Nghiên cứu thu nhận chondroitin sulfate từ sụn ức gà bằng phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bằng enzyme alcalase và khảo sát tính ổn định của sản phẩm

Kết quả xác định được các thông số của quá trình sấy phun, với tốc độ bơm nhập liệu là 7,5 ml/phút và nhiệt độ không khí đầu vào là 140oC thì độ ẩm sản phẩm đạt 6,47% phù hợp theo tiêu c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

TRƯƠNG NGỌC THẢO

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHONDROITIN SULFATE

TỪ SỤN ỨC GÀ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM KẾT HỢP

THỦY PHÂN BẰNG ENZYME ALCALASE VÀ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Đống Thị Anh Đào

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 CT: TS Trần Bích Lam

2 PB1: TS Nguyễn Hoài Hương

3 PB2: TS Trần Thị Thu Trà

4 UV: TS Lê Ngọc Liễu

5 UVTK: TS Nguyễn Thị Hiền

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRƯƠNG NGỌC THẢO MSHV: 1870066

Ngày, tháng, năm sinh: 09/07/1995 Nơi sinh: Đồng Nai

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tổng quan tài liệu về nguyên liệu sụn ức gà, enzyme dùng trong thủy phân Phân tích một

- Tối ưu hóa quá trình siêu âm sụn ức gà để đạt hiệu suất thu nhận CS cao nhất

- Khảo sát các điều kiện của quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase2,4L

- Khảo sát các điều kiện của quá trình sấy phun thu nhận chế phẩm

- Phân tích thành phần chế phẩm CS thu được

- Lão hóa chế phẩm CS nghiên cứu để xác định hạn sử dụng bằng phương pháp gia tốc nhiệt

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): GS.TS Đống Thị Anh Đào

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô GS TS Đống Thị Anh Đào đã tận tình hướng dẫn và có những định hướng thiết thực giúp em giải quyết các vấn đề nghiên cứu một cách hiệu quả và khoa học nhất

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và các bạn bè đã đồng hành, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em tham gia học tập và hoàn thành tốt công trình nghiên cứu này

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến gia đình, thầy cô và bạn bè

Trân trọng cảm ơn !

TP HCM, tháng 07 năm 2019

Học viên thực hiện

Trương Ngọc Thảo

TÓM TẮT

Chondroitin sulfate (CS) là một hợp chất thiên nhiên được tổng hợp ở cơ thể động vật bậc cao và tồn tại trong các mô liên kết, có tác dụng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp Sụn ức gà là phụ phẩm trong ngành công nghiệp chế biến thịt gà, chứa hàm lượng CS cao,

do đó việc tách chiết và thu nhận CS từ nguồn này để bổ sung vào thành phần của các loại thực phẩm chức năng là có ý nghĩa thiết thực

Từ nguyên liệu thô, qua các quá trình xử lí sơ bộ, chần ở nhiệt độ 80oC trong vòng 4 phút thu được sụn thô Các điều kiện của quá trình siêu âm được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Các giá trị tối ưu của quá trình siêu âm ứng với các biến Z1, Z2, Z3, Z4 lần lượt tại các điều kiện siêu âm gồm: tỉ lệ nguyênliệu:đệm 1:9 (wnguyên liệu/wđệm); pH 9; nhiệt độ 47,34oC và thời gian siêu âm là 9,5 phút Các điều kiện thủy phân để thu nhận Chondroitin sulfate bằng chế phẩm enzyme Alcalase 2,4L được xác định gồm hàm lượng enzyme/cơ chất 4% (v/wpro), nhiệt độ thủy phân 55oC trong thời gian 60 phút Hiệu suất thu hồi CS đạt 24,29% so với hàm lượng chất khô; 61,02% so với Carbohydrate tổng

Sau khi thủy phân, tiến hành vô hoạt enzyme ở 80oC trong 10 phút, dùng TCA 4% (w/v) để loại bỏ các protein hòa tan, ly tâm, lọc chân không với màng Whatman có kích thước lỗ 15-20µm thu lấy dịch và thẩm tích bằng màng cellophane MWCO 14 kDa trong vòng 3 giờ Các thông số ảnh hưởng đến quá trình sấy phun gồm nhiệt độ không khí đầu vào và tốc độ bơm nhập liệu khi sấy bằng thiết bị sấy phun hiệu Buchi B-290 thu nhận chế phẩm CS dạng bôt mịn đạt độ ẩm theo tiêu chuẩn USP38 được khảo sát Kết quả xác định được các thông số của quá trình sấy phun, với tốc độ bơm nhập liệu là 7,5 ml/phút và nhiệt độ không khí đầu vào là 140oC thì độ ẩm sản phẩm đạt 6,47% phù hợp theo tiêu chuẩn USP38 Chế phẩm được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký thẩm thấu gel (GPC) đạt được độ tinh sạch là 88,86% và khối lượng phân tử trung bình 184,57kDa

Áp dụng phương pháp gia tốc nhiệt để đánh giá hạn sử dụng của chế phẩm CS nghiên cứu nhằm tiết kiệm thời gian Chế phẩm CS nghiên cứu sau đem khi chia thành từng đơn vị mẫu (khối lượng 1g/gói, bảo quản trong bao bì nhựa PE, hàn kín) được lưu trữ ở 3 mốc nhiệt độ 35°C; 40°C; 45°C và xác định hàm lượng CS theo từng mốc thời gian Từ dữ liệu thực nghiệm, xác định có mối tương quan giữa hàm lượng và thời gian bảo quản của chế phẩm CS nghiên cứu Mối tương quan này được thể hiện bằng công thức Arrhenius và thời hạn sử dụng của chế phẩm CS nghiên cứu là 21,64 tháng khi bảo quản ở 30oC

Chondroitin sulfate (CS) is a natural compound synthesized in the body of animals and exists

in connective tissues, which helps prevent and support for the treatment of osteoarthritis Chicken keel cartilage, a by-product of the poultry slaughter industry, contains high CS content, therefore

it is meaningful to extract CS from this source to add to functional food ingredients

From raw materials, through pretreatment and blanching processes at a temperature of 80°C for 4 minutes, preliminary treatment of crude cartilage was obtained The variables of the ultrasound treatment process were investigated and optimal conditions were obtained by Response Surface Methodology – RSM method Optimal values for independent variables Z1, Z2, Z3, Z4 were found at a ratio of material and buffer 1:9 (wmaterial/wbuffer), pH9, temperature 47,34oC, and time within 9,5 minutes After ultrasound treatment, hydrolysis using the enzyme Alcalase was performed under the following conditions: ratio enzyme to substrate 4% (v/w), temperature 55oC, and time 60 minutes The overall yield of CS was 24,29% of the absolute dry weight, and 61,02%

of the total carbohydrate content of the starting material

At the end of hydrolysis, enzyme was inactivated at 80oC for 10 minutes, then using trichloacetic acid 4% w/v (TCA) to precipitate protein, hydrolyzed CS was centrafugated and was filtered by vacuum filtration method through Whatman filter paper of 15-20 µm Then the filtrate was dialyzed by dialysis tubing cellulose membrane with MWCO 14 kDa for 3 hours to remove out impurities like TCA, amino acids, and minerals The powdered CS with moisture content at 6,47% meet the USP38 standard was obtained by spray drying by the Buchi B-290 laboratory scale spray dryer at flow rate at 7,5 mL/min and temperature of air-in at 140 oC HPLC analysis showed that the powder product contained 88,86% CS with an average molecular weight of 184,57 kDa (determined by GPC)

Application of thermal acceleration method to evaluate the shelf life of the research CS product to save time The researched CS products were divided into sample units (weight of 1g / pack, stored in PE plastic packaging, sealed) were stored at three level temperature 35°C; 40°C; 45°C and determined CS content following time storage From experimental data, there was a correlation between the CS content and storage time of the researched product This correlation was expressed by the Arrhenius formula and the shelf life of the researched CS was 21,64 months when stored at 30oC

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Đống Thị Anh Đào Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

MỤC LỤC

Chương 1: TỔNG QUAN 1

1.1.Tổng quan về Chondroitin sulfate (CS) 1

1.1.1 Sơ lược về chất căn bản và Glycosaminoglycans (GAGs) 1

1.1.2 Cấu tạo của CS 2

1.1.3 Phân loại CS 2

1.1.4 Chức năng sinh học của CS và ứng dụng vào các sản phẩm thương mại 3

1.1.5 Phương pháp và nguồn thu nhận CS 5

1.1.6 Các nghiên cứu về CS 6

1.2 Giới thiệu về sụn 7

1.2.1 Sụn động vật 7

1.2.2 Sụn ức gà 7

1.3 Tổng quan về ngành công nghiệp chăn nuôi gà thịt và phụ phẩm chế biến từ gà 8

1.3.1 Chăn nuôi gia cầm và gà thịt công nghiệp 8

1.3.2 Đặc điểm chung một số giống gà thịt 9

1.3.3 Tình hình phát triển chăn nuôi gà ở Việt Nam 11

1.3.4 Phụ phẩm chế biến gà thịt 12

1.4 Tổng quan về phương pháp thu nhận CS thô 12

1.4.1 Tác động của sóng siêu âm đến quá trình thu nhận CS thô 12

1.4.2 Sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân sụn ức gà thu nhận CS 15

1.5 Tổng quan về phương pháp thẩm tích qua màng cellophane 16

1.5.1 Giới thiệu chung 16

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích 16

1.6 Tổng quan về quá trình sấy thu nhận sản phẩm 17

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.1 Sụn ức gà 19

2.1.2 Enzyme Alcalase 2,4L 19

2.1.3 Hóa chất trong nghiên cứu 19

2.2 Dụng cụ và thiết bị 19

2.2.1 Dụng cụ 19

2.2.2 Thiết bị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 20

2.3.2 Sơ đồ lão hóa xác định HSD của chế phẩm CS nghiên cứu 21

2.3.3 Quy trình sản xuất chế phẩm CS từ sụn ức gà 22

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

2.3.6 Các phương pháp phân tích 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Thành phần cơ bản của sụn ức gà 33

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố chần tới hiệu suất thu hồi CS 34

3.2.1 Nhiệt độ chần 34

3.2.2 Thời gian chần 35

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình siêu âm đến hiệu suất thu hồi CS 36

3.3.1 Tỉ lệ nguyên liệu:đệm 36

3.3.2 pH 37

3.3.3 Nhiệt độ 38

3.3.4 Thời gian 39

3.4 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân sụn ức gà 41

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS 46

3.5.1 Nhiệt độ 47

3.5.4 Thời gian thủy phân 48

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình sấy phun đến hiệu suất thu hồi CS 50

3.6.1 Tốc độ bơm nhập liệu 50

3.6.1 Nhiệt độ 52

3.8 Phân tích chế phẩm CS nghiên cứu thu được 54

3.8.1 Thành phần mẫu chế phẩm CS 54

3.8.2 Phân tích chế phẩm CS bằng HPLC 54

3.8.3 Kiểm tra khối lượng phân tử của chế phẩm nghiên cứu 55

3.8.4 Kiểm tra ảnh chụp SEM của CS chuẩn và chế phẩm nghiên cứu 58

3.8.5 Kết quả phân tích FTIR 58

3.9 Khảo sát tính ổn định của chế phẩm nghiên cứu 60

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

4.1 Kết luận 62

4.2 Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 67

A CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 67

A.1 Phương pháp xác định ẩm 67

A.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro 67

A.3 Phương pháp xác định hàm lượng béo 68

A.4 Phương pháp Kjeldahl 69

A.5 Phương pháp Sigma-Aldrich St Louis xác định hoạt độ enzyme 70

A.6 Phương pháp xác định CS theo Farndale và cộng sự (1986) 72

A.7 Phương pháp quang phổ hấp thu UV-Vis 73

A.8 Phương pháp thẩm tích 74

A.9 Xác định hàm lượng CS bằng phương pháp HPLC 74

A.10 Xác định khối lượng phân tử của chế phẩm CS theo phương pháp GPC 75

B CÁC GIÁ TRỊ PHÂN TÍCH THỰC NGHIỆM 76

B.1 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo nhiệt độ chần 76

B.2 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo thời gian chần 77

B.3 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo tỉ lệ nguyên liệu:đệm 77

B.4 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo pH siêu âm 78

B.5 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo nhiệt độ siêu âm 79

B.6 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo thời gian siêu âm 80

B.7 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) khi tiến hành thí nghiệm theo quy trình thực nghiệm 81

B.8 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo hàm lượng enzyme 82

B.9 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo nhiệt độ thủy phân 83

B.10 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo thời gian thủy phân 84

B.11 Kết quả độ ẩm sản phẩm (%) theo tốc độ nhập liệu 85

B.12 Kết quả độ ẩm sản phẩm (%) theo tốc độ nhập liệu 86

C CÁC BẢNG THỐNG KÊ 87

C.1 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo nhiệt độ chần 87

C.2 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo thời gian chần 87

C.3 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo tỉ lệ nguyên liệu:đệm 88

C.4 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo pH siêu âm 88

C.5 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo nhiệt độ siêu âm 88

C.6 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo thời gian siêu âm 89

C.7 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo hàm lượng enzyme 89

C.8 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo nhiệt độ thủy phân 90

C.9 Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) theo thời gian thủy phân 90

C.10 Kết quả độ ẩm sản phẩm (%) theo tốc độ nhập liệu 90

C.11 Kết quả độ ẩm sản phẩm (%) theo nhiệt độ không khí đầu vào 91

D BẢNG KẾT QUẢ GỬI MẪU 92

D.1 Thành phần cơ bản của sụn ức gà 92

D.2 Kết quả GPC của mẫu chuẩn 93

D.3 Kết quả GPC của chế phẩm nghiên cứu 94

D.4 Kết quả HPLC của chế phẩm CS nghiên cứu (độ tinh sạch 88,86%) 95

D.5 Kết quả HPLC của chế phẩm CS nghiên cứu sau 02 tháng 97

D.6 Kết quả HPLC của chế phẩm CS nghiên cứu sau 04 tháng 101

D.7 Kết quả HPLC của chế phẩm CS nghiên cứu sau 06 tháng 105

D.8 Kết quả HPLC của chế phẩm CS nghiên cứu sau 08 tháng 109

D.9 Kết quả HPLC của chế phẩm CS nghiên cứu sau 10 tháng 112

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Bảng phân loại CS 3

Bảng 1 2: Thành phần dinh dưỡng của thịt gà tính trên 100g (199kcal) thực phẩm ăn được9 Bảng 1 3: Số lượng đầu con và sản phẩm chăn nuôi gia cầm 2017 11

Bảng 1 4: Phân bố tổng đàn gia cầm theo một số địa phương 11

Bảng 2 1: Bảng quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, bốn yếu tố 27

Bảng 2 2: Giá trị tại tâm và bước nhảy trong thí nghiệm tối ưu hóa quá trình siêu âm 29

Bảng 3 1: Thành phần hóa học trong sụn ức gà 33

Bảng 3 2: Các mức yếu tố thí nghiệm tối ưu trong bài toán tối ưu hóa các yếu tố của quá trình siêu âm ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi CS (%) 41

Bảng 3 3: Kết quả hiệu suất thu hồi CS theo các yếu tố khi tiến hành thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm 41

Bảng 3 4: Hệ số phương trình hồi quy và độ tin cậy của các hệ số tương ứng với các yếu tố của quá trình siêu âm 43

Bảng 3 5: Kết quả hiệu suất thu hồi CS (%) từ phương trình hồi quy và thực nghiệm 45

Bảng 3 6: Thành phần mẫu chế phẩm và quy định 54

Bảng 3 7: Kết quả Mw, Mn, PI của CS chuẩn và chế phẩm nghiên cứu 56

Bảng 3 8: Sự thay đổi hàm lượng của chế phẩm 60

Bảng 3 9: Bảng giá trị đồ thị lnk-1/T theo nhiệt độ 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Cấu trúc của proteoglycan 1

Hình 1 2: Cấu trúc hóa học một monomer của CS 2

Hình 1 3: Cấu tạo của CS-O và một số đồng phân của CS 2

Hình 1 4: DS và các đồng phân 3

Hình 1 5: Sụn ức gà nguyên liệu: a) trước khi chần; b) Sau khi chần, lột thịt 8

Hình 1 6: Nhu cầu thịt toàn cầu hằng năm trong giai đoạn 2010-2030 8

Hình 1 7: Các khoảng tần số âm thanh 13

Hình 1 8: Nguyên lý hình thành và vỡ bọt khí 13

Hình 1 9: Mô tả phương pháp thẩm tích 16

Hình 1 10: Hệ thống thiết bị sấy phun (quy mô phòng thí nghiệm) 18

Hình 2 1: Quy trình sản xuất chế phẩm CS từ sụn ức gà 22

Hình 3 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ chần đến hiệu suất thu hồi CS 34

Hình 3 2: Ảnh hưởng của thời gian chần đến hiệu suất thu hồi CS 35

Hình 3 3: Ảnh hưởng tỉ lệ sụn:đệm tới hiệu suất thu hồi CS 36

Hình 3 4: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi CS 37

Hình 3 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hiệu suất thu hồi CS 39

Hình 3 6: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất thu hồi CS 40

Hình 3 7: Ảnh hưởng của giá trị pH và tỉ lệ nguyên liệu:đệm (a); tỉ lệ nguyên liệu:đệm và nhiệt độ siêu âm (b); thời gian siêu âm và tỉ lệ nguyên liệu:đệm (c); thời gian và nhiệt độ siêu âm (d) đến hiệu suất thu hồi CS 45

Hình 3 8: Ảnh hưởng nồng độ enzyme/cơ chất tới hiệu suất thu hồi CS 46

Hình 3 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS 48

Hình 3 10: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi CS 49

Hình 3 11: Ảnh hưởng của tốc độ nhập liệu đến độ ẩm sản phẩm 51

Hình 3 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đầu vào đến độ ẩm sản phẩm 53

Hình 3 13: Đồ thị kết quả xác định chuẩn CS bằng HPLC 54

Hình 3 14: Đồ thị kết quả xác định chế phẩm CS nghiên cứu bằng HPLC 54

Hình 3 15: Sắc ký đồ GPC của mẫu CS chuẩn 57

Hình 3 16: Sắc ký đồ GPC của chế phẩm nghiên cứu 57

Hình 3 17: Ảnh chụp SEM của CS chuẩn (a) và chế phẩm nghiên cứu (b) 58

Hình 3 18: Kết quả sắc kí đồ FTIR của mẫu CS chuẩn; CS nghiên cứu và CS thương mại

60

Hình 3 19: Đồ thị lnC-t (tháng) ở 35oC 61

Hình 3 20: Đồ thị lnC-t (tháng) ở 40oC 61

Hình 3 21: Đồ thị lnC-t (tháng) ở 45oC 62

Hình 3 22: Đồ thị lnk-1/T 62

CS-GAG Chondroitin sulfate glycosaminoglycan

IdoA Iduronic acid

DS Dermatan sulfate

HSD Hạn sử dụng

FMBRA Flour Milling and Baking Research Association (Hiệp hội sản xuất

bánh) BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)

OD Optical Density (Mật độ quang học)

DMMB 1,9-Dimethylmethylen Blue

ECM Extracellular matrix (Ma trận ngoại bào)

TCA Trichloroacetic acid

NOEs Nuclear Overhauser effects ( Hiệu ứng hạt nhân Overhause) RSM Response surface methodology (Phương pháp bề mặt đáp ứng) SEM Scanning Electron Microscope (Kính hiển vi quét điện tử)

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) GPC Gel Permeation Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel )

FTIR Fourier-transform infrared spectroscopy (Quang phổ Chuyển đổi

hồng ngoại Fourier)

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Từ năm 1996, cùng với sự đổi mới kinh tế đất nước, ngành chăn nuôi gia cầm có những bước tiến nhảy vọt Hiện nay, ngành chăn nuôi gia cầm nước ta đã tiếp thu một số công nghệ tiên tiến của thế giới về giống, thức ăn, thuốc thú y và quy trình chăm sóc nuôi dưỡng, hình thành nhiều cơ

sở chăn nuôi gia cầm quy mô lớn Theo ước tính, đến nay cả nước có trên 100.000 hộ chăn nuôi theo hình thức trang trại tại 8 vùng sinh thái khác nhau, thay thế dần kiểu chăn nuôi tự cấp, tự túc, tận dụng sản phẩm phụ của trồng trọt như trước đây bằng kiểu chăn nuôi hàng hóa quy mô vừa và một số ít trang trại có quy mô chăn nuôi hàng hóa lớn đã xuất hiện

Qua đó có thể thấy lượng phụ phẩm trong quá trình sản xuất và chế biến thịt gà xẻ là rất lớn Lượng xương và sụn gà rất dồi dào, đặc biệt là sụn từ xương ức gà Trong thành phần của sụn ức

gà lại có nhiều hợp chất quý có thể kế đến là Chondroitin sulfate (CS) giúp tái tạo các mô sụn và xương, hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp, nuôi dưỡng tế bào giác mạc mắt,…

Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu thu nhận CS từ sụn và ứng dụng vào trong các sản phẩm thực phẩm chức năng, hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp cho người Tuy nhiên,

ở nước ta vẫn chưa có công trình nghiên cứu cụ thể về khả năng tách chiết CS từ sụn ức gà Trước thực trạng đó, việc triển khai đề tài “Nghiên cứu thu nhận chondroitin sulfate từ sụn

ức gà bằng phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bằng enzyme alcalase và khảo sát tính ổn định của sản phẩm” là điều cần thiết

Đề tài nghiên cứu này góp phần nâng cao giá trị cho ngành công nghệ chế biến gia cầm nói chung và chăn nuôi gà nói riêng, tăng thêm nguồn thu nhập cho người chăn nuôi Đồng thời cũng tạo ra một sản phẩm có giá trị về mặt sức khỏe cho con người với giá thành phù hợp

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất CS dạng bột hòa tan, đạt chất lượng theo USP38

Phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là sụn ức gà được mua tại công ty TNHH Phạm Tôn

Enzyme Alcalase 2,4L sử dụng cho nghiên cứu là sản phẩm của hãng Novozymes (Mỹ) được cung cấp bởi công ty BrennTag Việt Nam, thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu này được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu

- Tổng quan tài liệu về nguyên liệu sụn ức gà, enzyme dùng trong thủy phân Phân tích một số thành phần cơ bản của sụn ức gà

- Thiết lập quy trình công nghệ thu nhận CS bằng phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bằng enzyme Alcalase 2,4L

- Khảo sát các yếu tố của các quá trình ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi CS từ sụn ức

gà gồm: quá trình xử lý nhiệt nguyên liệu, quá trình siêu âm, quá trình thủy phân

- Tối ưu hóa quá trình siêu âm sụn ức gà để đạt hiệu suất thu nhận CS cao nhất

- Khảo sát các điều kiện của quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase2,4L

- Khảo sát các điều kiện của quá trình sấy phun thu nhận chế phẩm

- Phân tích thành phần chế phẩm CS thu được

- Lão hóa chế phẩm CS nghiên cứu để xác định hạn sử dụng bằng phương pháp gia tốc nhiệt

Ứng dụng

Kết quả nghiên cứu giúp ta hiểu hơn về quy trình tách chiết cũng như thu nhận CS từ sụn

ức gà để sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng, hỗ trợ điều trị bệnh thoái hóa xương khớp ở người cao tuổi Tạo tiền đề cho những nghiên cứu sau này

Chương 1: TỔNG QUAN

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Chondroitin sulfate (CS)

1.1.1 Sơ lược về chất căn bản và Glycosaminoglycans (GAGs)

Mô liên kết có cấu tạo 3 phần: các tế bào liên kết, sợi liên kết và chất căn bản

Chất căn bản là một chất gel ưa nước ở trạng thái vô định hình, đồng nhất, trong suốt, làm nền cho tế bào với các phân tử sợi, có tính nhờn với hàm lượng nước và chất điện giải tương đương với máu Thành phần cấu tạo chủ yếu của chất căn bản liên kết là: glycosaminoglycans (GAGs); proteoglycans (PGs); nước và những muối vô cơ tạo thành dịch mô

Glycosaminoglycans (GAGs)

Là những chuỗi polysaccharide được tạo ra bằng sự đa trùng hợp của những đơn vị disaccharide được cấu tạo bởi acid uronic và nhóm hexoasmine

GAGs gồm dermatan sulfate (phần lớn ở da, gân, dây chằng), chondroitin sulfate (có nhiều

ở sụn trong, sụn đàn hồi, xương giác mạc, da, thành động mạch chủ), heparan sulfate (có nhiều trong thành động mạch chủ, động mạch phổi, gan); thường gắn với các protein bởi những liên kết đồng hóa trị để tạo thành những phân tử proteoglycans Những GAGs này làm cho chất căn bản ở trạng thái nửa sol (loãng) nửa gel (đặc)

Hình 1 1: Cấu trúc của proteoglycan

1.1.2 Cấu tạo của CS

CS là một polysaccharide được cấu tạo từ đơn vị cấu trúc cơ bản (monomer) là disaccharide chứa nhóm glucuronic acid (GlcA) và N-acetyl-galactosamine (GalNAc) liên kết với nhau bởi liên kết glucoside (GlcA-β(1→3)-GalNAc) (Hình 1.4) tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycan (CS-GAG) hay CS không phân nhánh Một chuỗi CS thường có chứa trên 50 đơn vị disaccharide.[1, 2]

Hình 1 2: Cấu trúc hóa học một monomer của CS

CS thường liên kết với các protein bằng liên kết o-glycoside tạo thành proteoglycan Các proteoglycans có nhiệm vụ tạo nên cấu trúc trơn nhẵn và đàn hồi cho màng sụn, chúng là những phân tử ưa nước tạo nên cấu trúc của sụn với hàm lượng nước cao Hàm lượng nước cao trong sụn

là một nhân tố quan trọng vì nó làm phân tán áp lực và là nơi diễn ra sự trao đổi chất giữa các tế bào liên kết với tuần hoàn máu cung cấp dưỡng chất cho sụn Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng

80 - 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học vững chắc.[1, 3]

Khi gốc GlcA bị thay thế bởi gốc iduronic acid (IdoA) sẽ tạo ra đồng phân lập thể với CS gọi

là dermatan sulfate (DS) Tương tự với CS, DS cũng có các đồng phân được tạo ra mỗi nhóm OH của CS-GAG được thay thế bởi nhóm sulphate (S) tại các vị trí C4 hoặc C6 của GalNAc và vị trí C2 của IdoA.[4]

Hình 1 4: DS và các đồng phân 1.1.4 Chức năng sinh học của CS và ứng dụng vào các sản phẩm thương mại

Chức năng sinh học của CS

CS có trong thành phần của sụn cá, vây cá, sụn và các chất nền hữu cơ trong xương động vật

Ở cơ thể con người, CS là thành phần tìm thấy ở sụn khớp, xương, da, giác mạc mắt và thành các động mạch CS là một thành phần trong dịch khớp, có tác dụng bôi trơn và bảo vệ sụn Sự phân bố

rộng rãi của CS ở các cơ thể sống khác nhau đã phản ánh được vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học.[6-8]

Tác dụng của CS

CS hỗ trợ điều trị bệnh viêm xương khớp

CS có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm xương khớp theo các cơ chế sau: Tham gia vào cấu trúc sụn khớp; bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzyme phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và N – acetylglucosamindase; và kích thích tăng hoạt tính các enzyme có vai trò xúc tác phản ứng tổng hợp acid hyaluronic là chất giúp khớp hoạt động tốt.[9]

Các công trình nghiên cứu những năm gần đây cho thấy CS (thu nhận từ sụn vi cá mập) có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp, đó là do CS tham gia vào cấu trúc màng tế bào,

có trong thành phần các sợi chun ở các mạch máu lớn, chiếm tỷ lệ cao trong chất cơ bản ở mô sụn

và xương nên bảo đảm cho sụn xương không những có độ chắc mà còn có tính đàn hồi

CS cũng có tác dụng ức chế enzyme elastase (enzyme này là chất trung gian gây thoái hóa sụn khớp) nên được chỉ định sử dụng để hỗ trợ các chứng hư và thoái hóa khớp Ở nhiều nước, CS được xem là chế phẩm bổ sung dinh dưỡng CS còn có khả năng kích thích quá trình tổng hợp các proteoglycan nên được nhiều bác sĩ chuyên khoa phối hợp với glucosamin sulfate dùng vào điều trị viêm xương khớp có tác dụng tốt

Điều trị bằng CS với liều 800 mg/ngày trong thời gian tối thiểu là 2 năm có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp.[10]

Trên thế giới trong 10 năm qua, các thành phần trong sụn như chondroitin và glucosamine ngày càng được khuyến cáo trong hướng dẫn của các bác sĩ đa khoa và chuyên gia về thấp khớp Trong năm 2008, doanh thu toàn cầu của chất bổ sung glucosamine và CS đạt gần 2 tỷ đô la (1,3 tỉ bảng Anh; 0,8 tỷ euro), tăng khoảng 60% so với năm 2003, với mức tăng trưởng liên tục dự kiến đến năm 2013 đạt 2,3 tỷ đô la.[11]

Chất kháng ung thư tiềm năng [12]

Trong những năm gần đây, CS đã được sử dụng rộng rãi trong thuốc bổ sung và thuốc điều trị bệnh viêm khớp, phòng ngừa các biến cố mạch vành, điều trị bệnh vẩy nến và các bệnh viêm mắt Vai trò sinh học của nó trong các bệnh khác nhau đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu và điều này đã thúc đẩy sự phát triển các loại thuốc mới, hiệu quả hơn

Những hiểu biết về vai trò của CS về sự hình thành mạch máu khối u (tumor angiogenesis)

và sự lan truyền đã thúc đẩy cho sự phát triển nhiều loại thuốc mới nhằm vào tế bào khối u và

Các nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng sử dụng CS đã được sửa đổi (modified CS) như là một tác nhân chống ung thư mạnh

Phòng và chữa các bệnh về mắt

CS cũng được dùng rất rộng rãi trong nhãn khoa Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có tác dụng tạo độ nhớt thích hợp và bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nước mắt trước giác mạc chống tình trạng khô mắt CS cũng có tác dụng duy trì độ trong suốt của thủy tinh thể và giác mạc mắt, tăng cường tính đàn hồi của thấu kính và thể mi khi mắt điều tiết nên hạn chế sự khô mắt, mỏi mắt, hoa mắt khi mắt làm việc quá nhiều

Ngoài ra, CS còn được dùng điều trị hỗ trợ trong phẫu thuật mắt (điều trị mô cườm mắt và ghép giác mạc) và dùng làm dung dịch bảo quản giác mạc trong phẫu thuật ghép giác mạc Do ức chế tạo sinh tân mạch, CS còn được dùng trong điều trị bệnh thoái hóa võng mạc mắt do tiểu đường (bệnh do tân mạch phát triển xâm nhập vào dưới võng mạc mắt gây tổn thương thành sẹo, có thể dẫn tới mù lòa) [13]

1.1.5 Phương pháp và nguồn thu nhận CS

Cấu trúc phân tử của CS rất phức tạp và đa dạng nên chưa thể tổng hợp bằng con đường hóa học, mà chỉ được thu nhận từ nguồn nguyên liệu tự nhiên thông qua quá trình chiết xuất mô, sụn động vật CS trong mô động vật liên kết chặt chẽ với protein trong dạng phức proteoglycan, cho nên cần phải tách CS ra khỏi protein hoặc phân hủy protein để giải phóng CS Chế phẩm CS từ sụn

có thể được thu nhận bằng phương pháp hóa học, vật lý và phương pháp sinh học

- Theo phương pháp hoá học: mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH ) để tách CS khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…) Phương pháp này đã áp dụng để thu CS từ sụn gà Tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS, làm thay đổi cấu trúc cũng như hoạt tính CS [14]

- Theo phương pháp vật lý: sóng siêu âm đã được ứng dụng để trích ly nhiều hợp chất từ các

phá vỡ cấu trúc của nguyên liệu, trích ly các hợp chất hòa tan Bên cạnh đó, nhiệt độ siêu âm có thể làm duỗi mạch và biến tính protein, dẫn đến giải phóng CS ra khỏi liên kết protein

- Theo phương pháp sinh học: dùng enzyme thuỷ phân mô sụn để thu nhận CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất (muối, kiềm, acid ) gây ra nên có hiệu quả cao nhất Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain, alcalase,…) để thuỷ phân sụn, giải phóng CS khỏi các protein liên kết Sau khi loại bỏ protein thì CS được tách ra và tinh sạch Phương pháp này đã được dùng để thu nhận

CS từ sụn cá tầm [15], sụn cá mập [16], cá đuối, cá nhám [3, 17], Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone và methanol, vì vậy có thể sử dụng các dung môi này để thu CS

Định lượng CS

Xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu DMMB dimethylmethylene blue) khi nó gắn với CS Hoà tan bột CS khô vào nước đã loại ion để nhận dung dịch 0,0005% (w/v) và xác định hàm lượng CS của dung dịch theo Farndale và cộng sự Dùng CS4 tinh khiết làm chất chuẩn, sau đó đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 525nm trên máy quang phổ [18]

(1,9-1.1.6 Các nghiên cứu về CS

V C Hascall và các cộng sự (1988) [19] đã nghiên cứu về cấu trúc phân tử của CS tự nhiên,

là một glycosaminoglycan (CS), một polyme mạch thẳng Đơn vị cấu trúc cơ bản của CS là disaccharide chứa nhóm GlcA và GalNAc liên kết với nhau bởi liên kết glucoside GlcA β (1→3) GalNAc tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycan (CS-GAG) không phân nhánh Một chuỗi CS-GAG có thể chứa hơn 50 đơn vị disaccharide [1, 20]

M Bernfield và các cộng sự (1999) [21] đã xác định rằng CS liên kết với các protein bởi liên kết glycoside tạo thành proteoglycan (PG)

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã chiết tách CS từ một số nguồn nguyên liệu như: sụn cá tầm cá tầm [15], sụn cá mập [16], cá đuối, cá nhám [3, 17],…W Garnjanagoonchorn và các cộng sự (2007) đã sơ bộ đưa ra quy trình tách chiết CS, sử dụng enzyme papain và từ đó so sánh khả năng trích ly CS từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như, sụn vi cá mập, sụn cá đuối, cá sấu

và sụn ức gà và phân tích định lượng bằng phương hấp thu quang phổ FTIR, đã cho thấy có thể thu được hàm lượng CS từ 11,55% đến 14,84% [2] Nakano và cộng sự (2012) cũng đã trích ly, tinh sạch và phân tích chế phẩm CS thu được từ nguồn sụn gà, hàm lượng CS thu được 30,08% (so với

Chương 1: TỔNG QUAN

chất khô nguyên liệu) [22] Qua đó có thể thấy được sụn ức gà chính là nguồn nguyên liệu tiềm năng để trích ly và thu nhận CS

Ngoài ra cũng có khá nhiều nghiên cứu về khả năng hấp thu CS vào cơ thể, như M Morrison

và các cộng sự (1977) [20] đã khảo sát sự hấp thu CS qua đường uống Kết quả cho thấy khả năng hấp thu phụ thuộc vào cấu trúc, tính chất sinh hóa, trọng lượng phân tử CS có trong chế phẩm Quá trình thử nghiệm lâm sàng trên chuột và chó, thì tất cả đều cho kết quả tỷ lệ hấp thu cao 70% Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu Vũ Thị Thanh Tâm, Võ Hoài Bắc [3] đã nghiên cứu thủy phân sụn cá đuối và cá nhám bằng enzyme papain, bromelain và protease ngoại bào từ chủng vi khuẩn B26; kết quả cho thấy protease ngoại bào từ chủng B26 là nguồn enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh như các chế phẩm enzym khác nhưng giá thành rẻ, có thể thay thế papain trong quá trình tách chiết CS

1.2 Giới thiệu về sụn

1.2.1 Sụn động vật

Sụn là mô liên kết mềm dẻo được tìm thấy ở nhiều nơi trong cơ thể người và các động vật khác, có trong khớp giữa các xương, khung sườn lồng ngực, vành tai, mũi, các phế quản và các đĩa gian đốt sống, đóng vai trò như lớp đệm bảo vệ, giúp giảm chấn động và tránh sự cọ xát giữa hai đầu xương khi khớp cử động

Sụn không giòn chắc bằng xương nhưng lại cứng hơn và không mềm dẻo bằng cơ Sụn được cấu tạo bởi những tế bào chuyên biệt gọi là nguyên bào sụn, nguyên bào sụn sản xuất một lượng lớn chất nền ngoại bào gồm các thành phần: sợi collagen; chất căn bản, proteoglycan; và sợi elastin Sụn được chia thành ba loại: sụn chun, sụn trong và sụn xơ, khác nhau về tỉ lệ của ba thành phần cấu tạo chính Nguyên bào sụn bị giữ lại trong chất nền gọi là tế bào sụn Chúng nằm trong ổ sụn,

có thể có đến 8 tế bào sụn trong một ổ sụn

Không giống như các loại mô liên kết khác, sụn không chứa mạch máu Tế bào sụn được nuôi dưỡng bởi sự thẩm thấu, sự thẩm thấu này được hỗ trợ bằng áp lực tạo nên bởi lực nén của sụn khớp hay sự đàn hồi của sụn chun Do đó, so với các loại mô liên kết khác, sụn sinh trưởng và sửa chữa chậm hơn [23]

1.2.2 Sụn ức gà

Sụn ức gà là phần nằm chính giữa phần xương ức nối hai phần ức gà giúp gà dễ cử động Sụn

ức gà nguyên liệu được lấy từ phần ức gà khi chưa qua xử lí mô thịt bám xung quanh và mỡ bọc

a) b)

Hình 1 5: Sụn ức gà nguyên liệu: a) trước khi chần; b) Sau khi chần, lột thịt

Sau khi được làm sạch, xử lý bằng quá trình gia nhiệt để loại đi lớp mô thịt và mỡ thì khối lượng còn khoảng từ 2-4g Sụn khi được làm sạch có màu trắng đục, phần trăm khối lượng sụn so với nguyên liệu ban đầu khoảng từ 33-40%

Phế liệu Sụn ức gà chứa hàm lượng cao hợp chất glycosaminoglycans, là nguyên liệu tiềm năng để trích ly thu nhận Chondroitin Sulfate Tình hình chăn nuôi gia cầm, đặc biệt là chăn nuôi

gà ở Việt Nam phát triển nhanh chóng trong những năm qua Nguồn phụ phẩm sau quá trình giết

mổ, sản xuất thịt như xương, sụn, đặc biệt là sụn ức gà rất lớn, sẽ là một nguồn nguyên liệu phong phú cho ngành công nghiệp sản xuất CS

1.3 Tổng quan về ngành công nghiệp chăn nuôi gà thịt và phụ phẩm chế biến từ gà 1.3.1 Chăn nuôi gia cầm và gà thịt công nghiệp

Gia cầm là loài cho sản phẩm thịt làm thực phẩm cho con người phổ biến nhất trên thế giới

Từ năm 2010 trở lại đây, nhu cầu thịt toàn cầu hằng năm là 285 triệu tấn, trong đó thịt gia cầm chiếm khoảng 35% (100 triệu tấn)

Hình 1 6: Nhu cầu thịt toàn cầu hằng năm trong giai đoạn 2010-2030

Gà công nghiệp hay gà thịt công nghiệp là những con gà được chăn nuôi tập trung theo quy trình và kỹ thuật công nghiệp Đó là gà thịt và được nuôi, chăm sóc, vỗ béo để tiêu thụ thịt Quá trình sản xuất thịt gà được thực hiện theo một dây chuyền công nghiệp và là một mắt xích trong chuỗi cung ứng gà thịt từ việc chọn giống, úp gà cho đến việc làm thịt gà, phân phối và cung ứng cho người tiêu dùng

Chương 1: TỔNG QUAN

Gà thịt điển hình lông trắng, da màu vàng Hầu hết gà thịt thương mại có trọng lượng thịt để giết mổ khoảng 5 – 7 tuần tuổi, đạt trọng lượng từ 2 – 2,5 kg/con Đối với gà nuôi thả vườn hay nuôi bằng thực phẩm hữu cơ thường bị giết mổ khi đạt 14 tuần tuổi

Thịt gà chứa nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe Theo các nhà dinh dưỡng học, ngoài những chất albumin, chất béo, thịt gà còn có các vitamin A, B1, B2, C, E, acid, canxi, phospho, sắt Đây là loại thực phẩm chất lượng cao, cơ thể con người dễ hấp thu và tiêu hóa

Bảng 1 2: Thành phần dinh dưỡng của thịt gà tính trên 100g (199kcal) thực phẩm ăn được

1.3.2 Đặc điểm chung một số giống gà thịt

Gà hướng thịt là những giống gà có tầm vóc lớn, tốc độ sinh trưởng nhanh Cơ thể có hình dạng cân đối, ngực săn chắc, tiết diện hình chữ nhật hay hình vuông Bộ lông phát triển không ép sát vào thân, màu lông đa dạng, mào đỏ, đầu to, mỏ to chắc, cổ to ngắn, ngực sâu rộng, lưng dài, rộng, phẳng, đùi lườn phát triển Sản lượng trứng thấp

Một số giống gà hướng thịt năng suất cao:

Gà có màu lông vàng, da vàng, chân vàng, ngoại hình bầu bĩnh, chân ngắn, thịt thơm ngon chịu đựng tốt khí hậu Việt Nam

Gà Sasso

Thích nghi cao, dễ nuôi, kháng bệnh tốt, chất lượng thịt thơm ngon

Hiện nay ở Việt Nam có hầu hết các tổ hợp lai cao sản thịt: AA (Arbor Acres), Ross, Avian (CP 707), Lohman,… Các giống gà hướng thịt có lông màu trắng, tăng trọng nhanh tiêu tốn thức

ăn ít

Gà thịt AA (Arbor Acres)

Là giống gà có 4 dòng tạo ra ở Mỹ, gà bố mẹ được nhập vào Việt Nam Gà có thân hình to cân đối, chân cao, đùi dài, ức phẳng, cho thịt nhiều, lông có màu trắng tuyền Da chân, mỏ màu vàng nhạt, mào cờ (màu đơn) Gà thịt AA sinh trưởng nhanh, gà thịt nuôi ở Việt Nam lúc 49 ngày tuổi con trống đạt trọng lượng 2,5kg, con mái đạt trọng lượng 2,3kg Khả năng đẻ trứng trung bình

160 – 170 quả/mái/9 tháng đẻ; tỷ lệ phôi 95 %, tỷ lệ nở/trứng ấp 80 – 85% Hiện nay giống gà này được phát triển ở nhiều vùng, có hiệu quả kinh tế cao

Gà thịt Ross

Có 3 giống, mỗi giống gồm có 4 dòng được tạo ra ở Anh và được nhập vào Việt Nam từ Hungary vào năm 1992, gà có lông màu trắng tuyền, chân cao vừa phải, ức ngực nở, cho nhiều thịt, mào cờ Gà thịt nuôi ở Việt Nam lúc 56 ngày tuổi trung bình trống mái đạt trọng lượng 2,3 kg, sản lượng trứng trong 9 tháng đẻ là 160 quả/mái Giống gà này đang được ưa chuộng ở Việt Nam, nhất

là giống Ross 308

Gà thịt Avian

Giống gà này được tạo ra từ Mỹ, nhập vào nước ta sau 1995 từ Thái Lan, giống gà này có tầm vóc, lông mào giống như một số gà thịt cao sản nêu trên Gà thịt nuôi ở Việt Nam lúc 49 ngày tuổi gà trống đạt trọng lượng 2,4 – 2,5kg, gà mái đạt trọng lượng 2,3 – 2,4kg Sản lượng trứng đạt

190 quả/mái/năm Giống gà này được nuôi chủ yếu ở miền nam nước ta

Gà thịt Loman (Lohman meat)

Giống gà thịt này được tạo ra từ Đức, gà bố mẹ được nhập vào nước ta năm 1997 từ Inđônêxia, gà có tầm vóc, màu lông mào giống như gà AA, ISA khối lượng cơ thể gà thịt lúc 49 ngày tuổi con trống nặng 2,6kg, con mái nặng 2,2kg Ở Việt Nam đạt tương ứng 2,4kg và 2,2kg cùng lứa tuổi Sản lượng trứng đạt 175 – 185 quả/mái/năm

Chương 1: TỔNG QUAN

1.3.3 Tình hình phát triển chăn nuôi gà ở Việt Nam

Ngành chăn nuôi gà công nghiệp có thể lấy mốc từ năm 1974, khi hai trung tâm giống Quốc gia được xây dựng đó là trung tâm giống gà hướng trứng Ba Vì (Sơn Tây) và trung tâm giống gà thịt Tam Đảo (Vĩnh Phúc) Đàn gà giống hướng thịt và hướng trứng được nhập vào nước ta từ Cuba cũng từ năm 1974 với 2 vạn trứng giống của các dòng thuần

Trong những năm 1985-1995, chăn nuôi gà công nghiệp phát triển với tốc độ nhanh; năm

1991 đàn gà công nghiệp chiếm 5-7% tổng đàn gia cầm thì năm 1994 đã tăng lên 25% Năm 1994

đã đạt 5 vạn tấn thịt gà Từ năm 1996, cùng với sự đổi mới kinh tế đất nước, ngành chăn nuôi gia cầm có những bước tiến nhảy vọt Tuy vậy dịch cúm gia cầm trong các năm 2003-2005 và ngay cả hiện tại đã và đang gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế nói chung Hiện nay, ngành chăn nuôi gia cầm đã tiếp cận một số công nghệ tiên tiến của thế giới về giống, thức ăn, thuốc thú y và quy trình chăm sóc nuôi dưỡng Ở nước ta cũng đã hình thành nhiều

cơ sở chăn nuôi gia cầm quy mô lớn Theo ước tính, đến nay cả nước có trên 100.000 hộ chăn nuôi theo hình thức trang trại tại 8 vùng sinh thái khác nhau, thay thế dần kiểu chăn nuôi tự cấp, tự túc, tận dụng sản phẩm phụ của trồng trọt như trước đây bằng kiểu chăn nuôi hàng hóa quy mô vừa và một số ít trang trại có quy mô chăn nuôi hàng hóa lớn đã xuất hiện

Bảng 1 3: Số lượng đầu con và sản phẩm chăn nuôi gia cầm 2017

Đơn vị

Tăng giảm

1/4/2017 so 1/4/2016 (%)

Phân bố đàn gia cầm: Đàn gà chủ yếu tập trung tại các tỉnh phía Bắc chiếm 75%, còn 25% tập trung ở phía Nam

Bảng 1 4: Phân bố tổng đàn gia cầm theo một số địa phương

Phú Thọ 9639,6 Bắc

Giang

14286

Đắk Lắk

8040,1

Đồng Nai

16379,4

Tiền Giang

mỡ hỗn hợp làm thức ăn chăn nuôi, bột thịt xương, bột lông vũ thủy phân…[24] Ngoài ra, sụn ức

gà được dễ dàng thu được sau khi phi lê ức gà lấy thịt được coi là một nguồn tiềm năng để thu nhận Chondroitin sulfate, Glucosamin, tăng cường hỗ trợ và điều trị bệnh khớp [1]

Các sản phẩm được làm từ các nguyên liệu không ăn được có đóng góp quan trọng về kinh

tế cho các ngành công nghiệp liên quan khác và cho xã hội Ngoài ra việc chế biến và sử dụng các phụ phẩm giết mổ cũng góp phần cải thiện chất lượng môi trường, sức khỏe gia súc và sức khỏe cộng đồng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào nguồn phế phẩm sụn ức gà (nguyên liệu chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều tại Việt Nam)

1.4 Tổng quan về phương pháp thu nhận CS thô

1.4.1 Tác động của sóng siêu âm đến quá trình thu nhận CS thô

Sóng siêu âm

Sóng siêu âm là sóng cơ học được tạo nên từ sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian và có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (20 – 20000 Hz) Do trong trường siêu âm, các phần tử dao động cùng phương với phương truyền sóng nên sóng siêu

âm có bản chất là sóng dọc [25]

Chương 1: TỔNG QUAN

Hình 1 7: Các khoảng tần số âm thanh

Trong môi trường chất lỏng, sóng siêu âm tạo ra các chu trình kéo và nén liên tục gây ra hiện tượng xâm thực khí Đồng thời tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha lỏng/rắn có sự hỗn loạn do tạo ra các vi xoáy, tăng cường sự truyền khối đối lưu và sự khuếch tán [26] Sóng siêu âm ứng dụng trong công nghệ thực phẩm thường sử dụng sóng có tần số thấp, năng lượng cao (20 – 100kHz) Do các mẫu thực phẩm thường có độ nhớt cao làm giảm sự lan truyền của các phần tử trong trường siêu

âm, khi đó các sóng có năng lượng cao sẽ dễ đi xuyên vào thực phẩm hơn [26]

Tác động sinh học của sóng siêu âm

Sóng siêu âm sử dụng trong quá trình trích ly rắn - lỏng có 3 tác động sinh học chính lên nguyên liệu như sau:

- Chuyển động của sóng siêu âm rất nhanh, làm lỏng các liên kết trong mô

- Sinh nhiệt

- Sự tạo và vỡ bọt: chuyển động của sóng siêu âm qua môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, tạo vùng áp suất chân không trong Hiện tượng tạo và vỡ bọt xảy ra khi áp suất chân không vượt quá so với độ bền kéo của chất lỏng

Hình 1 8: Nguyên lý hình thành và vỡ bọt khí

Hình 1.8 cho thấy cơ chế sự hình thành, lớn lên và nổ vỡ các bong bóng khí trong pha lỏng: Khi sóng âm gặp chất lỏng, sẽ tạo ra những chu kì gồm 2 pha giãn và nén liên tục, làm xuất hiện bong bóng khí trong pha lỏng

- Trong pha giãn: khí bên ngoài bong bóng được khuếch tán vào bên trong

- Trong pha nén: bong bóng co lại và khí bị hấp thụ ngược trở lại

Mặt khác các phân tử khí lại tiếp tục bị hấp thụ vào chất lỏng nên kích thước của bong bóng lớn dần qua các chu kì giãn và nén Khi đạt kích thước tối đa, bong bóng nổ vỡ, nhiệt độ có thể đạt

5000oC và áp suất 2000ats

Hiện tượng tạo bong bóng làm tăng quá trình truyền nhiệt và truyền khối trong pha lỏng, tăng cường sự tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, đồng thời tăng sự khuếch tán các chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi, làm gia tăng hiệu quả trích ly Mặt khác ở bề mặt pha lỏng – rắn xuất hiện sủi bọt khí, tạo ra các vi tia chất lỏng; nếu các vi tia này hướng đến bề mặt nguyên liệu rắn,

có thể tạo ra vết rạn nứt và vỡ nguyên liệu

Tóm lại, quá trình siêu âm gây ra hiện tượng xâm thực khí, sẽ làm cho nguyên liệu bị rạn nứt hoặc giảm kích thước, gia tăng sự tiếp xúc nguyên liệu với dung môi, tăng khuếch tán các chất hòa tan dẫn đến tăng động lực của quá trình trích ly

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành và vỡ bóng

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và hiệu quả trích ly bằng sóng siêu âm Chúng bao gồm các thông số liên quan đến:

- Âm trường: tần số sóng âm, cường độ âm, mật độ năng lượng âm,…

- Nguyên liệu thô: cấu trúc, mức phá vỡ, loại và số lượng các chất trích ly

- Đặc tính vật lý dung môi cũng như điều kiện khảo sát các yếu tố: thời gian, nhiệt độ, áp suất

Ứng dụng của sóng siêu âm trong ngành công nghệ thực phẩm

Siêu âm hiện nay cũng là một lĩnh vực đang được nghiên cứu và có tiềm năng phát triển trong ngành công nghệ thực phẩm Sóng siêu âm có tần số từ 20kHz đến trên 25MHz thường được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Có 2 lĩnh vực được ứng dụng chính trong công nghiệp thực phẩm:

Chương 1: TỔNG QUAN

- Tần số cao và năng lượng thấp: Siêu âm chuẩn đoán Trong khoảng tần số MHz Phần này được sử dụng như một kỹ thuật phân tích đảm bảo chất lượng, qui trình điều khiển và kiểm tra không làm phá hủy cấu trúc, điều này được ứng dụng trong xác định tính chất thực phẩm, đo tốc

độ dòng chảy, bao gói thực phẩm

- Tần số thấp và siêu âm năng lượng cao: Phần này được ứng dụng rộng rãi như một quy trình hỗ trợ trong hàng loạt các lĩnh vực như: kết tinh, sấy, bài khí, trích ly, lọc, đồng hóa, làm mềm thịt, quá trình oxi hóa, quá trình tiệt trùng,…

1.4.2 Sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân sụn ức gà thu nhận CS

Chế phẩm enzyme Alcalase

Enzyme Alcalase 2.4L (EC E.C.3.4.21.62) sử dụng cho nghiên cứu là sản phẩm của hãng Novozymes, được tổ chức FAO/WHO cho phép sử dụng

Đặc tính của enzyme Alcalase

- Được sản xuất từ loại vi khuẩn Bacillus licheniformis

- Điều kiện tối ưu: Nhiệt độ 40÷650C, tùy thuộc vào kiểu cơ chất, pH từ 6÷8

- Hoạt tính riêng của enzyme Alcalase được xác định bằng đơn vị Anson/ml (AU/ml) Độ hoạt động của enzyme giảm theo thời gian bảo quản, thường trên 24 tháng

- Enzyme Alcalase 2,4L có thể bị mất hoạt tính ở 50oC trong 30 phút ở pH 4,0; ở 85oC trong

10 phút khi pH = 8,0

- Ở dạng thương mại, enzyme Alcalase 2,4L là dạng dung dịch màu nâu và dễ dàng hòa tan với nước ở mọi nồng độ Màu sắc có thể thay đổi theo từng lô sản phẩm và nó không biểu hiện cho hoạt tính sinh học của sản phẩm

- Nhiệt độ bảo quản tốt nhất: 0 – 5oC, có bao gói, tránh ánh sáng mặt trời

Tác động của enzyme Alcalase đến quá trình thu nhận CS thô

Enzyme Alcalase thuộc phân nhóm nhỏ subtilisin, Serine protease (những protein chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme) Sử dụng đơn phân serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme Alcalase đóng vai trò là một endoprotease nên chúng thủy phân protein thành các polypeptide từ đó giải phóng CS trong dịch thủy phân Do tính đặc hiệu cơ chất cao của Alcalase,

có thể thủy phân hầu hết các liên kết peptide, trừ liên kết với proline và với acid glutamic có nhóm -COOH tự do

1.5 Tổng quan về phương pháp thẩm tích qua màng cellophane

1.5.1 Giới thiệu chung

Thẩm tích là quá trình khuếch tán của các phân tử từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp thông qua một màng bán thấm Chỉ có các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước của các lỗ màng mới có thể di chuyển qua màng và đạt được sự cân bằng về nồng độ trong toàn bộ hệ thẩm tích Khi đạt trạng thái cân bằng, các phân tử di chuyển ra và vào lỗ màng đạt cùng tốc độ Ngược lại, các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ màng sẽ không thể đi qua màng bán thấm và được giữ lại tại một phía, nồng độ của các phân tử này không có sự thay đổi giữa hai bên màng Khi thay dung dịch thẩm tích bên ngoài màng bán thấm sẽ tạo ra một gradient nồng độ mới [27]

Hình 1 9: Mô tả phương pháp thẩm tích 1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thẩm tích gồm: thể tích, thành phần và số lần thay đổi dung dịch ngoài màng bán thấm, thời gian, nhiệt độ thẩm tích và kích thước các phân tử so với kích thước lỗ màng [27] Các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng nhiều lần sẽ nhanh đạt được

sự cân bằng nồng độ hơn các phân tử có kích thước gần với kích thước lỗ màng Màng cellophane

sử dụng trong thí nghiệm có cấu trúc các lỗ rỗng xoắn, do đó các phân tử nhỏ có thể đi xuyên qua

Chương 1: TỔNG QUAN

độ > 0,5mg/ml nhưng có khác biệt lớn với mẫu có nồng độ < 0,1mg/ml Có thể bổ sung chất mang vào mẫu thẩm tích để ngăn ngừa sự mất mẫu do bám màng [27]

1.6 Tổng quan về quá trình sấy thu nhận sản phẩm

Sấy phun là công nghệ tiên tiến tạo nên các sản phẩm dạng bột khô chất lượng cao Trong quá trình sấy phun, nguyên liệu được đưa vào thiết bị dưới dạng dung dịch hoặc huyền phù trong trạng thái phân tán Quá trình sấy thực hiện với từng giọt lỏng phun ra Sản phẩm thu được sau quá trình sấy có dạng bột Sản phẩm được lấy ra khỏi thiết bị một hệ thống thu hồi riêng

Quá trình sấy phun gồm 3 giai đoạn cơ bản:

- Giai đoạn 1 (phun sương): Phân tán dòng nhập liệu thành những hạt sương nhỏ li ti

- Giai đoạn 2 (tách ẩm): Hòa trộn sương mù với dòng tác nhân sấy trong buồng sấy

- Giai đoạn 3: Tách sản phẩm ra khỏi dòng tác nhân sấy

Ưu điểm của quá trình sấy phun:

- Sản phẩm thu được say quá trình sấy phun là những hạt có hình dạng và kích thước tương đối đồng nhất Tỷ lệ khối lượng giữa các cấu tử không bay hơi trong hạt sản phẩm tương

tự như trong mẫu lỏng ban đầu

- Thời gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhân sấy trong thiết bị rất ngắn, do đó nhiệt độ của mẫu nguyên liệu cần sấy không bị tăng quá cao Nhờ đó sự tổn thất các hợp chất dinh dưỡng, hợp chất hoạt tính mẫn cảm với nhiệt độ có trong mẫu là không đáng kể

- Thiết bị sấy phun quy mô công nghiệp thường có năng suất cao và làm việc theo nguyên tắc liên tục Điều này góp phần hiện đại hóa quy trình sản xuất và tính thực tế của đề tài

Hình 1 10: Hệ thống thiết bị sấy phun (quy mô phòng thí nghiệm)

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Sụn ức gà

Sụn ức gà được mua từ Công ty TNHH Phạm Tôn Sau đó tiến hành xử lý loại thịt thừa, đem bảo quản lạnh đông ở –18oC

2.1.2 Enzyme Alcalase 2,4L

Enzyme Alcalase 2,4L của hãng Novozymes (Mỹ) được sản xuất từ vi khuẩn

Bacillus Licheniformis Enzyme alcalase 2,4L là một endo-protease, có hoạt tính 2,4 đơn vị Ason/g

(Một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm thủy phân casein trong 1 phút tạo ra sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 660nm tương ứng với 1mol tyrosine trên đường chuẩn); nhiệt độ tối ưu từ 40÷65oC;

pH tối ưu từ 6,0÷8,0; tỷ trọng là 1,17 (g/ml)

Chế phẩm Enzyme Alcalase để thí nghiệm được xác định lại hoạt tính theo phương pháp phương pháp Sigma-Aldrich St Louis trước khi sử dụng, có hoạt tính 2311,65 U/ml

2.1.3 Hóa chất trong nghiên cứu

Chondroitin 4-sulfate (CS4); 1,9 – Dimethylmethylene blue (DMMB); glycine; Ciocalteu’s phenol; casein; HCl; NaCl; Ethanol; Na2HPO4.12H20, NaH2PO4.7H2O; Trichloroacetic acid (TCA); NaOH; Na2CO3; CuSO4.0.5H2O,…

Folin-2.2 Dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Dụng cụ

Bình định mức 50ml, 100ml, 1000ml; erlen 250ml; micropipet (20 – 200μl, 100 - 1000 μl, 1 – 5 ml), phểu thủy tinh, đũa thủy tinh, nhiệt kế, thau, rổ, dao, thớt, bình hút chân không, ống nghiệm, cuvet

2.2.2 Thiết bị

Bếp điện từ; thiết bị khuấy từ, bể điều nhiệt, máy lắc, tủ sấy, pH kế, máy quang phổ UV-VIS, bơm chân không, máy ly tâm, cân điện tử 2 và 4 số lẻ, tủ đông, tủ mát, máy siêu âm, máy sấy phun…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

- Thời gian (2-10min; 2 min )

Hiệu suất thu hồi CS

- Thời gian (0-20min; 5min)

Hiệu suất thu hồi CS

- Thời gian (0-100min; 20min)

Hiệu suất thu hồi CS

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Lão hóa trong điều kiện gia tốc

nhiệt với các mốc nhiệt độ: 35oC;

40oC; 45oC

Xác định hàm lượng CS sau mỗi

2 tháng

Hàm lượng CS theo thời gian

Xây dựng phương trình hồi quy

giữa hàm lượng CS trong sản

phẩm theo thời gian và nhiệt độ

- Đồ thị lnCt – t (tháng)

- Xác định hằng số tốc độ phản ứng theo từng nhiệt độ

Ngoại suy từ phương trình hồi

quy thu được

Xác định HSD của chế phẩm nghiên cứu