Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng phương pháp có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ---o0o--- NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TRÍCH LY GINSENOSIDE TỪ CỦ TAM THẤT BẮC BẰNG PHƯƠNG PHÁP CÓ HỖ TRỢ ENZYME VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o -

NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY GINSENOSIDE TỪ CỦ TAM THẤT BẮC

BẰNG PHƯƠNG PHÁP CÓ HỖ TRỢ ENZYME

VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO TRÍCH

(Enzyme-assisted extraction of ginsenosides from Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen

and examination of the extract biological activities)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2019

i

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam………

TS Nguyễn Hữu Hiếu………

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Huỳnh Ngọc Oanh ……… ……

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Quốc Thắng………

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Tp HCM, ngày 22 tháng 01 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS TS Đống Thị Anh Đào – Chủ tịch

2 TS Huỳnh Ngọc Oanh – Ủy viên phản biện 1

3 TS Nguyễn Quốc Thắng – Ủy viên phản biện 2

4 PGS TS Phan Thị Phượng Trang - Ủy viên

5 TS Huỳnh Khánh Duy – Thư kí

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

GS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS TS PHAN THANH SƠN NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƯƠNG MSHV: 1770453

Ngày, tháng, năm sinh: 12/05/1995 Nơi sinh: Đồng Tháp Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI:

Tên tiếng Việt: “Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng

phương pháp có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích”

Tên tiếng Anh: “Enzyme-assisted extraction of ginsenosides from

Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen and examination of the extract biological

activities”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

2.1 Tổng quan: tam thất bắc và các loại ginsenoside, tình hình nghiên cứu trong và

ngoài nước, ứng dụng của cao trích củ tam thất bắc, phương pháp trích ly, phương pháp định lượng ginsenoside, phương pháp thử hoạt tính sinh học của cao trích

2.2 Thực nghiệm

 Trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc

 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện trích ly:

 Khảo sát từng yếu tố: pH, nhiệt độ, thời gian thủy phân;

 Khảo sát đồng thời ba yếu tố trên bằng quy hoạch thực nghiệm tâm xoay bậc haivới mô hình Box-Wilson, xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert 11.0;

 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích: kháng tiểu đường và kháng ung thư

2.3 Kết quả và bàn luận

2.4 Kết luận

iii

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/07/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 15/01/2019

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS HOÀNG MINH NAM, TS NGUYỄN HỮU HIẾU

Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Minh Nam và TS Nguyễn Hữu Hiếu

đã tận tình hướng dẫn tác giả hoàn thành luận văn

Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh chị và bạn bè ở Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Công nghệ hóa học và Dầu khí (CEPP) đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và quý anh chị ở Cục Thú Y – Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú Y Trung Ương II đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tác giả trong quá trình thực hiện luận văn

Tác giả Nguyễn Trần Xuân Phương

v

TÓM TẮT

Trong luận văn này, hai hoạt chất ginsenoside Rb1 và Rg3 được trích ly từ

củ tam thất bắc bằng phương pháp có hỗ trợ viscozyme L Đây là phức hợp nhiều cacbohydrase khác nhau như cellulase, arabanase, xylanase và hemicellulase Khi bổ sung viscozyme L vào quá trình trích ly thì phức hợp các enzyme này sẽ phân cắt các thành phần cấu tạo nên thành tế bào như pectin, cellulose, hemicellulose,…

Do đó, làm phá vỡ cấu trúc thành tế bào – cơ quan bảo vệ bên ngoài của tế bào không bị mất nước và duy trì tính toàn vẹn của tế bào, làm giải phóng các hoạt chất vào

dung môi trích ly

Ảnh hưởng của từng yếu tố đến sự hoạt động của enzyme như pH, nhiệt độ và thời gian thủy phân được khảo sát để tìm khoảng biến thiên phù hợp Sau đó, dựa trên các khoảng giá trị tìm được, tiến hành khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố này bằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp tâm xoay bậc hai với mô hình Box – Wilson và xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly phù hợp cho hàm lượng ginsenoside Rb1 và Rg3 trong cao trích cao nhất

Hàm lượng Rb1 và Rg3 trong cao trích được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance Liquid Chromatography – HPLC)

Đồng thời, mẫu đối chứng không bổ sung viscozyme L được tiến hành để so sánh hàm lượng ginsenoside với mẫu trích ly ở điều kiện phù hợp tìm được

Cao trích có hàm lượng Rb1 và Rg3 cao nhất ứng với điều kiện phù hợp được thử nghiệm các hoạt tính sinh học: kháng tiểu đường bằng phương pháp ức chế enzyme α-glucosidase và kháng ung thư trên ba dòng tế bào phổi Lu, gan Hep-G2 và

vú MCF-7 bằng phương pháp tetrazolium (MTT assay)

vi

ABTRACT

In this essay, two ginsenosides Rb1 and Rg3 were extracted from

Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen by enzyme-assisted method, which was

viscozyme L This was a complex of different carbohydrases such as cellulase, arabanase, xylanase and hemicellulase When viscozyme L was added to the extraction process, the complex of these enzymes could break down the cell walls such as pectin, cellulose and hemicellulose Therefore, ginsenosides were dissolved into solvent extraction

The effect of three independent variables in terms of pH, temperature and hydrolysis time was investigated to find a range of suitable conditions, which could help

viscozyme L to activate well Then, the Box and Wilson design was applied to survey the simultaneous effect of these factors, using Design Expert 11.0 software for the experimental design and regression analysis of the experimental data The target of this research was the highest of concentration ginsenoside Rb1 and Rg3 obtained

vii

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Hoàng Minh Nam và TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM

Số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực

Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2019

Tác giả Nguyễn Trần Xuân Phương

viii

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT v

ABTRACT vi

LỜI CAM ĐOAN vii

MỤC LỤC viii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT (tiếp theo) xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tam thất bắc và các loại ginsenoside 2

1.1.1 Danh pháp và phân loại khoa học 2

1.1.2 Mô tả thực vật 2

1.1.3 Khu vực phân bố, kỹ thuật trồng và thu hoạch 3

1.1.4 Thành phần hóa học trong củ TTB 4

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 9

1.2.1 Ngoài nước 9

1.2.2 Trong nước 10

1.3 Ứng dụng của cao trích củ TTB 11

1.3.1 Kháng tiểu đường 11

1.3.2 Kháng ung thư 14

1.4 Phương pháp trích ly 20

1.4.1 Phương pháp cổ điển 20

1.4.2 Phương pháp hiện đại 20

1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

1.5.1 Tính cấp thiết 23

1.5.2 Mục tiêu 24

ix

1.5.3 Nội dung 24

1.5.4 Phương pháp nghiên cứu 24

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 32

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị – dụng cụ và địa điểm thực hiện 32

2.1.1 Nguyên liệu 32

2.1.2 Hóa chất 32

2.1.3 Thiết bị – dụng cụ 34

2.1.4 Địa điểm thực hiện 35

2.2 Thí nghiệm 36

2.2.1 Quy trình trích ly ginsenoside từ củ TTB 36

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly 37

2.2.3 Phân tích hàm lượng ginsenoside 38

2.2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Điều kiện trích ly 41

3.1.1 Ảnh hưởng từng yếu tố 41

3.1.2 Áp dụng quy hoạch thực nghiệm tìm điều kiện trích ly phù hợp 44

3.2 Hoạt tính sinh học của cao trích 59

3.2.2 Hoạt tính kháng tiểu đường 59

3.2.3 Hoạt tính kháng ung thư 61

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các bộ phận của TTB 3

Hình 1.2 Công thức hóa học của dammaran 6

Hình 1.3 Bộ khung cacbon của polyacetylen 8

Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hóa polysaccarit vào máu 13

Hình 1.5 Quá trình tăng cường sự hấp thu glucose vào nội bào 14

Hình 1.6 Nhóm các nước có số ca mắc bệnh ung thư trên thế giới 15

Hình 1.7 Thống kê của WHO về tình hình mắc ung thư ở Việt Nam 15

Hình 1.8 Cơ chế kháng ung thư của Rb1 17

Hình 1.9 Cơ chế kháng ung thư của Rg3 18

Hình 1.10 Quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào của enzyme 21

Hình 1.11 Một số loại chế phẩm enzyme 21

Hình 1.12 Vị trí cắt của endo-β-1,4-glucanase trên mạch cellulase 22

Hình 1.13 Sơ đồ nguyên lý hoạt động HPLC 27

Hình 1.14 Thiết bị phân tích HPLC 28

Hình 1.15 Nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường 29

Hình 1.16 Nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư 30

Hình 2.1 Củ TTB 32

Hình 2.2 Chất chuẩn Rb1 và Rg3 33

Hình 2.3 Chế phẩm viscozyme L 33

Hình 2.4 Các thiết bị sử dụng 34

Hình 2.5 Quy trình trích ly ginsenoside từ củ TTB 36

Hình 3.1 Ảnh hưởng của pH 41

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 42

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 43

Hình 3.4 Hàm lượng Rb1 từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 47

Hình 3.5 Sự tác động của ba yếu tố khảo sát 48

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng Rb1 49

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng Rb1 50

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và pH đến hàm lượng Rb1 51

xi

Hình 3.9 Hàm lượng Rg3 từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 54

Hình 3.10 Sự tác động của ba yếu tố khảo sát 55

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng Rg3 56

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng Rg3 57

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và pH đến hàm lượng Rg3 58

Hình 3.14 Hoạt tính kháng tiểu đường của cao trích củ TTB 60

Hình 3.15 Hoạt tính kháng ung thư của cao trích củ TTB đối với ba dòng tế bào ung thư Lu, Hep-G2 và MCF7 61

xii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Cấu trúc các ginsenoside trong củ TTB 6

Bảng 1.2 Hoạt tính sinh học của một số loại ginsenoside quan trọng 8

Bảng 1.3 Mô hình Box – Wilson với 3 yếu tố độc lập 26

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 32

Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng (tiếp theo) 33

Bảng 2.3 Thiết bị sử dụng 34

Bảng 2.4 Dụng cụ sử dụng 35

Bảng 2.5 Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng từng yếu tố 37

Bảng 2.6 Thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box-Wilson 38

Bảng 2.7 Chương trình pha động 39

Bảng 2.8 Chuẩn bị chất chuẩn làm việc 39

Bảng 3.1 Khoảng biến thiên phù hợp 44

Bảng 3.2 Mức thí nghiệm 44

Bảng 3.3 Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Wilson đối với Rb1 45

Bảng 3.4 Kết quả phân tích ANOVA đối với Rb1 46

Bảng 3.5 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 47

Bảng 3.6 Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Wilson đối với Rg3 52

Bảng 3.7 Kết quả phân tích ANOVA đối với Rg3 53

Bảng 3.8 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 54

Bảng 3.9 Kết quả thực nghiệm kiểm chứng mô hình 59

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

CT Computed Tomography Quét cắt lớp vi tính

MRI Magnetic Resonance

Imaging

Chụp cộng hưởng từ hạt nhân

SW480 Human Colorectal Cancer

cell lines

Dòng tế bào ung thư đại trực tràng NCI-H460 Human Lung Cancer cell line Dòng tế bào ung thư phổi

xiv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT (tiếp theo)

BT474 Human Breast Cancer

PI3K Photphatidylinositol 3

kinase Akt hay PKB Protein kinase B

PEDF Pigment

Epithelium-Derived Factor

Yếu tố có nguồn gốc biểu mô sắc tố

CYP1A1 Cytochrome P450 1A1

NF-κB Nuclear Factor-kappa B

EAE

Enzyme-Assisted Extraction Trích ly có hỗ trợ enzyme

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, áp lực, căng thẳng trong công việc, chế độ ăn uống, nghỉ ngơi không hợp lý là những hiện tượng khá phổ biến ở giới trẻ Tình trạng này kéo dài là nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 và có thể dẫn đến ung thư Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường thế giới, năm 2017, có hơn

400 nghìn người mắc bệnh tiểu đường có độ tuổi từ 20 đến 79 tuổi Bên cạnh tiểu đường, số ca mắc bệnh ung thư trên thế giới cũng tăng vượt trội trong 5 năm trở lại đây, trong đó có Việt Nam Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, tình trạng ung thư nếu tiếp tục tăng sẽ đưa Việt Nam vào nhóm những nước có số lượng ca ung thư hàng năm cao nhất thế giới

Sự phát triển của khoa học công nghệ trong y học đã không còn là thách thức đối với bệnh tiểu đường và ung thư Tuy nhiên, các phương pháp về điều trị bệnh thường ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân và chi phí điều trị đắt đỏ Từ lâu, dân gian

đã biết sử dụng các loại dược liệu như nấm linh chi, nhân sâm, tam thất bắc, xạ đen,… trong việc điều trị bệnh nhưng không có cơ sở khoa học Bắt nguồn từ đó, nhiều công trình nghiên cứu lần lượt ra đời trên thế giới Tại Việt Nam, với điều kiện khí hậu, đất đai phù hợp, tam thất bắc được trồng khá nhiều ở các vùng núi cao phía Bắc, tạo điều kiện nghiên cứu và phát triển loại dược liệu này Đến nay, những công bố về phương pháp trích ly hoạt chất, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tam thất bắc được trồng tại Việt Nam vẫn chưa phổ biến Vì vậy, đề tài

luận văn “Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng phương pháp

có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích” được chọn

nghiên cứu nhằm làm đa dạng nguồn dược liệu điều trị tiểu đường, ung thư và nâng cao giá trị của loài thực vật bản địa Việt Nam

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tam thất bắc và các loại ginsenoside

1.1.1 Danh pháp và phân loại khoa học

Tên khoa học: Panax notoginseng hay Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen,

có tên gọi khác: sâm tam thất bắc, nhân sâm tam thất bắc, điền thất, kim bất hoán (vàng không đổi) có nghĩa là vị thuốc rất quý, vàng cũng không đổi được Ở Việt Nam, tên gọi phổ biến là tam thất bắc (TTB) [1, 2] Ở Trung Quốc, TTB còn có tên Sanqi, Tianqi hay Tien-chi [3] TTB có phân loại khoa học như sau:

 Ngành: Angiospermae (hạt kín);

 Lớp: Eudicots (hai lá mầm);

 Bộ: Apiales (hoa tán);

 Họ: Araliaceae (nhân sâm);

 Chi: Panax (sâm);

 Loài: Panax notoginseng hay Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen

1.1.2 Mô tả thực vật

TTB là loại cây thân thảo sống lâu năm Thân mọc thẳng cao 30-50 cm, màu tím tía

Lá kép chân vịt, 3-4 cái mọc vòng, cuống lá chung dài 3-6 cm, mang 3-7 lá chét hình mác dài, mép có khía răng cưa, có lông cứng ở gân trên cả hai mặt, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt và cuống lá chét dài 0,6-1,2 cm như thể hiện ở hình 1.1a

Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, nụ hoa màu lục vàng nhạt với 5 lá đài,

5 cánh hoa, 5 nhị và bầu dưới 2 ô như thể hiện ở hình 1.1b Quả mọng hình cầu dẹt, khi chín có màu đỏ; hạt hình cầu, màu trắng như thể hiện ở hình 1.1c Củ (rễ) sần sùi, màu vàng nhạt và có mùi đặc trưng như thể hiện hình 1.1d [1]

3

Hình 1.1 Các bộ phận của TTB (a) Cây, (b) Nụ hoa, (c) Hoa khi chín và (d) Củ

1.1.3 Khu vực phân bố, kỹ thuật trồng và thu hoạch

Khu vực phân bố của TTB chủ yếu ở các nước châu Á như Myanmar, Nepal, Nhật Bản và đặc biệt loài cây này được trồng nhiều ở phía Tây Nam Trung Quốc [4]

Ở Việt Nam, TTB được trồng nhiều ở tỉnh Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai (Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng,… tại các vùng núi cao 1.200-1.500 m Cần chọn những nơi sườn núi ít gió mạnh, phải làm các giàn che nắng

và phải rào để chống chuột hay sóc đến ăn củ

Đất phải được bón phân, chuẩn bị kỹ một năm trước khi gieo trồng và chia thành luống dọc cách nhau 1 m Vào tháng 10-11 chọn những hạt ở cây đã mọc 3-4 năm, gieo vào vườn ươm Đến khoảng tháng 2 năm sau, cây con mới mọc Một năm sau,

1.1.4.1 Hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

Các hợp chất hữu cơ tự nhiên từ lâu đã là đối tượng được các nhà hóa học, sinh học và dược liệu học quan tâm nghiên cứu Hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học (hay còn gọi là hoạt chất tự nhiên) là những hợp chất có nguồn gốc từ sinh vật (thực vật, động vật, vi sinh vật) có dược tính hoặc độc tính đối với động vật và con người Hầu hết hoạt chất tự nhiên là sản phẩm biến dưỡng bậc hai (hợp chất thứ cấp) có cấu trúc phân tử vô cùng đa dạng do cây sản xuất ra, không trực tiếp chuyển hóa năng lượng mà nhằm những mục đích khác như tự vệ (gây độc, mùi hăng, vị đắng…), hấp dẫn thụ phấn, phát tín hiệu hóa học,…

Các hoạt chất tự nhiên từ dược liệu thường là các hợp chất được sinh tổng hợp từ quá trình đường phân, chu trình Krebs (chu trình tricacboxylic axit – TCA) hoặc chu trình Calvin Theo đó, phân biệt về mặt nguồn gốc có ba nhóm hợp chất thứ cấp lớn là terpenoid, phenolic và hợp chất chứa nito Về mặt hoạt tính sinh học, kéo theo

sự phân biệt rõ hơn nữa mối liên quan giữa cấu trúc phân tử và chức năng chung mà hoạt chất tự nhiên được chia thành các nhóm lớn như alkaloid, quinonoid, coumarin, flavonoid, tinh dầu, glycoside tim, saponin,… [5, 6] Trong luận văn này, saponin được chọn để nghiên cứu

Một số tính chất chung của saponin là:

 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước;

 Làm vỡ hồng cầu ngay khi ở nồng độ loãng;

 Độc với cá, diệt các loại thân mền như giun, sán, ốc sên, ;

 Kích thích niêm mạc mắt gây đỏ mắt, hắt hơi;

 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-β-hydroxysteroid

Trong TTB, saponin là một trong những thành phần chiếm hàm lượng lớn

b Saponin trong TTB

Saponin trong TTB thuộc nhóm dammaran có phần sapogenin chủ yếu là (20S)-protopanaxadiol (PPD) và (20S)-protopanaxatriol (PPT) Đã có 56 saponin được phân lập từ củ TTB, trong đó có 35 saponin thuộc (20S)-PPD và 21 saponin thuộc nhóm (20S)-PPT Các saponin này thường được gọi là ginsenoside hoặc notoginsenoside

tùy theo cấu trúc khác nhau:

 Saponin có phần sapogenin là (20S)-PPD gồm: ginsenoside Rb1, Rb2, Rd, Rg3

(1)Ginsenoside, (2)Notoginsenoside, (3)β-D-glucopyranosyl, (4)β-D-xylopyranosyl,

(5)α-L-rhamnopyranosyl (6)α-L-arabinopyranosyl

7 Các hoạt tính sinh học chính của ginsenoside được thể hiện ở bảng 1.2

Hình 1.3 Bộ khung cacbon của polyacetylen

Hai polyacetylen trong củ TTB và nhân sâm Hàn Quốc đã được phân lập bằng việc

sử dụng dung môi trích n-hexan sau đó sử dụng sắc ký lớp mỏng (Thin Layer

1.1.4.4 Một số thành phần khác

Quecertin và quecertin-3-O-sophoroside là hai hợp chất thuộc họ flavonoid cũng như các loại polysacarit được phân lập từ củ TTB Các hợp chất này được định tính và định lượng bằng nhiều phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ (High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry – HPLC/MS), sắc ký khí (Gas Chromatography – GC), TLC, quang phổ hấp thu tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible spectroscopy – UV-Vis [2]

Củ TTB chứa nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, ginsenoside Rb1 và Rg3 là hai hoạt chất có khả năng kháng tiểu đường và ung thư nên trong luận văn, sử dụng viscozyme L để hỗ trợ quá trình trích ly hai ginsenoside này

Việc phân lập, xác định cấu trúc, thành phần của các chất có chứa trong củ TTB bằng nhiều phương pháp khác nhau đã được công bố khá nhiều trên thế giới, trong đó

TTB là một trong những loại thảo dược mang đặc trưng của vùng Nam Á

Vì vậy, các nghiên cứu hầu như tập trung ở khu vực này như Singapore, Hàn Quốc, Nhật Bản, đặc biệt là Trung Quốc

Năm 2003, nghiên cứu ở Singapore đã xây dựng được phương pháp phân tích sáu loại saponin bao gồm notoginsenoside R1, ginsenosides Rg1, Re, Rb1, Rc, Rd bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng metanol để xử lý mẫu Phương pháp cho độ nhạy cao, có giới hạn phát hiện 0,008-0,013 mg/mL, giới hạn định lượng 0,027-0,041 mg/mL [3]

10

Trong cùng năm, một nghiên cứu khác ở Trung Quốc công bố về hoạt tính chống

xơ gan do rượu gây ra của cao trích nước nóng từ củ TTB Thử nghiệm được thực hiện trên chuột Kết quả cho thấy, với hàm lượng 50 mg/kg, cao trích thể hiện hoạt tính lên đến 35,7% [13]

Năm 2008, bằng cách sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào, sự ức chế

tế bào ung thư lan rộng đã được thử nghiệm đối với bốn trích xuất từ thân, hoa, quả và

củ ở mức 0,05-1,0 mg/mL Cao trích từ hoa có tác dụng mạnh hơn so với ba bộ phận còn lại; ở mức 1,0 mg/mL có khả năng ức chế 93,1% sự tăng trưởng tế bào Ảnh hưởng của dung môi trích ly đến chu trình tế bào và sự rụng chết tế bào ung thư đại trực tràng (Human Colorectal Cancer cell lines – SW480) cũng được đánh giá để

so sánh, đối chiếu [14]

1.2.2 Trong nước

Năm 2016, bằng các phương pháp phân lập sắc ký và phân tích khối phổ, cộng hưởng từ hạt nhân thu được năm hợp chất saponin bao gồm ginsenoside Rc, Rd,

Re, Rb1 và Rg1 từ phân đoạn giàu saponin của củ tam thất ở vùng Tây Bắc

Từ phân đoạn saponin, phức hợp phytosome – saponin được tổng hợp với hiệu suất 88,76% Đây là công bố đầu tiên trong nước về nghiên cứu điều chế phức phytosome – saponin TTB [15]

Nghiên cứu về khả năng ngăn ngừa ung thư của phức hợp saponin – phospholipid Giá trị nồng độ ức chế 50% (The half maximal Inhibitory Concentration – IC50) của phức hợp saponin – phospholipit đối với tế bào ung thư phổi (Human Lung Cancer cell line – NCI-H460), ung thư vú (Human Breast Cancer cell lines – BT474) lần lượt là 28,47 và 53,18 mg/mL IC50 của trích xuất saponin đối với NCI-H460 47,97 mg/mL

và BT474 86,24 mg/mL [16]

Các nghiên cứu về TTB tại Việt Nam rất ít, mặc dù đây là một trong các loại thảo dược quý và chủ yếu do truyền miệng trong dân gian Các tác dụng có lợi của TTB có thể kể đến như ức chế phản ứng α-glucosidase hóa và khả năng gây độc tế bào của nhiều loại ung thư khác nhau

11

1.3 Ứng dụng của cao trích củ TTB

Hiện nay, có khá nhiều nghiên cứu về tác dụng của ginsenoside được trích ly hoặc phân lập từ TTB và các loài khác thuộc chi sâm như nhân sâm đỏ, sâm Cao Ly, sâm Ngọc Linh,… Có thể kể đến những ứng dụng như khả năng kháng tiểu đường và ung thư

1.3.1 Kháng tiểu đường

1.3.1.1 Bệnh tiểu đường

Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), tiểu đường

là một hội chứng có đặc tính biểu hiện như tăng hàm lượng glucose trong máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin [17]

Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ đã đưa ra một định nghĩa khác về tiểu đường:

“Tiểu đường là một hội chứng rối loạn mãn tính, có những thuộc tính sau: tăng glucose máu, kết hợp với những bất thường về chuyển hóa cacbohydrat, lipit và protein;

bệnh luôn gắn liền với xu hướng phát triển bệnh lý về thận, mắt, thần kinh và các bệnh tim mạch khác” [18]

Theo Hiệp hội đái tháo đường thế giới (International Diabetes Federation – IDF), insulin có nhiệm vụ vận chuyển glucose từ trong máu vào nội bào hoặc dự trữ ở gan

Sự thiếu hụt hoặc hoạt động không hiệu quả của insulin ở người bị tiểu đường có nghĩa là glucose vẫn lưu thông trong máu và không được vận chuyển vào nội bào Theo thời gian, hàm lượng glucose trong máu cao (được gọi là tăng đường huyết) gây tổn thương nhiều mô trong cơ thể, dẫn đến sự phát triển của các biến chứng khác [19]

Về phân loại, tiểu đường được chia thành 3 nhóm chính: tiểu đường tuýp 1, tuýp 2

và tiểu đường thai kì

Nguyên nhân gây bệnh là do khiếm khuyết gen liên quan đến hoạt tính của insulin; các bệnh tụy ngoại tiết như viêm tụy, chấn thương, hội chứng Cushing, cường năng tuyến giáp; do căng thẳng, do thuốc hoặc hóa chất, các thuốc điều trị HIV như pentamidine, thuốc kháng viêm nhóm corticoid, [20]

12

Hiện nay, số người mắc bệnh tiểu đường đang tăng lên với tốc độ báo động không những ở các quốc gia phát triển mà cả các quốc gia đang phát triển Đây là mối đe dọa tiềm ẩn của các bệnh rối loạn trao đổi chất và tim mạch trong tương lai Theo IDF, năm 2015, trên thế giới có khoảng 415 triệu người mắc bệnh tiểu đường và con số này có thể tăng đến 642 triệu người vào năm 2040 Có nghĩa là vào năm 2015,

cứ trong 11 người lớn sẽ có 1 người mắc bệnh và năm 2040 tỉ lệ mắc bệnh là 1/10 Cũng theo tổ chức này thì tỉ lệ mắc bệnh tiểu đường ở các nước châu Á Thái Bình Dương là cao nhất so với các khu vực khác, một nửa trong số những người mắc bệnh

đã

không được chẩn đoán đúng bệnh ngay từ đầu

Ở Việt Nam, số lượng người mắc bệnh tiểu đường đang có chiều hướng gia tăng với mức độ đáng báo động Theo thống kê vào năm 2017, hơn 3,5 triệu người mắc bệnh tiểu đường ở Việt Nam, cao nhất Đông Nam Á và dự đoán con số này sẽ tăng lên 6,1 triệu người vào năm 2040 Trong 10 năm qua, tỉ lệ gia tăng số ca mắc tiểu đường tại Việt Nam lên đến 211%, trong khi trên toàn thế giới chỉ tăng khoảng 70% Trong

đó, gần 70% số người mắc bệnh tiểu đường không được chẩn đoán Việt Nam nằm trong số các quốc gia thu nhập thấp và trung bình, chịu nhiều tác động xấu từ bệnh tiểu đường, nhiều bệnh nhân đang phải chịu những gánh nặng về kinh tế do chi phí rất lớn

để

điều trị bệnh [21]

Chính vì những lý do trên nên việc tìm ra các phương thuốc điều trị tiểu đường

đang được quan tâm Việc thử nghiệm in vitro được thực hiện khá phổ biến trong các

nghiên cứu thông qua hình thức ức chế enzyme α-glucosidase

1.3.2.2 Cơ chế ức chế enzyme α-glucosidase

Đa số đường trong thức ăn tiêu thụ hằng ngày đều ở dạng polysaccarit Tuy nhiên, ruột non chỉ hấp thu được đường ở dạng monosaccarit Vì vậy, quá trình thủy phân sẽ diễn ra 2 giai đoạn: đầu tiên enzyme α-amylase sẽ thủy phân các phân tử polysaccarit thành các oligosaccarit, sau đó enzyme α-glucosidase tại ruột non tiếp tục thủy phân các oligosaccarit thành các phân tử monosaccarit Các monosaccarit này sẽ được hấp thu ở ruột non, sau đó thẩm thấu vào máu Chức năng chính của các enzyme α-glucosidase trong quá trình thủy phân là xúc tác cho việc cắt đứt liên kết 1,4-α-D-

Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hóa polysaccarit vào máuNgoài ra, Rb1 còn thúc đẩy quá trình chuyển dịch vị trí GLUT1 (glucose transporter 1), GLUT4 (glucose transporter 4) lên thành tế bào, tạo điều kiện cho các phân tử glucose dễ dàng đi vào nội bào thông qua quá trình photphoryl hóa thụ thể IRS-1 (insulin-1), PI3K (photphatidylinositol 3 kinase) và Akt (Protein kinase B) Hơn nữa, Rb1 làm giảm sự sản sinh glucose bằng cách ngăn chặn sự biểu hiện của glucose-6-photphat và photphoenolpyruvate cacboxykinase [24, 25] Không giống như Rb1, Rg3 kích thích sự biểu hiện của IRS-1 và GLUT4 bằng con đường phiên mã Rg3 làm tăng quá trình phosphoryl hóa IRS-1 trong các sợi cơ, làm tăng cường tín hiệu PI3K và PKB (protein kinase B) [26] Các quá trình này được thể hiện ở hình 1.5

Mạch máu

14

Hình 1.5 Quá trình tăng cường sự hấp thu glucose vào nội bào [25]

Do đó, trong luận văn này, sử dụng cao trích từ củ TTB làm chất ức chế enzyme α-glucosidase để thử nghiệm khả năng kháng tiểu đường

Ngoài tiểu đường, các gốc tự do trong cơ thể cũng có thể hình thành nên các khối u ác tính, mà y học thường gọi là ung thư Đây là một trong những căn bệnh đang hoành hành hiện nay từ những nước đã phát triển lẫn các nước đang phát triển

1.3.2 Kháng ung thư

1.3.2.1 Bệnh ung thư

Ung thư là tên gọi của một nhóm các bệnh có liên quan đến sự phân chia tế bào một cách vô tổ chức, không kiểm soát được và các tế bào này xâm lấn các tế bào,

mô bình thường khác xung quanh qua hệ thống bạch huyết hoặc mạch máu

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Theo cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế ước tính đã phát hiện có khoảng 14,1 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu ca tử vong vào năm 2012, với 27 loại ung thư khác nhau Các con số này sẽ tăng lên 23 triệu ca mắc mới và 10 triệu tử vong vào năm 2020 Khoảng 70% các ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập trung bình và thấp, trong đó có Việt Nam [23, 24]

Theo thống kê của Viện nghiên cứu phòng chống ung thư, ước tính Việt Nam có khoảng 94 nghìn người chết vì ung thư/năm, tỷ lệ tử vong do ung thư đứng thứ 78/172 quốc gia được điều tra, xếp vào nhóm những nước có số ca ung thư nhiều thứ hai trên thế giới như thể hiện ở hình 1.6 Bên cạnh đó, vấn đề đáng lo ngại là số người mắc

15

bệnh ung thư ở Việt Nam đang có xu hướng ngày một tăng nhanh, từ 68 nghìn ca năm

2000 lên 126 nghìn ca năm 2010 và dự kiến sẽ vượt 190 nghìn ca vào năm 2020

Hình 1.6 Nhóm các nước có số ca mắc bệnh ung thư trên thế giới

Tại Việt Nam, năm loại ung thư đứng hàng đầu trong tổng số ca mắc bệnh mới, đó

là ung thư gan (17,6%), ung thư phổi (17,5%), ung thư dạ dày (11,4%), ung thư vú (8,9%) và ung thư đại trực tràng (7%) Biểu đồ hình 1.7 thể hiện số ca mắc ung thư (năm 2014) [23]

Hình 1.7 Thống kê của WHO về tình hình mắc ung thư ở Việt Nam

Lịch sử phát hiện và chẩn đoán ung thư đã trải qua nhiều năm, từ việc chẩn đoán lâm sàng: nhìn, sờ, nghe,… đến cận lâm sàng: chẩn đoán tế bào học trên kính hiển vi thường có độ phóng đại lớn, đến kính hiển vi điện tử có độ phóng đại gấp hàng nghìn lần so với kính hiển vi quang học thường Ngày nay, có nhiều phương tiện hỗ trợ cho

Vú Phổi Gan Cổ tử

cung

Dạ dày

16

chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao, cho phép tiếp cận với hầu hết các bộ phận trong

cơ thể và các khối u nằm sâu trong các nội tạng như siêu âm, phương pháp chẩn đoán

y học hạt nhân: chụp cắt lớp phát xạ đơn photon (Single Photon Emission Computer Tomography – SPECT), chụp cắt lớp phát xạ (Positron Emission Tomography – PET), quét cắt lớp vi tính (Computed Tomography scan – CT scan), chụp cộng hưởng từ hạt nhân (Magnetic Resonance Imaging – MRI) và nội soi Xuyên suốt bề dày lịch sử phát triển ấy, con người ngày càng chủ động trong lĩnh vực chẩn đoán sớm ung thư

Về phương pháp điều trị, hiện nay, ung thư được điều trị bằng các hình thức khác nhau tùy tình trạng bệnh:

 Phẫu thuật loại bỏ khối u chỉ mang lại hiệu quả khi khối u còn nhỏ và chưa

di căn

 Xạ trị là phương pháp sử dụng chùm tia xạ năng lượng cao như tia X hay tia proton để giết chết tế bào ung thư, chùm tia xạ trực tiếp vào phổi bị ung thư bằng một máy chiếu xạ ngoài cơ thể hoặc đặt nguồn phát xạ trong một cây kim hay một ống luồn và đặt vào gần khối u trong cơ thể

vào cơ thể thông qua một tĩnh mạch ở tay hoặc thuốc viên để uống Hóa trị thường được

sử dụng sau khi phẫu thuật để giết chết các tế bào ung thư còn sót lại Ngoài ra, phương pháp này cũng có thể được sử dụng trước khi phẫu thuật để làm khối u teo nhỏ lại, giúp cho việc phẫu thuật cắt bỏ khối u sẽ dễ dàng hơn

không thể điều trị được bằng những phương pháp trên Các phương pháp này bao gồm chăm sóc bệnh nhân, làm giảm đau, Đặc biệt, trong giai đoạn này, bệnh nhân thường tìm đến các loại thảo dược thiên nhiên như linh chi, TTB, đảng sâm, rong nâu, đông trùng hạ thảo, oliu, vì những loại này được nghiên cứu là có khả năng kháng ung thư Trong đó, TTB với hoạt chất ginsenoside có một số nghiên cứu về

cơ chế kháng ung thư

1.3.3.2 Cơ chế

17

Rb1 kích hoạt tiểu đơn vị thụ thể estrogen ER (ER-β) để tăng cường sản sinh các yếu tố có nguồn gốc biểu mô sắc tố PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) bằng cách tạo các chất kích hoạt phiên mã vào chất kích thích PEDF Sự tiết PEDF

ức chế sự hình thành ống trong các tế bào nội mô [29] CYP1A1 (Cytochrome P450 1A1) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa các hợp chất hóa học nội sinh và ngoại sinh Sự kích hoạt phiên mã của CYP1A1 thông qua bởi AhR (aryl hydrocacbon thụ thể) liên kết với các yếu tố thúc đẩy CYP1A1 Rb1 giúp cải thiện hoạt động của CYP1A1 bằng cách tăng cường hoạt động của AhR [30, 31] Do

đó,

ngăn cản được sự di căn của các tế bào ung thư Cơ chế này được thể hiện ở hình 1.8

Hình 1.8 Cơ chế kháng ung thư của Rb1 [25]

Rg3 được nghiên cứu là một chất có tác dụng rõ rệt lên các tế bào ung thư hơn so với các ginsenoside khác bởi vì Rg3 là chất ít phân cực

Liệu pháp điều trị ung thư được áp dụng để tiêu diệt các tế bào ung thư và ngăn chặn sự di căn Các tế bào ung thư liên tục trốn tránh sự điều trị này bằng cách kích hoạt

liên tục của yếu tố phiên mã NF-κB (Nuclear Factor-kappa B) NF-κB quy định nhiều gen tham gia vào tế bào tăng sinh, xâm lấn, tạo mạch, di căn, ức chế sự rụng chết tế

Ngăn cản di căn

18

bào theo chương trình và kháng trị trong khối u NF-κB bị ức chế bởi IκB và thường được cô lập trong tế bào chất Khi các tế bào tiếp xúc với kích thích ngoại bào, IκB bị thoái hóa, sau quá trình phosphoryl hóa, NF-κB có thể chuyển đến nhân, kích hoạt

sự phiên mã của một loạt các ADN trong tế bào ung thư phổi, dẫn đến sự lan rộng của các khối u Tuy nhiên, Rg3 có thể ức chế hoạt động của NF-κB này một cách đáng kể, dẫn đến ức chế sự phát triển của khối u [32, 33] Quá trình này được thể hiện ở hình 1.9

Hình 1.9 Cơ chế kháng ung thư của Rg3 [25]

Cũng theo hình 1.9, trong ung thư biểu mô tế bào gan, Rg3 thể hiện vai trò bảo vệ thông qua quá trình rụng chết tế bào theo chương trình qua trung gian caspase 3 và 9 bằng cách thay đổi biểu hiện BAX và BCL-2 để cho phép giải phóng cytochrome C Ngoài ra, bằng cách ức chế hoạt hóa NF-κB, Rg3 làm giảm biểu hiện của Ki67 – một protein hạt nhân được biểu hiện trong các giai đoạn chu kỳ tế bào, cụ thể là các pha S, G1, G2, M, yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu và CD34, dẫn đến

sự rụng chết tế bào ung thư [10, 34]

Các hoạt chất Rb1 và Rg3 chỉ mới được nghiên cứu về khả năng chống ung thư trong những năm gần đây Nhưng từ ngày xưa, con người đã sử dụng TTB như

Caspase 3

Di căn

Sự rụng chết tế bào theo chương trình

20

1.4 Phương pháp trích ly

Với sự phong phú và đa dạng của các chủng loại dược liệu thiên nhiên ở Việt Nam, hiện nay có một số nghiên cứu trích ly các hoạt chất phục vụ cho nghiên cứu và công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm Có nhiều phương pháp khác nhau, nhưng cơ bản

có hai phương pháp chính là cổ điển và hiện đại

1.4.1 Phương pháp cổ điển

Các phương pháp ngâm trích, sắc nóng, ngấm kiệt, ngâm trích bằng dung môi hữu cơ, chưng cất lôi cuốn hơi nước hay Soxhlet đều là phương pháp cổ điển được con người áp dụng từ xa xưa Trong đó, hai phương pháp thường được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu là ngâm trích bằng dung môi hữu cơ và Soxhlet

1.4.2 Phương pháp hiện đại

Sự cải tiến trong nghiên cứu khoa học kỹ thuật dẫn đến nhiều phương pháp trích ly hoạt chất tự nhiên mới và hiện đại ra đời Có thể kể đến như trích ly có hỗ trợ

vi sóng, siêu âm, trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn, đặc biệt là phương pháp kết hợp giữa hóa học và sinh học là phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme

Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme (Enzyme-Assisted Extraction – EAE)

Enzyme là các chất xúc tác sinh học có bản chất protein do tế bào sống sản xuất Enzyme có khả năng tiếp xúc và tạo phức với cơ chất nhờ sự phù hợp cấu hình không gian, làm giảm năng lượng hoạt hóa đầu vào của phản ứng; cũng như

sự tự quay vòng xúc tác khi kết thúc một chu kì hoạt động Trong cơ thể sinh vật đồng thời xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học, enzyme chính là tác nhân sống còn giúp đảm bảo mọi hoạt động sống diễn ra nhanh chóng, hiệu quả Chính vì thế, cho đến nay, chưa tìm thấy một quá trình vật lý – hóa học nào trong tự nhiên hiệu quả hơn quá trình trích ly có sự tham gia của enzyme

sử dụng tùy vào loại cơ chất và bản chất quá trình xúc tác của phản ứng mà có

sự chọn lựa enzyme phù hợp Có thể kể đến như chế phẩm viscozyme (viscozyme L

và viscozyme Cassava C), pectinex (pectinex ultra SP-L, pectinex ultra AFP, pectinex ultra clear, pectinex smash XXL…), α-amylase (termamyl 120L, α-amylase) flavourzyme (flavourzyme 500 MG, flavourzyme 1000 L)… Hình ảnh các loại enzyme trên được thể hiện ở hình 1.11

Hình 1.11 Một số loại chế phẩm enzyme

Trong luận văn này, chế phẩm viscozyme L được sử dụng để hỗ trợ quá trình trích

ly ginsenoside Viscozyme L có dạng chất lỏng màu nâu sẫm, hoạt độ vào khoảng

700 EGU/g (EGU – endoglucanase unit là đơn vị hoạt tính enzyme cellulase, là lượng enzyme cần thiết đủ để xúc tác tạo ra sản phẩm khử được 1 μmol 3,5-dinitrosalicylic

22

axit (DNS) trong 1 phút) Thành phần của viscozyme L chủ yếu là cellulase: endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4); ngoài ra còn có arabanase, hemicellulase, xylanase Endo-β-1,4-glucanase xúc tác phản ứng loại đường khử từ giữa phân tử cellulose ở các vị trí liên kết β-1,4-glycosidic như thể hiện ở hình 1.12 [44]

Hình 1.12 Vị trí cắt của endo-β-1,4-glucanase trên mạch cellulase

 Các nghiên cứu về trích ly bằng phương pháp có hỗ trợ enzyme

Trong những năm gần đây, enzyme được đưa nhiều vào những nghiên cứu ở quy mô PTN

Năm 2001, hiệu suất trích ly hợp chất phenolic và chất lượng sản phẩm dầu oliu được cải thiện khi bổ sung hỗn hợp enzyme olivex:novoferm 12 (tỉ lệ 1:1 (v/v)) [35] Trong cùng năm, năm loại enzyme grindamyl pectinase, macer8 FJ, macer8 R, pectinex BE và novozyme 89 protease được nghiên cứu Các loại enzyme này đều làm tăng

hiệu suất trích ly anthocyanin và phenol từ quả lý chua đen từ 1,5-1,6 lần so với mẫu đối chứng [36]

Năm 2004, nhóm nghiên cứu ở Thổ Nhĩ Kỳ đã sử dụng cellulase và pectinase nghiên cứu quá trình trích ly carotenoid từ vỏ cam, khoai lang và củ cải đỏ làm tăng chất lượng màu sắc của dịch trích [37] Năm 2006, một nghiên cứu khác về quá trình trích ly hợp chất phenolic trong vỏ cam, chanh và quýt bằng cách

bổ sung celluzyme MX, xác định hàm lượng phenolic thông qua phương pháp Folin–Ciocalteu Kết quả cho thấy, hiệu suất tăng hơn 65,5% so với khi không

sử dụng enzyme [38]

Vị trí cắt

pectase để hỗ trợ trích ly polysacarit từ Ophiocordyceps sobolifera Nghiên cứu sử

dụng quy hoạch thực nghiệm, phương pháp bề mặt đáp ứng với mô hình Box-Behnken thu được điều kiện trích ly: nồng độ enzyme 1,5%, thủy phân ở 49oC, trong 150 phút,

ở pH 4,8 và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 Theo điều kiện này, lượng polysacarit thu được tăng 4,11% so với không sử dụng enzyme [41]

 Ưu điểm

Sử dụng enzyme trong trích ly hoạt chất có nhiều ưu điểm nổi bật như tăng tốc độ phản ứng, làm giảm thời gian trích ly, có tính chọn lọc cao đối với từng loại thành tế bào, giảm thiểu lượng dung môi sử dụng, tăng hàm lượng và chất lượng hoạt chất Sử dụng enzyme là một biện pháp xanh trong công nghệ trích ly [42, 43]

 Nhược điểm

Mặc dù có thể hạn chế được lượng dung môi độc hại nhưng chi phí cho việc sử dụng enzyme khá đắt tiền nên vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi trong CN Ngoài ra, enzyme chỉ hoạt động tối ưu trong một khoảng nhiệt độ nhất định, ngoài nhiệt độ tối

ưu, enzyme sẽ không hoạt động tốt hoặc chết làm ảnh hưởng đến quá trình trích ly hoạt chất [43]

Trong luận văn này, phương pháp bổ sung enzyme được nghiên cứu, cụ thể là chế phẩm viscozyme L được sử dụng để hỗ trợ cho quá trình trích ly ginsenoside từ

củ TTB Đây là một hướng nghiên cứu mới, áp dụng những phương pháp trích ly hiện đại vừa nâng cao chất lượng cao trích, vừa thân thiện môi trường và an toàn với người

sử dụng

1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

1.5.1 Tính cấp thiết

24

Mặc dù hướng nghiên cứu về TTB khá phổ biến trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Á, Nam Á Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ liên quan đến việc xác định thành phần, còn hàm lượng cũng như đánh giá hoạt tính sinh học của cao trích chưa được nghiên cứu nhiều đối với củ TTB Việt Nam

Bên cạnh đó, sự phát triển của khoa học công nghệ làm hàng loạt các phương pháp trích ly mới ra đời, thay thế các phương pháp truyền thống thường được áp dụng từ

xa xưa Việc nghiên cứu về các công nghệ trích ly này còn khá hạn hẹp ở Việt Nam cũng như trên thế giới Một trong những phương pháp đầy tiềm năng đang được hướng tới là sử dụng enzyme để hỗ trợ trích ly hoạt chất tự nhiên

Việc nghiên cứu trích ly hoạt chất ginsenoside từ củ TTB là việc làm cần thiết nhằm tạo hướng nghiên cứu mới về công nghệ trích ly hoạt chất tự nhiên bằng enzyme Đồng thời, nâng cao giá trị kinh tế của cây TTB được trồng ở Việt Nam và tạo tiền đề cho việc ứng dụng các hoạt chất quý để sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm có tác dụng phòng ngừa và điều trị các bệnh lý thường gặp như tiểu đường và ung thư

Chính vì thế, đề tài luận văn: “Nghiên cứu trích ly hoạt chất ginsenoside từ

củ tam thất bắc bằng phương pháp có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích” đã được chọn và nghiên cứu

 Nội dung 1: khảo sát điều kiện trích ly ginsenoside (Rb1 và Rg3) từ củ TTB;

 Nội dung 2: thử nghiệm hoạt tính sinh học: kháng tiểu đường và ung thư của cao trích có hàm lượng ginsenoside (Rb1 và Rg3) cao ở nội dung 1

1.5.4 Phương pháp nghiên cứu

1.5.4.1 Khảo sát điều kiện trích ly

a Ảnh hưởng của từng yếu tố

Theo mô hình Box – Wilson, phương trình hồi quy thể hiện ở phương trình (1.1) :

∑ ∑ ∑ ∑ (1.1) trong đó là hàm lượng Rb1 và Rg3 đạt cao nhất, là hằng số, , , lần lượt là

hệ số tuyến tính bậc 1, bậc 2 và tương tác đôi, là biến mã hóa độc lập, , lần lượt đại diện cho biến mã hóa bậc 2 và tương tác đôi [45, 46]

Có 20 thí nghiệm và được thiết kế với ba yếu tố độc lập, mã hóa pH là , nhiệt độ (oC) là , thời gian thủy phân (phút) là như trình bày ở bảng 1.3 Tất cả các biến độc lập được mã hóa ở năm mức độ -α, -1, 0, +1, +α