Du lịch đã dần thay đổi chất lượng cơ sở hạ tầng địa phương như đường giao thông, phương tiện vận chuyển kết nối đảo Quan Lạn với thị trấn Cái Rồng và đường bộ kết nối các thôn trong đảo[r]
Trang 1Tính đa hình và đặc điểm nhân trắc ở các nhóm kiểu gen của
đa hình nucleotide đơn rs6548238 gen TMEM18 ở trẻ tiểu học
Miền Bắc, Việt Nam
Lê Thị Tuyết, Dương Thị Anh Đào *
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 136 Xuân Thủy, Hà Nội, Việt Nam
Nhận ngày 10 16 tháng 10 12 năm 20142016 Chỉnh sửa ngày 30 16 tháng 10 02 năm 20142017; Chấp nhận đăng ngày 20 2 24 tháng 11 03 năm 2017
Tóm tắt Ở người, protein TMEM18 (Transmembrane protein 18) có vai trò trong quá trình di
cư của tế bào tiền thần kinh qua các nhân tố tiết u thần kinh đệm Sự biểu hiện mạnh của gen
TMEM18 làm tăng quá trình di cư của các tế bào tiền thần kinh Đa hình đơn nucleotide (SNP) rs6548238 nằm ở vùng điều hòa gần gen TMEM18, SNP này là kết quả của sự thay thế nucleotide
T cho C trên mạch ADN Mối liên quan giữa SNP rs6548238 với các bệnh tật ở người đang đượcnghiên cứu rộng rãi ở các nước phát triển
Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định tần số alen và tỷ lệ kiểu gen của SNP rs6548238 ở trẻ
có tình trạng dinh dưỡng bình thường, đồng thời xác định một số đặc điểm nhân trắc của trẻ ở cácnhóm kiểu gen khác nhau Nghiên cứu được tiến hành trên 478 trẻ tại một số trường tiểu học HàNội, thành phố Thái Nguyên và thành phố Hải Dương Tình trạng dinh dưỡng của trẻ được xácđịnh theo tiêu chuẩn của WHO 2007 và IOTF 2000
Kết quả cho thấy: alen C của SNP rs6548238 là alen có tần số cao trong quần thể (tần số =0,952) và tỷ lệ kiểu gen và alen ở quần thể nghiên cứu tuân theo quy luật cân bằng Hardy -
Weinberg (P = 0,059) Khi phân tích các chỉ số nhân trắc ở các nhóm kiểu gen cho thấy: chỉ số BMI có xu hướng khác biệt giữa các nhóm kiểu gen (P = 0,082), trong đó trẻ có kiểu gen C/C có
chỉ số BMI trung bình cao nhất (15,5), tiếp theo là trẻ dị hợp C/T (15,1) và trẻ đồng hợp T/T có chỉ
số BMI thấp nhất (14,4)
Từ khóa: Gen TMEM18, rs6548238, trẻ em, miền Bắc.
1 Mở đầu
Ở người, gen TMEM18 (Transmembrane
protein 18) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 2,
mã hóa cho protein xuyên màng TMEM18 có
vai trò quan trọng trong sự di cư tế bào gốc
thần kinh [1] TMEM18 biểu hiện ở nhiều cơ
quan, trong đó mạnh nhất là ở vùng dưới đồi
và tuyến yên [2]
Tác giả liên hệ ĐT: 84-988081161.
Email: phamquangtuan@hus.edu.vn
TMEM18 lần đầu tiên được chứng minh là
một locus quan trọng liên quan đến béo phì ởngười vào năm 2009 qua kết quả của Zhao và
cs [3] nghiên cứu trên 4.951 trẻ và Willer cùng
cs [4] nghiên cứu trên 32.387 người béo phì và59.082 người bình thường Từ đó đến nay đã
có rất nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa
gen TMEM18 với các bệnh tật ở người Theo
cơ sở dữ liệu HuGE Navigator [5], tính đếntháng 5/2016 đã có 30 bệnh được báo cáo liên
quan đến gen TMEM18, trong đó, số lượng các
Trang 2Công nghệ, Tập 3033, Số 6S 1 (20142017) 195 -10 0
báo cáo về mối liên quan với việc tăng cân hay
giảm cân của cơ thể là nhiều nhất với khoảng
80 báo cáo
Rs6548238 là đa hình đơn nuclêotit (SNP)
nằm gần TMEM18, có thể ảnh hưởng đến quá
trình phiên mã của gen TMEM18 do ảnh
hưởng đến sự kết hợp của các nhân tố phiên
mã [6] SNP này là một trong những SNP đầu
tiên ở gen TMEM18 được phát hiện liên quan
đến béo phì vào năm 2009 trong nghiên cứu
của Zhao và cs [3] và là SNP có số lượng
nghiên cứu liên quan đến sự tăng cân, béo phì
nhiều nhất trong các năm tiếp theo
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của SNP
rs6548238 đến các bệnh ở người đến nay mới
chủ yếu thực hiện trên đối tượng người Châu
Âu và người da trắng Tuy nhiên, mức độ ảnh
hưởng đến bệnh lại không giống nhau giữa các
độ tuổi, giới tính và các quần thể người [5]
Gần đây, chúng tôi đã thành công trong
việc xây dựng quy trình xác định kiểu gen SNP
rs6538238 gen TMEM18 ở điều kiện phòng thí
nghiệm Việt Nam [7] Do đó, mục tiêu của
nghiên cứu này là áp dụng quy trình đã xây
dựng được để phân tích kiểu gen trên 478 trẻ
tiểu học có tình trạng dinh dưỡng bình thường,
từ đó xác định tần số alen, kiểu gen của SNP
này ở quần thể trẻ em Việt Nam, cũng như xác
định đặc điểm nhân trắc của trẻ ở các nhóm
kiểu gen
2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng của nghiên cứu là 478 trẻ em
tiểu học 6 - 11 tuổi có tình trạng dinh dưỡng
bình thường (nay gọi tắt là bình thường) tại Hà
Nội, Hải Dương và Thái Nguyên Đây là các
đối tượng được chọn theo kết quả điều tra sàng
lọc tại các trường tiểu học thuộc Hà Nội, thành
phố Hải Dương và thành phố Thái Nguyên,
được lấy từ đề tài Bộ Giáo dục và Đào tạo mã
số B2014-17-47 (thông tin thu thập vào năm2014)
Đề tài đã được Hội đồng Đạo đức ViệnDinh dưỡng và Hội đồng Y đức viện Vệ sinhdịch tễ Trung ương thông qua Bố mẹ của trẻtham gia nghiên cứu được cung cấp đầy đủthông tin về mục đích của nghiên cứu và cógiấy đồng ý tham gia nghiên cứu
2.2 Thu thập số liệu
Các chỉ số nhân trắc gồm tuổi, chiều cao,cân nặng, chu vi vòng eo, chu vi vòng hông,được đo theo phương pháp thường quy củaViện Dinh dưỡng Quốc gia Chiều cao đứngđược đo bằng thước đo chiều cao đứng bằng
gỗ (độ chính xác 0,1cm), kết quả tính bằng cm.Cân nặng được đo bằng cân điện tử SECA 890(Unicef) với độ chính xác 100g, kết quả tínhbằng kg Vòng eo, vòng hông được đo bằngthước dây, kết quả tính bằng cm
Trẻ được lấy 2 ml máu tĩnh mạch vào buổisáng sau khi nhịn đói ít nhất 8 giờ Kỹ thuậtviên lấy máu là chuyên viên lấy máu của bệnhviện Medlatec, bệnh viện Đa khoa Hải Dương
và Khoa Hóa Sinh, Đại học Y Thái Nguyên.Máu được bảo quản ở ống có tráng dung dịchchống đông EDTA (ethylene diamin tetraaceticacid), sau đó được chia vào các ống eppendorf1,5 ml và bảo quản ở tủ lạnh -800 C
2.3 Tiêu chuẩn xác định đối tượng nghiên cứu
- Tiêu chuẩn xác định trẻ có tình trạng dinh dưỡng bình thường: trẻ được xác định là
bình thường khi có tình trạng dinh dưỡng ởmức bình thường thoả mãn cả hai tiêu chuẩncủa Tổ chức Y tế thế giới (World HealthOrganization, WHO) năm 2007 và Tổ chứchành động vì béo phì quốc tế (The InternatinalObesity Task Force, IOTF) năm 2000 [8].Theo tiêu chuẩn WHO 2007 sử dụng Z-score
Trang 3BMI theo tuổi và giới: ngưỡng từ -2SD đến
+1SD [9] Tiêu chuẩn IOTF 2000 đưa ra các
ngưỡng xác định tình trạng dinh dưỡng cho trẻ
từ 2-18 tuổi, tương đương với ngưỡng đối với
tình trạng bình thường và béo phì sử dụng cho
người lớn (18,5≤BMI<25 kg/m ) [10] 2
- Tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu
là những trẻ đang mắc bệnh cấp tính, mãn tính
2.4 Phương pháp xác định kiểu gen
- Tách chiết ADN: Tổng số ADN ở 300 μll
máu toàn phần được tách bằng bộ kit
Winzard® Genomic DNA Purification (Promega
Corporation, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất
- Phương pháp RFLP-PCR: Phương pháp
xác định kiểu gen đã được trình bày ở công bố
gần đây [7]
2.5 Phân tích số liệu thống kê
Số liệu được nhập và kiểm tra bằng phần
mềm EpiData Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
được biểu diễn theo trung bình ± độ lệch chuẩn
đối với các biến định lượng hoặc tần số (%)
đối với các biến định tính Tần số các alen và
kiểu gen genotype được trình bày theo bảng số
liệu Quy luật Hardy-Weinberd-Equilibrium về
sự phân bố kiểu gen trong quần thể được kiểm
định bằng Fisher exact test nhờ phần mềm
SNPstat Các phân tích thống kê được thực
hiện trên phần mềm SPSS 16.0 Ý nghĩa thống
kê được xác định với giá trị P<0,05 theo 2
phía
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
Các đặc điểm về tuổi, giới và những đặc
điểm nhân trắc của 478 đối tượng nghiên cứu
là 3,05kg
3.2 Tỷ lệ kiểu gen và alen của SNP rs6548238
ở trẻ tiểu học
Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của SNP
rs6548238 gen TMEM18 ở trẻ tiểu học được
trình bày trong bảng 2
Bảng 2 Phân bố alen và kiểu gen của SNP
rs6548238 ở trẻ tiểu học
Kết quả bảng 2 cho thấy: SNP rs6548238
có 2 alen (C và T), alen C là alen có tần số caotrong quần thể do đó, tỷ lệ trẻ mang kiểu gen
Đặc điểm
Giới tính nam (%) 65,6Tuổib (năm) 7,85 (6,85 - 8,96)Chiều caoc (cm) 124,5 (123,7 - 125,3)Cân nặngb (kg) 23,4 (20,9 - 27,2)BMIb (kg/m2 ) 15,3 (14,5 - 16,5)Chu vi vòng eob (cm) 53,0 (50,0 - 56,5)Chu vi vòng hôngb (cm) 63,0 (59,9 - 67,5)
Tỷ lệ eo/hônga 0,85 ± 0,06Cân nặng sơ sinh (kg) b 3,05 (3,00 - 3,40)
Kiểu gen
C/C 435 (91,0%) C/T 40 (8,4%)
Trang 4Công nghệ, Tập 3033, Số 6S 1 (20142017) 195 -10 0
CC chiếm đa số (91%) còn trẻ đồng hợp TT có
tỷ lệ thấp (0,6%) Tỷ lệ kiểu gen và alen ở
quần thể nghiên cứu đều tuân theo quy luật cân
bằng Hardy - Weinberg (P = 0,059), điều này
chứng tỏ quần thể nghiên cứu có tính đại điện
cao
Vì tỷ lệ kiểu gen và alen của quần thể
nghiên cứu đều tuân theo quy luật Hardy –
Weinberg nên chúng tôi tiến hành phân tích so
sánh tần số alen C ở quần thể trẻ tiểu học miền
Bắc Việt Nam (trong nghiên cứu này) với tần
số alen C ở các quần thể khác trên thế giới –
với số liệu được lấy từ cơ sở dữ liệu quốc tế
HapMap [11] Hình 1 là biểu đồ thể hiện biểu
đồ kết quả so sánh Quần trẻ miền Bắc Việt
Nam trong nghiên cứu này được ký hiệu là
NVC (Children in North Vietnam)
Kết quả cho thấy: tần số alen của quần thể
trẻ em Miền Bắc Việt Nam tương đương với
quần thể người Hán Trung Quốc ở Bắc Kinh
(Han Chinese in Beijing, CHB) (có tần số là
0,929)
Hình 1 Tần số alen C ở các quần thể trên thế giới
Chú thích:
ASW: Người gốc Châu Phi sống ở Tây Nam Hoa Kỳ;
CEU: Người gốc Bắc và Tây Châu Âu sống ở Utah Mỹ; CHB: Người Hán ở Bắc Kinh Trung Quốc;
GIH: Người gốc Gurarat Ấn Độ sống ở Texas Mỹ; JPT: Người Nhật ở Tokyo, Nhật Bản;
MEX: Người gốc Mexico sống ở Los Angeles, Mỹ; TSI: Người Tuscan ở Italia;
YRI: Người Yoruban ở Inbadan, Nigeria;
NVC: Trẻ em Miền Bắc, Việt Nam.
3.3 Đặc điểm nhân trắc của trẻ ở các nhóm kiểu gen SNP rs6548238
Các đối tượng nghiên cứu thuộc các nhómkiểu gen của SNP rs6548238 được phân tích
về những đặc điểm nhân trắc (chiều cao, cânnặng, BMI, vòng eo, vòng mông, tỷ lệeo/mông), cân nặng sơ sinh Kết quả được thểhiện ở bảng 3
Bảng 3 Đặc điểm nhân trắc ở các nhóm kiểu gen của SNP rs6548238 ở trẻ tiểu học
Đặc điểm C/C (n = 435) C/T (n = 40)Kiểu gen T/T(n = 3) P
Các biến tuân theo phân phối chuẩn được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, P - value
nhận được từ kiểm định One - Way ANOVA test.
b
Các biến không tuân theo phân phối chuẩn được biểu diễn bằng trung vị và 25th 75th percentile, P
-value nhận được từ kiểm định Kruskall - Wallis test.
c
Các biến không tuân theo phân phối chuẩn được biểu diễn bằng trung bình nhân (95%CI), P - value nhận
được từ kiểm định One - Way ANOVA test.
Trang 5Kết quả bảng 3 cho thấy chỉ số BMI có
xu hướng khác biệt giữa các nhóm kiểu gen
(P = 0,082), trong đó trẻ có kiểu gen C/C có
chỉ số BMI trung bình cao nhất (BMI trung
bình = 15,5 kg/m2 ) và trẻ đồng hợp T/T có
chỉ số BMI thấp nhất (BMI trung bình =
14,4 kg/m2 )
Gen TMEM18 nằm trên NST số 2 ở vị
trí p25.3, là gen có tính bảo tồn cao giữa các
loài Protein TMEM18 là một protein nhỏ,
gồm khoảng 140 acid amin, liên quan đến
sự di cư của tế bào gốc thần kinh, ngoài ra
TMEM18 còn tham gia vào việc điều tiết
nội cân bằng năng lượng, vì nó được phát
hiện trong phần lớn tế bào thần kinh ở
những vùng não liên quan đến điều hoà ăn
uống [2] Tuy nhiên, cơ chế phân tử về sự
hoạt động của protein này trong điều hòa
năng lượng vẫn chưa được làm sáng rõ
Nghiên cứu trên chuột đã chứng minh được
mối tương quan chặt giữa mức độ biểu hiện
của gen TMEM18 ở vùng vỏ não trước trán
với khối lượng chuột [6] Những nghiên cứu
trên người mới dừng ở những báo cáo về
mối liên quan của biến dị gen TMEM18 và
bệnh qua nghiên cứu bệnh chứng [12, 13]
SNP rs6548238 nằm cách gen TMEM18
khoảng 30kb về phía đầu 3’ SNP này có thể
ảnh hưởng đến quá trình sao mã của gen
TMEM18 do ảnh hưởng đến sự kết hợp của
các nhân tố sao mã hoặc nhân tố cùng điều
hòa quá trình sao mã, tuy nhiên cơ chế cụ
thể của quá trình này hiện vẫn chưa biết [6]
Nghiên cứu trên người cho thấy SNP này
liên quan đến béo phì và đặc điểm nhân trắc
của trẻ em Châu Âu [14], Thụy Điển [2], Hy
Lạp [6]
Kết quả của nghiên cứu trên trẻ tiểu học
Miền Bắc cho thấy SNP rs6548238 có thể
ảnh hưởng đến BMI của trẻ, tuy nhiên để
xác định mức độ ảnh hưởng của SNP nàytới các tính trạng nhân trắc của trẻ cần tiếnhành thêm nghiên cứu bệnh chứng hoặcnghiên cứu thuần tập (nghiên cứu theo dõitheo thời gian)
4 Kết luận
Nghiên cứu về tần số alen và kiểu gen của
SNP rs6548238 gen TMEM18 trên 478 trẻ em
tiểu học 6 - 11 tuổi tại Hà Nội, Hải Dương vàThái Nguyên cho kết quả: SNP rs6548238 có 2alen (C và T), alen C là alen có tần số caotrong quần thể (=0,952) Tỷ lệ kiểu gen và alen
ở quần thể nghiên cứu tuân theo quy luật cân
bằng Hardy - Weinberg (P = 0,059), điều này
chứng tỏ quần thể nghiên cứu có tính đại điệncao Khi phân tích các chỉ số nhân trắc ở cácnhóm kiểu gen cho thấy: chỉ số BMI có xu
hướng khác biệt giữa các nhóm kiểu gen (P =
0,082), trong đó trẻ có kiểu gen C/C có chỉ sốBMI trung bình cao nhất (15,5), tiếp theo là trẻ dịhợp C/T (15,1) và trẻ đồng hợp T/T có chỉ sốBMI thấp nhất (14,4)
Lời cảm ơn
Nghiên cứu được sự tài trợ của Sở Khoahọc công nghệ Hà Nội với đề tài mã số 01C-08/05-2011-2 và sự tài trợ của Bộ Giáo dục vàđào tạo với đề tài mã số B2014-17-47
Tài liệu tham khảo
[1] J Jurvansuu, Y Zhao, S Y Doreen, et al.,
Transmembrane Protein 18 Enhances the Tropism of Neural Stem Cells for Glioma Cells, Cancer Res June 15 (2008) 68.
[2] M S Almén, J A Jacobsson, J H Shaik, et
al., The obesity gene, TMEM18, is of ancient
origin, found in majority of neuronal cells in all major brain regions and associated with obesity
in severely obese children, BMC Med Genet (2010) 58.
Trang 6Công nghệ, Tập 3033, Số 6S 1 (20142017) 195 -10 0
[3] J Zhao, J P Bradfield, M Li, et al., The role
of obesity-associated loci identified in
genome-wide association studies in the determination of
pediatric BMI, Obesity (Silver Spring) 17 (12)
(2009) 2254
[4] C J Willer, E K Speliotes, R J Loos, et al.,
Six new loci associated with body mass index
highlight a neuronal influence on body weight
regulation, Nat Genet 41(1) (2009) 25.
Moschonis, et al., Association of TMEM18
variants with BMI and waist circumference in
children and correlation of mRNA expression in
the PFC with body weight in rats, Eur J Hum
Genet 20 (2) (2012) 192.
[7] L.T.Tuyet, T.Q.Binh, D.T.Dao và cs.,
Application of restriction fragment leghth
polymorphirm method for genotyping TMEM18
rs6548238 polymorphism, Journal of biology 37
[10] J.C Tim, C.B Mary, et al., Establishing a
standard definition for child overweight and
obesity worldwide: international survey, BMJ
320 (2000) 1.
[11] HapMap, 2016 http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov
/cgi- perl/snp_details_phase3?name=rs6548238
&source=hapmap28_B36&tmpl=snp_details_ph
ase3 (tra cứu ngày 15/10/2015)
[12] K Hotta, M Nakamura, T Nakamura, et al.,
Association between obesity and polymorphisms
in SEC16B, TMEM18, GNPDA2, BDNF, FAIM2
and MC4R in a Japanese population, J Hum
Genet 54(12) (2009) 727
[13] J Wang, H Mei, W Chen, et al., Study of eight
GWAS-identified common variants for
association with obesity-related indices in
Chinese children at puberty, Int J Obes (Lond),
36(4) (2012) 542.
[14] A Hinney, C Vogel, J Hebebrand, From
monogenic to polygenic obesity: recent
advances, Eur Child Adolesc Psychiatry 19(3) (2010) 297.
Trang 7Polymorphism and anthropometric characteristics in genotype
groups of single nucleotide polymorphism rs6548238
TMEM18 gene in North Vietnamese children school
Le Thi Tuyet, Duong Thi Anh Dao
Hanoi National University of Education, 136 Xuan Thuy, Hanoi, Vietnam
Abstract In human, TMEM18 protein (Transmembrane protein 18) is involved in the migratory
response of neural precursors toward glioma-secreted factors and the overexpression of TMEM18
resulted increased the migration of human neural precursor cells Single nucleotide polymorphism
(SNP) rs6548238 locates at regulatory region near the TMEM18 gene, which results in the substitution
of T for C in the DNA sequence The association of SNP rs6548238 with the risk of several disorders
has been intensively studied in developed countries
The aim of this study was to determine the allele frequency and genotype ratio of SNP rs6548238
in normal nutritional status children, and identifies anthropometric characteristics of children in
different genotype groups The study was conducted in 478 children who were recruited from some
primary school in Hanoi, Thainguyen and Haiduong city Children nutritional status was classified
using the criteria of WHO 2007 and IOTF 2000
The results showed that allele C is the macro alleles (frequency = 0.952) and the allele frequencies
and genotype frequencies in populations were at Hardy-Weinberg Equilibrium (P = 0.059) The mean
of BMI was tended to difference between three genotype groups (P = 0.082), in which C/C children
had the highest mean of BMI (15.5), followed by C/T children (15.1) and T/T children had the lowest
one (14.4)
Keywords: TMEM18, rs6548238, children, North Vietnam
Xây dựng quy trình sản xuất rượu Brandy sử dụng quả bần chua (Sonneratia caseolaris)
Đoàn Văn Thược*, Vũ Thị Hằng
Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, 136 Xuân Thủy, Hà Nội, Việt Nam
Nhận ngày 07 tháng 12 năm 2015Chỉnh sửa ngày 17 tháng 4 năm 2015; Chấp nhận đăng ngày 17 tháng 3 năm 2017
Tóm tắt Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng quy trình sản xuất rượu brandy bần
chua ở quy mô lên men 350 l/mẻ, kết quả cho thấy sau 14 ngày lên men chúng tôi đã thu
được dịch lên men có hàm lượng rượu đạt 16,5% (v/v) Dịch lên men đã được chưng cất
Hình 18 Kết quả mô phỏng với tốc độ học 0.0003 bằng ngôn ngữ C
Trang 8Công nghệ, Tập 3033, Số 6S 1 (20142017) 195 -10 0
để thu rượu mạnh, rượu thu được có mùi hăng sốc và khó uống do có chứa tạp chất vớihàm lượng cao như acid (864 g/l), aldehyde (124,7 g/l), ester (211,2 g/l) và methanol(134,8 g/l) Bằng cách xử lý với NaOH và KMnO4 sau đó chưng cất lại, phần lớn các tạpchất này đã bị loại bớt, acid, aldehyde, ester và methanol trong rượu sau khi xử lý lần lượtcòn là 130 g/l, 43 mg/l, 92,4 mg/l và 23,5 mg/l Brandy bần chua cũng đã được ngâm với
gỗ sồi theo các tỷ lệ khác nhau, kết quả cho thấy ngâm 1 l rượu (60%, v/v) với 3 – 3,25 g
gỗ sồi sẽ cho màu sắc và mùi vị tốt nhất Các số liệu phân tích và cảm quan chứng tỏ rằngrượu brandy bần chua hoàn toàn đáp ứng Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về rượu mạnh Đây
là nghiên cứu đầu tiên sản xuất brandy từ dịch quả bần chua lên men
Từ khóa: quả bần chua, brandy, lên men, chưng cất, Sonneratia caseolaris.
Rừng ngập mặn là hệ sinh thái đặc biệt nằm ở giữa đất liền và biển ở các vùng nhiệt đới và cậnnhiệt đới Rừng ngập mặn chiếm diện tích khoảng 152361 km2 và phân bố tại 123 quốc gia và vùnglãnh thổ [1] Việt Nam chúng ta có khoảng gần 200 ha rừng ngập mặn trải dài khắp ba miền Bắc –Trung – Nam Rừng ngập mặn của Việt Nam khá đa dạng với các loài cây phổ biến như Trang, Đước,
Mắm, Bần chua, Sú, Vẹt Bần chua có tên khoa học là Sonneratia caseolaris là một loài cây phổ biến
ở vùng ngập mặn ven biển Ở Việt Nam, cây Bần chua được trồng và mọc hoang ở các rừng ngậpmặn ven biển từ Bắc vào Nam Đây là một loài cây gỗ trung bình (có thể cao tới 15-20m) có giá trịchủ yếu là phòng hộ, lấy gỗ Cây bần chua thường có hoa nở vào tháng 4-5, kết trái vào tháng 10-11,mỗi cây cho khoảng 350 quả, trung bình mỗi kg sẽ có khoảng 10-15 quả [2]
Ở một số quốc gia trên thế giới người ta đã tận dụng quả bần chua để làm nước quả, nước xi-rô.Điển hình là ở Sri Lanka, người dân ở vùng phía Nam và Tây Nam đã sử dụng quả cây Bần chua đểlàm nước quả tươi Ở Maldive người dân trồng cây Bần chua ở trong vườn để dùng quả cây làm nguồnthực phẩm và làm nước quả Trong khi đó người dân Indonesia đã dùng quả cây Bần chua để sản xuấtnước xi-rô [3] Ở Việt Nam (đặc biệt ở miền Bắc) việc sử dụng quả bần chua làm thực phẩm và đồuống còn nhiều hạn chế Người dân chưa biết giá trị kinh tế của quả bần và cũng chưa biết cách chếbiến thực phẩm, đồ uống từ quả bần
Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã phân lập được chủng nấm men Candida tropicalis
NM2 từ quả bần chua có khả năng lên men rượu khá tốt Khi sử dụng quả bần chua làm nguyên liệulên men và tiến hành lên men trong 14 ngày ở nhiệt độ 30 oC và pH 3,5, chủng Candida tropicalis
NM2 có thể tạo ra lượng rượu là 14,9% (v/v) [4] Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng nấm
men Candida tropicalis NM2 để lên men dịch quả bần chua ở qui mô 350 L/mẻ, dịch lên men sau đó
được chưng cất nhằm tạo ra rượu Brandy bần chua
2 Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Nguyên liệu
Tác giả liên hệ ĐT: 84-948071329.
Email: thuocdv@hnue.edu.vn
Trang 9Đối tượng
Chủng nấm men Candida tropicalis NM2 được phân lập từ dịch quả bần chua lên men [4].
Quả bần chua được thu hái từ rừng ngập mặn xã Vinh Quang, huyện Tiên Lãng, thành phố HảiPhòng
Các loại môi trường sử dụng
Môi trường dùng để giữ giống nấm men (môi trường Hansen) có thành phần (g/l): glucose: 50;
KH2PO4: 3; MgSO4.7H2O: 2; pepton: 10; thạch (agar): 20; pH = 5
Môi trường nhân giống cấp 1: môi trường Hansen lỏng (không có agar)
Môi trường nhân giống cấp 2: môi trường Hansen lỏng và dịch quả bần chua phối trộn với nhau tỉ
lệ 1:1; hàm lượng đường 110 g/l; pH = 3,6; SO2: 30mg/l
Môi trường nhân giống cấp 3: môi trường Hansen lỏng và dịch quả bần chua phối trộn với nhau tỉ
lệ 1:1; hàm lượng đường 220 g/l; pH = 3,6; SO2: 50mg/l
2.2 Phương pháp
Phương pháp xử lý và chuẩn bị nguyên liệu lên men
Quả bần chua sau khi thu hái được đóng bao chuyển về phòng thí nghiệm CNSH-Vi sinh Chúngtôi đã tiến hành chọn lọc và loại bỏ quả sâu, quả dập hỏng Đối với các quả xanh chúng tôi đã giấmtrong các thùng xốp có bổ sung đất đèn chờ chín (Hình 1A) Các quả chín sẽ được rửa sạch và ngâmvới đường theo tỉ lệ 2 quả: 1 đường (Hình 1B) Sau khi ngâm 20 ngày, tiến hành lọc loại bỏ vỏ và hạt,pha loãng dịch quả để đạt hàm lượng đường khoảng 220 g/l
Hình 1 Xử lý quả để chuẩn bị dịch lên men: (A) ủ chín quả bần chua và (B) ngâm bần chua vớiđường
Hoạt hoá và nhân giống nấm men
Cấy chủng Candida tropicalis NM2 trên môi trường Hansen đặc, nuôi ở nhiệt độ 30 ºC trong 36 h,
cấy chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở nhiệt độ
30 ºC trong 24 h Bổ sung giống cấp 1 vào môi trường nhân giống cấp 2 (tỷ lệ giống bổ sung là 10%,v/v), nuôi ở nhiệt độ 30 ºC trong 24 h Bổ sung 10% (v/v) giống cấp 2 vào môi trường nhân giống cấp
3 và nuôi tiếp trong 24 h ở 30 oC, lúc này chủng nấm men đã nhân giống xong và sẵng sàng sử dụngcho các thí nghiệm tiếp theo
Trang 10Công nghệ, Tập 3033, Số 6S 1 (20142017) 195 -10 0
Lên men sản xuất và chưng cất rượu
Bổ sung 35 l giống cấp 3 vào thùng lên men 500 l có chứa 315 l dịch quả bần chua để đạt thể tíchcuối cùng là 350 l Lên men ở 30 oC trong 14 ngày Lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau để kiểm tra
pH và hàm lượng rượu tạo thành Tiến hành chưng cất thu hồi rượu mạnh khi kết thúc lên men
Phương pháp làm giảm một số tạp chất trong rượu
Dung dịch rượu sau khi chưng cất được pha loãng đưa về 60% (v/v), tiến hành xử lý bằngKMnO4 và NaOH với các nồng độ khác nhau [5] Sau đó, rượu sẽ được pha loãng 2 lần rồi tiến hànhchưng cất, thu hồi để cảm quan hương vị Từ kết quả cảm quan tìm ra được hàm lượng KMnO4 vàNaOH phù hợp có khả năng làm giảm nồng độ các tạp chất như acid, este, aldehyde, methanol,furfurol
Phương pháp tạo màu cho rượu brandy bần chua
Rượu sau khi xử lý và chưng cất lần 2 được đưa về nồng độ 60% (v/v) và được ngâm với bột gỗsồi có hàm lượng khác nhau : 2.5; 2.75; 3; 3.25, 3.5 (g/l) ở nhiệt độ 30 0C Sau 12 tháng, tiến hành lọcloại bỏ bột gỗ sồi thu rượu brandy Sử dụng nước cất pha loãng rượu về nồng độ 40% (v/v) rồi tiếnhành đánh giá cảm quan, lựa chọn được hàm lượng gỗ sồi bổ sung thích hợp
Các phương pháp phân tích
Xác định độ rượu: Chưng cất một lượng dịch lên men nhất định (V1 ml) thu được V2 ml rượu.Dùng rượu kế đo độ rượu tạo ra trong V2 thu được giá trị a Từ đó tính được độ rượu b theo tỉ lệ % (v/v) theo công thức: b = (a x V2):V1
Xác định acid và este có trong rượu theo phương pháp của Lê Thanh Mai và cộng sự [5]
Xác định hàm lượng furfurol có trong rượu theo phương pháp HPLC sử dụng cột HypersilDPSC18, 1% acetonitril được sử dụng làm dung môi chạy HPLC, furfurol tinh khiết (Sigma, Mỹ)được sử dụng để xây dựng đề thị chuẩn
Hàm lượng aldehyde và methanol trong mẫu rượu được xác định tại Trung tâm Kĩ thuật tiêu chuẩn
đo lường chất lượng 1
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Lên men và động thái của quá trình lên men
Dịch lên men được chúng tôi sử dụng chính là dịch quả bần chua có chứa hàm lượng đường 220g/l và SO2 với hàm lượng 50mg/l Bổ sung lượng giống theo tỷ lệ 10% (v/v) và tiến hành lên men ở28- 30 0C trong 2 tuần Để xác định động thái của quá trình lên men chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu 2ngày/lần để khảo sát 2 yếu tố: hàm lượng rượu tạo thành và sự thay đổi của pH Kết quả được trìnhbày trong Hình 2
Trang 11Hình 2 Động thái quá trình lên men rượu từ dịch quả bần chua.
Ở thời điểm bắt đầu lên men, trong dịch quả lên men đã có chứa 2,6% rượu Như vậy trong 20ngày ngâm ủ chiết dịch, một số nấm men dại trong quả bần chua đã lên men tạo rượu Trong quá trìnhlên men, hàm lượng rượu tăng mạnh trong 4 ngày đầu tiên (từ 2,6% thời điểm bắt đầu lên 10,9% ởngày thứ 4), sau đó vẫn tăng đều từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 12 và đạt 16,1% Hàm lượng rượu đạt cựcđại (16,5%) sau 14 ngày lên men và không thay đổi khi kéo dài quá trình lên men lên 16 hoặc 18 ngày.Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng thời gian 14 ngày là thời điểm phù hợp để dừng lên men, ở thờiđiểm này hiệu suất chuyển hóa đường thành rượu là 91,6% Hàm lượng rượu thu được trong nghiêncứu này (16,5%) cao hơn so với nghiên cứu trước đây (14,9%) [4] là do đã có sẵn 2,6% rượu khi bắtđầu quá trình lên men Nếu trừ đi lượng rượu có sẵn này thì lượng rượu thực tế tạo ra cũng là 14,9% -ngang bằng với hàm lượng rượu trong nghiên cứu trước đây
Trái ngược với sự thay đổi mạnh mẽ của hàm lượng rượu trong quá trình lên men, giá trị pH thayđổi không đáng kể, pH có xu hướng giảm nhẹ trong quá trình lên men do sự hình thành của một sốacid ví dụ như axit axetic
3.2 Chưng cất thu hồi sản phẩm và đánh giá sơ bộ chất lượng sản phẩm
Lượng rượu tạo thành trong quá trình lên men dịch bần chua đã được chúng tôi chưng cất thu hồi.Rượu brandy từ quả bần chua sau khi chưng cất thu hồi có màu trong suốt nhưng vẫn hơi nồng, hăng
và sốc Chúng tôi tiến hành kiểm tra một số yếu tố có trong rượu có ảnh hưởng trực tiếp đến chấtlượng rượu như acid, este, aldehyde, methanol và furfurol Kết quả phân tích được trình bày trongBảng 1
Thành phần quan trọng ảnh hưởng đến hương vị brandy là các acid, đặc biệt là acid dễ bay hơi Kếtquả phân tích cho thấy hàm lượng acid trong rượu brandy bần chua là 864 mg/l, cao hơn so với rượubrandy nho (khoảng 100 – 500 mg/l) [6] và rượu brandy anh đào (khoảng 140 - 280 mg/l) [7] Sự khácbiệt này là do thành phần nguyên liệu và điều kiện lên men của các loại rượu khác nhau, trong đó bầnchua là loại quả có nhiều acid nhất nên hàm lượng acid có trong rượu cũng sẽ cao
Ngoài acid thì ester cũng là một yếu tố quan trọng góp phần tạo nên hương vị cho rượu brandy.Trên 160 loại ester khác nhau đã được tìm thấy trong các loại rượu vang cũng như rượu brandy khácnhau Phổ biến nhất trong rượu đó là ethyl ester, thành phần này được hình thành do phản ứng esterhóa giữa các acid hữu cơ và ethanol [6] Kết quả phân tích trong Bảng 1 cho thấy hàm lượng estetrong rượu brandy bần chua là khoảng 212,2 mg/l, thấp hơn nhiều so với rượu brandy anh đào (daođộng trong khoảng 580 - 1400 mg/l) [7]
Trang 12[6] Hàm lượng aldehyde trong rượu brandy bần chua chiếm khoảng 124,7 mg/l, cao hơn so vớibrandy nho (aldehyde khoảng 80 – 100 mg/l) [6] và tương tự như brandy anh đào có hàm lượngaldehyde dao động trong khoảng 60 - 166 mg/l [7].
Methanol không phải sản phẩm của quá trình lên men rượu, nó được hình thành nhờ enzyme thủyphân nhóm methoxyl của pectin trong quá trình lên men Việc kiểm soát hàm lượng methanol trongrượu là rất quan trọng bởi nó rất độc đối với cơ thể con người Khi vào trong cơ thể, methanol đượcchuyển hóa thành formaldehyde và acid formic, cả hai chất này đều rất độc đối với hệ thần kinh Nồng
độ formaldehyde cao sẽ gây tổn thương thần kinh thị giác và thậm chí mù lòa [8] Bảng 1 cho thấy,hàm lượng methanol trong bần chua vào khoảng 134,8 mg/l, tương tự như trong brandy nho (dao độngtrong khoảng từ 120 – 280 mg/l) [6], nhưng cao hơn nhiều so với hàm lượng methanol có trong rượuanh đào (khoảng 23 – 70 mg/l) [7] Tuy hơi cao nhưng hàm lượng methanol trong rượu brandy bầnchua vẫn đảm bảo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống có cồn [9]
Một thành phần khác trong rượu brandy bần chua cũng được chúng tôi phân tích đó là furfural.Hợp chất này được tạo ra từ phản ứng oxi hóa đường diễn ra ở nhiệt độ cao trong quá trình chưng cấtrượu Đây là một hợp chất có tính độc, công thức phân tử là C5H4O2 Nhiệt độ bay hơi của furfural là
1620C, hàm lượng của chất này càng tăng cao về cuối giai đoạn chưng cất [10] Hàm lượng furfuraltrong brandy bần chua là 3,48 mg/l, thấp hơn so với furfural trong brandy nho (dưới 33 mg/l), tương tựnhư furfural trong brandy anh đào (khoảng 3,5 mg/l)
Mặc dù thành phần các chất không mong muốn có trong rượu brandy bần chua đều nằm trongngưỡng cho phép, nhưng khi cảm quan chúng tôi nhận thấy rượu rất hăng và sốc, do đó để tăng chấtlượng rượu thì cần làm giảm các thành phần không mong muốn này
3.3 Nghiên cứu làm giảm một số chất không mong muốn trong rượu brandy bần chua
Chúng tôi đã tiến hành xử lý rượu bằng KMnO4 và NaOH với các nồng độ khác nhau, sau đó phaloãng, chưng cất thu hồi Kết quả cảm quan cho thấy mùi hăng sốc của rượu đã giảm nhiều, nhưng vẫngiữ được hương vị rượu brandy bần chua đặc trưng Hàm lượng các chất có trong mẫu rượu brandybần chua sau khi xử lý đã được phân tích và kết quả được trình bày trong Hình 3
Trang 13Hình 3 Hàm lượng một số chất trong rượu brandy bần chua trước và sau khi xử lý.
Kết quả cho thấy, hàm lượng các chất trong rượu brandy bần chua sau khi xử lý đều giảm so vớitrước khi xử lý Giảm mạnh nhất là lượng acid tổng số, giảm từ 864 mg/l xuống còn 130 mg/l (giảmgần 7,5 lần) Nguyên nhân là do NaOH đã trung hòa lượng lớn acid trong rượu Thành phần này chiếm
tỷ lệ thấp trong rượu góp phần làm giảm vị chua và tăng giá trị cảm quan của rượu Bên cạnh đó, cácchất khác như ester, aldehyde và methanol cũng giảm đáng kể: ester giảm từ 211,2 mg/l xuống còn92,4 mg/l; aldehyde giảm từ 124,7 mg/l xuống còn 43 mg/l; trong khi đó methanol giảm gần 6 lầnxuống còn 23,5 mg/l Tuy nhiên, hàm lượng furfural gần như không thay đổi sau khi xử lý: 3,48 g/l(trước khi xử lý) và 3,38 g/l (sau khi xử lý) Nhìn chung, quá trình xử lý rượu sử dụng hai hóa chất làKMnO4 và NaOH đã làm giảm đáng kể một số thành phần không mong muốn Rượu sau khi xử vẫngiữ được mùi đặc trưng của bần chua nhưng không còn mùi hăng nồng khó chịu, vị của rượu cũngđược cải thiện đáng kể sau khi xử lý Các số liệu phân tích và cảm quan chứng tỏ rằng rượu brandybần chua hoàn toàn đáp ứng Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về rượu mạnh
3.4 Ngâm gỗ sồi tạo màu và hương vị cho rượu brandy bần chua
Màu sắc là một yếu tố quan trọng góp phần rất lớn vào chất lượng và chuẩn hóa rượu brandy Sựxuất hiện màu sắc của một loại rượu, cũng như các loại thực phẩm khác, sẽ quyết định ấn tượng đầutiên của người tiêu dùng và sự lựa chọn của họ Giá trị thương mại của một loại rượu brandy được quyđịnh bởi các đặc điểm cụ thể của nó, trong đó có đặc điểm về màu sắc Do đó, tạo màu cho rượubrandy bần chua có lợi ích rất quan trọng việc tăng giá trị cảm quan cũng như giá trị thương mại củarượu
Sử dụng thùng gỗ sồi lưu trữ để tạo màu sắc, hương vị cho rượu vang và các loại rượu cao độ khác
là kinh nghiệm lâu đời trong sản xuất rượu [6] Tuy nhiên, ở những khu vực điều kiện tự nhiên khôngthích hợp với sự phát triển của cây sồi, việc nhập ngoại các thùng gỗ sồi khá tốn kém, ảnh hưởng đếngiá trị thương mại và lợi nhuận kinh tế của các nhà sản xuất rượu Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng bột gỗsồi nhập khẩu từ Pháp ngâm trong rượu brandy để giảm chi phí và thời gian lưu trữ rượu Để xác địnhhàm lượng gỗ sồi thích hợp dung để ngâm ủ rượu brandy bần chua, chúng tôi tiến hành thí nghiệm vớimức bổ sung khối lượng gỗ sồi khác nhau từ 2,5 đến 3,5 g/l (bước nhảy 0,25)
Hình 4 cho thấy bổ sung lượng gỗ sồi vào rượu càng nhiều thì màu sắc rượu càng đậm màu Đốivới các loại thực phẩm và đồ uống, bên cạnh yếu tố màu sắc, mùi vị là yếu tố quan trọng bậc nhấtquyết định sự lựa chọn của người tiêu dung Để tìm được hàm lượng bột gỗ sồi bổ sung thích hợp,chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan sơ bộ rượu brandy bần chua sau 12 tháng ngâm ủ Kết quả cảmquan cho thấy, hàm lượng gỗ sồi dùng để ngâm ủ brandy bần chua khoảng 3 - 3,25 g/l là phù hợp nhất