nGHIêN cứu tác dụNG cHốNG oxy hóa của cAO cHIếT phân đoạn từ lá sa kê (artocarpus aLTILIS) ĐịNH hướNG hỗ trợ điều trị bệNH gOUT

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề tài làm rõ hoạt tính sinh học của lá Sa kê, đồng thời tìm ra nguồn dược liệu mới ứng dụng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh gout với các nội dung chính sau:  Đị

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN HOÀNG MINH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CAO

CHIẾT PHÂN ĐOẠN TỪ LÁ SA KÊ (ARTOCARPUS ALTILIS)

ĐỊNH HƯỚNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRUNG TÂM SÂM VÀ DƯỢC LIỆU THÀNH PHỒ HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương

Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Bùi Văn Lệ

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày

11 tháng 01 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

2 Thư ký hội đồng: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

3 Ủy viên phản biện 1: PGS.TS Bùi Văn Lệ

4 Ủy viên phản biện 2: TS Huỳnh Ngọc Oanh

5 Ủy viên hội đồng: TS Trần Trung Hiếu

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Nguyễn Đức Lượng Phan Thanh Sơn Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Hoàng Minh MSHV: 1670260

Ngày, tháng, năm sinh: 20/02/1990 Nơi sinh: Sa Đéc- Đồng Tháp

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của cao chiết phân đoạn từ

lá Sa kê (Artocarpus altilis) theo hướng hỗ trợ điều trị bệnh gout

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Đề tài làm rõ hoạt tính sinh học của lá Sa kê, đồng thời tìm ra nguồn dược liệu mới ứng dụng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh gout với các nội dung chính sau:

 Định lượng hàm lượng hợp chất polyphenol tổng và thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết tổng để sàng lọc cao chiết tổng tiềm năng

 Sàng lọc cao chiết phân đoạn thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất từ cao chiết tổng tiềm năng

 Khảo sát tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn tiềm năng trên mô hình gây tăng acid uric máu chuột nhắt trắng đực bằng kali oxonat

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 20/08/2018

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2018

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương

Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Tp HCM, ngày 11 tháng 01 năm 2019

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn 1 Cán bộ hướng dẫn 2

Nguyễn Thị Thu Hương Nguyễn Thúy Hương

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

Lê Thị Thủy Tiên TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Phan Thanh Sơn Nam

LỜI CẢM ƠN

Thực tế luôn cho thấy, sự thành công nào cũng đều gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ của những người xung quanh dù cho sự giúp đỡ đó là ít hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp

Với tấm lòng biết ơn vô cùng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương Người đã chấp cánh cho tôi niềm đam mê nghiên cứu từ những bước đầu tiên bậc đại học, đã dùng những tri thức và tâm huyết của mình truyền đạt cho tôi những định hướng, những kiến thức quý báu, những lời hướng dẫn tận tình để giúp tôi hoàn thiện luận văn tốt nghiệp được tốt hơn Và tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Việt Dũng (Viện Dược liệu), Ths Dương Thị Mộng Ngọc, Ths Trần Mỹ Tiên, cô Đoàn Thị Bích Thủy cùng các anh chị em tại Trung tâm Sâm

và Dược liệu Tp.HCM đã tạo điều kiện, hỗ trợ, động viên chia sẻ cùng tôi trong suốt thời gian qua

Dưới mái trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, tôi không sao quên được những buổi lên lớp của thầy cô đã cho chúng tôi những kiến thức thật tuyệt vời Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã tận tâm chỉ bảo hướng dẫn tôi qua từng buổi học, từng buổi nói chuyện, thảo luận về đề tài nghiên cứu Nhờ có những lời động viên, hướng dẫn, dạy bảo đó mà luận văn này của tôi đã hoàn thành được tốt hơn Những lời răng dạy ấy của cô còn là hành trang giúp tôi vững bước trên con đường sự nghiệp của tôi sau này Và tôi cũng không sao quên được những người bạn cao học khóa K2016 đã cùng chia sẻ động viên nhau vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập Tôi xin cảm ơn thầy cô và mọi người

“Ba mẹ ơi! Con sắp bước lên một nấc thang mới trong cuộc đời mình rồi” Tôi nghĩ nấc thang ấy sẽ thay lời cảm ơn của tôi gửi đến ba mẹ, là chỗ dựa vững chắc cho con đường học vấn của tôi Tôi xin cảm ơn gia đình, cảm ơn vợ tôi đã đồng hành chia

sẻ cùng tôi những khó khăn về mặt tinh thần trong suốt quá trình học tập cao học Với vốn kiến thức còn hạn chế tôi nên bài viết luận văn không thể tránh sai sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để luận văn được hoàn thiện hơn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2018

Nguyễn Hoàng Minh

TÓM TẮT

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CỦA CAO CHIẾT PHÂN ĐOẠN

TỪ LÁ SA KÊ (ARTOCARPUS ALTILIS) ĐỊNH HƯỚNG HỖ TRỢ

ĐIỀU TRỊ BỆNH GOUT

Theo kinh nghiệm dân gian, lá Sa kê (Artocarpus altilis (Park.) Fosb.) được sử

dụng trong các bài thuốc điều trị bệnh gout Lá Sa kê chứa nhiều steroid, terpenoid, saponin, flavonoid, alkaloid và đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, ức

chế xanthin oxidase in vitro Do đó, đề tài tiến hành nghiên cứu tác dụng của cao chiết

phân đoạn từ lá Sa kê theo định hướng hỗ trợ điều trị bệnh gout

Đề tài tiến hành định lượng hàm lượng hợp chất polyphenol tổng và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các cao chiết nước, cao chiết ethanol 45%, cao chiết ethanol 70%, cao chiết ethanol 96% từ lá Sa kê Kết quả cho thấy cao chiết nước có hàm lượng hợp chất polyphenol (8,94 mg GAE/g dược liệu) và thể hiện hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH với IC50 = 106,95 μg/ml; ức chế peroxy hóa lipid tế bào với IC50 = 84,44 μg/ml;

ức chế xanthin oxidase IC50 = 38,63 μg/ml tốt nhất so với các cao chiết tổng còn lại Nghiên cứu đã sàng lọc được cao chiết ethanol 45% là cao chiết tiềm năng để tiến hành chiết các cao phân đoạn cho các thử nghiệm tiếp theo

Đề tài tiếp tục đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các cao chiết phân đoạn Kết quả cho thấy cao phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH với

IC50 = 14,02 μg/ml, ức chế peroxy hóa lipid tế bào với IC50 = 2,76 μg/ml; ức chế xanthin oxidase với IC50 = 28,48 μg/ml tốt nhất so với các cao phân đoạn diethyl

ether, chloroform, n-butanol và cao phân đoạn nước Nghiên cứu đã sàng lọc được

cao chiết phân đoạn ethyl acetat là cao chiết phân đoạn tiềm năng để tiến hành thử

nghiệm in vivo

Đề tài tiến hành khảo sát tác dụng hạ acid uric máu của cao phân đoạn ethyl acetat trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat (liều 300 mg/kg) ở chuột nhắt trắng Kết quả cho thấy ở cả 2 phác đồ điều trị hay dự phòng, cao phân đoạn ethyl acetat cả 2 liều 0,17 g cao/kg – 0,34 g cao/kg trọng lượng chuột đều thể hiện tác dụng

hạ acid uric máu (17,90% - 25,91%) đạt ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý và phục hồi trở về mức bình thường, tác dụng tương tự như allopurinol liều 10 mg/kg trọng lượng chuột

ABSTRACT

STUDY ON ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE FRACTIONATED

EXTRACT FROM ARTOCARPUS ALTILIS LEAVES

IN TREND OF GOUT TREATMENT

According to folklore, Artocarpus altilis leaves have been used for treatment of

gout It contains steroids, terpenoids, saponins, flavonoids, alkaloids, and are shown

to possess active anti-oxidant, xanthine oxidase inhibitory activity in vitro Therefore, the aim of this study is to evaluate the anti-hyperuricemic effect of the extracts from

Artocarpus altilis leaves in mouse model of hyperuricemia

The project proceeded to quantify the total polyphenol content and evaluate

anti-oxidant activity of 45%, 70%, 96% ethanol extract and aqueous extract of Artocarpus

altilis leaves Results showed that 45% ethanol extract contained the total polyphenol

content (8.94 mg GAE/g raw materials) and had the best DPPH scavenging activity (IC50 = 106.95 μg/ml), lipid peroxidation inhibitory activity (IC50 = 84.44 μg/ml), xanthine oxidase inhibitory activity (IC50 = 38.63 μg/ml) compared to all other total extracts The study was able to screen 45% ethanol extract which was a potential

extract It fractionated to get diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, n-butanol and

water fractional extracts for next experiments

The project evaluated anti-oxidant activity of fractional extracts Results showed that ethyl acetate fractional extract had the best DPPH scavenging activity (IC50 = 14.02 μg/ml), lipid peroxidation inhibitory activity (IC50 = 2.76 μg/ml), xanthine oxidase inhibitory activity (IC50 = 28.48 μg/ml) compared to all other fractional extracts The study was able to screen ethyl acetate fractional extract which was the

potential fractional extract to proceed in vivo experiment

This study investigated the anti-hyperuicemic effects of ethyl acetate fractional extract on kali oxonat (300 mg/kg weight of mice) - induced hyperuricemic model in mice The result showed that either single dose or repeated doses of ethyl acetate fractional extract at oral doses 0.17 g/kg - 0.34 g/kg weight of mice exerted a decrease

on plasma uric acid (17.90% - 25.91%) which was significantly different as compared

to physiological control and return to normal value as well as allopurinol (at oral dose

10 mg/kg weight kg of mice)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương và PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, các số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, nếu có gì sai sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2018

Nguyễn Hoàng Minh

MỤC LỤC

Trang

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ASSTRACT iv

LỜI CAM ĐOAN v

MỤC LỤC vi

BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về Sa kê 3

1.1.1 Danh pháp 3

1.1.2 Phân bố sinh thái 3

1.1.3 Hình thái 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Công dụng 4

1.1.6 Một số công trình trong và ngoài nước liên quan đến nghiên cứu 4

1.2 Hợp chất polyphenol 6

1.2.1 Flavonoid 7

1.2.2 Tannin 10

1.3 Bệnh gout 11

1.3.1 Khái niệm về bệnh gout 11

1.3.2 Xanthin oxidase 12

1.3.3 Quá trình sinh tổng hợp và đào thải acid uric 14

1.3.4 Cơ chế bệnh sinh của gout 15

1.3.5 Hậu quả tăng acid uric 15

1.3.6 Thuốc điều trị bệnh gout 16

1.4 Mô hình thực nghiệm gây tăng acid uric máu 21

1.5 Một số dược liệu có tác dụng hạ acid uric 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 24

2.2 Vật liệu 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.2 Động vật thí nghiệm 24

2.2.3 Thiết bị 24

2.2.4 Hóa chất 25

2.2.5 Dụng cụ 25

2.3 Sơ đồ nghiên cứu của đề tài 25

2.4 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 26

2.4.1 Sàng lọc cao chiết tổng tiềm năng 26

2.4.2 Sàng lọc cao chiết phân đoạn tiềm năng 32

2.4.3 Khảo sát tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn tiềm năng trên mô hình gây tăng acid uric máu bằng kali oxonat 33

2.4.4 Xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 36

3.1 Sàng lọc cao chiết tổng tiềm năng 36

3.1.1 Chiết xuất các cao chiết tổng 36

3.1.2 Mất khối lượng do làm khô của dược liệu và các cao chiết tổng 36

3.1.3 Hàm lượng hợp chất polyphenol tổng của các cao chiết tổng 37

3.1.4 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của các cao chiết tổng 39

3.1.5 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của các cao chiết tổng 41

3.1.6 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của các cao chiết tổng 44

3.2 Sàng lọc cao chiết phân đoạn tiềm năng 46

3.2.1 Chiết xuất các cao chiết phân đoạn 46

3.2.2 Mất khối lượng do làm khô của các cao chiết phân đoạn 46

3.2.3 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của các cao chiết phân đoạn 47

3.2.4 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của các cao chiết phân đoạn 48

3.2.5 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của các cao chiết phân đoạn 50

3.3 Kết quả tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn ethyl acetat trên mô hình gây tăng acid uric máu chuột nhắt trắng bằng kali oxonat 52

3.3.1 Kết quả tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn ethyl acetat ở phác đồ điều trị 52

3.3.2 Kết quả tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn ethyl acetat ở phác đồ dự phòng 54

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Đề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT

AMP Adenosin monophosphat Adenosine monophosphate

ADP Adenosin diphosphat Adenosine diphosphate

ATP Adenosin triphosphat Adenosine triphosphate

DPPH 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl

DCHBS Acid 3,5 -

dichloro-2-hydroxybenzen-sulfonic

GMP Guanosin monophosphat Guanosine monophosphate

IMB Inosin monophosphat Inosine monophosphate

MDA Malonyl dialdehyd Malonyl dialdehyde

phosphate

drugs NOS Các dạng hoạt động nitrogen Nitrogen oxygen species

OD Mật độ đo quang Optical density

ROS Các dạng hoạt động oxygen Reactive oxygen species

SEM Sai số chuẩn của số trung bình Standard error of the mean

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thống kê một số dược liệu có tác dụng hạ acid uric 23

Bảng 2.1 Quy trình xây dựng đường tuyến tính chất chuẩn acid gallic 28

Bảng 2.2 Bố trí thử nghiệm tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn 33

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết các cao chiết tổng 36

Bảng 3.2 Mất khối lượng do làm khô của dược liệu và các cao chiết tổng 36

Bảng 3.3 Hàm lượng hợp chất polyphenol tổng của các cao chiết tổng 38

Bảng 3.4 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của các cao chiết tổng 39

Bảng 3.5 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của các cao chiết tổng 42

Bảng 3.6 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của các cao chiết tổng 44

Bảng 3.7 Tổng hợp kết quả hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết tổng 45

Bảng 3.8 Hiệu suất chiết các cao chiết phân đoạn 46

Bảng 3.9 Mất khối lượng do làm khô của các cao chiết phân đoạn 46

Bảng 3.10 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của các cao chiết phân đoạn 47

Bảng 3.11 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của các cao chiết phân đoạn 49

Bảng 3.12 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của các cao chiết phân đoạn 50

Bảng 3.13 Tổng hợp kết quả hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn 51

Bảng 3.14 Hàm lượng acid uric máu của các lô thử nghiệm theo phác đồ điều trị 52 Bảng 3.15 Hàm lượng acid uric máu của các lô thử nghiệm theo phác đồ dự phòng 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sa kê 3

Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất polyphenol 6

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của flavonoid 7

Hình 1.4 Các flavonoid thường gặp 8

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng bắt gốc tự do của flavonoid 9

Hình 1.6 Gốc kim loại gắn vào flavonoid 9

Hình 1.7 Cấu trúc của tannin 10

Hình 1.8 Cấu trúc trung tâm hoạt động của xanthin oxidase 12

Hình 1.9 Sơ đồ xanthin oxidase xúc tác sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể 13

Hình 1.10 Con đường đào thải acid uric 15

Hình 1.11 Sơ đồ allopurinol ức chế xanthin oxidase 19

Hình 1.12 Các thuốc điều trị bệnh gout 20

Hình 1.13 Sơ đồ kali oxonat ức chế sự chuyển hóa acid uric 22

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu đề tài 25

Hình 2.2 Quá trình chuyển hóa hypoxanthin, xanthin thành acid uric 31

Hình 2.3 Quy trình sàng lọc cao chiết phân đoạn tiềm năng 32

Hình 2.4 Sơ đồ thử nghiệm tác dụng hạ acid uric máu chuột của cao chiết phân đoạn tiềm năng ở phác đồ điều trị 33

Hình 2.5 Sơ đồ thử nghiệm tác dụng hạ acid uric máu chuột của cao chiết phân đoạn tiềm năng ở phác đồ dự phòng 34

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic và ΔOD 37

Hình 3.2 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của acid ascorbic 39

Hình 3.3 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol 45% 40

Hình 3.4 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của cao chiết ethanol 70% 40

Hình 3.5 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của Trolox 41

Hình 3.6 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của cao chiết ethanol 45% 42

Hình 3.7 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của cao chiết ethanol 70% 42

Hình 3.8 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của allopurinol 43

Hình 3.9 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của cao chiết ethanol 45% 44 Hình 3.10 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của cao chiết ethanol 70% 44 Hình 3.11 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của cao chiết phân đoạn diethyl ether 47 Hình 3.12 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của cao chiết phân đoạn chloroform 47 Hình 3.13 Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH của cao chiết phân đoạn ethyl acetat 48 Hình 3.14 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của cao chiết phân đoạn diethyl ether 49 Hình 3.15 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của cao chiết phân đoạn chloroform 49 Hình 3.16 Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của cao chiết phân đoạn ethyl acetat 49 Hình 3.17 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của cao chiết phân đoạn chloroform 51 Hình 3.18 Hoạt tính ức chế xanthin oxidase của cao chiết phân đoạn ethyl acetat 51

MỞ ĐẦU

Bệnh gout là một dạng viêm khớp do sự tích tụ của tinh thể natri urat hình kim tại các khớp và dịch bao khớp Gout có đặc điểm chính là tăng acid uric ở mức cao trong máu và nước tiểu do rối loạn chuyển hoá các nhân purin, tiền chất tổng hợp acid uric Xanthin oxidase là một enzym xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin và hypoxanthin thành acid uric Trong điều kiện hàm lượng acid uric ở giá trị bình thường (4 mg/ml

- 7 mg/ml) thì acid uric hoạt động như chất chống oxy hóa; tuy nhiên khi hoạt tính xanthin oxidase tăng sẽ dẫn đến acid uric máu tăng vượt mức giá trị bình thường và quá trình chuyển hóa xanthin sẽ tạo ra nhiều gốc tự do superoxid vượt mức kiểm soát của cơ thể dẫn đến stress oxy hóa [32], [43] Trong điều trị bệnh gout cấp tính thường

sử dụng colchicin hoặc các thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs) như indomethacin, naproxen Còn trong điều trị gout mạn tính thì sử dụng các thuốc có tác dụng làm tăng sự bài tiết acid uric qua đường tiểu như probenecid, hoặc thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase để làm giảm sự tổng hợp acid uric như allopurinol Tuy nhiên, các thuốc này gây rất nhiều phản ứng phụ như colchicin gây đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, rụng tóc; NSAIDs gây rối loạn chức năng thần kinh trung ương; probenecid gây dị ứng, suy thận, đau dạ dày; allopurinol thì gây nhức đầu, viêm tá tràng, viêm gan [9], [10], [42] Do đó, việc nghiên cứu những dược liệu định hướng theo hoạt tính chống oxy hóa, ức chế xanthin oxidase, giảm sinh tổng hợp hoặc tăng đào thải acid uric mang tính cấp thiết trong việc phát triển những sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên trong hỗ trợ điều trị bệnh gout

Theo kinh nghiệm dân gian lá Sa kê (Sa kê, có tên gọi là “cây bánh mì”, tên khoa học là Artocarpus altilis, thuộc họ dâu tằm Moraceae) được phối hợp với một số vị

thuốc khác hỗ trợ điều trị một số bệnh như sỏi thận, bệnh thoái hóa khớp, bệnh gout, đái tháo đường, viêm gan vàng da [12] Theo nhiều nghiên cứu chứng minh lá Sa kê chứa nhiều hợp chất thứ cấp bao gồm flavonoid và flavon có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, ức chế quá trình peroxy hóa tế bào, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng tế bào ung thư; điều trị bệnh xơ gan, gout, đái tháo đường [33], [66], [67] Theo kết quả sàng lọc của Đái Thị Xuân Trang và cộng sự (2014), cao chiết ethanol (99,5%) từ lá Sa kê thể hiện hoạt tính ức chế xanthin oxidase với IC50 = 0,198 mg/ml [21] Kết quả nghiên

cứu trước đây của chúng tôi cũng cho thấy rằng cao chiết ethanol 45% từ lá Sa kê có tác dụng làm giảm hàm lượng acid uric máu trên mô hình gây tăng acid uric máu chuột nhắt trắng cấp bằng kali oxonat trên cả hai phác đồ điều trị và dự phòng [15]

Kế thừa những nghiên cứu trên, luận văn tiếp tục tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

tác dụng chống oxy hóa của cao chiết phân đoạn từ lá Sa kê (Artocarpus altilis)

theo hướng hỗ trợ điều trị bệnh gout”, với mục tiêu và các nội dung nghiên cứu

như sau:

Mục tiêu cụ thể:

 Sàng lọc cao chiết tổng tiềm năng từ lá Sa kê

 Sàng lọc cao chiết phân đoạn tiềm năng từ lá Sa kê

 Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn tiềm năng

Nội dung nghiên cứu:

 Định lượng hàm lượng hợp chất polyphenol tổng và thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết tổng để sàng lọc cao chiết tổng tiềm năng

 Sàng lọc cao chiết phân đoạn thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt nhất từ cao chiết tổng tiềm năng

 Khảo sát tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phân đoạn tiềm năng trên mô hình gây tăng acid uric máu chuột nhắt trắng đực bằng kali oxonat

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về Sa kê

Chi (Genus): Artocarpus

Loài (Species): Artocarpus altilis

Danh pháp khoa học: Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg [58]

1.1.2 Phân bố sinh thái

Sa kê (Artocarpus altilis) được bắt nguồn từ Artocarpus camansi Blanco - cây có

nguồn gốc từ New Guinea, Moluccas (Indonesia) và Philippin Vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á và nhiều đảo ở Thái Bình Dương Nguồn gốc ở các đảo phía nam Thái Bình Dương, Châu Đại Dương (Châu Úc) Hiện được di thực vào các đảo Giava, Sumatra (Indonesia) Malaysia, các vùng đảo Đông Nam Châu Á Hầu hết các giống

Sa kê là xuất hiện từ Polynesia (Pháp) và Melanesia (Úc) qua nhiều thế hệ nhân giống sinh dưỡng và lựa chọn Sau đó Sa kê được vận chuyển đi nhiều nơi và phụ thuộc con người phân tán; dữ liệu được so sánh với lý thuyết về các thuộc địa của con người Châu Đại Dương [58]

Ở Việt Nam, Sa kê được trồng phổ biến ở các tỉnh Nam Trung Bộ và Nam Bộ Sa

kê là cây ưa sáng và ưa khí hậu của vùng nhiệt đới nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình

21 – 32 °C Cây có thể chịu được thời tiết nắng nóng đến 40 °C, lượng mưa trung bình thích hợp để phát triển là 1500 - 3000 mm/năm Sa kê phù hợp trồng ở 17 độ vĩ

độ Nam và Bắc, cao dưới 650 m và phát triển được trong cát san hô hoặc đất mặn Sa

kê sinh trưởng phát triển kém ở những vùng có nhiệt độ trung bình năm dưới 20 °C hoặc có mùa đông lạnh kéo dài [12], [58]

Hình 1.1 Xa kê

Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg [79]

1.1.4 Thành phần hóa học

Sa kê chứa các hợp chất polyphenol tổng như flavonoid, stilbenoid, arylbenzofuron

và lectin Hơn 130 hợp chất được xác định trong các cơ quan khác nhau của cây Sa

kê, hơn 70 hợp chất có nguồn gốc từ con đường sinh tổng hợp phenylpropanoid

Lá Sa kê chứa tannin, phenolic, glycosid, saponin, steroid, terpenoid, anthraquinon Flavonoid hiện diện nhiều trong dịch chiết ether dầu hỏa và ethyl acetat

từ lá Sa kê, còn tannin chỉ hiện diện trong dịch chiết methanol từ lá Sa kê Trong lá

Sa kê cũng có chứa các hợp chất polyphenol khác như stilben, chalcon, flavon [57]

1.1.5 Công dụng

Theo kinh nghiệm dân gian lá Sa kê có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm, lợi tiểu, trị tiêu chảy, đái tháo đường, huyết áp cao, sỏi thận, bệnh gout và viêm gan [12]

1.1.6 Một số số công trình trong và ngoài nước liên quan đến nghiên cứu

Đái Thị Xuân Trang và cộng sự (2014) đã chứng minh cao chiết ethanol 99,5% từ

lá Sa kê thể hiện hoạt tính ức chế xanthin oxidase với IC50 = 0,198 mg/ml [21] Năm 2015, nhóm nghiên cứu tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Sa kê cho thấy cả bột dược liệu, cao chiết ethanol 45%, cao chiết nước từ lá Sa kê đều chứa các hợp chất tự nhiên như triperpenoid, anthraquinon, proanthocyanosid, đường 2 - deoxy, saponin, polyphenol, chất khử và hợp chất polyuronic [13] Năm 2016, nhóm nghiên cứu này đã chứng minh cao chiết ethanol 45% từ lá Sa kê liều tương đương 2 – 5 g dược liệu/kg trọng lượng chuột đều

có tác dụng làm giảm 8,3 - 17,5% hàm lượng acid uric máu chuột gây bởi kali oxonat trên chuột nhắt trắng đạt ý nghĩa thống kê khi so sánh với lô chứng bệnh lý uống nước cất [15]

Trần Thu Hương và cộng sự (2012) đã chứng minh trong dịch chiết methanol từ

lá Sa kê có 1 hợp chất auron được prenyl hóa mới và 2 hợp chất chalcon được prenyl hóa, 3 hợp chất flavonon được prenyl hóa, 3 hợp chất triterpen Nhóm nghiên cứu cũng đã chứng minh hợp chất auron được prenyl hóa loại trừ NO với IC50 = 287,1

µM và 2 hợp chất chalcon được prenyl hóa (1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy- 2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)-2H-1- benzopyran-5-yl]-1-propanon, 2-geranyl-2’,3,4,4’-tetrahydroxydihydrochalcon) có hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH với giá trị IC50 lần lượt là 82,2 µM; 82,4 µM [74]

Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2012) đã chứng minh trong dịch chiết methanol từ lá Sa kê có 3 auron mới (altilisin H, I, J) và 2 flavonoid (8-geranyl 4’,5,7-trihydroxyflavon và cycloaltilisin Năm hợp chất phân lập được đều có tác dụng ức chế tyrosinase với IC50 nhỏ hơn 100 µM, trong đó 2 flavonoid (8-geranyl 4’,5,7-trihydroxyflavon và cycloaltilisin có hoạt tính ức chế tyrosinase với giá trị IC50 lần lượt là 42,5 µM; 43,9 µM (tốt hơn cả đối chứng dương acid kojic với IC50 = 44,6 µM) Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn chứng minh altilisin H và altilisin J có tác dụng

ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 4,9 µM; 5,4 µM (tốt hơn cả đối chứng dương acarbose với IC50 = 241,8 µM) [61]

Chinmay Pradhan và cộng sự (2013) đã sơ bộ thành phần hóa học cho thấy trong dịch chiết methanol từ lá Sa kê chứa các hợp chất như steroid, phenol, tannin, phytosterol, gôm, resin và terpenoid; trong dịch chiết ethyl acetat từ lá Sa kê có sự hiện diện của các hợp chất như steroid, phenol, flavonoid, phytosterol, gôm, resin và terpenonoid; trong dịch chiết ether dầu hỏa từ lá Sa kê chứa có các hợp chất như steroid, flavonoid, phytosterol, gôm và resin [33]

Wen Chun Lan và cộng sự (2013) cũng đã chứng minh trong lá Sa kê chứa flavonoid prenyl hóa gồm 10-oxoartogomezianon, 8-geranyl-3-hydroxyprenyl) isoetin, hydroxyartoflavon A, isocycloartobiloxanthon và furanocyclocommunin với

12 loại hợp chất khác có tác dụng chống oxy hóa, dập tắt gốc tự do 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH); 2,2’azinobis[acid 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic] (ABTS+); superoxid[77]

Mukesh S Sikarwar và cộng sự (2013) đã nghiên cứu cho thấy cao chiết ethanol 96% lá Sa kê chứa 26,2 mg GAE/g cao chiết đã trừ độ ẩm, thể hiện hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH với IC50 = 140,54 µg/ml (acid ascorbic với IC50 = 7,53 µg/ml) [56]

Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2014) chứng minh dịch chiết methanol từ lá

Sa kê ở nồng độ 50 µg/ml có tác dụng ức chế 100% tế bào ung thư PANC – 1 tuyến tụy ở người Đồng thời, nhóm nghiên cứu còn phân lập được 8 dihydrochalcon được prenyl hóa mới được gọi là các sakenin Trong đó có 2 sakenin là 2’,4’,3,4-tetrahydroxydihydrochalcon và 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(7-hydroxy-2-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl)propan-1-on có tác dụng gây độc tế bào với giá trị PC50(PC: preferentially cytotoxic) lần lượt là 8,0 µM; 1,11 µM [60]

Hesti Riasari và cộng sự (2015) đã phân lập từ lá Sa kê được 3 flavonoid bao gồm sitostenon, flavon với 2 nhóm prenyl, β- caroten [46]

Tjandrawati Mozef và cộng sự (2015) đã chứng minh hợp chất flavonoid geranyl-2’,3, 4, 4’-tetrahydroxydihydrochalcon phân lập từ lá Sa kê có hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH, với IC50 = 94,1 μM [72]

2-1.2 Hợp chất polyphenol

Hợp chất polyphenol là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzen) chứa một hay hai, ba hoặc nhiều nhóm hydroxyl (.OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm .OH với bộ khung hóa học mà các tính chất lý hoá học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi

Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất polyphenol [18]

Trong thiên nhiên, các hợp chất polyphenol như là flavonoid, tannin, phenol đơn vòng, xanthan, quinon, coumarin [18]

1.2.1 Flavonoid

1.2.1.1 Khái niệm chung về flavonoid

Flavonoid là một nhóm lớn của hợp chất polyphenol, có cấu trúc cơ bản là diphenylpropan (C6-C3-C6) hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A

và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon [16], [17]

Hình 1.3 Cấu trúc cơ bản của flavonoid[18], [19]

1.2.1.2 Phân loại flavonoid

Các flavonoid được phân loại dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C

Flavon: có cấu trúc là 2 vòng benzen A và B Vòng B gắn vào vòng C (pyran) ở

giữa qua dây nối ở C2 và có nối đôi C2/C3

Flavanon: không có dây nối đôi ở C2 và C3 Chúng có nhóm .OH ở vòng A hoặc

B Flavanon tiêu biểu là naringin, hesperidin

Flavonol: khác với flavon là có thêm .OH ở C3 Chúng có nhiều trong thực vật hạt kín và các chất thường gặp là quercetin, kaempferol, mirixetin

Flavanonol: cấu trúc giống flavonol nhưng không có nối đôi ở C2 và C3 Chất phổ biến là 7-hydroxyldihydro flavonol

Chalcon: là flavonoid vòng mở Hai nhân thơm kết hợp qua một dãy 3 cacbon α

và β không bão hòa Chất chalcon phổ biến là butein tạo ra màu vàng tươi của nhiều hoa và đều có nhiều nhóm .OH ở vòng A hoặc B

Dihydrochalcon: đó là chalcon mất dây nối đôi α và β Ít gặp và chất tiêu biểu là

phloridzin trong quả táo

Auron: cấu trúc là một hệ thống hai benzylliden coumaron cho màu vàng của một

số hoa

Antoxyanidin: khác với các flavonoid khác là không có nhón cacbonyl ở C4 và luôn

có các nhóm oza (như glucoza, galactoza, arabinoza, fructoza) gắn vào .OH

Leucoantoxyanidin: là 3,4-diol flavan không màu Nhưng trong môi trường acid

biến thành antoxyanidin có màu hồng hoặc đỏ

Isoflavonoid: là chất cụ thể của isoflavonoid Và khác với flavonoid ở chỗ vòng B

không gắn ở C2 mà gắn ở C3

Rotenoid: có cấu trúc couman-croman 4 vòng là dẫn xuất của isoflavonon Đã biết

tới 15 chất rotenoid và chất quan trọng là rotenon

Neoflavonid: đây là hợp chất có khung cấu trúc là 4-aril croman

Biflavonoid: đây là những flavonoid dimer và trimer Nó được tạo thành từ flavon,

flavanon, dihydroflavonol, chalcon, auron [18], [19]

Isoflavonoid Flavonol

1.2.1.3 Tác dụng sinh học của flavonoid

Flavonoid có nhiều tác dụng sinh học, trong đó nổi bật nhất ở hầu hết các nhóm flavonoid là chống oxy hóa Flavonoid thể hiện tác dụng chống oxy hóa theo 3 cách: flavonoid ức chế enzym hoặc tạo phức với các ion kim loại tham gia xúc tác nhiều phản ứng oxy hóa (các enzym tham gia vào phản ứng oxy hóa như: microsomal monooxygenase, glutathion S-transferase, mitochondrial succinoxidase, NADH oxidase …); flavonoid bắt giữ các gốc tự do (flavonoid nhường 1 nguyên tử hidro cho gốc tự do để trung hòa gốc tự do), gây ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế bào; flavonoid giúp cải thiện hệ thống chống oxy hóa nội sinh của cơ thể [49]

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng bắt gốc tự do của flavonoid [50]

Flavonoid có khả năng tạo liên kết phức hợp với trung tâm hoạt động của các enzym làm giảm quá trình chuyển hóa tạo ra các gốc tự do cũng như bắt giữ các gốc kim loại tự do giúp giảm các gốc tự do tồn tại trong trong cơ thể [50], [65]

Hình 1.6 Gốc kim loại gắn vào flavonoid [63]

Trên tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavonol có tác dụng thông tiểu [19]

Theo nhiều nghiên cứu chứng minh flavonoid có hoạt tính ức chế nhiều loại enzym như phosphodiesterase, aldose reductase, lipoxygenase, cyclooxygenase Ví dụ như hợp chất flavonoid jaceosidin có khả năng ức chế hoạt động của cyclooxygenase với

IC50 = 2,8 mM Masayoshi Iio và cộng sự (1985) đã chứng minh myricetin, kaempferol, quercetin, fisetin, quercitrin và morin có hoạt tính ức chế xanthin oxidase với IC50 lần lượt là 2, 2, 3, 7, 15, 19 µM Flavonoid có khả năng ức chế xanthin oxidase, chính nhờ liên kết kép của C2 = C3 các nhóm .OH trong cấu trúc của flavonoid làm tăng khả năng liên kết phức hợp với trung tâm hoạt động của xanthin oxidase và

ức chế xanthin oxidase [24], [55]

1.2.2 Tannin

1.2.2.1 Khái niệm chung về tannin

Tannin là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát, dương tính với phản ứng thuộc da Cơ chế thuộc da được giải thích do tannin có nhiều nhóm .OH phenol, tạo nhiều dây nối hydro với mạch polypeptid và protein [19]

Hình 1.7 Cấu trúc của tannin [19]

1.2.2.2 Phân loại tannin

Tannin thủy phân được hay tannin pyrogallic: khi thủy phân bằng acid thì được giải phóng ra phần đường và phần không đường Phần đường thường là glucose, đôi khi gặp đường đặc biệt như là đường hamamelose

Tannin ngưng tụ hay còn được gọi là tannin không thủy phân, tannin pyrocatechic hay phlobatamin Các chất thuộc nhóm này là những polyflavonoid thường được tạo thành do ngưng tụ từ các đơn vị flavan-3-ol hoặc flavan-3,4-diol

Tannin hỗn hợp: loại này được tạo thành trong cây do sự kết hợp giữa tannin pyrogallic và tannin pyrocatechic Trong phân tử có dây nối C-glycosid giữa C6 hay

C8 của flavonoid và C1 của glucose Những cacbon còn lại của glucose thì nối với hexahydroxyphenic theo dây nối ester [19]

1.2.2.3 Tác dụng sinh học của tannin

Ở trong cây, tannin tham gia vào quá trình trao đổi chất và các quá trình oxy hóa khử Là những hợp chất polyphenol có vị chát, tannin cũng là những chất bảo vệ cho cây chống lại sự xâm hại của vi khuẩn, nấm mốc gây bệnh, côn trùng và các gia súc

1.3.1 Khái niệm về bệnh gout

Bệnh gout là một dạng viêm khớp do sự tích tụ của tinh thể natri urat hình kim tại các khớp và dịch bao khớp Gout có đặc điểm chính là tăng acid uric ở mức cao trong máu và nước tiểu do rối loạn chuyển hoá các nhân purin [2], [75]

Bệnh gout có 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1: nồng độ acid uric trong máu cao (không triệu chứng)

Giai đoạn 2: viêm khớp cấp tính Các tinh thể acid uric bắt đầu tích tụ trong chất

dịch ở khớp, thường là 1 khớp (phổ biến nhất là ngón chân cái) gây sưng đau

Giai đoạn 3: đau cách khoảng Ở giai đoạn này, bệnh nhân không thấy triệu chứng

trong thời gian giữa 2 lần đau Ở nhiều người, giai đoạn này tiến triển chậm khi các cơn đau xảy ra thường hơn Những cơn sau có thể đau hơn, lâu hơn và xảy ra ở nhiều khớp hơn

Giai đoạn 4: gout mãn tính Nếu triệu chứng gout tái đi tái lại mà không điều trị

trong 10 năm hay lâu hơn, chúng có thể trở thành mãn tính và thường tấn công nhiều khớp hơn Có thể không còn khoảng cách giữa các cơn đau Giai đoạn này thường bị nhầm với các dạng viêm khớp khác, nhất là viêm xương khớp

Đến lúc này, đã đủ tinh thể acid uric tích tụ trong cơ thể tạo thành cục lồi thường xuất hiện dưới da Mà ở bên trong các cục lồi chứa các tinh thể urat trông giống phấn bảng gọi là hạt tophi (topus), những cục này có kích thước từ vài milimet đến nhiều centimet, hơi chắc hoặc mềm Vậy, bản chất của các hạt tophi là tinh thể urat Lớp da trên đó có thể mỏng và đỏ Những cục tophi sát da có thể có màu kem hay vàng [11]

1.3.2 Xanthin oxidase

Xanthin oxidase là enzym xúc tác hai phản ứng cuối cùng trong quá trình sinh tổng hợp acid uric của cơ thể Do đó, hoạt tính của enzym này ảnh hưởng trực tiếp đến nồng độ acid uric trong máu và nước tiểu Xanthin oxidase được tìm thấy ở nhiều loài động vật có vú, chim, côn trùng, vi khuẩn; phân bố rộng rãi ở trong thận, tim, phổi

và nội mạc mạch máu, đặc biệt tập trung chủ yếu ở gan và ruột non động vật có vú

1.3.2.1 Những đặc điểm cơ bản của xanthin oxidase

Xanthin oxidase thuộc họ enzym chưa molybden, là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lượng là 290 kDa (kilo dalton), chứa 2 tiểu đơn vị tương đồng Mỗi tiểu đơn vị của protein gồm 3 domain đó là một cofactor molybden, một phần chứa hai tâm sắt - lưu huỳnh [2Fe-2S], một phần là flavin adenin dinucleotid (FAD) cofactor Cofactor molybden là dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác Các quá trình oxy hóa của xanthin oxidase diễn ra tại trung tâm molybdoterin (Mo-pt), hóa trị của kim loại từ VI về IV và các electron được vận chuyển nhanh chóng tới phân tử oxy tại flavin adenin dinucleotid (FAD) cofactor qua trung gian là trung tâm sắt-lưu huỳnh [35], [76]

Hình 1.8 Cấu trúc trung tâm hoạt động của xanthin oxidase [35], [76]

1.3.2.2 Chức năng của xanthin oxidase đối với cơ thể

Xanthin oxidase có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa purin tạo sản phẩm cuối cùng là acid uric

Hình 1.9 Sơ đồ xanthin oxidase xúc tác sinh tổng hợp acid uric trong cơ thể [73]

Xanthin oxidase xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric đồng thời tạo ra gốc tự do superoxid và hydrogen peroxid, các gốc tự

do superoxid tự sinh dưới ảnh hưởng của superoxid dismutase (SOD) chuyển thành hydrogen peroxid và oxy [49] Những phản ứng này có thể được viết theo các phương trình phản ứng như sau:

Hypoxanthin + O2 + H2O → Xanthin + H2O2Xanthin + 2O2 + H2O → Uric acid + 2O2∙+ 2H+2O2.- + 2H+ → H2O2 + O2

Xanthin oxidase là một nguồn sản xuất các phân tử chứa oxy có khả năng hoạt động hóa học mạnh (reactive oxygen species- ROS)- những tác nhân oxy hóa ở các

tế bào, cơ quan trong cơ thể H2O2 và 2O2. là những chất gây độc cho tế bào do tổn thương phá hủy DNA, phá vỡ màng tế bào làm giải phóng Ca2+, có liên quan đến một

số bệnh lý như viêm, xơ vữa động mạch, ung thư [43]

Phản ứng oxy hóa hypoxanthin và xanthin dưới xúc tác của xanthin oxidase được coi là một nguồn chủ yếu sinh ROS ROS là một sản phẩm bình thường của quá trình trao đổi chất trong cơ thể con người, có rất nhiều phản ứng sinh ra ROS Khi ROS được sản xuất quá mức sẽ làm tổn thương các tế bào, mô và gây nhiều bệnh lý [43]

Do đó, xanthin oxidase không đơn thuần chỉ có vai trò quan trọng trong bệnh sinh gout mà nó còn có vai trò quan trọng trong nhiều bệnh lý khác như suy tim mãn tính, đái tháo đường, suy thận, đột quỵ, các bệnh thần kinh như Alzheimer, Parkinson, Xanthin oxidase xúc tác quá trình hydroxyl hóa dị vòng thơm như purin, pteridin, các hợp chất chứa nhóm nitro thơm Xanthin oxidase khử nhóm nitro và hoạt động như một nitroreductase Xanthin oxidase tham gia vào quá trình oxy hóa các nhóm sulfhydryl trong glutathion, acid béo, phospholipid, ethanol, amin hữu cơ, Xanthin oxidase cũng xúc tác quá trình iod hóa protein bằng iod hữu cơ Xanthin oxidase là nguồn cung cấp các chất nhận điện tử như các gốc tự do superoxid, là nguồn cung cấp các chất điện tử cho các phản ứng liên hợp

Các liệu pháp ức chế xanthin oxidase có hai ý nghĩa trong dự phòng và điều trị một

số bệnh lý Thứ nhất, các hợp chất ức chế xanthin oxidase sẽ làm giảm tổng hợp acid uric, rất có ý nghĩa trong phòng và điều trị các bệnh lý liên quan đến tăng acid uric trong đó có bệnh gout Thứ hai, các chất ức chế xanthin oxidase là các chất chống oxy hóa làm giảm sự hình thành các gốc tự do nên có vai trò trong phòng và điều trị các bệnh do gốc tự do gây ra [64]

1.3.3 Quá trình sinh tổng hợp và đào thải acid uric

Acid uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa của purin trong các tế bào của cơ thể dưới tác dụng của xanthin oxidase Xanthin oxidase xúc tác phản ứng biến đổi hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric Trong uricase máu sẽ chuyển acid uric thành allantoin, đưa đến thận và thải ra ngoài qua nước tiểu và đường đại tiện, hàm lượng acid uric trong huyết thanh bình thường < 2 mg/dL Phần lớn acid uric trong máu ở dạng tự do, chỉ khoảng < 4% gắn với protein huyết thanh Vì vậy,

sự ức chế hoạt tính xanthin oxidase có thể làm giảm acid uric

Tổng hợp: Acid uric được tạo thành từ 3 nguồn với sự tham gia của các nuclease,

xanthin oxidase, hypoxanthin guanin phosphoribosyl transferase: (1) Thoái biến từ

thực phẩm có nhân purin; (2) Thoái biến từ chất có nhân purin trong cơ thể, ví dụ như acid deoxyriboncleic (DNA) và acid riboncleic (RNA); (3) tổng hợp các purin từ con đường nội sinh

Thải trừ: Để cân bằng, hàng ngày acid uric được thải trừ chủ yếu theo đường thận

(450 – 550 mg/24 giờ), một phần qua đường đại tiện [2], [73]

Hình 1.10 Con đường đào thải acid uric [73]

1.3.4 Cơ chế bệnh sinh của gout

Cơ chế bệnh sinh của gout là sự gia tăng acid uric máu Tăng acid uric được định nghĩa là khi nồng độ acid uric máu vượt quá giới hạn trong huyết tương: nam trên 7,0 mg/dL (tức trên 420 µmol/L); nữ trên 6,0 mg/dL (tức trên 360 µmol/L) Khi nồng độ acid uric trong huyết tương tăng cao dẫn tới tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi Sự lắng đọng của các hạt này tại các vị trí khác nhau sẽ gây nên các tổn thương khác nhau Tại sụn khớp, khi các hạt này vỡ ra, sẽ khởi phát cơn gout cấp, sự lắng đọng của các vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch, trong mô sụn

và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gout Sự có mặt vi tinh thể urat tại mô mềm bao gồm tạo nên các hạt tophi và cuối cùng lắng động tại tổ chức kẽ của thận gây viêm thận kẽ Như vậy, việc tác động vào các yếu tố tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric sẽ là một trong các cách làm thay đổi nồng độ acid uric máu [23]

1.3.5 Hậu quả tăng acid uric máu

Đối với bệnh nhân có acid uric máu tăng cao có thể có triệu chứng đau hoặc không đau tại các khớp đó là một đặc điểm với cả gout cấp tính và mãn tính Gout có thể gây ra các đợt gout cấp tính thường gặp ở các chi dưới như khớp chân cái, gối, khớp

cổ chân, vành tai, mỏm khủy, bàn chân, bàn tay, cổ ta, thời gian tiến triển vài năm đến vài chục năm Tuy nhiên nhiều nghiên cứu gần đây chứng minh tăng aicd uric

máu có mối quan hệ với tăng huyết áp, thông qua thí nghiệm gây tăng acid uric ở chuột Sprague – Dawley [51]

Xanthin oxidase là một enzym xúc tác cho quá trình oxy hóa xanthin và hypoxanthin thành acid uric Trong điều kiện hàm lượng acid uric ở giá trị bình thường (4 mg/ml - 7 mg/ml) thì acid uric hoạt động như chất chống oxy hóa; tuy nhiên khi hoạt tính xanthin oxidase tăng sẽ dẫn đến acid uric máu tăng vượt mức giá trị bình thường và quá trình chuyển hóa xanthin sẽ tạo ra nhiều gốc tự do superoxid

và hydrogen peroxid vượt mức kiểm soát của cơ thể dẫn đến stress oxy hóa Các gốc

tự do superoxid tự sinh hoặc dưới ảnh hưởng của superoxid dismutase (SOD) chuyển thành hydrogen peroxid và oxy gây kích thích hoạt động NADPH oxidase, làm tăng sản xuất ROS, kích hoạt kinase MAP p38 và ERK ½, làm tăng quá trình nitrosyl hóa protein, làm tăng LOO., oxy đơn bội gây tăng quá trình peroxy hóa lipid tế bào; cũng

là một trong những yếu tố dẫn đến kháng insulin và bệnh tim mạch [32]

1.3.6 Thuốc điều trị bệnh gout

1.3.6.1 Thuốc chống viêm

Colchicin

Colchicin có tác dụng giảm đau và chống viêm đặc hiệu với cơn gout cấp tính Colchicin cũng ngăn cản natri urat lắng đọng bằng cách trực tiếp làm bạch cầu đa nhân giảm sản xuất acid lactic và làm giảm thực bào nên gián tiếp giảm tạo tính acid (vì tính acid sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các vi tinh thể urat lắng đọng) Khi uống colchicin trong vòng vài giờ đầu đợt gout cấp, trên 90% người bệnh đáp ứng tốt; nếu uống muộn hơn, sau 24 giờ, chỉ 75% người bệnh đáp ứng tốt

Colchicin được coi là thuốc đứng hàng thứ hai Vì colchicin có độc tính cấp khi dùng liều cao, nên có thể dùng để điều trị đợt gout cấp khi mà bệnh nhân không đáp ứng hoặc không dung nạp được các thuốc chống viêm không steroid như indometacin, ibuprofen, naproxen Colchicin có cửa sổ điều trị hẹp, có thể biểu hiện gây độc tính toàn thân nếu quá liều: rối loạn tiêu hóa (buồn nôn, nôn, đau bụng, tiêu chảy); nổi mề đay, phát ban dạng sởi, giảm bạch cầu, tiểu cầu, rối loạn thần kinh cơ; gây ức chế tủy xương, viêm dây thần kinh, độc với gan, thận; gây đông máu nội mạch rải rác, rụng tóc [11]

Các thuốc chống viêm không steroid

Các NSAIDs thường dùng trong điều trị cơn viêm khớp gout cấp như diclofenac, indomethacin, naproxen, ibuprofen, piroxicam…, các nhóm thuốc ức chế chọn lọc COX-2 (celecoxib, etoricoxib…) Các thuốc này thường được chỉ định đơn trị liệu hay phối hợp với colchicin nhằm giảm đau trong các cơn gout cấp

Đặc biệt, đối với người cao tuổi và người có bệnh kèm theo thì cần thận trọng và cân nhắc khi dùng chỉ nên sử dụng các thuốc này trong thời gian ngắn với liều thấp Thuốc cần tránh dùng đối với bệnh nhân bị suy gan, suy thận nặng, viêm loét dạ dày

- tá tràng tiến triển hay bệnh lý chảy máu không được kiểm soát đang dùng thuốc chống đông Lưu ý không nên phối hợp các thuốc trong cùng nhóm do không tăng tác dụng điều trị mà lại gia tăng các tác dụng phụ

Tác dụng không mong muốn của các thuốc chống viêm không steroid chủ yếu liên quan đến tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin; ảnh hưởng đến hệ thống tiêu hóa (kích ứng, đau thượng vị, nặng hơn có thể loét dạ dày tá tràng, xuất huyết tiêu hóa); kéo dài thời gian chảy máu do ức chế kết tập tiểu cầu, giảm tiểu cầu và giảm prothrombin; giảm lưu lượng máu qua thận, giảm sức lọc cầu thận, giảm thải dẫn đến

ứ nước, tăng kali máu và viêm thận kẽ; gây cơn hen giả trên người không bị hen hoặc làm tăng các cơn hen ở người hen phế quản; mẫn cảm (ban da, mề đay, sốc quá mẫn); gây độc với gan [11], [23]

tá tràng; vết thương chậm lên sẹo, dễ nhiễm trùng; tăng đường huyết hoặc làm nặng thêm bệnh đái tháo đường; nhược cơ, teo cơ, mỏi cơ; loãng xương, xốp xương; rối

loạn phân bố mỡ; suy thượng thận cấp khi ngừng thuốc đột ngột; các tác dụng không mong muốn khác như: đục thủy tinh thể, mất ngủ, rối loạn tâm thần [9]

1.3.6.2 Thuốc giảm acid uric máu

Nhóm thuốc tăng thải acid uric

Các thuốc trong nhóm bao gồm: probenecid (250 mg - 3000 mg/ngày), sulfinpyrazon (100 – 800 mg/ngày), benzbromarone Các thuốc này có tác dụng tăng đào thải acid uric qua nước tiểu do cạnh tranh với acid uric trên hệ thống vận chuyển anion ở ống thận Chỉ định nhóm này cần xét nghiệm acid uric niệu Chống chỉ định khi acid uric niệu trên 600 mg/24 giờ, suy thận, sỏi thận, người cao tuổi, gout mạn có hạt tophi Đôi khi có thể dùng phối hợp allopurinol với một loại thuốc tăng đào thải acid uric

Trong giai đoạn khởi đầu (6 - 12 tháng đầu), khi sử dụng nhóm thuốc này có thể gây cơn gout cấp do tăng tạm thời acid uric máu, trong khi thuốc chưa đủ nồng độ để

ức chế hoàn toàn sự tái hấp thu acid uric Vì vậy, nên sử dụng thêm một liều nhỏ colchicin trước và trong giai đoạn các tháng đầu của đợt điều trị Ngoài ra, trong giai đoạn này cũng có thể tạo sỏi thận do acid uric niệu tăng nên cần uống nhiều nước để duy trì lượng nước tiểu ít nhất 2 lít/ngày và phải kiềm hóa nước tiểu để tránh tạo sỏi urat[20]

Nhóm thuốc ức chế tổng hợp acid uric

Febuxostat

Febuxostat là thuốc ức chế xanthin oxidase mới, không có nhân purin, có tác dụng làm giảm sản xuất acid uric Thuốc này được chỉ định kết hợp với allopurinol hoặc thay thế khi không đáp ứng hoặc không dung nạp hay dị ứng với các thuốc kinh điển Liều khởi đầu 40 mg/ngày, tăng dần tới 120 mg/ngày Thuốc không cần chỉnh liều ở bệnh nhân suy thận mạn [9]

Allopurinol

Allopurinol là chất ức chế mạnh xanthin oxidase làm giảm sinh tổng hợp acid uric, giảm nồng độ acid uric máu và nước tiểu Allopurinol không những làm các sạn urat hòa tan dễ dàng, ngăn chặn tiến triển thành viêm khớp mạn mà còn làm tăng đào thải

qua thận các tiền chất oxypurin, do đó làm giảm nguy cơ sỏi thận và bệnh thận Như

vậy, allopurinol vừa làm giảm sản xuất vừa làm tăng thải acid uric [20], [34]

Hình 1.11 Sơ đồ allopurinol ức chế xanthin oxidase [47]

Allopurinol dùng để điều trị: tăng acid uric máu do viêm khớp gout cấp và mạn tính, tăng acid uric máu khi dùng hóa trị liệu điều trị ung thư, bệnh sỏi thận do acid uric (kèm theo hoặc không kèm theo viêm khớp do gout), điều trị sỏi calci oxalat tái phát ở nam có bài tiết urat trong nước tiểu trên 750 - 800 mg mỗi ngày

Cách dùng: allopurinol dùng đường uống hoặc đường truyền tĩnh mạch Đường truyền tĩnh mạch chỉ dùng khi bệnh nhân không dung nạp được bằng đường uống Liều dùng của allopurinol khác nhau tùy theo mức độ bệnh và được điều chỉnh theo đáp ứng và dung nạp của bệnh nhân

Bệnh nhân mắc bệnh gout: liều khởi đầu 100 mg/kg/ngày, tăng dần sau mỗi tuần thêm 100 mg, đến khi nồng độ urat trong huyết thanh giảm xuống 0,36 mmol/l (6 mg/100 ml) hoặc thấp hơn hoặc cho tới khi đạt tới liều tối đa khuyến cáo 800 mg/kg trọng lượng người/ngày Liều thường dùng mỗi ngày ở người lớn trong trường hợp bệnh nhẹ là 200 - 300 mg/kg/ngày, gout có sạn urat (tophi) trung bình là 400 - 600 mg/kg/ngày Liều trên 300 mg/kg/ngày phải chia nhiều lần để giảm nguy cơ kích ứng

dạ dày Sau khi nồng độ urat huyết thanh đã được kiểm soát, có thể giảm liều Liều duy trì trung bình ở người lớn là 300 mg/kg/ngày và liều tối thiểu có tác dụng là 100

- 200 mg/kg/ngày

Phản ứng có hại của thuốc allopurinol thông thường nhất là nổi ban trên da xảy ra

ở khoảng 10% bệnh nhân sử dụng thuốc, phản ứng này thường gặp hơn ở bệnh nhân

có bệnh thận và bệnh nhân đang sử dụng thuốc lợi tiểu thiazid, có liên quan chặt chẽ với nồng độ cao của oxypurinol trong huyết thanh Các bệnh phát ban thường gặp nhất là ban dát sần kèm theo ngứa, thỉnh thoảng gặp ban xuất huyết Phát ban, mày đay, ngứa có thể là chỉ là dấu hiệu của quá mẫn hoặc có thể là một phần của phản ứng toàn thân Các phản ứng mẫn cảm nghiêm trọng hơn có thể xảy ra bao gồm Stevens Johnson Syndrome – hội chứng Stevens Johnson (SJS) - viêm da tróc vảy và Toxic epidermal necrolysis (TEN) - nhiễm độc hoại tử biểu bì da Các triệu chứng khác của quá mẫn bao gồm sốt và ớn lạnh, hạch to, giảm bạch cầu hoặc tăng bạch cầu, tăng bạch cầu eosin, đau khớp viêm mạch dẫn đến tổn thương thận và gan Phản ứng quá mẫn của allopurinol có thể nặng, thậm chí gây tử vong, đặc biệt có nguy cơ cao ở những bệnh nhân suy gan hoặc thận Ngoài phản ứng trên da, allopurinol còn có thể gây các phản ứng có hại khác biểu hiện trên nhiều hệ cơ quan trong cơ thể: máu, thần kinh, tiêu hóa, mắt, gan,… Các phản ứng có hại của thuốc này cũng có báo cáo nhưng hiếm gặp như: dị cảm, bệnh thần kinh ngoại biên, rụng tóc, rối loạn vị giác, rối loạn thị giác, đau bụng, tiêu chảy Bệnh nhân gout có thể bị tăng các đợt gout cấp khi bắt đầu điều trị bằng allopurinol và thường giảm sau vài tháng [11], [20], [28]

Hình 1.12 Các thuốc điều trị bệnh gout [78]

1.4 Mô hình thực nghiệm gây tăng acid uric máu

Sử dụng fructose: Fructose khi vào cơ thể sẽ được phosphoryl hóa bởi ATP, nếu

lượng fructose đưa vào càng nhiều thì cơ thể sẽ tiêu thụ nhiều ATP làm tích lũy ngày càng nhiều AMP và ADP, những chất này nhanh chóng chuyển thành acid uric làm tăng acid uric máu [70]

Sử dụng acid oxonic: Acid oxonic ức chế uricase dẫn đến ức chế thoái hóa acid

uric, làm tăng nồng độ acid uric máu Acid oxonic có thể sử dụng bằng đường uống (750 mg/kg trọng lượng chuột) hoặc ăn thức ăn (có chứa 2% acid oxonic) Thời gian này gây tăng tùy thuộc vào mô hình, cho động vật uống acid oxonic liên tục có thể gây tăng acid uric 5 ngày, 5 tuần Cho chuột ăn thức ăn chứa acid oxonic có thể gây tăng acid uric trong 7 – 9 tuần [55]

Sử dụng cao nấm men: Cao nấm men được sử dụng bằng cách để cho tế bào nấm

men Saccharomyces cerevisiae tự phân hủy để loại bỏ vỏ tế bào Cao nấm men gây

rối loạn chuyển hóa purin bằng cách kích thích xanthin oxidase, thúc đẩy quá trình chuyển hóa tiền chất hypoxanthin và xanthin thành acid uric, do đó làm tăng hàm lượng acid uric tương tự như quá trình tăng acid uric trên người có chế độ ăn nhiều protein chứa nhân purin Liều gây tăng acid uric được xác định trên thực nghiệm là

30 g/kg trọng lượng chuột/ngày và 20 g/kg trọng lượng chuột/ngày [52]

Sử dụng kết hợp adenin và kali oteracil: adenin là tiền chất tổng hợp acid uric;

kali oteracil ức chế hoạt động của uricase tạo ra những tinh thể urat tích tụ ở ống thận dẫn đến gây viêm thận, làm cho quá trình đào thải acid uric càng khó hơn Sự kết hợp của hai tác nhân này được áp dụng để thiết lập mô hình gây tăng acid uric máu mạn trên chuột trong thời gian 15 - 45 ngày Jiao Huo và cộng sự (2018) đã chứng minh khi kết hợp adenin liều 50 - 100 mg/kg và kali oteracil liều 1,5 g/kg ở chuột cống đực Sprague Dawley làm tăng hàm lượng acid uric, creatinin, urea trong huyết tương sớm

và kéo dài đến ngày 45 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý; còn nhóm gây tác động chỉ bằng kali oteracil liều 1,5 g/kg cũng làm gia tăng đáng kể hàm lượng acid uric máu theo thời gian, nhưng không có sự gia tăng của cretinin và urea [48]

Sử dụng kali oxonat: Trong máu ở các động vật gặm nhấm có sự hiện diện của

uricase làm chuyển hóa acid uric máu trong huyết tương Vì vậy, để làm cho các động

vật gặm nhấm tăng acid uric máu thì cần làm giảm hoạt động của uricase Hiện nay, phương pháp sử dụng phổ biến nhất là dùng chất ức chế uricase như kali oxonat Cơ chế gây tăng acid uric máu của kali oxonat: Kali oxonat sẽ có thể cạnh tranh vị trí gắn vào trung tâm hoạt động của uricase với acid uric nên acid uric không thể gắn vào uricase, nồng độ acid uric trong máu sẽ tăng cao vượt mức bình thường Do đó, uricase không xúc tác phản ứng chuyển hóa acid uric thành 5-hydroxyisourat (5-HIU) trong chuỗi phản ứng chuyển hóa acid uric thành allantoin dẫn đến nồng độ acid uric trong máu sẽ tăng lên [40]

Hình 1.13 Sơ đồ kali oxonat ức chế sự chuyển hóa acid uric [40]

Kali oxonat có thể được sử dụng trong mô hình gây tăng acid uric máu cấp và mạn thực nghiệm Kali oxonat tiêm màng bụng liều duy nhất 250 - 500 mg/kg trọng lượng chuột nhắt trắng có khả năng gây tăng acid uric máu cấp sau 2 và 3 giờ Do mô hình gây tăng acid uric máu bằng kali oxonat được sử dụng rộng rãi vì đáp ứng nhanh và cho kết quả khả quan, nên đề tài chọn mô hình này để làm thực nghiệm [5], [7]

1.5 Một số dược liệu có tác dụng hạ acid uric

Bảng 1.1 Thống kê một số dược liệu có tác dụng hạ acid uric

Tên dược liệu- tên khoa học Kết quả đạt được

Lá đại bi

Blumea balsamifera L (DC)

Họ Asteraceae

Cao chiết ethanol 48% và cao chiết nước từ lá Đại

bi có hoạt tính ức chế xanthin oxidase với IC50 lần lượt là 170,7 µg/ml và 170,5 µg/ml; có tác dụng làm giảm hàm lượng acid uric trong huyết tương

ở mô hình gây tăng acid uric cấp và mạn tính [5]

lý ở cả 2 phác đồ điều trị và dự phòng trên mô hình gây tăng acid uric máu chuột bằng kali oxonat [4]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Địa điểm thực hiện: các nghiên cứu của đề tài thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lý- Hóa sinh trực thuộc Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM

Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2017 đến tháng 12/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu lá Sa kê khô được thu hái vào tháng 11 - 12/2016 tại tỉnh Đồng Tháp, được Bộ môn Tài nguyên Dược liệu-Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM định danh

và lưu mẫu Đề tài dựa vào kinh nghiệm và các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước chứng minh khi chiết lá Sa kê màu vàng nâu (đã khô và rụng từ trên cây xuống) cho hiệu suất, hoạt chất thứ cấp cao hơn lá Sa kê tươi [26], cho nên đề tài chọn lá Sa

kê vàng khô rụng từ trên cây xuống để nghiên cứu Lá Sa kê khô thu về được xử lý sạch, phơi râm, xay thành bột có kích thước qua cỡ mắc rây số 250(0,25 mm)[8]

2.2.2 Động vật thí nghiệm

Các thử nghiệm in vivo được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực (Swiss albino), 5

- 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 25 ± 2g Chuột và thực phẩm nuôi được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - TP Nha Trang.Thể tích cho uống (p.o.) hay tiêm phúc mạc (i.p.) là 10 ml/kg trọng lượng chuột Các thí nghiệm trên động vật nghiên cứu được thực hiện theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế (ban hành kèm theo quyết định số 141/QĐ – K2ĐT ngày 27/10/2015)

2.2.3 Thiết bị

Máy đo sinh hóa bán tự động Screen Master 3000 (Arezzo, Ý), cân phân tích Mettler Toledo AB-204 (Switerland), máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, máy ly tâm (Boeco, Đức), thiết bị nghiền đồng thể (IKA Works, Malaysia), máy ly tâm lạnh Hermle (Sigma, Mỹ), bể cách thủy Memert (Đức), thiết bị đánh siêu âm Branson (Mỹ), máy khuấy từ VELP (cộng đồng chung châu Âu), máy đo pH Hanna (Trung Quốc), tủ sấy dụng cụ KC-65 (Đức), máy cô quay Buchi (Thụy Sĩ)

2.2.4 Hóa chất

1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl, acid thiobarbituric, xanthin, xanthin oxidase, kali oxonat, allopurinol (Sigma, Mỹ); acid ascorbic (Merck, Đức); Trolox (Calbiochem Ltd Co.); bộ kit định lượng acid uric (Human Co., Đức); ethanol 96% (Cty Dược

phẩm OPC- Việt Nam); diethyl ether, chloroform, n- butanol, ethyl acetat, NaCl và

một số dung môi hóa chất dùng trong phòng thí nghiệm (Trung Quốc)

2.2.5 Dụng cụ

Kim chuyên dụng cho chuột uống (Hàn Quốc), ống chống đông máu chứa 1 ml acid ethylendiaminetetraacetic (Hồng Thiện Mỹ, Việt Nam), becher 50 - 100 ml, đũa thủy tinh (Trung Quốc) và một số dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm

2.3 Sơ đồ nghiên cứu của đề tài

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu đề tài

2.4 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

2.4.1 Sàng lọc cao chiết tổng tiềm năng

2.4.1.1 Xác định mất khối lượng do làm khô của bột lá Sa kê

Muốn bảo quản dược liệu/cao chiết tránh hiện tượng meo mốc, hoạt chất trong dược liệu bị biến đổi thì dược liệu/cao chiết phải có giá trị mất khối lượng do làm khô không quá một giới hạn nào đó (được gọi là giá trị mất khối lượng do làm khô an toàn) Với đa số dược liệu có mất khối lượng do làm khô an toàn không quá 13%; và cao chiết có mất khối lượng do làm khô an toàn không quá 20% (cao đặc) theo quy định Dược điển Việt Nam V [8], [10]

mg Tiến hành lặp lại 3 lần đối với từng mẫu thử

Tính kết quả

Mất khối lượng do làm khô được tính theo công thức: X = 𝑎−𝑏

𝑎 x 100 Trong đó: X: Mất khối lượng do làm khô dược liệu/cao chiết, tính ra phần trăm a: khối lượng dược liệu/cao chiết khi chưa sấy (g)

b: khối lượng dược liệu/cao chiết khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

2.4.1.2 Chiết nóng

Chiết nóng được thực hiện nhằm mô phỏng lại cách sử dụng dược liệu trong dân gian, nhằm so sánh công dụng cao được chiết bằng phương pháp này với các phương pháp khác Ưu điểm chiết nóng đó là thực hiện đơn giản, có khả năng hòa tan nhiều chất tan trong nước là cao nhất và quá trình hòa tan diễn ra nhanh Nhược điểm của phương pháp này là năng suất thấp, chiết một lần thì không kiệt, chiết nhiều lần cần

nhiều dung môi nước [8]