Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích

iv TÓM TẮT Trong luận văn này, hoạt chất flavonoid quercetin và kaempferol được trích ly từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp sử dụng dung môi etanol có hỗ trợ siêu âm.. Đồng thời phư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-o0o -NGUYỄN LƯU VĨNH KHANG

TRÍCH LY FLAVONOID TỪ LÁ CÂY HOÀN NGỌC TRẮNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SIÊU ÂM VÀ THỬ NGHIỆM

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO TRÍCH

(Extraction of flavonoids from Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk leaves

by ultrasonic-assisted extraction method and investigation of antibacterial activity)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2019

i

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam………

TS Nguyễn Hữu Hiếu………

Cán bộ chấm nhận xét 1: ……… ……

Cán bộ chấm nhận xét 2: ………

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM Tp HCM, ngày tháng năm 2019 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 ……… – Chủ tịch 2 ……… – Ủy viên phản biện 1 3 ……… – Ủy viên phản biện 2 4 ……… – Ủy viên 5 ……… – Thư kí Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ………

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ………

ii

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN LƯU VĨNH KHANG

MSHV: 1770139 Ngày, tháng, năm sinh: 16/08/1993 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

I TÊN ĐỀ TÀI:

Tên tiếng Việt: “Trích ly flavonoid từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ

siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích”

Tên tiếng Anh: “Extraction of flavonoids from Pseuderanthemum palatiferum

(Nees) Radlk leaves by ultrasonic-assisted extraction method and investigation of

antibacterial activity”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

2.1 Tổng quan: cây hoàn ngọc trắng, flavonoid, hoạt tính của lá hoàn ngọc trắng,

phương pháp trích lyhỗ trợ siêu âm, phương pháp định lượng flavonoid, phương pháp thử

nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích, quy hoạch thực nghiệm

2.2 Thực nghiệm

 Trích ly flavonoid (quercetin và kaempferol) từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương

pháp hỗ trợ siêu âm

 Khảo sát ảnh hưởng của từng điều kiện đến hàm lượng quercetin và kaempferol bao

gồm: nồng độ etanol, thời gian siêu âm, nhiệt độ trích ly và công suất siêu âm

 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời ba điều kiện nồng độ etanol, thời gian siêu âm và

nhiệt độ trích ly đến hàm lượng quercetin và kaempferol bằng quy hoạch thực nghiệm theo

phương pháp tâm xoay bậc hai với mô hình Box-Wilson

 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 07/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07/2019

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.HOÀNG MINH NAM, TS NGUYỄN HỮU HIẾU

Tp HCM, ngày … tháng… năm 2019

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PTN TĐ ĐHQG-HCM CNHH & DK

TS NGUYỄN HỮU HIẾU TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS TS PHAN THANH SƠN NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến hai thầy TS Hoàng Minh Nam và TS Nguyễn Hữu Hiếu đã tận tình hướng dẫn tác giả hoàn thành luận văn

Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến tập thể nghiên cứu viên ở Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ hóa học và Dầu khí (CEPP) đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và quý anh chị Trung tâm

Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 (QUATEST 3) đã tạo điều kiện thuận lợi

và hỗ trợ tác giả trong quá trình thực hiện luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Tháng 07 năm 2019

Tác giả Nguyễn Lưu Vĩnh Khang

iv

TÓM TẮT

Trong luận văn này, hoạt chất flavonoid (quercetin và kaempferol) được trích ly từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp sử dụng dung môi etanol có hỗ trợ siêu âm Hàm lượng quercetin và kaempferol trong cao trích được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography - HPLC)

Ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly như nồng độ etanol (%), thời gian siêu âm (phút), nhiệt độ trích ly (oC) và công suất siêu âm (W) đến hàm lượng quercetin và kaempferol được khảo sát bằng phương pháp luân phiên từng biến để chọn ra ba điều kiện ảnh hưởng nhất Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời ba điều kiện này như nồng

độ etanol, thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly bằng phương pháp tâm xoay bậc hai với

mô hình Box – Wilson Số liệu được xử lý bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng quercetin và kaempferol cao nhất Đồng thời phương pháp trích ly không có sự hỗ trợ của sóng siêu âm cũng được thực hiện để đối chứng.Cao trích có hàm lượng quercetin và kaempferol cao nhất được thử hoạt tính kháng

khuẩn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu trên hai vi khuẩn: Streptococcus agalactiae

và Edwardsiella ictaluri.

v

ABSTRACT

In this assay, flavonoid (quercetin and kaempferol) is extracted from the

Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk (P palatiferum) leaves by using ethanol

solvent and ultrasound-assisted method The contents of quercetin and kaempferol were determined by high-performance liquid chromatography method

Effects of extraction conditions as ethanol concentration (%), ultrasonic time (min), extraction temperature (oC) and the ultrasonic power (W) on quercetin and kaempferol contents in the extract, which were investigated by alternate each variable method to choose the three most influential factor Then, carry out a survey of the simultaneous effects of three factors such as ethanol concentration (%), ultrasonic time (min), extraction temperature (oC) by a quadratic rotation method with the Box - Wilson model Data are processed with Design Expert 11.0 software to find extraction conditions for the highest quercetin and kaempferol content At the same time, the check sample extracted with the above conditions but without ultrasonic support was also tested to compare with the extraction sample in suitable conditions

Extract with the highest concentration of quercetin and kaempferol tested for antibacterial activity to determine the minimum inhibitory concentration for

Streptococcus agalactiae and Edwardsiella ictaluri

vi

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS Hoàng Minh Nam và TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Lưu Vĩnh Khang

vii

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

LỜI CAM ĐOAN vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Cây hoàn ngọc trắng 2

1.1.1 Phân loại khoa học và khu vực phân bố 2

1.1.2 Mô tả thực vật 2

1.1.3 Thành phần hoá học của lá cây HNT 3

1.1.4 Công dụng 5

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6

1.2 Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản 7

1.2.1 Tình hình chung 7

1.2.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae 8

1.2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 9

1.2.4 Kháng khuẩn 11

1.3 Các phương pháp trích ly 11

1.3.1 Phương pháp trích ly truyền thống 11

1.3.2 Phương pháp trích ly hiện đại 12

1.4 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu và tính mới của

luận văn 17

1.4.1 Tính cấp thiết 17

1.4.2 Mục tiêu nghiên cứu 18

1.4.3 Nội dung 18

viii

1.4.4 Phương pháp nghiên cứu 18

1.4.5 Tính mới của luận văn 24

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 25

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị - dụng cụ và địa điểm thực hiện 25

2.1.1 Nguyên liệu 25

2.1.2 Hóa chất 25

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 26

2.1.4 Địa điểm thực hiện 27

2.2 Thí nghiệm 27

2.2.1 Khảo sát quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT 27

2.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao trích 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng quercetin và kaempferol 36

3.1.1 Ảnh hưởng của từng điều kiện 36

3.1.2 Ảnh hưởng đồng thời các điều kiện 40

3.1.3 Kiểm chứng mô hình 54

3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của cao trích 56

3.2.1 Đối với S agalactiae 56

3.2.2 Đối với E ictaluri 58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Lá và rễ cây hoàn ngọc trắng 3

Hình 1.2: Công thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid 4

Hình 1.3: Công thức hóa học của quercetin 4

Hình 1.4: Công thức hóa học của kaempferol 5

Hình 1.5: Vi khuẩn S agalactiae 8

Hình 1.6: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn S Agalactiae gây bệnh trên cá diêu hồng 9

Hình 1.7: Vi khuẩn E ictaluri 9

Hình 1.8: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá da trơn 10

Hình 1.9: Nhóm OH kháng khuẩn của hoạt chất quercetin và kaempferol 11

Hình 1.10: Phổ điện từ 12

Hình 1.11: Một số loại enzyme thông dụng 13

Hình 1.12: Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2 14

Hình 1.13: Tần số của âm thanh 15

Hình 1.14: Mô hình tâm xoay bậc hai 19

Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý máy HPLC 21

Hình 1.16: Cách đo đường kính vòng kháng khuẩn 23

Hình 2.1: Lá HNT đã sấy khô và xay nhuyễn 25

Hình 2.2: (a) Bể siêu âm, (b) Máy HPLC-30 Nexera 26

Hình 2.3: Quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT 27

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH 36

Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 37

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 38

Hình 3.4: Ảnh hưởng của công suất siêu âm 39

Hình 3.5: Hàm lượng quercetin từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 43

Hình 3.6: Sự ảnh hưởng đồng thời của ba điều kiện khảo sát 44

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH và thời gian siêu âm đến 45

hàm lượng quercetin 45

Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly đến 46

hàm lượng quercetin 46

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ EtOH đến 47

x

hàm lượng quercetin 47

Hình 3.10: Hàm lượng kaempferol từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 50

Hình 3.11: Sự tác động của ba điều kiện khảo sát 51

Hình 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH và thời gian siêu âm đến 52

hàm lượng kaempferol 52

Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly đến 53

hàm lượng kaempferol 53

Hình 3.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ EtOH đến 54

hàm lượng kaempferol 54

Hình 3.15: Hoạt tính kháng khuẩn S agalactiae của cao trích HNT 56

Hình 3.16: Kết quả kháng khuẩn S agalactiae bằng kỹ thuật pha loãng tới hạn của cao trích HNT 57

Hình 3.17: Hoạt tính kháng khuẩn E ictaluri của cao trích HNT 58

Hình 3.18: Kết quả kháng khuẩn E ictaluri bằng kỹ thuật pha loãng tới hạn của cao trích HNT 59

xi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Chuẩn và hoá chất sử dụng 25

Bảng 2.2: Thiết bị, dụng cụ sử dụng 26

Bảng 2.3: Thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH 28

Bảng 2.4: Thí nghiệm khảo sát thời gian siêu âm 29

Bảng 2.5: Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ trích ly 30

Bảng 2.6: Thí nghiệm khảo sát công suất siêu âm 30

Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box-Wilson 31

Bảng 2.8: Chuẩn bị chất chuẩn làm việc 33

Bảng 2.9: Nồng độ dịch trích pha loãng 35

Bảng 3.1: Khoảng biến thiên 40

Bảng 3.2: Mức thí nghiệm 40

Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Wilson đối với quercetin 41

Bảng 3.4: Kết quả phân tích ANOVA đối với quercetin 42

Bảng 3.5: Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 43

Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Wilson đối với kaempferol 48 Bảng 3.7: Kết quả phân tích ANOVA đối với kaempferol 49

Bảng 3.8: Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 50

Bảng 3.9: Điều kiện hiệu chỉnh từ mô hình 55

Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng mô hình 55

xii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HPLC High-performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

FAO Food and Agriculture Organization of

The United Nations

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc MIC Minimal Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thị trường thủy sản hiện nay sản phẩm cá diêu hồng và da trơn xuất khẩu của Việt Nam đã được xuất sang nhiều quốc gia trên thế giới Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, các sản phẩm cá xuất khẩu của Việt Nam đang chiếm lĩnh gần như toàn bộ thị phần thế giới, kim ngạch xuất khẩu cá đạt hơn 500 triệu đô la và dự kiến trong 2018 sẽ có 600 ngàn tấn cá xuất khẩu, thu về gần 2 tỷ đô la Mỹ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam còn đưa ra dự kiến trong vòng 10 năm tới diện tích nuôi cá

sẽ tăng gấp đôi so với hiện nay, đẩy mạnh đầu tư hai khu vực sông Tiền và sông Hậu Tuy nhiên, bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển phức tạp, ảnh hưởng lớn đến chất lượng thịt cá và người nuôi cá Phương pháp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng thuốc kháng sinh, song có thể dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc Với thực trạng đó, ngày nay, các nhà khoa học đang hướng đến các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật, nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh ở thủy sản Các loại hoạt chất có khả năng kháng khuẩn đang nhận được nhiều sự quan tâm như carotenoid, flavonoid, alkaloid, terpenoid, trong

đó, flavonoid được nghiên cứu là có hoạt tính kháng khuẩn cao và được tìm thấy nhiều trong các bộ phận của cây hoàn ngọc trắng, đặc biệt chứa nhiều trong lá cây

Dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp ngâm trích truyền thống dễ thực hiện, đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid thấp, các phương pháp trích ly hiện đại như sử dụng hỗ trợ vi sóng, enzyme, lưu chất siêu tới hạn và hỗ trợ siêu âm có ưu điểm thời gian trích ly nhanh, hàm lượng flavonoid cao nhưng thiết bị lại đắt tiền Phương pháp trích ly sử dụng dung môi có

hỗ trợ siêu âmvới giá thành hóa chất và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích

ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt và thiết bị dễ

sử dụng là những ưu điểm nổi trội phương pháp này

Vì vậy, đề tài “Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ

trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích” được chọn để nghiên

cứu

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Cây hoàn ngọc trắng

1.1.1 Phân loại khoa học và khu vực phân bố

Cây hoàn ngọc trắng (HNT) còn có tên gọi khác là Xuân Hoa, Tu Lình, Nhật Nguyệt Cây được tìm thấy lần đầu tiên ở Miền Bắc Việt Nam, thường mọc hoang ở các vùng núi Cao Lạng và hiện nay được trồng với quy mô lớn tại Tây Ninh [1, 2] Hoàn ngọc trắng có phân loại khoa học như sau:

 Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk

 Ngành: thực vật có hoa (Angiospermae)

 Lớp: hai lá mầm (Eudicots)

 Bộ: Hoa Môi (Lamiales)

 Họ: Ô Rô (Acanthaceae)

 Chi: Xuân hoa (Pseuderanthemum)

 Loài: Pseuderanthemum palatiferum

1.1.2 Mô tả thực vật

Cây mọc thành bụi, cao 0,6-1,5 m, là cây lâu năm Khi cây còn non, thân trơn nhẵn, các đốt có màu hơi vàng, lá mọc đối xứng và có cuống dài, có hình mũi giác; khi già chuyển thành màu nâu, phân ra thành nhiều nhánh Lá mọc đối, phiến lá bầu dục dài; mép lá nguyên hoặc lượn sóng, có khía; cuống lá dài 1,5-2,5 cm Mặt trên hầu như nhẵn với rất ít lông che chở đa bào ngắn hoặc lông tiết có chân đơn bào, dọc gân chính nhiều lông; mặt dưới nhẵn; gân phụ 5-6 cặp như được thể hiện ở hình 1.1 Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, cụm hoa dài 10-16 cm Hoa lưỡng tính, không đều, màu trắng Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch [1]

3

Hình 1.1: Lá và rễ cây hoàn ngọc trắng Các bộ phận của HNT đều được dân gian sử dụng để chữa bệnh Đặc biệt là lá vì trong

đó có chứa nhiều thành phần hóa học có hoạt tính sinh học [3]

1.1.3 Thành phần hoá học của lá cây HNT

Bằng các phương pháp phân lập, định danh và định lượng bởi các thiết bị hiện đại như sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography – HPLC), sắc kí khí (Gas Chromatography – GC), phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (Fourier Transform InfraRed – FT-IR), khối phổ (Mass Spectrometry – MS), quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy – NMR) cho thấy lá HNT chứa nhiều hoạt chất như flavonoid, apigenin, triterpenoids, saponin, -sitosterol, stigmasterol, axit salicylic, phenolic và axit ascobic [4, 5]

1.1.3.1 Flavonoid

Flavonoid bắt nguồn từ Latin, flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên, là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật Tuy nhiên, một số flavonoid có màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại không có màu [6]

Theo danh pháp IUPAC, nhóm flavonoid có thể được chia thành: flavone (2-phenylchromen-4-one), isoflavonoid (3-phenylchromen-4-one (3-phenyl-1,4benzopyrone)) và neoflavonoid (4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2-benzopyrone)) Các công thức hóa học được thể hiện ở hình 1.2 [7]

có thể hoạt động như một chất chuyển giao hóa học hoặc điều chỉnh sinh lý, có thể hoạt động như các chất ức chế chu kỳ tế bào [8]

Trong flavonoid, nổi bật có hai hoạt chất có hoạt tính sinh học là quercetin và kaempferol

1.1.3.2 Quercetin

Quercetin có danh pháp IUPAC là chromen-4-one, là một flavone phân bố rộng rãi trong thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.3

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-H-Hình 1.3: Công thức hóa học của quercetin Quercetin thường có mặt dưới dạng glycosit và được chuyển đổi thành liên hợp glucuronit/sunphat trong quá trình hấp thu ở ruột và do đó chỉ có các chất chuyển hóa liên hợp được tìm thấy trong máu lưu thông Quercetin đã được chứng minh là tương tác với một số thụ thể, đặc biệt là thụ thể hydrocacbon aryl, có liên quan đến sự phát triển của bệnh ung thư do một số hóa chất gây ra Quercetin cũng đã được chứng minh là điều chỉnh một

5

số đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến quá trình viêm và gây ung thư Các nghiên cứu động vật gặm nhấm đã chứng minh rằng việc sử dụng quercetin trong chế độ ăn kiêng ngăn ngừa ung thư đại tràng và các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng quercetin có thể liên quan đến việc ngăn ngừa ung thư phổi Do đó, quercetin trong chế độ ăn uống là một tác nhân đầy hứa hẹn để ngăn ngừa ung thư và nghiên cứu sâu rộng hơn [9]

1.1.3.3 Kaempferol

Kaempferol (3,4,5,7-tetrahydroxyflavone) là một flavone được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và thực phẩm có nguồn gốc thực vật, có công thức hóa học như thể hiện ở hình 1.4

Hình 1.4: Công thức hóa học của kaempferol Kaempferol là một chất rắn kết tinh màu vàng với điểm nóng chảy là 276 oC, ít tan trong nước, tan nhiều trong EtOH nóng, ete và dimethyl sulfoxide (DMSO) Kaempferol có hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa cao, có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư khác nhau

 Loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột

 Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, chữa suy nhược thần kinh

 Tác dụng cầm máu cực kỳ hiệu quả, bạn chỉ cần nhai lá HNT đắp vào vùng bị sưng đau, chảy máu, vết thương sẽ được cầm máu ngay

6

 Hỗ trợ điều trị bệnh huyết áp, tim mạch

 Tác dụng bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, tiểu ra máu, tiểu buốt, tiểu gắt [10, 11]

Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã nổi lên phong trào trồng cây HNT để chữa những bệnh thuộc đường tiêu hoá hoặc tiểu đường và hầu hết các công dụng đó đều đã và đang được khoa học chứng minh bằng các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.1.5.1 Ngoài nước

Năm 2013, khả năng kháng viêm của cao trích lá HNT được đánh giá bằng xét nghiệm phù tai do ethyl phenylpropiolate gây ra trên chuột nhắt trắng Cao trích cho thấy khả năng kháng viêm cấp tính và mãn tính đáng kể Cao trích ở hàm lượng thấp được sử dụng trong xét nghiệm viêm cấp tính (1 mg/tai chuột) có tác dụng kháng viêm cấp tính tương đương với hoạt chất kháng viêm chuẩn – phenylbutazone Tác dụng kháng viêm mãn tính phụ thuộc vào hàm lượng cao trích và có tác dụng tốt hơn so với chất đối chứng diclofenate [12]

Năm 2015, hai hợp chất stigmasterol và sitosterol-3-O-D-glucopyranoside đã được phân lập từ lá HNT được nghiên cứu điều trị bệnh tiểu đường Với liều 0,25 và 0,50 mg/kg cao trích được cho chuột bị tiểu đường điều trị trong 21 ngày So sánh lượng đường huyết lúc đói (Fasting blood glucose – FBG) vào các ngày 0, 4, 7, 10, 14, 17 và 21 với một thuốc chống tiểu đường – glibenclamine cho thấy lượng đường trong máu ở tất cả các liều điều trị đã giảm đáng kể, cùng với sự gia tăng đồng thời của insulin Stigmasterol 0,5 mg/kg có hiệu quả hạ đường huyết tốt nhất Ngoài ra, hai hoạt chất này cũng làm tăng lượng cholesterol tốt (High-Density Lipoprotein – HDL), làm giảm lượng cholesterol xấu (Low-Density Lipoprotein – LDL), hàm lượng urê trong máu, creatinine, v.v [13]

Năm 2016, cao trích EtOH của lá HNT được thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường

bằng khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro Kết quả cho thấy cao

trích có khả năng ức chế cả α-amylase và α-glucosidase với các giá trị ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration – IC50) tương ứng là (11,79 ± 8,10) mg/mL và (1,00 ± 0,11) mg/mL [5]

và steroid từ lá HNT bằng phương pháp NMR lần lượt được thực hiện [15, 16]

Năm 2006, tám hợp chất: dotriacontan, phytol, squalen, 24-metylencycloaratanol, lolionlide, β-sitosterol, β-sitoterol 3-β-O-D-glucopyranoside và stigmasterol 3-β-O-D-glucopyranoside lần đầu tiên được phân lập trong lá HNT, đồng thời khảo sát khả năng kháng khuẩn đường ruột của cao trích [17]

Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao trích lá HNT trồng tại Việt Nam vẫn chưa được tìm hiểu về chiều sâu Bên cạnh đó, tình hình kháng thuốc kháng sinh của các loại vi khuẩn đang diễn ra phổ biến trên người và kể cả động vật, nhất là đối với thủy sản

1.2 Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản

1.2.1 Tình hình chung

Theo một thông báo đặc biệt được hệ thống thông tin và cảnh báo sớm của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations – FAO), sự bùng phát dịch bệnh trên thuỷ sản cần được quan tâm đặc biệt nên cần áp dụng các biện pháp quản lý thích hợp như tăng cường kiểm tra chẩn đoán, thực thi các giấy chứng nhận sức khoẻ, triển khai các biện pháp kiểm dịch và lập kế hoạch dự phòng [18]

Tại Việt Nam, cá diêu hồng và cá da trơn là các loài cá có sức khoẻ tốt, khả năng kháng bệnh cao, là hai loại cá được xuất khẩu đến rất nhiều nước trên thế giới mang về lợi nhuận rất lớn cho ngành thủy sản Năm 2015, sản lượng cá diêu hồng và da trơn trên thế giới từ

cả nuôi trồng thủy sản và đánh bắt lên tới 6,4 triệu tấn, với giá trị ước tính là 9,8 tỷ đô la

Mỹ, thương mại toàn cầu đạt 1,8 tỷ đô la Mỹ FAO còn cho biết cá diêu hồng là đối tượng của an ninh lương thực và dinh dưỡng toàn cầu [19]

Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra trên cá diêu hồng, bệnh

đốm trắng (hay bệnh hoại tử nội tạng) ở cá da trơn do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

có nguy cơ lan rộng, gây thiệt hại lớn về kinh tế và đời sống của người nuôi trồng thuỷ sản

8

Người nuôi trồng thủy sản và các nhà khoa học đã ý thức được rằng bệnh do các loài

vi khuẩn khác nhau gây ra có thể trở thành mối đe dọa số một đối với ngành thủy sản

Streptococcus agalactiae được coi là vi khuẩn gây bệnh có ảnh hưởng lớn nhất trên cá diêu

hồng, có thể gây chết cá với số lượng lớn và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi trồng

1.2.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Streptococcus agalactiae (S agalactiae) là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, phân chia

tế bào theo trục dọc thành chuỗi Hình ảnh dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn về vi khuẩn này được thể hiện ở hình 1.5

Hình 1.5: Vi khuẩn S agalactiae [20]

Biểu hiện của cá khi nhiễm phải vi khuẩn S agalactiae như sau:

 Cá bơi lờ đờ trên tầng mặt, một số cá bị bệnh nặng bơi nghiêng mình trên mặt nước và quay tròn một vài vòng sau đó tử vong

 Mắt cá bị lồi một bên và trên mắt kéo một lớp màng màu trắng đục

 Phía trong nắp mang bị xuất huyết, có màu đỏ nhưng không bị thối

 Hậu môn sưng đỏ

 Giải phẫu trong xoang bụng chứa nhiều dịch, ruột xuất huyết và chứa các bọt khí, quan sát thấy mật sưng to [20, 21]

Các biểu hiện trên được thể hiện ở hình 1.6

9

Hình 1.6: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn S Agalactiae gây bệnh trên cá diêu hồng [20]

Cá bị nhiễm trùng loại vi khuẩn này dễ dẫn đến nhiễm trùng máu và các bệnh liên quan đến hệ thần kinh của cá dẫn đến tử vong tỷ lệ từ 30 đến 50% [20]

1.2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước 1×2-3 μm,

không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, được thể hiện ở hình 1.7

Hình 1.7: Vi khuẩn E ictaluri Biểu hiện của cá khi nhiễm vi khuẩn E ictaluri như sau:

 Cá kém ăn hay bỏ ăn, gầy yếu

 Bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi

 Giải phẫu cơ quan nội tạng gan, lá lách, thận bị hoại tử thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5-2,5 mm, còn gọi là bệnh đốm trắng như thể hiện ở hình 1.8

10

Hình 1.8: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây bệnh trên cá da trơn

E ictaluri gây bệnh trên cá da trơn với tốc độ nhiễm bệnh và bệnh phát triển rất nhanh

Bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển rất phức tạp và phương pháp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng kháng sinh tân dược Các loại thuốc này có hoạt tính mạnh, có thể thẩm thấu trực tiếp vào máu, mang đến hiệu quả nhanh chóng, đặc biệt là tiêu diệt các ổ nhiễm khuẩn tồn tại trong cơ thể Tuy nhiên, vì chất kháng sinh tổng hợp là một hoạt chất có tính kháng khuẩn, nên khi người dùng không tuân thủ liệu trình điều trị thì sẽ chưa tiêu diệt hoàn toàn

vi khuẩn và lúc này vi khuẩn sẽ tự thích nghi bằng cách sinh ra một cơ chế phòng vệ với kháng sinh đó Lâu ngày, vi khuẩn sẽ thích nghi hoàn toàn với kháng sinh và dẫn tới tình trạng kháng thuốc (tức là thuốc không còn tác dụng kháng khuẩn với vi khuẩn đó nữa) [15]

Kháng sinh thực vật là sự phối hợp nhiều loại hợp chất với tác dụng kháng khuẩn theo

nhiều cơ chế phức tạp Khi đó, vi khuẩn không có khả năng nhận diện cơ chế tác động của kháng sinh thực vật để hình thành khả năng phòng vệ và gần như không có khả năng kháng thuốc Vì vậy, ngày nay, hướng nghiên cứu về kháng sinh thực vật đang nhận được nhiều sự quan tâm trên thế giới

11

Các loại kháng sinh thực vật được nghiên cứu khá nhiều và có tác dụng diệt khuẩn cao như flavonoid, polyphenol, triterpenoid Trong đó, flavonoid được nghiên cứu là có tác dụng kháng khuẩn cao trên nhiều dòng vi khuẩn khác nhau và nhóm hoạt chất này có chứa nhiều trong lá HNT Do đó, cần nghiên cứu về các phương pháp trích ly flavonoid từ lá HNT để thay thế kháng sinh tân dược trong việc điều trị bệnh thủy sản

1.2.4 Kháng khuẩn

Quercetin và kaempferol là hai hoạt chất được tìm thấy trong lá HNT, với cấu tạo vòng gắn các nhóm OH như hình 1.9, các nhóm OH này làm tăng khả năng kháng khuẩn với cơ chế liên kết với adhesin – yếu tố độc lực của vi khuẩn làm ức chế giải phóng acetylcholine – thành phần lớp phospholipid ở màng tế bào làm mất chức năng của vi khuẩn [22, 23]

Hình 1.9: Nhóm OH kháng khuẩn của hoạt chất quercetin và kaempferol

từ hàng ngàn năm nay trong lịch sử y học Nhìn chung, phương pháp trích ly truyền thống đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên, tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid trích ly thấp Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, các phương pháp trích ly cổ điển này đang dần được thay thế bởi các máy móc, trang thiết bị hiện đại hơn

12

1.3.2 Phương pháp trích ly hiện đại

Các phương pháp hiện đại đã và đang phổ biến hiện nay như trích ly hỗ trợ vi sóng, enzyme, lưu chất siêu tới hạn và đặc biệt là siêu âm

vi sóng không ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử của hợp chất hữu cơ Sự kích thích phân tử của vi sóng đơn thuần là tác động về động học

Khi vi sóng chạm đến vật liệu, một phần năng lượng của nó bị phản xạ trở lại, một phần đáng kể sẽ bị hấp thu vào trong vật liệu Năng lượng này sẽ được chuyển hóa thành nhiệt và giảm dần khi nó truyền đi trong vật liệu

Sự đun nóng của vi sóng là do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền ion Nhiệt được sinh

ra do sự dẫn truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường chống lại sự dịch chuyển của các ion trong điện trường Sự quay lưỡng cực là quá trình thay đổi hướng của một phân tử phân cực theo chiều của điện trường Các phân tử phân cực có xu hướng sắp xếp theo chiều điện trường Tuy nhiên, điện trường xoay chiều có tần số cao (MHz) gây ra

sự ma sát với vận tốc xoay rất lớn giữa các phân tử, làm cho vật chất nóng lên

Những hợp chất càng phân cực thì dưới tác động của vi sóng sẽ nóng càng nhanh Trong

đó, nước có độ phân cực mạnh và cấu trúc bất đối xứng, do đó, nước là một chất rất dễ đun nóng bằng vi sóng

1.3.2.2 Hỗ trợ enzyme

Hiện nay, enzyme cũng đang được sử dụng trong việc tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học Trích ly các hợp chất có hoạt tính bằng enzyme mang lại hiệu quả cao và được xem như là công nghệ “xanh”, thân thiện với môi trường Các loại chế phẩm enzyme thông dụng như pectinase, cellulase, viscozyme, lactase, fungal ‘rennin’, v.v

Hình 1.11 thể hiện hình ảnh một số loại enzyme thường được sử dụng trong các nghiên cứu khoa học

Hình 1.11: Một số loại enzyme thông dụngCông nghệ trích ly có hỗ trợ của enzyme sử dụng những enzyme đặc hiệu để phá hủy thành tế bào của nguyên liệu nhằm nâng cao hàm lượng trích ly Phương pháp này

có thể kết hợp với các phương pháp khác để thu hồi tất cả các chất có hoạt tính từ nguyên liệu

Tiền xử lý nguyên liệu bằng enzyme sẽ giúp giảm thời gian trích ly, giảm thiểu lượng dung môi sử dụng, ít tốn năng lượng, nâng cao chất lượng sản phẩm thu được

Sự hiểu biết về cấu trúc và thành phần của thành tế bào của nguyên liệu giúp lựa chọn enzyme đặc hiệu cho quá trình tiền xử lý Việc giảm lượng dung môi và giảm thiểu năng

14

lượng sử dụng trong quá trình trích ly sẽ giúp giảm tác hại đối với môi trường, cung cấp một lựa chọn “xanh” hơn so với các phương pháp không sử dụng enzyme [25]

1.3.2.3 Lưu chất siêu tới hạn

Phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn cũng được áp dụng để trích ly các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên Trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ

và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng siêu tới hạn Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng [26] Phương pháp này đang được sử dụng để trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học và lưu chất thường được sử dụng là cacbon dioxit (CO2) CO2 có nhiệt độ, áp suất tới hạn thấp và rẻ tiền, dễ kiếm (TCr = 31 oC, PCr = 73,8 atm) Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2 được mô tả ở hình 1.12

Hình 1.12: Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2

CO2 siêu tới hạn thân thiện với môi trường, tỉ trọng xấp xỉ chất lỏng, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp, độ linh động cao Những tính chất trên cho thấy, đây là dung môi đặc biệt hiệu có hiệu quả trong việc hòa tan và thâm nhập sâu vào trong nguyên liệu trích ly Trong quá trình trích ly bằng CO2 siêu tới hạn, nhiệt độ tương đối thấp và loại bỏ

1.3.2.4 Hỗ trợ siêu âm

Sóng siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn ngưỡng con người nghe thấy được (16-18 kHz) như thể hiện ở hình 1.13 Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc hay sóng nén, nghĩa

là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo cùng phương với phương truyền sóng

Hình 1.13: Tần số của âm thanh Nguyên lý tác động của sóng siêu âm dựa trên hiện tượng xâm thực khí và hiện tượng

vi xoáy

Hiện tượng xâm khí thực: khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các

chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa Bọt khí xuất hiện trở thành hạt nhân của hiện tượng xâm thực khí, bao gồm bọt khí ổn định và bọt khí

Con người nghe thấy được

Siêu âm công suất thông thường

Hóa học ứng dụng siêu âm

Siêu âm dung trong chẩn đoán bệnh

16 Hz - 18 kHz

20 kHz - 100 kHz

20 kHz - 2 MHz

5 MHz - 10 MHz

16

tạm thời Qua các chu trình kéo và nén liên tục, các bọt khí này tăng lên về kích thước và khi đạt đến kích thước tối đa chúng nổ tung dữ dội Khi đó, các phân tử va chạm vào nhau mãnh liệt, kết quả là hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao với vận tốc rất nhanh Hiện tượng này giúp thúc đẩy các phản ứng hóa học do tăng khả năng trộn lẫn các chất phản ứng với nhau, tạo ra các gốc tự do, tăng hiệu suất đồng hóa, hỗ trợ trích ly các chất tan như enzyme từ tế bào v.v [27]

Hiện tượng vi xoáy: sóng siêu âm cường độ cao truyền vào trong lòng chất lỏng sẽ gây

nên sự kích thích mãnh liệt Tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy Hiện tượng này làm giảm ranh giới giữa các pha, tăng cường sự truyền khối đối lưu và thúc đẩy sự khuếch tán mà ở khuấy trộn thông thường không thực hiện được [27]

So với phương pháp trích ly thông thường thì trích ly hỗ trợ siêu âm mang lại những hiệu quả tốt hơn như thời gian trích ly ngắn, hàm lượng trích ly cao hơn, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt, thiết bị dễ sử dụng, tăng tốc độ hòa tan và tăng khả năng khuếch tán của các chất vào trong dung môi, lượng hóa chất sử dụng ít hơn Do đó, trong luận văn này, phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm được sử dụng để trích ly hoạt chất flavonoid (quercetin và kaempferol) từ lá cây HNT bằng dung môi Tuy nhiên, phương pháp này còn hạn chế ở quy mô lớn, tiếng ồn do thiết bị phát ra

Bản chất của quá trình trích ly là sự khuếch tán hoạt chất từ dược liệu vào dung môi Do

đó, việc lựa chọn dung môi cũng hết sức quan trọng Dung môi lựa chọn sao cho phải hòa tan được tối đa lượng hoạt chất, tối thiểu tạp chất, dễ thấm vào dược liệu (độ nhớt thấp và sức căng bề mặt nhỏ), trơ về mặt hóa học (không phản ứng với hoạt chất), dễ bay hơi trong quá trình cô đặc, không làm thành phẩm có mùi đặc biệt, ít độc hại, và dễ bảo quản Nước, EtOH, glycerin và dầu thực vật là những dung môi thường được sử dụng để trích ly các hoạt chất quý từ dược liệu [28]

Tuy nhiên, việc trích ly hoàn toàn bằng dung môi tinh khiết sẽ không mang lại hiệu quả tốt nhất nên cần sử dụng hỗn hợp cả hai dung môi Nước và EtOH với giá thành rẻ, thân thiện với môi trường do EtOH có thể được sản xuất từ nguyên liệu tự nhiên như rơm rạ, bã mía, ngô v.v nên trong luận văn này, dung môi EtOH pha loãng trong nước được chọn để nghiên cứu

Trong 6 tháng đầu năm 2015, tổng sản lượng nuôi trồng đạt 1,67 triệu tấn, tăng 3,8% giúp Việt Nam trở thành một trong những nước dẫn đầu về xuất khẩu cá Năm 2015, sản lượng cá diêu hồng trên thế giới từ cả nuôi trồng thủy sản và đánh bắt lên tới 6,4 triệu tấn, tổng sản lượng xuất khẩu cá da trơn đạt mức 4,4 triệu tấn trong năm 2016 Sản lượng dự kiến sẽ tăng lên mức khoảng 4,7 triệu tấn trong năm 2017 [18]

Bên cạnh những thuận lợi về thị trường cũng xuất hiện những thách thức về công nghệ

và dịch bệnh Dịch bệnh ngày càng phức tạp và khó điều trị, làm cá chết hàng loạt ảnh hưởng lớn đến đời sống người nuôi và nền kinh tế đất nước Một trong những bệnh

gây hại cho cá đang được quan tâm nhất là bệnh xuất huyết ở cá diêu hồng do vi khuẩn S agalactiae và bệnh đốm trắng ở cá da trơn do E ictaluri gây ra

Các bệnh này thường được điều trị bằng kháng sinh, nhưng việc điều trị này đang chịu

nhiều rủi ro do hiện tường kháng kháng sinh Có thể kể đến S agalactiae kháng các loại kháng sinh như penicilline, erythromicine; E ictaluri kháng sulphonamid, oxytetracyline,

streptomycine, v.v nên việc điều trị bệnh khi cá bị nhiễm khuẩn gặp không ít khó khăn [21]

Để khắc phục tình trạng đó, kháng sinh thực vật là sự phối hợp nhiều loại kháng sinh với tác dụng kháng khuẩn theo nhiều cơ chế phức tạp Vì vậy, vi khuẩn không có khả năng nhận diện cơ chế tác động của kháng sinh thực vật để hình thành khả năng phòng

vệ và gần như không có khả năng kháng thuốc

Do đó, luận văn “Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp

hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích ” được chọn và

nghiên cứu

18

1.4.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đưa ra quy trình trích ly thành công hoạt chất flavonoid (quercetin và kaempferol) từ lá HNT bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm với đầy đủ các thông số và kết luận về hoạt tính

kháng khuẩn của cao trích

1.4.3 Nội dung

 Nội dung 1: khảo sát điều kiện trích ly: nồng độ EtOH, thời gian siêu âm, nhiệt độ

trích ly và công suất siêu âm đến hàm lượng hoạt chất quercetin và kaempferol từ lá cây HNT bằng phương pháp trích ly bằng dung môi EtOH có hỗ trợ siêu âm

 Nội dung 2: thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích với điều kiện trích ly

phù hợp ở nội dung 1

1.4.4 Phương pháp nghiên cứu

1.4.4.1 Khảo sát điều kiện trích ly

 Khảo sát ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly đến hàm lượng quercetin và

 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời các điều kiện trích ly đến hàm lượng quercetin và

kaempferol

Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm hiện đại, trong đó công cụ toán học giữ vai trò tích cực Cơ sở toán học nền tảng của lý thuyết quy hoạch thực nghiệm là toán học xác suất thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi quy [29]

Trong các phương pháp quy hoạch thực nghiệm, phương pháp tìm cực trị được phát triển từ thực nghiệm mô phỏng, nhiệm vụ là xây dựng mô hình tính toán thực nghiệm, theo

đó xác định bộ kết hợp giá trị các điều kiện mà tại đó hàm mục tiêu đạt giá trị lớn nhất Phương pháp tâm xoay bậc hai theo mô hình Box-Wilson là một trong những phương pháp tìm cực trị, mô hình được sử dụng trong trường hợp mô hình tuyến tính không đủ để

19

mô tả đối tượng nghiên cứu với độ chính xác phù hợp, lúc này thí nghiệm được thiết kế sao cho các điều kiện được thay đổi ở ba mức độ trở lên [30] Mô hình được miêu tả dưới dạng hình học là một hình lập phương 8 đỉnh (hình 1.14), mỗi đỉnh ứng với một thực nghiệm, điểm ở tâm và những điểm nằm trên trục tọa độ là những thực nghiệm cần phải tiến hành để tìm ra cực trị

Hình 1.14: Mô hình tâm xoay bậc hai Sau khi chọn được khoảng biến thiên phù hợp của điều kiện trích ly, tiến hành khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các điều kiện đến hàm lượng quercetin và kaempferol bằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp tâm xoay bậc hai với mô hình Box – Willson [31] Tất cả các biến độc lập được mã hóa ở ba mức độ -1, 0, +1 Cách thức chuyển đổi giữa biến mã hóa 𝑥𝑗 và giá trị thực 𝑍𝑗 được tiến hành dựa trên công thức (1.1)

𝑥𝑗 = 2(𝑍𝑗 − 𝑍𝑗

0 )

𝑍𝑗𝑚𝑎𝑥 − 𝑍𝑗𝑚𝑖𝑛 với 𝑗 = 1,2,3,…,k (1.1) trong đó: 𝑌 là hàm lượng quercetin hoặc kaempferol, 𝑥𝑗 là biến mã hóa tương ứng điều kiện khảo sát Zj, 0 là hằng số, 𝑗là hệ số bậc 1, 𝑗𝑢 là hệ số tương tác đôi, 𝑗𝑗 là hệ số bậc

2

Số thí nghiệm trong mô hình này được thể hiện ở công thức (1.2)

𝑁 = 2𝑘+ 2𝑘 + 𝑛0 (1.2)

20

trong đó: 𝑁 là số thí nghiệm, 𝑘 là số điều kiện độc lập ảnh hưởng tới hàm lượng quercetin

và kaempferol trích ly, 𝑛0 là số thí nghiệm tại tâm [31]

Đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa giữa các thí nghiệm bằng phương pháp xử lý thống kê ANOVA với mức độ tin cậy 95%, sử dụng phần mềm Design – Expert 11.0 Sau khi tìm được điều kiện trích ly phù hợp, tiến hành thực hiện quy trình trích ly theo

mô hình và so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả dự đoán của mô hình

1.4.4.2.Phân tích hàm lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid (quercetin và kaempferol) có trong cao trích được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa theo đường chuẩn của quercetin và kaempferol xây dựng bằng chất chuẩn tinh khiết

 Phương pháp phân tích

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích hiện đại Trong đó, pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân, hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử) [32, 33]

Nguyên tắc: pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký

và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì có sắc ký gel hay rây phân

tử

Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, cần có một pha động Như vậy, nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C, v.v vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C, v.v sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F) và ngược lại Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi 3 lực F1, F2, F3, trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh

21

hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy, với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

Cột C18 (pha đảo) trong sắc ký lỏng: pha tĩnh thường là những hạt silicagel có kích thước µm được liên kết hóa học với nhóm C18 ít phân cực Các cấu tử sau khi vào cột

sẽ xảy ra sự tương tác với pha tĩnh nên cấu tử sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha động Nhờ

sự ái lực khác nhau giữa cấu tử và pha tĩnh giúp cho các cấu tử di chuyển với vận tốc khác nhau trong pha động Kết quả là các chất được tách với thời gian lưu trên cột khác nhau, cấu tử tương tác yếu hơn sẽ ra khỏi cột trước, cấu tử bị lưu giữ mạnh hơn sẽ ra khỏi cột sau

Đầu dò DAD (Diode Array Detector) là loại đầu dò khá phổ biến trong sắc ký lỏng hiệu năng cao Nguyên tắc hoạt động là pha động vận chuyển các cấu tử sau khi tách khỏi cột

đi vào một ống đo (flowcell), một chùm bức xạ chiếu qua một ống đo đó, với mỗi cấu tử cần phân tích sẽ có bước sóng hấp thu cực đại và nhờ vào đó đầu dò sẽ phát hiện được cấu tử cần phân tích và ghi nhận tín hiệu, sau cùng là chuyển tín hiệu đến bộ phận xử lý (máy vi tính) được thể hiện ở hình 1.15 [32, 33]

Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý máy HPLC

22

Ứng dụng: phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, xác định hàm lượng vết, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt Trong luận văn này, phương pháp HPLC được sử dụng để phân tích hàm lượng

quercetin và kaempferol có trong cao trích lá HNT [34]

 Xác định hàm lượng

Hàm lượng quercetin và kaempferol trong cao trích nghiên cứu được phân tích bằng HPLC, tính toán dựa theo phương trình đường chuẩn (1.3) xây dựng bằng chất chuẩn quercetin và kaempferol tinh khiết có dạng:

𝑦 = 𝐴𝑥 + 𝐵 (1.3) trong đó 𝑥 là hàm lượng của quercetin hoặc kaempferol (mg/L), 𝑦 là diện tích đỉnh (peak) sắc ký

Đánh giá hàm lượng trích ly quercetin và kaempferol được tính theo công thức (1.4) có dạng:

𝐹𝑙 =𝑥×𝑉0

𝑚0 (1.4) trong đó 𝐹𝑙 là hàm lượng của quercetin hoặc kaempferol (mg/g), 𝑥 là hàm lượng của từng chất (mg/L) suy ra từ đường chuẩn (1.2), 𝑉0 là thể tích MeOH:H2O tỉ lệ 1:1 (v/v) (mL),

𝑚𝑝𝑡 là khối lượng cao trích phân tích (g), 𝑚𝑐 là khối lượng cao trích (g), 𝑚0 là khối lượng bột lá HNT ban đầu (g)

1.4.4.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn được thử nghiệm trên hai chủng vi khuẩn S agalactiae và

E ictaluri bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán và pha loãng tới hạn

 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh

Kỹ thuật này dùng để bán định lượng nồng độ cao trích có khả năng ức chế vi khuẩn, nhằm tìm ra giới hạn nồng độ thực hiện kỹ thuật pha loãng tới hạn

23

Cao trích sẽ được tẩm vào một khoanh giấy có đường kính 6 mm, sau đó được đặt vào môi trường thạch có chứa vi khuẩn Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với cao trích được biểu hiện bằng đường kính các vòng kháng khuẩn xung quanh khoanh giấy [35]

Cách đo đường kính vòng kháng khuẩn (𝐷𝐾) theo công thức (1.5) và hình 1.16:

𝐷𝐾 = 𝐷 − 𝑑 (1.5) trong đó: 𝐷 (mm) là đường kính vòng kháng khuẩn và 𝑑 (mm) là đường kính khoanh giấy kháng sinh

Hình 1.16: Cách đo đường kính vòng kháng khuẩn

 Kỹ thuật pha loãng tới hạn

Kỹ thuật này dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ cao trích thấp nhất có khả năng ức chế được sự phát triển của vi khuẩn được gọi là nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) MIC càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao [36]

Cách xác định MIC của kỹ thuật pha loãng tới hạn: pha loãng cao trích trong môi trường lỏng tại các nồng độ khác nhau dựa vào giới hạn tìm được từ kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh (thường là pha loãng theo cấp số nhân), một lượng vi khuẩn nhất định như nhau được

24

cấy vào môi trường có nồng độ cao trích khác nhau, tăng sinh vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy phù hợp, đo độ đục của vi khuẩn trên đĩa 96 giếng tại bước sóng 600 nm [37, 38]

Ở nồng độ cao trích thấp nhất nào thấy giá trị đo độ đục tương đương với giá trị đo của đối

chứng dương thì tại đó là nồng độ ức chế tối thiểu của cao trích

1.4.5 Tính mới của luận văn

Mặc dù HNT là loại dược liệu được nghiên cứu khá nhiều tại Việt Nam cũng như trên thế giới Tuy nhiên, việc nghiên cứu điều kiện trích ly flavonoid (quercetin và kaempferol) bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm vẫn còn khá ít Bên cạnh đó, việc áp dụng quy hoạch thực nghiệm để tìm ra điều kiện trích ly cho hàm lượng hoạt chất cao nhất vẫn còn là hướng nghiên cứu mới trong trích ly HNT Thêm vào đó việc áp dụng phương pháp HPLC hiện đại để xác định riêng rẽ quercetin và kaempferol làm tăng độ chính xác so với phương pháp chuẩn độ hay phổ hấp thu phân tử

Hiện nay, kháng sinh từ dược liệu thiên nhiên để ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh trên thủy sản, thay thế kháng sinh tân dược đang được quan tâm nghiên cứu tại Việt Nam Các kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh và pha loãng tới hạn được áp dụng đồng thời để tìm

ra nồng độ ức chế tối thiểu của cao trích HNT trên vi khuẩn S agalactiae và E ictaluri

cũng là tính mới của đề tài, giúp nâng cao độ tin cậy và tính khách quan của kết quả

Hình 2.1: Lá HNT đã sấy khô và xay nhuyễn

Sau đó, mẫu được xay nhuyễn với kích thước khoảng 500-700 μm

26

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm được liệt kê ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Thiết bị, dụng cụ sử dụng

Hình 2.2: (a) Bể siêu âm, (b) Máy HPLC-30 Nexera

27

2.1.4 Địa điểm thực hiện

Luận văn được thực hiện tại:

PTN Trọng điểm ĐHQG-HCM – Công nghệ Hóa học và Dầu khí

(CEPP), Trường ĐH Bách Khoa, ĐHQG-HCM, Phòng 119B2, số

268, đường Lý Thường Kiệt, phường 14, Quận 10, Tp HCM

Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3

(QUATEST 3), số 7, đường số 1, Khu công nghiệp Biên Hòa 1, tỉnh

Đồng Nai

2.2 Thí nghiệm

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện trích ly

Quy trình trích ly từ lá cây HNT được thể hiện ở hình 2.3

Hình 2.3: Quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT