nay, Bộ Y tế Việt Nam ban hành quyết định số 3742/QĐ-BYT ngày 30/9/2001 về việc cấm sử dụng và

2

tuyệt đối không được dùng formaldehyde trong thực phẩm với bất cứ hàm lượng và cách thức nào Vì vậy, việc khảo sát tình hình sử dụng formoldehyde trong các loại thực phẩm rất cần được quan tâm

Tình hình sử dụng formaldehyde trong thực phẩm cũng diễn ra tại Campuchia

Do sự cấp thiết và đáp ứng với yêu cầu thực tế trên và có sự hỗ trợ dụng cụ hóa chất, thiết bị của Trung Tâm Thí Nghiệm Công Nghiệp Campuchia (ILCC) và dựa trên những công trình nghiên cứu liên quan đã được công bố ngoài nước, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phương pháp phân tích formaldehyde trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng đầu dò UV/vis kết hợp tạo dẫn xuất trước cột”

3

CHƯƠNG II TỔNG QUAN

2.1.1 Tính chất của formaldehyde

Formaldehyde là hợp chất hữu cơ có rất nhiều tên gọi khác nhau như formol, formalin, methyl aldehyde, formic aldehyde, methaldehyde, oxymethylene, methylene oxide, metanal, là aldehyde đơn giản nhất, có công thức hóa học CH2O Formaldehyde (HCHO) là hợp chất hữu cơ không màu, dễ bay hơi và có khả năng chuyển sang thể khí ở điều kiện bình thường, mùi cay xốc, vị chua, độc hại (tác động đến mắt, da, mũi và họng) khó ngửi, là aldehyde có khả năng hoạt động mạnh nhất

− Có hòa tan trong nước, ethanol, ether hoặc acetone [1-3]

Hình 2.1: Công thức cấu tạo formaldehyde 2.1.2 Độc tính của formaldehyde

Formaldehyd đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như thuốc diệt nấm, thuốc diệt vi trùng, chất khử trùng và dung dịch ướp xác Nó cũng được sử dụng trong sản xuất tơ nhân tạo, dệt may, nhựa, phenol, urê, thuốc nhuộm, mực in, este cellulose

4

và các phân tử hữu cơ khác, gương và chất nổ Nó cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp giấy, nhiếp ảnh và nội thất Nó là một trung gian trong sản xuất thuốc và thuốc trừ sâu [1, 4]

2.1.2.1 Tiếp xúc ngắn hạn

Tiếp xúc với formaldehyde có thể ăn mòn mắt, da và đường hô hấp Tiếp xúc cấp tính với formaldehyde có thể dẫn đến bỏng da, mắt và niêm mạc, chảy nước mắt, buồn nôn, nôn (có thể có máu), đau bụng, tiêu chảy khó thở, ho, viêm phổi và phù phổi có thể xảy ra Những người nhạy cảm có thể gặp các phản ứng hen suyễn ngay

cả khi tiếp xúc ngắn Hạ huyết áp (huyết áp thấp) và hạ thân nhiệt (giảm nhiệt độ cơ thể) có thể xảy ra các triệu chứng tim mạch Chóng mặt, co giật và hôn mê có thể được ghi nhận Các bệnh viêm thận, tiểu máu (nước tiểu có máu) và độc tính gan đã được báo cáo Phơi nhiễm ở nồng độ cao có thể gây tử vong Đôi khi triệu chứng có thể bị trì hoãn [1]

Hít vào: kích ứng mũi và cổ họng có thể xảy ra sau khi tiếp xúc 0.25 – 0.45

ppm Mức giữa 0,4 và 0,8 ppm có thể làm phát sinh ho và khò khè, tức ngực và khó thở Phơi nhiễm đột ngột với nồng độ 4 ppm có thể dẫn đến kích thích phổi và cổ họng đủ nghiêm trọng để dẫn đến viêm phế quản và viêm thanh quản Hơi thở có thể

bị suy yếu ở mức trên 100 ppm và tổn thương phổi nghiêm trọng có thể xảy ra ở mức

50 ppm

Da: tiếp xúc trực tiếp với chất lỏng có thể dẫn đến kích ứng, ngứa, rát và khô

Nó cũng có thể phát triển một phản ứng dị ứng với hợp chất sau khi tiếp xúc bằng bất

kỳ tuyến đường nào

Mắt: tiếp xúc với nồng độ formaldehyde trong không khí là 0.4 ppm đã gây

chảy nước mắt và kích ứng Một lượng nhỏ chất lỏng văng vào mắt có thể gây tổn thương giác mạc Kích ứng mắt đã được báo cáo ở mức giữa 0.05 đến 2.0 ppm

5

Uống vào: chỉ có một lượng nhỏ chất lỏng đã dẫn đến chết con người Một

lượng nhỏ hơn có thể làm hỏng cổ họng, dạ dày và ruột dẫn đến buồn nôn, nôn, đau bụng và tiêu chảy Tiếp xúc vô tình cũng gây mất ý thức, hạ huyết áp, tổn thương thận và nếu người đó mang thai, khả năng thai nhi bị phá thai

2.1.2.2 Tiếp xúc lâu dài

Hít vào có thể dẫn đến tắc nghẽn đường hô hấp với ho liên quan và khó thở Tiếp xúc với da nhiều lần có thể dẫn đến khô và vảy da Một số cá nhân có thể gặp phản ứng dị ứng sau khi tiếp xúc ban đầu với hóa chất Tiếp xúc sau đó có thể gây phát ban da và hen suyễn và các phản ứng có thể trở nên nghiêm trọng hơn nếu tiếp xúc kéo dài Hít vào lâu dài nồng độ formaldehyde hơi cao (14 ppm) dẫn đến tỷ lệ mắc ung thư mũi tăng cao Thiệt hại di truyền do tiếp xúc đã được thể hiện ở vi khuẩn

và một số côn trùng Nó có ảnh hưởng đến con người rất nghiêm trọng như có thể gây ung thư chẳng hạn [1]

Ngày 10/6/2011 chính phủ Mỹ đã đưa fomaldehyde vào danh sách những chất

có khả năng gây ung thư đối với con người Ở Campuchia, mặc dù sử dụng một lượng lớn fomaldehyde độc hại, nhưng cho đến nay số liệu công bố về nồng độ fomaldehyde trong thực phẩm làm việc rất ít, chưa có các công trình nghiên cứu đánh giá mức độ rủi ro sức khỏe do fomaldehyde gây ra đối với người tiếp xúc [5]

2.2.1 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật tách vật lý được tiến hành trong pha lỏng, trong đó mẫu được tách thành các thành phần cấu thành (hoặc chất phân tích) bằng cách phân bố giữa pha động (chất lỏng chảy) và pha tĩnh (chất hấp thu bên trong cột) HPLC là kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích định lượng dược phẩm, phân tử sinh học, polyme và các hợp chất hữu cơ khác [6]

6

2.2.1.1 Nguyên lý hoạt động

Bơm cao áp bơm pha động vào cột Pha động được lọc trước bằng màng lọc với kích thước lỗ xốp thích hợp Có thể tiến hành phân tích ở nhiệt độ phòng, hoặc dùng bộ ổn nhiệt để hiệu chỉnh nhiệt độ cột ở nhiệt độ thích hợp Mẫu được bơm vào

hệ thống thông qua bộ phận nạp mẫu Sau đó mẫu được pha động đưa qua cột bảo vệ rồi cột phân tích Trong cột phân tích, cấu tử nào của mẫu có ái lực mạnh với pha động sẽ theo pha động đi ra trước, cầu tử nào có ái lực yếu hơn sẽ đi ra sau Pha động

ra khỏi cột sẽ được đưa tới đầu đò

2.2.1.2 Thiết bị sắc ký lỏng

Để thực hiện việc tách một hỗn hợp chất bằng kỹ thuật phân tích HPLC, phải

có các hệ thống trang thiết bị về kỹ thuật này bao gồm 8 bộ phận chính (hình 2.2) là bơm cao áp (pump), bộ nạp mẫu (syringe), cột tách (column), bộ lọc tạp chất, hệ thống pha động (mobile phase) và đầu dò (detector) Trong thiết bị HPLC có hai bộ phận quan trọng nhất là bơm cao áp và đầu dò HPLC sử dụng bơm cao áp để đẩy pha động đi qua cột tách [7-9]

Hình 2.2: Nguyên lý hoạt động của HPLC

7

a Bình chứa dung môi pha động

Pha động phục vụ vận chuyển mẫu đến hệ thống Tiêu chí thiết yếu của pha động là độ trơ đối với các thành phần mẫu Các dung môi tinh khiết hoặc kết hợp đệm thường được sử dụng Pha động phải không có tạp chất hạt và khử khí trước khi sử dụng

Mục đích của bộ phận khử khí là để loại bỏ các bọt trong dung môi pha động Nếu trong quá trình phân tích, dung môi pha động có sót các bọt khí thì một số hiện tượng sẽ sảy ra như:

− Máy lấy tỷ lệ pha động của dung môi không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi

− Áp suất không ổn định nên phân tích sẽ có kết quả không đúng

Mục đích của bơm cao áp là để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm cung cấp dòng chảy di động liên tục vào cột dưới áp suất không đổi

Mục đích của bộ phận tiêm mẫu là sử dụng để cung cấp khối lượng mẫu không đổi trong dòng pha động Độ trơ và độ tái lập của tiêm là cần thiết để duy trì độ chính xác cao Thông thường có hai cách đưa mẫu vào cột là tiêm mẫu bằng tay và tiêm mẫu tự động

8

e Cột sắc ký (pha tĩnh)

Cột là một ống thép không gỉ được nhồi pha tĩnh Cột là bộ phận quan trọng

và cần được duy trì đúng theo hướng dẫn của nhà cung cấp để có được hiệu quả phân tách độ tái lập chạy sau khi chạy

− Đầu dò UV/vis được chia thành hai phần là đầu dò có gắn đèn UV (thường là deuterium 190 – 360 nm) và đèn vis (đèn tungsten 360 – 800 nm) Vì vậy các hợp chất hấp thu ánh sáng được đầu dò phát hiện từ khoảng 180 – 800 nm

− Đầu dò PAD (Photo Diode Array Detector): việc kết hợp số lượng lớn của diod đóng vai trò là giúp đầu dò theo dõi nhiều thành phần hấp thụ ở các bước sóng khác nhau Điều này mang lại lợi ích tiết kiệm thời gian và giảm chi phí cho các dung môi đắt tiền

− Đầu dò huỳnh quang (fluorescence detector): đầu dò này cung cấp độ nhạy cao hơn đầu dò UV/vis Tuy nhiên, số lượng các hợp chất huỳnh quang tự nhiên nhỏ hơn so với các hợp chất hấp thụ ánh sáng Hạn chế này được khắc phục bằng cách tạo dẫn xuất trước hay sau cột

− Đầu dò khối phổ (Mass Spectroscopic Detector): đầu dò này cung cấp

độ nhạy và độ chọn lọc rất cao Kỹ thuật LC – MS đã mở ra các lĩnh vực ứng dụng mới do lợi thế của độ phân giải và độ nhạy

9

− Đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector): đáp ứng sự thay đổi chỉ số khúc xạ của hợp chất rửa giải trong pha động Sự khác biệt lớn về chỉ số chiết suất giữa mẫu và pha động càng lớn thì càng tạo ra một sự mất cân bằng lớn Đầu dò này không thể chạy chương trình Gradient được vì thay đổi thành phần dung môi dẫn đến chiết suất của pha động thay đổi Đầu dò ít nhạy hơn đầu dò UV/vis Kiểm soát nhiệt độ là cần thiết vì nó có độ nhạy nhiệt độ cao Ứng dụng chủ yếu trong Sắc ký loại trừ kích thước

− Đầu dò điện hóa (Electrochemical Detector): Dựa trên quá trình oxy hóa điện hóa hoặc khử mẫu trên bề mặt điện cực Tuy nhiên, nó nhạy cảm với những

thay đổi trong thành phần hoặc tốc độ dòng của pha động

− Đầu dò tán xạ ánh sáng (Light Scattering Detectors): đầu dò này rất hữu ích để phát hiện các phân tử trọng lượng phân tử cao Sau khi loại bỏ pha động bằng cách đi qua vùng nóng, các phân tử chất tan được phát hiện bằng tán xạ ánh sáng tùy

thuộc vào kích thước phân tử [9, 10]

g Xử lý dữ liệu

Các hệ thống HPLC hiện đại dựa trên máy tính và phần mềm điều khiển các thông số vận hành như thành phần pha động, nhiệt độ, tốc độ dòng chảy, thể tích tiêm

h In dữ liệu

Sau khi phân tích xong các mẫu, ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy hoàn thành có thể in ra được

10

2.2.2 Khái niệm về phương pháp HPLC

2.2.2.1 Các thông số cơ bản của sắc ký

a Thời gian lưu giữ t R (retention time)

Thời gian lưu tR (hình 2.3) là thời gian giữa điểm tiêm mẫu và chất phân tích đến đầu dò Thời gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột sắc ký đến chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại [6-9, 11]

− tRA, tRB: thời gian lưu của chất tan peak 1 và peak 2 trong cột sắc ký

− WA, WB: chiều rộng của peak 1 và 2 tính theo đường nền

Thời gian lưu của mỗi chất phụ thuộc các yếu tố:

11

− Bản chất của pha tĩnh, kích thước, độ xốp và cấu trúc xốp

− Bản chất, thành phần, pH và tốc độ của pha động

− Cấu tạo và bản chất phần tử của chất tan và các nhóm thế

− Một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo phức

b Thể tích lưu trữ

Thể tích lưu của một chất là thể tích của pha động chảy qua cột sắc ký trong khoảng thời gian kể từ lúc mẫu được bơm vào cột đến lúc chất tan được rửa giải ra ở thời điểm có nồng độ cực đại (peak), tương ứng với thời gian lưu tR Nếu chất tan không bị lưu giữ trong cột tách, thì thể tích lưu của nó sẽ bằng thể tích V0 của pha động chảy qua cột [6, 7]

− tR0: thời gian không lưu trữ

− tR: thời gian lưu thu được trên sắc ký đồ

c Hệ số phân bố K (Partition coefficient)

Hệ số phân bố là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ của nó trong pha động [6, 8, 12]

12

− K: hệ số phân bố

− CS: nồng độ chất tan trong pha tĩnh (mg/mL)

− CM: nồng độ chất tan trong pha động (mg/mL)

d Hệ số chứa (Hệ số dung lượng cột) k' (capacity factor)

Hệ số chứa hay hệ số dung lượng cột là tỷ số giữa lượng chất tan pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động [6-8, 12]

0 0

− tR: thời gian lưu (phút)

Hệ số dung lượng cột liên quan với thời gian lưu:

− k' << 1: quá trình rửa giải xảy ra quá nhanh làm cho rất khó xác định thời gian lưu một cách chính xác

− k' (20 – 30): thời gian lưu quá dài

− k' nằm trong khoảng 1 – 5 là trị số tối ưu

e Hiệu năng của cột (Column Efficiency)

Hiệu năng của cột là thông số về hiệu suất phân tích của cột liên quan với tỷ

lệ thời gian lưu và độ lệch chuẩn của chiều rộng peak [6, 8, 11]

Công thức tính toán hiệu năng của cột dựa theo phân bố peak Gausse:

13

Số đĩa lý thuyết

2 2

− tR: thời gian lưu (phút)

− W: bề rộng của peak tính theo đường nền

− W1/2: bề rộng của peak tương ứng giữa chiều cao

Chiều cao đĩa lý thuyết

bị dãn nhiều

f Hệ số chọn lọc  (Selectivity)

Hệ số chọn lọc là đại lượng đặc trưng cho khả năng phân tách đối với các cấu

tử khác nhau trong hỗn hợp chất khảo sát (mức độ tách của 2 peak) (hình 2.4) Hệ số chọn lọc là tỷ số giữa các thể tích hoặc thời gian lưu của các peak trên sắc ký đồ [6,

11, 12]:

− tR1, tR2: thời gian lưu của chất tan 1 và 2 (phút)

− t0: thời gian không lưu trữ (phút)

− k'1, k'2: hệ số dung lượng chất tan 1 và 2

Hình 2.4: Sắc ký đồ HPLC thể hiện mức độ tách của hỗn hợp hai thành phần

Độ chọn lọc phải lớn hơn 1 (  ) để tách tốt Nếu  quá lớn thời gian phân tích sẽ dài Độ chọn lọc phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh (C18, C8, phenyl, cyano )

và thành phần pha động [12]

g Độ phân giải của cột (Resolution)

Độ phân giải RS của cột là một đại lượng biểu thị khả năng tách hai cấu tử ra khỏi nhau Độ phân giải của cột được thể hiện giữa hiệu năng của dung môi và hiệu năng của cột

15

Hệ số phân giải RS liên quan đến hệ số dung lượng (k') độ chọn lọc () và số đĩa lý thuyết (N) Mối liên quan này được thể hiện bằng hiểu thức [7, 11]:

' 2

2 ' 1

− RS =1.5: peak tách được một phần nhưng chưa tách hoàn toàn

− RS =2: peak tách khỏi nhau hoàn toàn

Hình minh họa tương quan giữa độ phân giải và hiệu quả tách

Hình 2.5: Hệ số phân giải trong HPLC

16

h Hệ số đuôi (Tailing Factor)

Hệ số đuôi được sử dụng để đánh giá sự cân đối của peak (hình 2.6) thể hiện bằng biểu thức Gaussian:

− W0.05: bể rộng peak ở 5% chiều cao

− f: khoảng cách từ đường cao đến chân của peak ở 5% chiều cao

Hình 2.6: Hệ số đuôi thể hiện đường cao và chân của peak

Hệ số đuôi chấp nhận được nằm trong khoảng 0.9 – 1.4 và Tf = 1 thì peak đối xứng hoàn toàn Hệ số đuôi càng lớn thì hiện tượng kéo đuôi càng rõ [12]

2.2.2.2 Các thông số pha động

a Độ bền và độ chọn lọc của dung môi hữu cơ

Dung môi mạnh hoặc % hàm lượng dung môi hữu cơ trong pha động kiểm soát thời gian lưu của chất phân tích và các dung môi hữu cơ khác nhau như methanol (MeOH), Acetonitrile (ACN), Tetrahydrofuran (THF) có thể có tác động lớn đến

độ chọn lọc [12]

17

b Bộ đệm (Buffers)

Nhiều chất phân tích có các nhóm chức acid hoặc base và có thể tồn tại trong các dung dịch ở dạng ion hóa hoặc không ion hóa Trạng thái ion và mức độ ion hóa ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu của sắc ký Thông thường, dạng ion không phân chia tốt vào pha tĩnh kỵ nước và do đó có k' thấp hơn đáng kể so với dạng trung tính, không ion hóa Bộ đệm thường được sử dụng để kiểm soát pH của pha động để tách các chất phân tích acid hoặc base [12]

c Tính acid của pha động

Pha động trong môi trường acid có pH 2.5 – 3 là điểm khởi đầu tốt cho hầu hết các ứng dụng phân tích vì pH thấp ngăn chặn quá trình ion hóa của hầu hết các chất phân tích acid dẫn đến thời gian lưu cao hơn Các loại acid phổ biến được sử dụng cho pha động có acid phosphoric, acid formic và acid acetic Độ pH thấp cũng giảm thiểu nhiễu của các chất phân tích base với silanol trên bề mặt pha tĩnh silica (vì silanol không bị ion hóa ở pH trong môi trường acid) Ngoài ra, tuổi thọ của cột silica được sử dụng trong phạm vi pH 2 – 8 là tốt nhất Tuy nhiên, các chất phân tích base được ion hóa ở pH thấp và có thể không được giữ lại trừ khi sử dụng thuốc thử ghép ion [12]

18

f Các thông số khác (tốc độ, nhiệt độ cột)

Đối với phân tích isocratic, tốc độ dòng chảy không ảnh hưởng đến k' hoặc 

vì dòng chảy có cùng tác động đến tR và t0 Cả áp suất vận hành và thời gian phân tích tỷ lệ nghịch với tốc độ dòng chảy Tốc độ dòng chảy cũng có ảnh hưởng đáng kể đến số đĩa lý thuyết (N) vì hiệu quả bị giảm (với H tăng) ở tốc độ dòng chảy cao hơn

do khả năng chống chuyển khối lớn hơn (định luật van Deemter C)

Nhiệt độ cột cao làm giảm độ nhớt của pha động (và do đó là áp suất) và tăng

hệ số khuếch tán của chất phân tích (tăng N) [12]

2.2.3 Isocratic và Gradient

Thông thường, HPLC có hai chương trình chạy dung môi là isocratic và gradient Nhược điểm đáng chú ý nhất của chương trình chạy isocratic là công suất (capacity) cực đại có hạn chế (số lượng cực đại có thể chứa trong sắc ký đồ) và có vấn đề với các mẫu chứa phân tích phân cực khác nhau Ngoài ra isocratic có rửa giải muộn nên rất khó trong phân tích do thời gian lưu dài

Ngược lại, chương trình chạy gradient có thành phần của pha động thay đổi theo thời gian trong quá trình rửa giải mẫu, phù hợp với các mẫu phức tạp và mẫu có chứa chất phân tích có độ rộng lớn Chương trình chạy gradient được sử dụng sàng

lọc cao và kiểm tra tạp chất [12]

2.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử mà có thể định lượng được bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ đúng

và độ chính xác thích hợp [13]

19

Có nhiều cách để xác định LOD và LOQ:

− Dựa vào độ lệch chuẩn

✓ Làm trên mẫu trắng (không có chất cần phân tích)

1

i

x x SD

▪ x0: nồng độ trung bình của mẫu trắng

▪ SD0: độ lệch chuẩn của mẫu trắng

✓ Làm trên mẫu thử (nên chọn mẫu thử có nồng độ thấp)

▪ SD: độ lệch chuẩn của mẫu thử

Đánh giá LOD đã tính được: R x

LOD

= (17)

✓ Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính

được đáng tin cậy

✓ Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch đậm đặc hơn hoặc spike vào

dung dịch thử rồi làm thí nghiệm và tính R lại

✓ Nếu R >10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn (pha loãng

dung dịch thử) rồi thí nghiệm và tính R lại

− Dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Hình 2.7: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ tín hiệu nhiễu

LOD được chấp nhận tại nồng độ có tín hiệu lớn gấp 2 – 3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

LOQ được chấp nhận tại nồng độ có tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10

− Dựa vào đường chuẩn

Xác định LOD và LOQ dựa vào hệ số gốc của phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn

21

− SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu

− a: độ dốc của đường chuẩn (phương trình hồi quy tuyến tính) LOD phụ thuộc vào nhiều yếu tố của quá trình sắc ký như [7]:

− Thể tích hay lượng mẫu được nạp vào cột tách

− Tính chất và các thông số đặc trưng của pha tĩnh

− Tính chất và thành phần của pha động (có khi cả giá trị pH)

− Tốc độ của pha động và kỹ thuật rửa giải

− Độ nhạy phát hiện của detector và các đặc trưng của nó

− Hệ thống đường ống dẫn (từ van nạp mẫu đến FlowCell của detector)

− Tính chất của chất phân tích đối với kỹ thuật phát hiện

− Thiết bị để ghi đo tín hiệu của chất phân tích

2.2.5 Ứng dụng của HPLC phân tích HCHO trong thực phẩm

Bảng 2.1: Ứng dụng của HPLC phân tích HCHO trong thực phẩm

- Dung môi pha mẫu: ACN

- Pha động: chạy isocratic MeOH:H2O (65:35)

- Dung môi pha mẫu: H2O

- Pha động: chạy isocratic MeOH:H2O (75:25)

[15]

23

Hiện nay, phương pháp phân tích định lượng formaldehyde trong thực phẩm chủ yếu là phương pháp quang phổ UV/vis Phương pháp đã được bộ Y tế Việt Nam lập phương pháp ra tiêu chuẩn Việt Nam [20, 21] Bên cạnh đó phương pháp sắc ký lỏng đầu dò UV/vis là thiết bị tin cậy, phát hiện ở nồng độ thấp được sử dụng rất nhiều trong các phòng thí nghiệm Các nghiên cứu phân tích hàm định lượng formaldehyde trong thực phẩm trước đây đều có quá trình xử lý mẫu phức tạp và tốn thời gian nhiều trong quá trình xử lý mẫu và chưa có công trình nghiên cứu khoa học nào phân tích formaldehyde trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng đầu dò UV/vis tại Campuchia nên tôi chọn thiết bị này để phân tích

1 LunaC (4.6mm 250 mm, 518  m) Đo nồng độ Trung Quốc

2 Máy quang phổ UV/vis Đo độ hấp thu Agilent Cary 60 UV-vis

3 Bể điều nhiệt ủ mẫu, ủ chuẩn GFL

4 Máy siêu âm Đánh siêu âm Elma S 100 H Elmasonic

5 Máy lắc rung vial Lắc vial VORTEX GENIE 2

6 Máy ly tâm Ly tâm mẫu Meditry TGL – 10B

7 Màng lọc chân không Lọc pha động Labtech VP30

8 pH kế Đo pH Model PHS – 3C