Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn châu phi gây bệnh trên lợn tại việt nam

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI GÂY BỆNH TRÊN L

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI GÂY BỆNH

TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện : Đặng Ngọc Trân MSSV : 1711545286 GVHD : TS Thân Văn Thái

TP HCM, 2020

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN VIRUS DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI GÂY BỆNH

TRÊN LỢN TẠI VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện : Đặng Ngọc Trân

Mã số sinh viên : 1711545286 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Thân Văn Thái

TP HCM, 2020

- -oOo -

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1 Đầu đề luận văn:

Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam

2 Mục tiêu

- Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam

3 Nội dung:

- Phát hiện được ASFV bằng phản ứng PCR

- So sánh được mức độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp mồi với mẫu ASFV gây bệnh trên lợn tại Việt Nam

- Giải trình tự và phân tích được một số gen trong phản ứng PCR

4 Thời gian thực hiện: tháng 06/2020 đến tháng 09/2020

5 Người hướng dẫn chính: TS Thân Văn Thái

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn

TP HCM, ngày…… tháng……năm20…

Khoa/Bộ môn Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

i

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự nỗ lực của bản

thân, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, anh chị, bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Thân Văn Thái đã hướng

dẫn nhiệt tình, giúp đỡ, khích lệ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện

khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo khoa và toàn thể quý Thầy Cô

giảng dạy tại khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã nhiệt

tình hỗ trợ cũng như cung cấp cho tôi những kiến thức sâu rộng để tôi có nền tảng

nghiên cứu đề tài

Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè đặc biệt là khóa K17, cha mẹ cũng như

gia đình đã luôn bên cạnh khích lệ tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thời gian

tập trung thực hiện đề tài này

Trong quá trình thực hiện luận văn, mặc dù bản thân đã cố gắng hoàn thiện,

nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy tôi rất mong nhận được sự

chỉ dẫn, đóng góp của quý Thầy Cô và bạn đọc để khóa luận được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Đặng Ngọc Trân Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

TÓM TẮT v

SUMMARY vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

ĐẶT VẤN ĐỀ x

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan về African swine fever virus 1

1.1.1 Phân loại khoa học 1

1.1.2 Đặc điểm hình thái 1

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc 1

1.2 Tổng quan về dịch tả lợn Châu Phi 3

1.2.1 Triệu chứng 3

1.2.2 Cơ chế gây bệnh 4

1.2.3 Phương thức lây nhiễm 5

1.2.4 Dịch tễ học 7

1.2.5 Các biện pháp phòng chống và ngăn chặn 9

1.3 Các phương pháp chẩn đoán ASFV 9

1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 9

1.3.2 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 10

1.4 Kỹ thuật điện di 13

iii

1.4.1 Nguyên lý 13

1.4.2 Các kỹ thuật điện di 10

1.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 13

1.6 Xây dựng cây phát sinh loài 15

1.7 Tình hình nghiên cứu bệnh dịch tả lợn Châu Phi 15

1.7.1 Các nghiên cứu trên thế giới 15

1.7.2 Các nghiên cứu trong nước 18

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Địa điểm thực hiện 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.4 Vật liệu nghiên cứu 20

2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 20

2.4.2 Hóa chất, thuốc thử 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.1 Thu mẫu 21

2.5.2 Tách chiết DNA 21

2.5.3 PCR phát hiện 22

2.5.4 Phương pháp điện di 24

2.5.5 Giải trình tự, xây dựng cây phả hệ 25

2.5.6 So sánh độ nhạy của cặp mồi trong phản ứng PCR 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả thu mẫu 27

3.2 Kết quả PCR phát hiện 27

3.3 Kết quả so sánh độ nhạy của các cặp mồi 29

iv

3.4 Kết quả giải trình tự gen 34

3.5 Kết quả xây dựng cây phát sinh loài 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 40

v

TÓM TẮT

Virus gây bệnh dịch tả lợn ở Châu Phi (African swine fever virus - ASFV) là tác

nhân gây bệnh nghiêm trọng ở bất kỳ loài lợn nào và có tỷ lệ tử vong cao ở hầu hết lợn

bị nhiễm bệnh Đề tài “Ứng dụng phản ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam” được thực hiện từ tháng 06-09/2020 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Đề tài có ba nội dung chính như sau: (1) Phát hiện ASFV trên lợn bằng phản ứng PCR (2) So sánh độ đặc hiệu và độ nhạy của các cặp mồi với mẫu ASFV (3) Giải trình tự và phân tích một số gen trong phản ứng PCR

Những kết quả đạt được sau thời gian nghiên cứu:

1 Phát hiện được ASFV bằng phản ứng PCR

2 So sánh độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp mồi phát hiện ASFV trong phản ứng PCR cho thấy cặp mồi PPA-1/2 cho hiệu quả cao hơn cặp mồi OIE-F/R

3 Giải trình tự gen B646L của chủng ASFV và phân tích cây phát sinh loài của ASFV trên gen B646L cho thấy được chủng nghiên cứu ASFV thuộc kiểu gen

II Chủng ASFV nghiên cứu cùng nhóm với các chủng ASFV có kiểu gen II phân lập tại Châu Phi và Georgia đã được công bố

vi

SUMMARY

African swine fever virus (ASFV) caused serious illness in swine and high

mortality in almost all infected swine Thesis title "Application of the PCR assay for

detection African swine fever virus causing disease in pigs in Viet Nam" carried out

from June to September, 2020 at Microbiology Laboratory, Department Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University

The topic includes three contents: (1) Detection of ASFV in swine samples by PCR (2) Compare the specificity and the sensitivity of primers on ASFV samples (3) Sequencing and analysis of some genes in PCR test

The study results as follow:

1 ASFV was detected by PCR

2 Comparison of the specificity and sensitivity of the ASFV detected primer pairs revealed that the PPA-1/2 more effective than the OIE-F/R

3 The B646L gene of ASFV strain was sequenced, analyzed and phylogenetic tree analyzed based on B646L gene indicated that the studied strain ASFV belongs to genotype II The ASFV strains in the same group with the ASFV strains with genotype II isolated in Africa and Georgia

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ảnh vi điện tử của hạt virus ASFV 1

Hình 1.2 Ảnh biểu diễn giản đồ của một hạt ASFV cho thấy hàm lượng protein 3

Hình 1.3 Ve mềm Ornithodoros erraticus 6

Hình 3.1 Kết quả phản ứng PCR phát hiện trong các mẫu DNA nghi nhiễm ASFV chạy với mồi OIE-F/R 27

Hình 3.2 Kết quả phản ứng PCR phát hiện trong các mẫu DNA nghi nhiễm ASFV chạy với mồi PPA-1/2 28

Hình 3.3 Độ nhạy của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OIE-F/R 30

Hình 3.4 Độ nhạy của phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PPA-1/2 31

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự tốt 33

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự nhiễu 33

Hình 3.7 Kết quả sau khi BLAST trình tự của cặp mồi OIE-F/R 34

Hình 3.8 Kết quả sau khi BLAST trình tự của cặp mồi PPA-1/2 34

Hình 3.9 Cây phát sinh loài mô tả mối quan hệ gen B646L của ASFV 35

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 2.3 Danh mục hóa chất và thuốc thử 21

Bảng 2.4 Primers sử dụng của phản ứng PCR 23

Bảng 2.5 Các thành phần của phản ứng PCR 23

Bảng 2.6 Trình tự các cặp mồi và chu trình nhiệt tương ứng 24

Bảng 3.1 Thống kê kết quả PCR phát hiện của 2 cặp mồi 29

Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ DNA (ng/μl) 30

Bảng 3.3 Giới hạn phát hiện ASFV của cặp mồi OIE-F/R và PPA-1/2 31

x

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay nhu cầu về thịt lợn của con người ngày càng tăng cao, tạo cơ hội cải thiện cuộc sống cho những người có thu nhập thấp thông qua chăn nuôi, chế biến, thương mại các sản phẩm từ chăn nuôi

Tuy nhiên, trong những năm gần đây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) do tác

nhân African swine fever virus (ASFV) gây ra đã xuất hiện và lây lan nhanh sang

nhiều khu vực gây thiệt hại nghiêm trọng cho những nước bị nhiễm bệnh ASFV lây truyền trực tiếp thông qua tiếp xúc với lợn bị nhiễm bệnh, hay qua đường máu, qua các vết thương, v.v và khi ASF lần đầu xuất hiện tại các trang trại, khu vực thì tỷ lệ chết

có thể lên đến 100 % Vào năm 2019, Việt Nam đã chính thức công bố về sự xuất hiện ASFV lần đầu tiên tại Hưng Yên, sau đó lây qua Thái Bình, Hải Phòng, Thanh Hóa,

Hà Nội, Hà Nam Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, từ đầu năm 2020 đến nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi đã tái phát tại 155 xã của 20 tỉnh, thành phố, và buộc tiêu hủy gần 4.000 con lợn Nguy cơ dịch bệnh tiếp tục tái phát, lây lan diện rộng là rất lớn, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam

Dù đã có nhiều nước công bố tình trạng về ASFV, nhưng bệnh lại mới xuất hiện lần đầu tại Việt Nam nên những nghiên cứu ở trong nước còn rất ít Do không có vaccine phòng và điều trị bệnh, nên việc kiểm soát dịch chủ yếu dựa vào chẩn đoán phòng thí nghiệm và thực hiện các biện pháp an toàn sinh học Hơn nữa, dịch tả lợn Châu Phi gây ra tổn thương và các triệu chứng lâm sàng tương tự với một số bệnh gây trên lợn như dịch tả lợn cổ điển, hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (bệnh PRRS), nên việc chẩn đoán phòng thí nghiệm để phân biệt ASF từ lợn bị nhiễm bệnh

là rất cần thiết để kịp thời hạn chế dịch lây lan Do đó, yêu cầu chẩn đoán phòng thí nhiệm phải có quy trình nhanh và chính xác cho việc phát hiện ASFV

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Ứng dụng phản

ứng PCR phát hiện virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam” Mục tiêu của đề tài:

Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện được virus dịch tả lợn Châu Phi gây bệnh trên lợn tại Việt Nam

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về African swine fever virus

1.1.1 Phân loại khoa học

African swine fever virus (ASFV) là một loại virus có hình thái icosahedral (đa

diện với 20 mặt) và có đường kính trung bình là 200 nm ASFV được nhân lên trong tế bào chất của tế bào chủ 3

Hạt virus có hình thái icosahedral, được sắp xếp theo cấu trúc gồm nhiều lớp Nó được cấu tạo bởi một hệ thống nucleoprotein, bao gồm một lõi bên trong được hình thành bởi bộ gen trung tâm nucleoid, được bao bởi 1 lớp protein dày là vỏ lõi, một lớp

vỏ lipid bên trong bao quanh lõi và cuối cùng là lớp capsid, lớp ngoài cùng của virion

4 Một cấu trúc khác, virus được bao phủ bởi một lớp bao bên ngoài bổ sung được thu nhận trong quá trình nảy chồi 4

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc

ASFV là một loại virus DNA sợi kép lớn, từ 170 đến 190 kilobase (Kbp) mã hóa hơn 150 khung đọc mở (ORF) tùy thuộc vào chủng virus 4 Các protein cấu trúc của virus được mã hóa có liên quan đến sự sao chép bộ gen và nhiễm virus ASFV có khoảng hơn 50 protein được đóng gói thành virion và hoạt động trong quá trình virus lây nhiễm, ví dụ như p72, p54, p30, v.v…5

2

Phần lớn hàm lượng protein của virion ASFV được mã hóa bởi khung đọc ORF B646L mã hóa cho VP72 và khung đọc ORF CP2475L mã hóa cho pp220 được phân cắt thêm để tạo ra các protein virus p150, p37, p34 và p14 1 Protein pp62 được mã hóa bởi gen CP530R được phân cắt thành các protein virus p35 và p15 p150, p37, p14, p34, p35 và p15 đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus, chiếm khoảng

30 % tổng khối lượng prorein của virus, tạo thành các thành phần chính của vỏ lõi 5 Protein p72 có trọng lượng phân tử là 73,2 kDa là protein cấu trúc chính của ASFV và là protein kháng nguyên quan trọng được mã hóa bởi gen B646L (VP72) p72 rất quan trọng trong việc hình thành capsid của virus và là thành phần chính của các icosahedral virus 5

Protein CD2v hay còn được đặt tên là PEP402R được mã hóa bởi gen EP402R

có trọng lượng phân tử là 105 kDa Protein được biểu hiện muộn trong quá trình lây nhiễm và cần thiết cho hiện tượng hấp thụ máu trong các tế bào bị nhiễm ASFV Ngoài ra, protein CD2v còn tham gia vào quá trình kết dính tế bào, tăng cường độc lực

và điều hòa phản ứng miễn dịch 5

Các protein sau này tạo thành lõi virus, tương ứng với 25 % khối lượng protein của virion Các protein gắn p12 và p24 được định vị trên màng ngoài Protein màng không thể thiếu quan trọng nhất là p54 được giới hạn trong vỏ ngoài của virus cùng với p22, p32 và protein xuyên màng CD2v cần thiết cho quá trình hấp thụ máu của các

tế bào hồng cầu xung quanh các tế bào bị nhiễm Các protein p10, p12, p17 cũng liên quan đến sự hấp phụ ASFV và chuyển virion 1,5

Các protein pp220, pp62, p54, p30, p72 và CD2v đã được xác định là các protein cấu trúc quan trọng trong việc gắn kết, xâm nhập của virus và là thành phần chính của virion Bên cạnh đó, một số protein cấu trúc khác, chẳng hạn như p10, p12, p14.5 và p17, được mã hóa bởi bộ gen ASFV Chúng cũng có vai trò quan trọng trong việc lây nhiễm virus Protein p10 có trọng lượng phân tử tương đối là 8,4 kDa được mã hóa bởi gen K78R 5

Protein p14.5 còn được gọi là pE120R được mã hóa bởi gen E120R Nó là một protein liên kết DNA với trọng lượng phân tử tương đối là 13,6 kDa Protein p14.5

Nếu nghiêm trọng hơn nữa, lợn có triệu chứng da sung huyết đến tím bầm hoặc xuất huyết nhất là ở vùng bụng, có thể co giật, chảy dịch mũi trắng, đặc có lẫn máu, mắt có thể có ghèn, niêm mạc sung huyết nặng có thể xuất huyết, một vài lợn có hiện tượng bón hoặc tiêu chảy có máu và sẽ chết trong vòng 7 ngày sau khi xuất hiện triệu chứng Trong trường hợp lợn sống sót sau nhiễm thì sẽ trở thành dạng mang mầm

Hình 1.2 Ảnh biểu diễn giản đồ của một hạt ASFV cho thấy

hàm lượng protein 1

14 ngày, thậm chí có thể kéo dài đến 20 ngày

Thể á cấp: Ở thể này, lợn bị nhiễm bệnh xuất hiện các triệu chứng như sốt nhẹ hoặc không sốt, sụt cân, khó thở, có thể sẩy thai ở lợn đang mang thai Tỷ lệ lợn chết khi mắc dịch tả lợn Châu Phi ở thể này là 30 – 70 %, sau khoảng 15 – 45 ngày nhiễm bệnh

Thể mạn tính: Thường thấy ở lợn từ 2 đến 3 tháng tuổi, các triệu chứng lúc này

có thể kèo dài từ 1 đến 2 tháng Lợn bị nhiễm ở thể này gặp phải tình trạng rối loạn tiêu hóa, xuất hiện các nốt xuất huyết trên da chuyển từ đỏ sang tím Khi mắc bệnh ở thể này, lợn có tỷ lệ chết thấp hơn các thể khác Tuy nhiên, khi khỏi bệnh vẫn tồn tại virus và là nguồn lây bệnh (https://medlatec.vn/)

1.2.2 Cơ chế gây bệnh

Chu kỳ lây nhiễm ASFV bắt đầu với sự hấp phụ của virus và xâm nhập vào tế bào chủ Theo các nghiên cứu ban đầu về sự xâm nhập của ASFV cho thấy đó là một quá trình phụ thuộc vào pH và nhiệt độ thấp phù hợp với thâm nhập nội bào qua trung gian thụ thể và đặc hiệu trong đại thực bào của lợn 4

Virus sẽ mã hóa các enzyme cần thiết để sao chép và sao chép bộ gen của nó, bao gồm các yếu tố của hệ thống sửa chữa cắt bỏ bazơ và protein cấu trúc Sự nhân lên của virus được diễn ra trong các khu vực hạt nhân, và đó là một quá trình được phối hợp chặt chẽ với các giai đoạn tiền phiên mã, sớm, trung gian và muộn Các gen sớm được

5

biểu hiện trước khi bắt đầu sao chép DNA Sau khi sao chép DNA, sự phiên mã của các gen trung gian và muộn bắt đầu 4

Hầu hết sự sao chép và lắp ráp xảy ra ở các khu vực hạt nhân của tế bào được gọi

là các “nhà máy” virus và bước cuối của sự hình thành virion sẽ là việc đóng gói DNA

để tạo thành virion trưởng thành Cuối cùng, virus mới hình thành sẽ rời khỏi “nhà máy” và được vận chuyển đến bề mặt tế bào nơi nó được giải phóng khỏi tế bào vật chủ bằng cách nảy chồi 4

1.2.3 Phương thức lây nhiễm

1.2.3.1 Vectơ truyền bệnh

ASFV dễ dàng lây lan và có thể xảy ra khi tiếp xúc trực tiếp với lợn bị nhiễm bệnh, các sản phẩm thịt lợn và fomite bị nhiễm bệnh, cũng như tiếp xúc với các vật

trung gian như lây truyền qua bọ ve mềm thuộc giống Ornithodoros Chi

Ornithodoros của ve mềm trong họ Argasidae đóng vai trò là vectơ sinh học và là nơi

chứa tự nhiên và vật trung gian chính của ASFV 6

Ornithodoros là một loại của bọ ve thuộc họ Argasidae Các loài thuộc chi này

được đặt tên là Ornithodores Bọ ve chủ yếu sống trên các loài chim, tuy nhiên, nhiều

loài sống trong hang của loài gặm nhấm và đã thích nghi với nơi sinh sản, nhưng đôi khi có thể đốt người, các loài động vật khác để tạo ra một bữa ăn máu ở đó và có thể truyền virus hoặc vi khuẩn gây bệnh sang qua các vết đốt 7

Nhiều loài Ornithodoros được tìm thấy trong hang động vật đã bị nhiễm virus

gây bệnh dịch tả lợn châu Phi (ASF) và có khả năng truyền mầm bệnh này không chỉ tồn tại ở Châu Phi mà còn ở các vùng của Châu Âu và Châu Mỹ

Khi bọ ve mềm Ornithodoros bị nhiễm ASFV chúng có thể giữ lại virus trong

thời gian dài và truyền nó sang cho các vật chủ nhạy cảm Do đó, vai trò của chúng chủ yếu là duy trì ASFV trong khu vực Ngoài ra, các thành viên của bọ ve

Ornithodoros spp có thể truyền ASFV từ bọ ve này sang bọ ve khác và cho phép virus

tồn tại ngay cả khi không có vật chủ gây bệnh 6

6

Hình 1.3 Ve mềm Ornithodoros erraticus

https://www.dicyt.com/viewItem.php?itemId=38795 Cho đến nay, tám loài Ornithodoros đã được chứng minh là vectơ thích hợp cho ASFV Ve mềm Ornithodoros porcinus (thường được gọi là O moubata porcinus hoặc O moubata) bị nhiễm ASFV ở Châu Phi đã được tìm thấy ở Madagascar Ngoài

ra, vectơ Ornithodoros cũng được biết là tồn tại ở các vùng của Châu Âu và Châu Mỹ

Ve mềm Ornithodoros erraticus (còn được gọi là O marocanus và đổi tên thành bọ ve mềm Carios erraticus) sống ở bán đảo Iberia và các khu vực Địa Trung Hải của Châu

Phi và Châu Á, và là một vectơ quan trọng cho ASFV ở Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha trong thế kỷ ASF - thế kỷ 20 6,7

Ở Châu Âu và Châu Á, lây truyền giữa lợn và lợn có thể xảy ra ở chăn nuôi động vật hoang dã Sự lây truyền giữa lợn có khả năng duy trì và lan truyền virus trên các khu vực địa lý rộng lớn và ve mềm đóng vai trò là vectơ trung gian chứa virus 6 Nhiễm trùng ASFV có thể tạo ra một loạt các biểu hiện lâm sàng từ bệnh mãn tính, hoặc bệnh ở mức độ thấp đến sốt xuất huyết và tử vong liên tục, tùy thuộc vào chủng virus và tính nhạy cảm của vật chủ Các nghiên cứu về phân lập kiểu gen có độc lực cao đã tạo ra tỷ lệ tử vong 100 % ở lợn nhà và lợn rừng, với bệnh tiến triển nhanh

từ các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu như sốt, chán ăn, tiêu chảy dẫn đến tử vong 6

ASFV lây nhiễm khi tiếp xúc trực tiếp với lợn nhiễm bệnh, tuy nhiên mức độ truyền bệnh khác nhau đã được quan sát đối với các chủng có độc lực cao, trung bình

và thấp, có khả năng do sự khác biệt về mức độ nhiễm virus

7

Máu, dịch cơ thể, phân và xác lợn nhiễm bệnh cũng đóng vai trò là con đường lây nhiễm gián tiếp Lợn hồi phục sau khi bị nhiễm có thể trở thành vật mang mầm bệnh và có khả năng truyền virus sang những con lợn khác 6

1.2.3.2 Các phương thức lây nhiễm khác

Bệnh do ASFV xảy ra ở mọi lứa tuổi của lợn và lây nhiễm qua tiếp xúc trực tiếp, qua đường máu, các vết thương nên tốc độ lây lan khá nhanh ASFV lây nhiễm trực tiếp giữa lợn với lợn xảy ra qua tiếp xúc với lợn nhiễm bệnh, qua vết cắn từ ve mềm bị nhiễm bệnh, hay qua thức ăn, nước uống nhiễm virus Khi ASF xuất hiện lần đầu ở trong trại hay khu vực, v.v… thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100 %

Khi lợn nuôi bị nhiễm ASFV có thể bài thải một lượng lớn virus trước khi có biểu hiện lâm sàng qua nước bọt, dịch mũi, nước tiểu, phân và cũng có rất nhiều trong máu Do đó, người, thiết bị, quần áo và phương tiện vận chuyển cũng là yếu tố mang mầm ASFV lan truyền đến những nơi xa hơn, trong thời gian xảy ra dịch, virus có thể lây truyền qua kim tiêm được dùng chung cho lợn (http://www.vemedim.com/vi/).

1.2.4 Dịch tễ học

Bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) được mô tả đầu tiên vào năm 1921 tại Kenya

và lây lan trong khu vực Châu Phi và đến năm 1970 dịch xuất hiện và cũng được dập tắt thành công ở khu vực Caribe và Brazil Một lần nữa bệnh lại vượt ra khỏi biên giới Châu Phi, vào năm 2007 dịch lại xuất hiện tại Nga Năm 2014, bệnh đã xâm nhập vào Đông Âu như Cộng hòa Séc, Bungari và Ba Lan Cho đến năm 2019, Tổ chức Thú Y thế giới OIE đã thống kê vào giai đoạn từ ngày 01/02/2019 đến 14/02/2019 ASF đã gây chết 5.672 con lợn tại Châu Á (trong đó có 4.776 con ở Trung Quốc và 896 con thuộc khu vực Mông Cổ), 196 con chết hoặc bị thiêu hủy tại Châu Âu (Italia, Estonia

và Lithuania), 156 con bị chết tại Châu Phi

Ở Việt Nam, năm 2019, Cục Thú Y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã chính thức công bố dịch tả lợn Châu Phi Tháng 02/2019, tại xã Trung Nghĩa (Hưng Yên) đã phát hiện ổ dịch với hàng trăm con lợn bị nhiễm bệnh Tiếp đến, tại Thái Bình cũng đã phát hiện được bệnh ở một số hộ chăn nuôi tại xã Đông Đô Tính đến ngày 27/02/2019, ASF đã xuất hiện tại 96 hộ, 33 thôn, 20 xã, 13 huyện của 6 tỉnh, thành phố

hưởng đến đàn lợn giống của quốc gia (http://www.cucthuy.gov.vn/Pages/default.aspx )

Mặc dù hiện nay, chúng ta về cơ bản đã khống chế được ASFV, tuy nhiên nhiều địa phương vẫn đang đứng trước nguy cơ tái bùng phát ASFV

Đến ngày 27/05/2020, dịch tả lợn Châu Phi tái phát tại 20 tỉnh, thành phố và có nguy cơ tiếp tục tái phát, lây lan trên diện rộng Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, từ đầu năm 2020 đến nay, bệnh dịch tả lợn Châu Phi đã tái phát tại 155 xã của 20 tỉnh, thành phố, và buộc tiêu hủy gần 4.000 con lợn Nguy cơ dịch bệnh tiếp tục tái phát, lây lan diện rộng là rất lớn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc tổ chức nuôi tái đàn, tăng đàn lợn và bảo đảm nguồn cung thịt lợn

Tính đến ngày 20/6/2020, đã có 103 hộ chăn nuôi, ở 50 xóm, thuộc 30 xã, thị trấn tại 9/10 huyện, thành phố trong tỉnh Cao Bằng tái phát dịch tả lợn Châu Phi Các ổ dịch rải rác tại các địa phương và đáng lo ngại nhất là dịch bệnh có diễn biến phức tạp, chưa được khống chế, có chiều hướng lây lan diện rộng Tại thành phố Cao Bằng có

143 con lợn, tổng trọng lượng trên năm tấn lợn của 40 hộ chăn nuôi ở 13 xóm, năm xã, phường tái phát dịch ASF Ngày 16/7/2020, đã xuất hiện hai ổ dịch ASFV tại xã Tân Phong, thị xã Giá Rai, Bạc Liêu, và tiêu hủy 20 con lợn bị nhiễm bệnh chết, mỗi con

có trọng lượng khoảng 20 kg

Tuy nhiên, trong thực tiễn, ngăn chặn ASFV tái phát vẫn khó khăn do nhận thức của một bộ phận người dân còn hạn chế, chưa tích cực phối hợp áp dụng các biện pháp khống chế và báo cáo dịch theo quy định Bên cạnh đó, một số cán bộ chuyên môn cơ

sở chưa thực sự nắm bắt tình hình dịch trên địa bàn ảnh hưởng đến công tác phòng chống dịch ASF

9

1.2.5 Các biện pháp phòng chống và ngăn chặn

Cho đến nay vẫn chưa có vaccine hoặc thuốc để điều trị hoặc phòng ngừa ASFV, dẫn đến việc áp dụng các biện pháp kiểm soát nghiêm ngặt để kiểm soát căn bệnh này Biện pháp kiểm soát và diệt trừ ASFV dựa trên các phương pháp kiểm soát dịch bệnh bao gồm giám sát, điều tra dịch tễ học, truy tìm và dập dịch các đàn bị nhiễm bệnh, cũng như kiểm dịch nghiêm ngặt, các biện pháp an toàn sinh học

Phòng bệnh: Vệ sinh chuồng trại thường xuyên, kiểm soát động vật lây truyền như ve, chuột, bọ tránh để mầm bệnh phát tán ra bên ngoài Ngoài ra còn cần tăng cường sức đề kháng cho lợn bằng cách bổ sung vitamin, khoáng vào khẩu phần ăn Ngăn chặn: Ngay khi phát hiện lợn có triệu chứng lâm sàng ngay lập tức cần cách ly và thông báo đến các trung tâm chẩn đoán thú y, chi cục thú y vùng để xác định rõ tác nhân gây bệnh và từ đó xử lý theo đúng quy định

Trong trường hợp bùng phát cục bộ, có một số biện pháp kiểm soát được khuyến cáo áp dụng như cảnh báo sớm và báo cáo về ổ dịch, cách ly các đàn bị nhiễm bệnh và kiểm soát di chuyển

Chính sách hỗ trợ người chăn nuôi: Việc tiêu hủy gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người chăn nuôi Do đó việc áp dụng các biện pháp hỗ trợ sẽ khuyến khích người chăn nuôi có lợn nhiễm bệnh thực hiện đúng qui định tiêu hủy, tránh lây lan bệnh trên diện rộng

Qui định chôn lấp: Việc xử lý hoặc đốt xác tại các bãi chôn lấp phải được thực hiện càng gần vùng nhiễm bệnh càng tốt để tránh vùng nhiễm bệnh càng rộng Vệ sinh, khử trùng tiêu độc chuồng trại chăn nuôi lợn mắc bệnh bằng thuốc diệt khuẩn

1.3 Các phương pháp chẩn đoán ASFV

1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dấu hiệu lâm sàng của bệnh dịch tả lợn Châu Phi rất giống với bệnh dịch tả lợn

cổ điển, bệnh PRRS, v.v… ở lợn Vì vậy, trong trường hợp ghi nhận có hiện tượng lợn bệnh và chết hàng loạt ở mọi lứa tuổi với các biểu hiện lâm sàng giống với các bệnh khác như dịch tả lợn cổ điển, bệnh PRRS thì nghi ngờ là bệnh dịch tả lợn Châu Phi

10

Các trang trại trong vùng xảy ra dịch có nguy cơ bị lây nhiễm cao phải hết sức chú ý để kịp chẩn đoán sớm, cách ly và tiêu hủy nhanh lợn nghi nhiễm bệnh nhằm hạn chế nguy cơ lây lan sang những khu vực khác (http://www.vemedim.com/vi/)

1.3.2 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

1.3.2.1 Lịch sử hình thành

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis – nhà khoa học người Mỹ phát minh năm 1985 Ý tưởng của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase 8

DNA polymerase có mặt tự nhiên trong sinh vật sống, thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia Enzyme DNA polymerase làm việc bằng cách nối với sợi DNA mạch đơn và tạo sợi DNA bổ sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro), sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 oC và việc tổng hợp mạch đôi DNA sẽ nhờ hoạt tính của enzyme DNA polymerase Tuy nhiên quy trình PCR gốc của Mullis không đạt hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase 8

Sau này, quy trình trên được phát triển hơn bằng cách sử dụng DNA polymerase

lấy từ vi khuẩn ưa nhiệt (Thermophilic bacteria) DNA polymerase từ sinh vật này ổn

định được ở nhiệt độ cao và khi sử dụng trong quy trình PCR thì không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA Một trong những DNA polymerase chịu

nhiệt đầu tiên được phân lập từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq Taq

polymerase là enzyme được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR 8

1.3.2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này 9

Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có

Đoạn mồi (Primer) là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18 - 30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) vào đoạn khởi đầu và kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đơn 10

dNTP (deoxy nucleoside triphosphate) là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích Năng lượng để phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP 10

Enzyme DNA polymerase: Taq-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt được

sử dụng đầu tiên cho phản ứng PCR Hiện nay, một số DNA polymerase chịu nhiệt khác cũng được sử dụng trong phản ứng PCR như Vent/deep vent DNA polymerase

(Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UITma DNA polymerase (Thermotoga

maritime) 10

Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: Thường chứa muối đệm Tris-HCl, KCl, MgCl2 Trong đó, MgCl2 ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng PCR MgCl2 cần cho hoạt

động của Taq-polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp

làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm 10

12

mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1 - 2 phút 11

Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống cho phép mồi bắt cặp vào sợi DNA khuôn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi

và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45 - 60 °C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian bắt cặp: 1 - 2 phút 11

Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc Cuối cùng, DNA-polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài của trình tự DNA cần khuếch đại Như một quy tắc 1000 bp/ 1 phút Và các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo 11

1.3.2.5 Phát hiện ASFV bằng phản ứng PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được sử dụng để phát hiện bộ gen ASFV trong máu, nội tạng, v.v… từ các mẫu lợn Các đoạn DNA nhỏ sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR cho đến khi số lượng có thể phát hiện được Tất cả các xét nghiệm PCR cho phép phát hiện DNA virus ngay trước khi xuất hiện các biểu hiện lâm sàng, và chẩn đoán ASF được thực hiện chỉ trong vòng vài giờ sau khi đến phòng thí nghiệm 12

Các phản ứng PCR thông thường và RT-PCRs được OIE khuyến nghị trong Hướng dẫn xét nghiệm chẩn đoán và vaccine cho động vật trên cạn là công cụ hữu ích

để chẩn đoán bệnh Các quy trình RT-PCR khác đã được chứng minh là cung cấp độ nhạy cao hơn so với các phương pháp RT-PCR do OIE quy định để phát hiện bộ gen ASFV 12

13

Các bộ mồi và đầu dò được sử dụng trong các kỹ thuật phân tử này được thiết kế trong khu vực mã hóa vp72, một khu vực được bảo tồn cao của bộ gen ASFV Một loạt các chủng phân lập thuộc tất cả 22 kiểu gen virus p72 đã biết có thể được phát hiện bằng các xét nghiệm PCR này, ngay cả trong các mẫu bị bất hoạt hoặc bị thoái hóa 12

PCR là công cụ có thể phát hiện bộ gen của virus, nó có thể dương tính ngay cả khi không phát hiện thấy virus truyền nhiễm do phân lập virus, làm cho nó trở thành một công cụ rất hữu ích để phát hiện DNA của ASFV ở lợn nhiễm bệnh 12

1.4 Kỹ thuật điện di

1.4.1 Nguyên lý

Điện di là quá trình chuyển động cùa các phần tử tích điện trong dung dịch dưới tác dụng của dòng điện Trong quá trình điện di, phân tử tích điện sẽ di chuyển về điện cực có điện tích trái dấu với nó Một hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ

di chuyển với tốc độ khác nhau 13

Kỹ thuật điện di trên gel là kỹ thuật sử dụng để tách, phân tích các phân tử như DNA, RNA và protein dựa trên đặc điểm vật lý của chúng: kích thước, hình dạng

Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di

1.4.2 Các kỹ thuật điện di

Các phân tử protein, DNA, RNA có thể chạy điện di trên một khuôn đỡ như giấy, gel agarose hay gel polyacrylamide Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên gel agarose hay polyacrylamide thường được sử dụng phổ biến hơn 13

1.5 Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự là quy trình xác định trình tự của phân tử DNA Có hai phương pháp giải trình tự gen là phương pháp hóa học của Maxam – Gilbert và phương pháp enzyme hay phương pháp Dideoxy của Sanger và cộng sự

14

Phương pháp hóa học cùa Maxam – Gilbert:

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp giải trình

tự gen bằng phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiểu phân đoạn có kích thước khác nhau 14 Phương pháp enzyme hay phương pháp Dideoxy:

Phương pháp này được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977 Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP), kết quả là sẽ tổng hợp được nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau 14

Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi là đoạn DNA mạch đơn có kích thước khoảng 20 nucleotide, các loại dNTP, và bổ sung thêm 1 % ddATP cho mỗi loại phản ứng Các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 2, do đó khi mạch DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Mỗi loại phản ứng của phương pháp này được thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm, đồng thời có bổ sung thêm 1 % một loại ddNTP 14

Kết quả phản ứng sẽ tổng hợp được các đoạn nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau và được nhận biết nhờ phương pháp điện di Tổng hợp kết quả phản ứng sẽ thu được trình tự các nucleotide của mạch đơn, và trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen 14

Ngoài ra còn có phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động Trong phương pháp này, không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome) Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trên gel, kết quả sẽ được xử lý qua hệ thống vi tính

15

1.6 Xây dựng cây phát sinh loài

Cây phát sinh loài (Phylogenic tree) được dùng để miêu tả lịch sử tiến hóa của một nhóm các loài (species) với những đặc tính khác nhau nhưng cùng có mối quan hê

họ hàng với nhau và cùng hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ

Có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau để chứng minh đặc điểm phát sinh của chủng loại này Trước hết, có thể so sánh trình tự các đoạn DNA (thuộc sinh học phân

tử hay hệ gen học (genomics), hoặc so sánh các hóa thạch (fossil) hoặc các di chỉ (record) của sinh vật cổ (thuộc khảo cổ học – paleontology)

Các nhà sinh học tổ chức và phân tích các mối quan hệ thông qua các phương pháp khác nhau, bao gồm phát sinh chủng loại học (phylogenetics), ngoại hình học (phenetics) và miêu tả theo nhánh học (cladistics) Các sự kiện chính xảy ra trong quá trình tiến hóa của sự sống được xây dựng thành biểu đồ thời gian của tiến hóa (evolutionary timeline) dựa trên các hiểu biết hiện nay của khoa học

1.7 Tình hình nghiên cứu bệnh dịch tả lợn Châu Phi

1.7.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2003, A D S Bastos và các cộng sự đã công bố bài báo nghiên cứu về

“Xác định kiểu gen các chủng virus bệnh dịch tả lợn Châu Phi bằng cách xác định đặc điểm một phần gen p72” trên tạp chí Archives of Virology Nghiên cứu cho thấy một phương pháp giải trình tự dựa trên PCR đã được phát triển cho phép phát hiện và xác định đặc điểm của các biến thể của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASFV) trong vòng 5 và 48 giờ tương ứng sau khi nhận được bệnh phẩm Và nghiên cứu này cung cấp một phương tiện nhanh chóng và chính xác để xác định kiểu gen của các chủng ASF tại hiện trường và ổ dịch và do đó rất hữu ích cho việc làm rõ dịch tễ học phân tử của ASF 15

Năm 2003, Donald P King và cộng sự đã có nghiên cứu “Phát triển xét nghiệm TaqMan® PCR với kiểm soát khuếch đại bên trong để phát hiện virus sốt lợn ở Châu Phi” trên tạp chí Journal of Virological Methods Nghiên cứu cho thấy độ chính xác của phản ứng TaqMan® PCR đã được phát triển để phát hiện ASFV Ưu điểm của phương pháp này là có thể có được chẩn đoán trong phòng thí nghiệm đáng tin cậy

16

trong vòng 24 giờ kể từ khi nhận mẫu Phương pháp này nhanh hơn nhiều so với phương pháp phân lập virus (virus isolation), có thể mất tới 6 ngày để công bố kết quả Việc giảm thời gian như vậy giúp cho trang trại hoặc cơ sở giết mổ quay lại hoạt động bình thường trong thời gian ngắn Nghiên cứu xét nghiệm ASFV TaqMan® PCR này

sẽ là một công cụ có giá trị để chẩn đoán phân biệt nhanh trong trường hợp nghi ngờ khi lợn nhiễm bệnh 16

Năm 2003, M Agüero và cộng sự đã công bố báo cáo nghiên cứu về độ chính xác cao của phản ứng PCR cho việc chẩn đoán thông thường với mẫu lâm sàng trên tạp chí Journal of Clinical Microbiology Nghiên cứu cho thấy phản ứng PCR mới nhanh, chính xác, và có thể phát hiện các chủng ASFV trên thế giới Nghiên cứu cũng cho thấy phương pháp PCR mới đã được chuẩn hóa để có thể được sử dụng trên các mẫu mô, mẫu máu được xử lý bằng EDTA và mẫu huyết thanh, và có thể được thực hiện ngay cả trên các mô được bảo quản kém hoặc khử trùng 17

Năm 2004, M Agüero và các cộng sự đã tiếp tục công bố báo cáo nghiên cứu về

sự phát triển và tiêu chuẩn hóa của một xét nghiệm RT-PCR đa thành phần, rất nhạy

và đặc hiệu để chẩn đoán đồng thời và phân biệt bệnh sốt lợn châu Phi (ASF) và sốt lợn cổ điển (CSF) trên tạp chí EDP Sciences Phương pháp này sử dụng hai bộ mồi, mỗi bộ dành riêng cho virus tương ứng, khuếch đại các đoạn DNA khác nhau về chiều dài, cho phép phát hiện phân biệt dựa trên gel của các sản phẩm PCR Việc phân tích toàn bộ mẫu máu và huyết thanh từ các động vật bị nhiễm bệnh thực nghiệm đã chứng minh tính hữu ích của phương pháp chẩn đoán sớm cả hai bệnh, ngay cả trước khi xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên Một nghiên cứu trên 150 mẫu trường dương tính

từ một số vụ dịch ASF và CSF cho thấy sự phù hợp của phương pháp này trong chẩn đoán phân biệt nhạy cảm và đặc hiệu nhanh chóng (dưới 5 giờ) trong các mẫu lâm sàng 18

Năm 2009, Solenne Costard và các cộng sự đã công bố báo cáo nghiên cứu

“Dịch tả lợn Châu Phi: Làm thế nào để ngăn chặn sự lây lan toàn cầu?” trên tạp chí The Royal Society Nghiên cứu này xem xét các cơ chế mà ASFV được duy trì trong các quần thể động vật hoang dã, lợn nhà và cách nó có thể lây truyền Sau đó, xem xét