Thiết kế và thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ bộ gen canine parvovirus tại việt nam

- Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên các chủng CPVs phân lập tại Việt Nam.. Đề tài “Thiết kế và thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ bộ

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT KẾ VÀ THỬ NGHIỆM MỒI CHO PHẢN ỨNG PCR PHỤC VỤ GIẢI TRÌNH TỰ GẦN ĐẦY

ĐỦ BỘ GEN Canine parvovirus TẠI VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện : Trần Trung Nguyên

GVHD : TS Thân Văn Thái

TP HCM, 2020

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT KẾ VÀ THỬ NGHIỆM MỒI CHO PHẢN ỨNG PCR PHỤC VỤ GIẢI TRÌNH TỰ GẦN ĐẦY

ĐỦ BỘ GEN Canine parvovirus TẠI VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện : Trần Trung Nguyên

Mã số sinh viên : 1711545647 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Thân Văn Thái

TP HCM, 2020

- -oOo -

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1 Đầu đề luận văn:

Thiết kế và thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ

bộ gen Canine parvovirus tại Việt Nam

2 Mục tiêu

- Thiết kế được bộ mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ của bộ

gen Canine parvovirus

3 Nội dung:

- Thiết kế mồi PCR phục vụ nhu cầu giải trình tự gần đầy đủ bộ gen của CPV

- Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên các chủng CPVs phân lập tại Việt Nam

4 Thời gian thực hiện: tháng 6/2020 đến tháng 9/2020

5 Người hướng dẫn chính: TS Thân Văn Thái

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn

TP HCM, ngày …… tháng…… năm20…

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học và Ban giám

hiệu trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã hỗ trợ một môi trường học tập tốt và truyền

dạy những kiến thức cần thiết để giúp tôi nâng cao trình độ nghiên cứu khoa học

Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Thân Văn Thái, người thầy

đã tận tình chỉ dẫn, truyền dạy, hướng dẫn cũng như cho tôi những lời khuyên cần

thiết trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn đến các anh trong Phòng thí nghiệm Vi sinh vật đã nhiệt

tình chỉ bảo, hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Con xin cảm ơn cha mẹ, người đã nuôi dạy và giúp con trưởng thành, đã luôn

luôn ủng hộ và khích lệ khi con gặp những khó khăn trong suốt thời gian học tập Đã

giúp con có thêm động lực để phát triển trên con đường trong tương lai

Cuối cùng, tôi cũng xin cảm ơn đến các thành viên trong lớp 17DSH1A đã luôn

giúp đỡ, hỗ trợ lẫn nhau trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Trần Trung Nguyên Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

TÓM TẮT v

SUMMARY vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

ĐẶT VẤN ĐỀ x

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Tổng quan về Canine parvovirus 1

1.1.1 Lịch sử phát hiện 1

1.1.2 Phân loại khoa học Canine parvovirus 2

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc CPV 3

1.1.4 Các bệnh do nhiễm Canine parvovirus 5

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán CPV 5

1.2 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 6

1.2.1 Tổng quan về PCR 6

1.2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 7

1.2.3 Thành phần phản ứng PCR 8

1.2.4 Ứng dụng của phản ứng PCR 10

1.2.5 Kỹ thuật điện di 11

1.3 Nguyên tắc thiết kế mồi 12

1.3.1 Sơ lược về đoạn mồi 12

1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi 13

1.3.3 Các phần mềm thiết kế mồi phổ biến 15

1.4 Tình hình nghiên cứu về Canine parvovirus 16

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước 16

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước 17

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nơi thực hiện 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Vật liệu nghiên cứu 20

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 20

2.3.2 Các hóa chất sử dụng 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Thu thập trình tự mẫu 21

2.4.2 Sắp gióng cột trình tự 21

2.4.3 Thiết kế mồi 21

2.4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi sau khi thiết kế 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Thu trình tự mẫu 26

3.2 Kết quả thiết kế mồi 27

3.3 Kết quả kiểm tra PCR và chuẩn hóa độ đặc hiệu của bộ mồi 31

3.3.1 Kết quả kiểm tra độ khuếch đại của cặp mồi 31

3.3.2 Kết quả chuẩn hóa quy trình độ đặc hiệu của bộ mồi 33

3.3.3 Kết quả kiểm tra vùng overlap 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 47

TÓM TẮT

Bệnh tiêu chảy cấp trên chó do Canine parvovirus (CPV), một trong những tác

nhân chính, là một căn bệnh cấp tính nguy hiểm, nguyên nhân gây ra tỷ lệ tử vong cao

ở chó trên toàn thế giới Từ đó, việc giải trình tự full genome của CPV là cần thiết để tìm ra phương hướng chữa trị thích hợp là vô cùng quan trọng

Đề tài “Thiết kế và thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần

đầy đủ bộ gen Canine parvovirus tại Việt Nam” được thực hiện từ tháng 06/2020 đến

tháng 09/2020 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, thuộc khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành với các mục tiêu áp dụng các phần mềm tin sinh học, kỹ thuật khuếch đại PCR để thiết kế bộ mồi cho phản ứng PCR nhằm giải trình tự full genome của CPV

Hướng nghiên cứu chính của để tài bao gồm 2 nội dung: thiết kế mồi cho phản ứng PCR phục vụ nhu cầu giải trình tự gần đầy đủ của CPV và kiểm tra tính đặc hiệu của bộ mồi được thiết kế dựa trên các chủng CPVs phân lập tại Việt Nam

Sau 3 tháng thực hiện khóa luận, chúng tôi thu nhận được các kết quả sau:

− Thu nhận được 39 chủng Canine parvovirus full genome trên NCBI

− Thiết kế được bốn cặp mồi cho phản ứng PCR lần lượt là Parvo F1/R1, Parvo F2/R2, Parvo F3/R3, Parvo F4/R4

− Chọn được nồng độ mồi chuẩn của cả 4 cặp mồi là 5 pmol

− Lựa chọn được nhiệt độ bắt căp thích hợp của các cặp mồi lần lượt theo thứ tự NSFext/R1, F2/R2, F3/R3, F4/4823R lần lượt là 58 oC, 54 oC, 54 oC, 57 oC

SUMMARY

Canine parvovirus (CPV), one of the main causes of dog diarrhea, is a serious

acute disease that causes high rates of death in dogs worldwide Since then, it is important to sequence the full genome of CPV to find the appropriate treatment

The project "Designing and testing primers for PCR reactions for nearly

complete sequencing of the Canine parvovirus genome in Vietnam" was conducted

from June 2020 to September 2020 at Microbiology Laboratory, Department of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University with the aim of applying bioinformatics software, PCR amplification technique to design primers for PCR reaction in order to sequence the full genome of CPV

The main research direction of the project includes 2 contents: design primers for PCR reaction to serve the need of nearly complete sequencing of CPV and test specificity of designed primers with the stool samples of acute diarrhea canine in Ho Chi Minh city, Vietnam

After 3 months of doing the thesis, we obtained the following results:

− Received 39 strains of Canine parvovirus full genome on NCBI

− Designing four primers for PCR reaction respectively Parvo F1/R1, Parvo F2/R2, Parvo F3/R3, Parvo F4/R4

− Select the standard primer depth of all 4 primers of 5 pmol

− Selecting suitable catching temperature of primer pairs NSFext/R1, F2/R2, F3/R3, F4/4823R respectively 58 oC, 54 oC, 54 oC, 57 oC

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sự tiến hóa của CPV 2

Hình 1.2 Minh họa bộ gen đầy đủ của CPV 4

Hình 1.3 Mồi xuôi và mồi ngược tổng hợp DNA 12

Hình 3.1 Vị trí bắt cặp của bộ mồi 30

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra độ khuếch đại của bộ mồi 33

Hình 3.3 Kết quả chuẩn hóa nồng độ mồi 35

Hình 3.4 Kết quả chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp mồi 37

Hình 3.5 Kết quả độ đặc hiệu của bộ mồi 39

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự tốt 40

Hình 3.7 Kết quả BLAST trình tự trên NCBI 40

Hình 3.8 Vùng overlap giũa các cặp mồi 41

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Danh sách các thiết bị sử dụng 20

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ sử dụng 20

Bảng 2.3 Danh mục các hóa chất sử dụng 21

Bảng 2.4 Các thành phần cho phản ứng PCR 23

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng 23

Bảng 2.6 Các thành phần phản ứng PCR với nồng độ mồi 30 pmol 24

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng 25

Bảng 3.1 Các trình tự full genome Canine parvovirus 26

Bảng 3.2 Các cặp mồi được thiết kế 29

Bảng 3.3 Các thông số của bộ mồi 31

Bảng 3.4 Các mồi thay thế 32

Bảng 3.5 Kích thước sản phẩm PCR 32

Bảng 3.6 Nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi 36

Bảng 3.7 Nồng độ mồi và nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho bộ mồi 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CPV Canine parvovirus

PCR Polymrase Chain Reaction

FPV Feline panleukopenia virus

MEV Mink enteritis virus

RPV Racoon parvovirus

DNA Deoxyribonucleotide

ssDNA Chuỗi DNA sợi đơn (single strain DNA)

NS1 Phi cấu trúc 1 (Non structural 1)

NS2 Phi cấu trúc 2 (Non structural 2)

RCR Rolling Circle Replication

TFRC Transferrin receptor

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay

KN Kháng nguyên (antigen)

KT Kháng thể (antibody)

dNTP Deoxy nucleoside triphosphat

TAE Tris Acetate Elution

Tm Nhiệt độ nóng chảy (Melting temperature)

NCBI National Center for Biotechnology Information BLAST Basic Local Alignment Search Tool

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo nghiên cứu, chó là loài được con người thuần hóa sớm nhất trong các loài động vật Chúng là loài vật thông minh, trung thành và gắn liền với các hoạt động xã hội của con người như trông nhà, làm thú cảnh, trở thành một người bạn thân thiết trong gia đình, v.v Từ đó, nhu cầu về việc nuôi chó cũng như chăm sóc chó ngày càng được xem trọng và tăng cao, bên cạnh đó thì việc xuất hiện các dịch bệnh lây truyền trên chó cũng được thế giới quan tâm Bệnh trên chó rất đa dạng, có thể kể đến như bệnh dại, bệnh ngoài da, bệnh hô hấp, v.v Trong đó, bệnh về đường tiêu hóa là căn bệnh phổ biến trên các giống chó lưu hành hiện nay, nếu không được chữa trị kịp thời

có thể dẫn đến tử vong Đặc biệt là bệnh tiêu chảy cấp tính do Canine parvovirus

(CPV) gây ra

CPV là một loài virus gây bệnh chủ yếu trên chó, chúng rất dễ lây lan từ chó sang chó qua các con đường trực tiếp lẫn gián tiếp Chó con dễ mắc bệnh CPV gây ra hơn là các loại chó trưởng thành do có sức đề kháng yếu Khi mắc bệnh, chó có trạng thái lờ đờ, nôn ra máu cũng như đi tiêu ra máu Tình trạng bệnh thường tiến triển nhanh và khiến rất nhiều chó con lẫn chó chưa tiêm chủng vaccine tử vong nhanh hơn Hiện nay, vaccine là phương pháp hữu hiệu nhất trong việc phòng bệnh CPV gây

ra trên chó Dẫn đến các nghiên cứu về việc giải trình tự full genome về CPV ngày càng nhiều và cần thiết để tìm ra loại vaccine thích hợp cho việc điều trị Nhưng các nghiên cứu này còn nhiều sai sót do các bộ mồi hiện tại chưa thích hợp cho giải trình

tự các chủng khác nhau hoặc ở các vị trí địa lý khác nhau Các bộ mồi được sử dụng hiện tại chưa đảm bảo được tính đặc hiệu và độ chính xác cao có thể dẫn đến sai sót trong trong quá trình giải trình tự full genome Từ những lý do trên, chúng tôi đề xuất

đề tài “Thiết kế và thử nghiệm mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần

đầy đủ bộ gen Canine parvovirus tại Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài

- Thiết kế được bộ mồi cho phản ứng PCR phục vụ giải trình tự gần đầy đủ của bộ

gen Canine parvovirus

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Canine parvovirus

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Canine parvovirus (CPV) được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1976 trên

những con chó ở Châu Âu Đến năm 1978, CPV đã lây lan một cách không kiểm soát, trở thành một đại dịch, gây ra các dịch bệnh viêm cơ tim và viêm dạ dày, khiến cho rất nhiều chó con cũng như các loại chó trưởng thành khác tử vong hàng loạt trên thế giới

Chúng được xem như là một biến thể của Feline panleukopenia virus (FPV), một loại

virus được phát hiện từ những năm 1920, gây ra các bệnh trên mèo, chồn và một số động vật khác CPV có thể phát sinh do quá trình đột biến gen cho phép nó mở rộng phạm vi vật chủ lên trên chó, chó sói, gấu trúc cũng như một số động vật hoang dã khác 1

Ngay sau khi xuất hiện, CPV-2 đã trải qua quá trình tiến hóa liên tiếp tạo ra 2 biến thể kháng nguyên: CPV-2a và CPV-2b thay thế dần chủng CPV ban đầu, được báo cáo lần đầu tiên vào các năm 1979 và 1984 Năm 2000, lại tiếp tục xuất hiện thêm một biến thể kháng nguyên mới là CPV-2c, được phát hiện ở Ý, Việt Nam, Tây Ban Nha và nhanh chóng lây lan sang một số quốc gia khác Chúng đang dần trở nên phổ biến ở các khu vực địa lý khác nhau và gây ảnh hưởng đến cả trên các loại chó trưởng thành và cả những giống chó đã được tiêm chủng vaccine 2 So với loại CPV-2 ban đầu, các biến thể mới được đánh giá có khả năng lây lan cho mèo, tăng thêm phạm vi

ký chủ Khảo sát dịch tễ học về biến thể CPV-2c, chúng có một biến thể kháng nguyên đặc biệt, có sự khác biệt so với các biến thể CPV khác Dẫn đến việc tiêm phòng các vaccine trước đó không còn hiệu quả Tuy nhiên, một số nghiên cứu chỉ ra rằng vẫn có một số loại vaccine dựa trên biến thể CPV-2b vẫn có khả năng chống lại CPV-2c 3

Ba thập kỷ sau khi được phát hiện, tuy việc các loại chó tử vong do CPV đã được cải thiện nhờ sự nghiên cứu chế tạo thành công vaccine vào cuối những năm 1970 Nhưng CPV vẫn được xem là một cuộc đại dịch ở chó trên toàn thế giới do sự phát triển của các biến thể ngày càng nhanh chóng và nguy hiểm Vì vậy việc phòng ngừa

và điều trị vẫn là một điều vô cùng quan trọng (Theo đường dẫn: https://www.vet.cornell.edu/)

Hình 1.1 Sự tiến hóa của CPV 3

1.1.2 Phân loại khoa học Canine parvovirus

Family (Họ): Parvoviridae Subfamilies (Phân họ): Parvovirinae Genus (Chi): Protoparvovirus

Species (Loài): Carnivore protoparvovirus 1

Họ Parvoviridae bao gồm hai phân họ, Parvovirinae và Densovirinae, lây nhiễm lần lượt tương ứng trên vật chủ là động vật có xương sống và côn trùng Tính đến thời

điểm hiện tại, có năm chi nằm trong phân họ Parvovirinae, bao gồm Protoparvovirus, Erythrovirus, Dependovirus, Amdovirus và Bocavirus CPV nằm trong chi Protoparvovirus, cùng với Feline panleukopenia virus (FPV), Mink enteritis virus (MEV) và Racoon parvovirus (RPV) Hiện tại, có hai loại CPV gây bệnh trên chó là

CPV-1 và CPV-2 Tuy nhiên, tác nhân phổ biến gây ra bệnh tiêu chảy cấp trên chó là

do CPV-2 còn CPV-1 đã được phân loại vào trong chi Bocavirus cùng với Parvovirus

gây bệnh trên bò 2

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc CPV

Vật liệu di truyền của CPV là một chuỗi DNA sợi đơn (single strain, ssDNA), có chiều dài khoảng 5.000 nucleotides Chứa hai khung đọc mở (open reading frame,

ORF) chính Khung đọc mở đầu tiên của nửa đầu 3’ mã hóa hai gen phi cấu trúc NS1

và NS2, đây là các gen đóng vai trò thiết yếu cho sự nhân lên của virus và chịu trách

nhiệm gây ra quá trình apoptosis trong các tế bào vật chủ 4 Trong đó:

− NS1: Protein phi cấu trúc 1 (Non structural 1) đa chức năng hiển thị các hoạt động endonuclease và helicase cần thiết để bắt đầu và chỉ đạo sao chép DNA của virus

Nó cũng đóng một vai trò trong việc đóng gói virus và chuyển hóa một số chất xúc tác Liên kết vị trí cụ thể với 2 - 3 bản sao song song gần đúng trong nguồn gốc của quá trình sao chép (Ori), tháo vùng kẹp tóc này và kẹp một sợi DNA, do đó bắt đầu sao chép vòng tròn lăn (Rolling Circle Replication, RCR) Liên kết hợp tác Ori với PIF(Preimplantation factor) và có thể là các yếu tố khác, kích hoạt chức năng nickase của

NS1 Trở thành gắn cộng hóa trị vào đầu 5’ của nick và cung cấp 3’OH để tổng hợp DNA mồi Hoạt động helicase tháo xoắn DNA theo hướng 3’ – 5’ trên sợi dài hơn Ức chế chu kỳ tế bào chủ trong quá trình chuyển đổi G1/S, pha S và chuyển tiếp G2/M Việc ức chế này có thể cung cấp các yếu tố tế bào cần thiết cho quá trình sao chép DNA của virus.Thúc đẩy quá trình apoptosis trong tế bào vật chủ4

− NS2: Protein phi cấu trúc 2 (Non structrual 2) của Parvovirus ở chó (CPV) được

tạo ra từ khung đọc mở bên trái của bộ gen virus và chứa 87 acid amin đầu tận cùng với protein không cấu trúc 1 (NS1) liên kết với 78 acid amin từ một khung đọc mở thay thế Trong virus minus của chuột parvovirus NS2 đóng vai trò kiểm soát quá trình lắp ráp và dịch mã protein capsid theo cách thức cụ thể của vật chủ Theo nghiên cứu của Dai Wang và các cộng sự thì NS2 của CPV được dự đoán khác với protein của các

loài Parvovirus ở loài gặm nhấm, và protein cũng như các chức năng của nó chưa

được mô tả4

Khung đọc mở thứ hai từ nửa đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc, VP1 và VP2,

có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid từ 6 bản sao của VP1 và 54 bản sao của VP2, chúng còn là kháng nguyên chính tạo ra các kháng thể bảo vệ và là yếu tố gây độc lực5 CPV capsid có đường kính khoảng 25 nm, được lắp ráp từ 60 bản sao kết hợp từ các protein VP1 và VP2, khác nhau bởi sự hiện diện của N- mở rộng đầu cuối trong minor protein VP1 capsid bao bọc ssDNA của bộ gen Trong đó:

− VP1 chiếm khoảng 10% , hình thành nên một icosa-herdal giúp chúng có khả năng chống lại acid, bazơ, v.v Đây là protein có vai trò chủ chốt trong quá trình lây nhiễm trong tế bào, chúng thường nằm sâu trong capsid và khó bị phát hiện bởi các kháng thể Đây là protein cần thiết trong vai trò lây nhiễm của capsid nhưng lại không đóng góp cao trong việc hình thành capsid Vùng kết thúc của VP1 còn chứa một số nhóm acid amin cơ bản giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm trình tự được bảo tồn gần cuối vùng kết thúc bao gồm 4 acid amin cơ bản, có nhiệm vụ vận chuyển các protein vào trong nhân tế bào 6

− Còn VP2 chiếm phần lớn còn lại có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid và là yếu tố độc lực chính 4 Các protein Capsid chịu trách nhiệm cho việc gắn vào TFRC (Transferrin receptor) thụ thể của tế bào chủ Sự gắn kết này chủ yếu gây ra sự nội hóa virion thông qua quá trình nội bào hóa clathrin Liên kết với các thụ thể vật chủ cũng gây ra sự sắp xếp lại capsid dẫn đến sự tiếp xúc trên bề mặt của VP1 N-endinus, đặc biệt là vùng giống như phospholipase A2 của nó 5

Hình 1.2 Minh họa bộ gen đầy đủ của CPV

(Theo đường dẫn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001539.1?report=graph)

1.1.4 Các bệnh do nhiễm Canine parvovirus

Parvovirus đường ruột: Parvo đường ruột có thể tiến triển nhanh, đặc biệt với các

chủng mới a, b, c của CPV-2 Tình trạng nôn mửa xảy ra dữ dội, tiêu chảy, chán ăn và mất nước nhiều Phân chuyển màu xám vàng, có lẫn máu tươi và máu thẫm Nhiệt độ trực tràng tăng cao (40 – 41 oC) và tăng bạch cầu, đặc biệt là trong các trường hợp nghiêm trọng Chết trên chó xảy ra sớm trong vòng 2 ngày sau khi bị bệnh tấn công và thường kết hợp với sự nhiễm khuẩn gram âm hoặc đông tụ nội mạc thành mạch hoặc

cả hai

Bệnh thần kinh: Dấu hiệu thần kinh có thể do sự xuất huyết trong hệ thống thần kinh trung ương hoặc bị giảm đường huyết trong suốt quá trình bệnh, sự nhiễm khuẩn hoặc sự rối loạn các ion acid – bazơ

Bệnh về da: Những tổn thương gồm: loét ở gang bàn chân, miệng và màng nhầy

âm đạo Các hốc trong xoang mũi và các mảng ban đỏ ở bụng và vùng da xung quanh

âm hộ cũng được phát hiện

Viêm cơ tim: CPV gây viêm cơ tim có thể phát triển do lây nhiễm từ dạ con hoặc bào thai nhỏ hơn 6 tuần thai Tất cả chó con đều bị ảnh hưởng, chó con bị nhiễm CPV gây viêm cơ tim đều bị chết hoặc chết sau một thời gian ngắn có biểu hiện triệu chứng, khó thở, và nôn mửa

Chứng huyết khối: CPV gây ra tình trạng huyết khối động mạch chủ, do sự xuất hiện các cục máu đông trong động mạch chủ, dẫn đến sự gián đoạn truyền lưu lượng máu đến các mô được phân đoạn bởi động mạch chủ chó, có thể gây ra các biến chúng nghiêm trọng

Nhiễm khuẩn nước tiểu: Do sự nhiễm bẩn từ phân của cơ quan sinh dục ngoài kết hợp với Neutropenia Sự nhiễm bệnh trên hệ tiết niệu mà không được điều trị có thể dẫn đến bệnh đường niệu mãn như một hậu quả không mong muốn.(Theo đường dẫn: https://www.vet.cornell.edu/)

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán CPV

Hiện nay, chẩn đoán bệnh do virus gây ra thông thường bằng một số kỹ thuật sau:

Chẩn đoán theo triệu chứng: CPV có thể khiến cho chó có biểu hiện mệt mỏi, stress và mất hoặc chán ăn, sau đó là đột ngột sốt cao, nôn mửa và tiêu chảy ra máu Tuy nhiên, CPV chỉ là một trong số những nguyên nhân có khả năng, không thể nhận định chính xác nguyên nhân thật sự

Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay): cho đến nay, phương pháp phổ biến nhất và thuận tiện nhất để kiểm tra sự hiện diện của CPV là xét nghiệm ELISA trong phân Nguyên lý của kỹ thuật ELISA là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên - antigen (KN) hoặc Kháng thể - antibody (KT) đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứaKT hoặc KN cần tìm vào giếng Bổ sung thêm kháng thể có gắn với enzyme Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme

sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh

quang Trong xét nghiệm ELISA, các kháng thể đối với Parvovirus được cố định trên

bề mặt của các giếng, một mẫu phân được thêm vào khoang, và các kháng thể gắn vào

các protein Parvovirus có thể có trong phân Sau đó, một hóa chất thay đổi màu sắc được thêm vào buồng, và nếu virus Parvovirus đã gắn vào các kháng thể, hóa chất sẽ

đổi màu và cho biết kết quả “dương tính” Mặc dù xét nghiệm ELISA khá chính xác, nhưng đôi khi nó có thể tạo ra kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả 7

Bác sĩ thú y cũng có thể dựa vào xét nghiệm sử dụng kỹ thuật gọi là phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để chẩn đoán CPV từ các mẫu phân Xét nghiệm PCR trong phân của CPV phát hiện các mẫu nhỏ DNA của virus đặc hiệu cho CPV trong phân của một con chó bị nhiễm bệnh Xét nghiệm này rất chính xác (hơn cả ELISA trong phân của CPV), nhưng yêu cầu mẫu phân phải được gửi đến phòng thí nghiệm chuyên thực hiện xét nghiệm dựa trên PCR, vì vậy, nó thường đòi hỏi nhiều thời gian hơn so với ELISA trong phân của CPV 7

1.2 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

1.2.1 Tổng quan về PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn

trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA

Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của các sinh vật ở mức độ phân tử, v.v 8

1.2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của PCR dựa trên cơ chế sao chép của DNA, như quá trình phân bào của mỗi tế bào để DNA của sinh vật được nhân đôi Nó tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu

về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt 8

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95 oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới 9 Bước 2: (bắt cặp, annealing) Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt

độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn

Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 oC Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây 9

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ được tăng lên 72 oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút 9

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích

đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao

1.2.3 Thành phần phản ứng PCR

1.2.3.1 DNA khuôn mẫu (DNA template)

Chúng có thể là đoạn acid nucleic đặc trưng của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền, v.v mà phản ứng PCR sẽ nhân bản lên (gia tăng số lượng) để chúng có thể được phát hiện dễ dàng Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được nếu bệnh phẩm không có nucleic acid đích hoặc trong bệnh phẩm còn các chất ức chế phản ứng PCR (SDS, hemoglobin, sắc tố, heparin, v.v) Trong những trường hợp này kết quả PCR sẽ âm tính nhưng là âm tính giả Vì vậy, vấn đề chuẩn bị mẫu bệnh phẩm cho thử nghiệm PCR phải được coi trọng, đặc biệt là trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh

1.2.3.2 Đoạn mồi (Primer)

Là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18 30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) vào đoạn khởi đầu và kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đơn Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính:

-− Quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng PCR, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và phản ứng PCR càng đặc hiệu

− Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi đích khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

Thông thường người ta dùng một cặp mồi bao gồm mồi xuôi và mồi ngược Cặp mồi này quyết định nên kích thước của sản phẩm PCR Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa bao nhiêu thì kích thước sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại

1.2.3.3 dNTP (deoxy nucleoside triphosphate)

Đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP), hay thymine (dTTP), hay cytosine (dCTP), hay guanine (dGTP) ở carbone số 1 (C1) Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này

và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên chuỗi đích Năng lượng để phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP 10

1.2.3.4 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Taq-polymerase là DNA polymerase chịu nhiệt được sử dụng đầu tiên cho phản

ứng PCR Nó được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nóng Thermus

aquaticus Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính Hiện nay, một số DNA

polymerase chịu nhiệt khác cũng được sử dụng trong phản ứng PCR như Vent/deep

vent DNA polymerase (Thermococcus litoralis), Pfu DNA polymerase (Pyrococcus

furiosus), Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus), UITma DNA polymerase

(Thermotoga maritime), v.v 10

1.2.3.5 Dung dịch đệm cho phản ứng PCR

Thường chứa muối đệm Tris-HCl, KCl, MgCl2 Trong đó, MgCl2 ảnh hưởng đáng kể đến phản ứng PCR MgCl2 cần cho hoạt động của Taq-polymerase, hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm 10

1.2.4 Ứng dụng của phản ứng PCR

Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn DNA rất nhỏ như: một giọt máu, một sợi tóc hay một tế bào, v.v người ta có thể nhân bản chính xác, trật tự một lượng lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản ứng Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự DNA, v.v

Trong vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân

vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp: Tác nhân không thể nuôi cấy thường quy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV,

virus SARS, H5N1, v.v), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma,

Treponema pallidum, v.v) Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: M tuberculosis Tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã được điều

trị kháng sinh trước đó (lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ, v.v) PCR cũng được dùng để xác định độc tố của vi sinh vật: Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT - cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng PCR đã được dùng khuếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc

chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các

nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết;

nonagglutination, NAG) Clostridium difficile cũng được định loại (phân type) thông

qua xác định các loại độc tố riêng biệt của chúng bằng PCR 11

Vi khuẩn trong dạ dày Helicobacter pylori (HP) hiện đang là một trong những

vấn đề thời sự của y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày được quan tâm gần đây Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó, PCR đã

được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (vacA,

cagA) liên quan tới độc tính của nó Nhờ PCR, người ta còn biết được sự phân bố của

các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định 11

PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn Từ trước đến nay, tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng các kỹ thuật dựa trên nuôi cấy như kháng sinh đồ theo Kirby Bauer (khuếch tán trên thạch) và xác định

nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimal Inhibitory Concentration) Các kỹ thuật này chiếm nhiều thời gian nên khó cho phép có định hướng điều trị kịp thời trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp Ngoài ra, các kỹ thuật nuôi cấy có hiệu quả phục vụ điều trị không

cao đối với một số vi sinh vật, như Mycobacterium tuberculosis, có thời gian tăng

trưởng rất dài (nhiều tuần lễ) Với kỹ thuật PCR, người ta có thể phát hiện nhanh tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh Ví dụ, PCR để xác định các đột biến

kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để xác định một M tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB Nhờ vậy, những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một

cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân nói riêng và cộng đồng nói chung, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung

ra môi trường bên ngoài 12

1.2.5 Kỹ thuật điện di

Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân để phân tích các đại phân tử tích điện Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR Axit nucleic nói chung là một phân tử tích điện âm,

vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA, người ta dùng phương pháp làm hiện hình Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromid Chất này sẽ gắn xen các bazơ của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel và có thể phân biệt được phân tử DNA trên cùng một bảng gel Đối với gel polyacrylamid, các phân tử thông thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phóng

xạ tự ghi 8

Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn, thường là DNA λ Khi điện

di cho chạy cùng với mẫu nghiên cứu, qua đó có thể so sánh với DNA mẫu với DNA chuẩn để biết trọng lưọng phân tử, hoặc trích li được DNA khác nhau 8

1.3 Nguyên tắc thiết kế mồi

1.3.1 Sơ lược về đoạn mồi

Đoạn mồi, hay còn được gọi là Primer, là những đoạn oligonucleotide, dùng để làm đoạn khởi đầu cho quá trình nhân đôi DNA Thông thường, các DNA polymerase (enzyme xúc tác) không thể bắt đầu tổng hợp đoạn DNA mới mà thiếu primer Đoạn primer sẽ bắt đầu gắn vào mạch DNA khuôn và làm cầu nối cho DNA polymerase thực hiện tổng hợp đoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung 13

Đoạn mồi thường dùng cho chuỗi phản ứng PCR thường có chiều dài khoảng

15-30 base, là các phân tử DNA được tổng hợp nhân tạo Bao gồm hai đoạn mồi, đoạn mồi xuôi (forward primer) và đoạn mồi ngược (reverse primer) Đoạn mồi xuôi được bắt cặp với mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã Ngược lại, mồi ngược được bắt cặp với mạch đối nghĩa và sẽ kéo dài ngược chiều phiên mã 14

Hình 1.3 Mồi xuôi và mồi ngược tổng hợp DNA13

Có thể nói, Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn tốt hơn

1.3.2 Nguyên tắc thiết kế mồi

Do mồi đóng vai trò quan trọng cho việc thành công của phản ứng PCR, vì vậy việc thiết kế một primer thích hợp cho chuỗi phản ứng PCR là cần thiết và cần thỏa mãn các điều kiện trong nguyên tắc thiết kế như độ dài, tỷ lệ G/C và nhiệt độ nóng chảy của mồi

1.3.2.1 Độ dài của mồi

Chiều dài của mồi ảnh hưởng tới tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó Nói cách khác, primer càng dài thì tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy cũng như nhiệt độ bắt cặp của nó càng cao

Cặp mồi cho phản ứng PCR nên có độ dài thích hợp, nằm trong khoảng từ 15 -

30 bp, độ dài tối ưu là từ khoảng 18 - 22 bp, mồi xuôi và mồi ngược không nên cách nhau quá 3 nucleotides Độ dài thích hợp để đảm bảo mồi đủ dài để gắn đặc hiệu và đủ ngắn để có thể dễ dàng gắn vào khuôn tại nhiệt độ gắn mồi 15

1.3.2.3 Nhiệt độ nóng chảy (Tm)

Nhiệt độ nóng chảy được định nghĩa là điểm nhiệt mà tại đây 50% sợi đôi DNA phân tách nhau và tạo ra sợi đơn Thông thường, Tm của một cặp mồi nằm trong khoảng 50 - 62 oC, hai mồi không nên cách nhau quá 2 oC Nếu nhiệt độ nóng chảy vượt quá 5 oC, phản ứng PCR sẽ không thành công14

Xác định được Tm sẽ cho phép xác định được các thông số chu kỳ nhiệt độ thích hợp Trong giai đoạn ủ của PCR, nhiệt độ phản ứng cần phải đủ thấp để cho phép cả cặp mồi xuôi và ngược liên kết với mẫu, nhưng không quá thấp để xuất hiện các cấu trúc kẹp tóc nội phân tử hoặc các mồi liên kết ngược với nhau, làm giảm hiệu suất phản ứng

Để tính toán được Tm của đoạn mồi, có thể tham khảo một số công thức sau:

Tm = 2(A + T) + 4(G + C) Trong đó A, T, G, C là số nu tương ứng trong trình

tự mồi 17

Do nhiệt độ nóng chảy chịu ảnh hưởng của nồng độ muối trong đệm, pH và nồng

độ mồi, vì vậy Tm có thể tính chính xác bằng công thức:

Tm = 81,5 + 16,6(log[Na+] + 0,41(%GC) – 675/độ dài mồi 17

Hiện tượng tương đồng chéo: là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gen khác có trong hỗn hợp ban đầu Để tránh hiện tượng này, sau khi thiết kế cần được đưa lên các phần mềm tin sinh học để kiểm tra độ đặc hiệu 15

1.3.3 Các phần mềm thiết kế mồi phổ biến

1.3.3.1 Phần mềm thiết kế mồi Primer3

Primer3 là chương trình được sử dụng phổ biến để thiết kế mồi (primer) cho phản ứng PCR Đây là chương trình mã nguồn mở, do Steve Rozen and Helen Skaletsky phát triển tại Whitehead Institute và Howard Hughes Medical Institute, USA (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) luôn được cập nhật thường xuyên và được sử dụng thường xuyên cho việc thiết kế mồi Primer3 được áp dụng trong nhiều dự án nghiên cứu khác nhau 18

Phần mềm Primer3 có nhiều ứng dụng khác nhau như tạo STSs (sequence tagged sites) đế lập bản đồ lai, hoặc khuếch đại trình tự để tìm kiếm nucleotide đa hình Primer3 cũng có thể tạo các mồi đơn để phục vụ giải trình tự hoặc tạo các đầu dò lai oligonucleotide Trong việc lựa chọn oligos cho mồi hoặc đầu dò lai, Primer3 có thể xem xét nhiều yếu tố Chúng bao gồm nhiệt độ nóng chảy oligo, chiều dài, hàm lượng

GC, độ ổn định 3’, cấu trúc thứ cấp ước tính, khả năng ủ hoặc khuếch đại các trình tự không mong muốn (ví dụ: các lần lặp lại xen kẽ nhau), khả năng hình thành hiện tượng kết cặp giữa hai bản sao của cùng một mồi và độ chính xác của trình tự nguồn Trong thiết kế cặp mồi Primer3 có thể xem xét kích thước sản phẩm và nhiệt độ nóng chảy,

sự khác biệt giữa nhiệt độ nóng chảy của các mồi và vị trí của mồi so với các vùng cụ thể quan tâm hoặc cần tránh19

1.3.3.2 Phần mềm thiết kế Primer-BLAST

Hầu hết các phần mềm thiết kế mồi hiện nay đều chỉ thực hiện một trong hai chức năng: thiết kế đoạn mồi hoặc kiểm tra tính đặc hiệu của mồi Như phần mềm Primer3 chỉ tổng hợp các thông số như tỷ lệ G/C, chiều dài mồi, Tm nhưng không thể kiểm tra được tính đặc hiệu của mồi Từ đó, phần mềm thiết kế Primer-BLAST được nghiên cứu và phát triển để đáp ứng được nhu cầu thiết kế mồi cũng như kiểm tra tính đặc hiệu của mồi được thiết kế Đặc biệt, Primer-BLAST có cơ chế kết hợp căn chỉnh

và nhạy cảm trong việc phát hiện các mục tiêu khuếch đại tiềm năng Hầu hết các phần mềm thiết kế mồi hiện nay đều chỉ thực hiện một trong hai chức năng: thiết kế đoạn mồi hoặc kiểm tra tính đặc hiệu của mồi Như phần mềm Primer3 chỉ tổng hợp các thông số như tỷ lệ G/C, chiều dài mồi, Tm nhưng không thể kiểm tra được tính đặc

hiệu của mồi Từ đó, phần mềm thiết kế Primer-BLAST được nghiên cứu và phát triển

để đáp ứng được nhu cầu thiết kế mồi cũng như kiểm tra tính đặc hiệu của mồi được thiết kế Đặc biệt, Primer-BLAST có cơ chế kết hợp căn chỉnh và nhạy cảm trong việc phát hiện các mục tiêu khuếch đại tiềm năng 20

Phần mềm Primer-BLAST được phát triển dựa trên sự kết hợp phần mềm NCBI C++ và phần mềm Primer3 Nó bao gồm một module để tạo các cặp mồi và một module để kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi được tạo ra Module kiểm tra tính đặc hiệu sử dụng kết hợp giữa BLAST cùng với thuật toán căn chỉnh toàn cầu Neddleman-Wunsch (NW) để tìm kiếm các kết quả phù hợp giũa mồi và vùng mục tiêu 20

Ngoài các phần mềm trên, còn một số phần mềm khác như: BatchPrimer3, UniPrime2, RexPrimer , v.v

1.4 Tình hình nghiên cứu về Canine parvovirus

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2018, Trần Ngọc Bích cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu về việc khảo

sát bệnh viêm ruột do Parvovirus gây ra trên chó tại Cần Thơ Ở nghiên cứu này, cho

thấy tỷ lệ nhiễm bệnh là 29,45% Xảy ra nhiều và nghiêm trọng nhất ở độ tuổi từ 1 đến dưới 3 tháng tuổi là 42,99% và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chó từ độ tuổi từ 5 đến 6 tháng tuổi (14,46%), không có sự khác biết về tỷ lệ nhiễm bệnh giũa chó đực và chó cái Tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm chó giống nội và nhóm chó giống ngoại lần lượt là 29,49% và 29,50% Tỷ lệ điều trị thành công là khoảng 84,76% 21

Tháng 5/2019, Nguyễn Thị Yến đã công bố nghiên cứu về đặc tính phân tử của

Parvovirus type 2 được phân lập tại Hà Nội, theo kết quả nghiên cứu, đã phân tích

được trình tự của 4 chủng Parvovirus VNUA-CP17, VNUA-CP31, VNUA-CP32 và VNUA-CP35 Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự gen VP2 của Parvovirus type

2 trong nghiên cứu này cho thấy mức độ tương đồng cao về nucleotide (nt) và acid

amin (aa) khi so sánh với các chủng Parvovirus vaccine và các chủng Parvovirus tham

chiếu khác trên thế giới, tỷ lệ tương đồng trình tự nt từ 98,4 – 100% và aa từ 97,7 – 100% Kết quả phân tích cây phả hệ cho thấy các chủng Parvovirus type 2 trong

nghiên cứu này thuộc 2 nguồn gốc khác nhau là từ mèo và chó Trong đó, 3 chủng VNUA-CP31, VNUA-CP32 và VNUA-CP35 cùng nằm trên nhánh phát sinh của các

chủng Parvovirus gây giảm bạch cầu ở mèo, còn chủng VNUA-CP17 có nguồn gốc từ

chó Cũng trong nghiên cứu này, chủng VNUA-CP17 có mức độ tương đồng cao so với các chủng ở Mỹ và Hàn Quốc 22

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Năm 2014, Ruben Pe´ rez và cộng sự đã công bố nghiên cứu về trình tự full genome và sự xuất hiện của việc tái tổ hợp của một số chủng Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tái tổ hợp hiện đang lưu hành giữa các chủng trong quần thể tự nhiên, tạo ra

sự đa dạng cho các chủng virus và sự xuất hiện của các kiểu gen mới Kết quả nghiên cứu nhấn mạnh nên việc nghiên cứu giải trình tự đầy đủ bộ gen của CPV để có một biện pháp khắc phục hợp lý 23

Năm 2015, Shi-Chong Han và các cộng sự đã công bố nghiên cứu đặc điểm của

bộ gen đầy đủ của CPV phân lập tại Tây Bắc Trung Quốc Trong nghiên cứu này, các kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng CPV-LZ1 và CPV-LZ2 lần lượt được chỉ định

là CPV-2a và CPV-2b mới Kết quả phân tích sự liên kết trình tự cho thấy rằng hai chủng mới này đã trải qua các biến thể đặc biệt cụ thể trong quá trình thích nghi địa phương Các vùng không dịch mã bên trái của các chủng này hình thành cấu trúc kẹp tóc hình chữ Y, trong khi các vùng không dịch mã bên phải thiếu sự tái lập trình tự DNA Một cây phát sinh loài được xây dựng từ 33 vùng mã hóa toàn bộ của CPV cho thấy sự phân cụm không gian mạnh mẽ, và hai dòng này thuộc về dòng cụm chủng Trung Quốc Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp để có được bộ gen có chiều dài đầy đủ của CPV Việc phân lập và mô tả đặc điểm của những virus này ngày càng

bổ sung kiến thức về bộ gen dài đầy đủ của CPV Kết quả từ nghiên cứu này cũng cung cấp cái nhìn sâu sắc về dịch tễ học phân tử và sự đa dạng di truyền của các chủng CPV được phân lập từ vùng Tây Bắc Trung Quốc và có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa và kiểm soát lây nhiễm CPV ở khu vực này 24

Tháng 9/2017, S.P Silva và cộng sự đã công bố nghiên cứu về trình tự cũng như đặc tính phân tử về CPV ở Brazil Theo kết quả nghiên cứu, họ đã công bố bộ gen đầy

đủ của các chủng CPV-2 ở Brazil, và nhận định được các chủng CPV-2 là các biến thể

CPV-2b (Asn426Asp) lưu hành ở Belém Các chủng CPV-2b này còn được phát hiện đột biến ở các vị trí acid amin 87, 101, 300, 305 và 375 Phân tích cây phát sinh loài còn chỉ ra các chủng CPV-2b này và các chủng CPV-2a từ những năm 1990 có mối quan hệ với nhau, cho thấy các chủng CPV-2b ở Belém có nguồn gốc từ những chủng CPV-2a từ những năm 1990 Cần theo dõi liên tục và xác định đặc điểm phân tử của các mẫu CPV2 không chỉ để xác định những thay đổi về gen và kháng nguyên có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine mà còn để hiểu rõ hơn về các cơ chế thúc đẩy sự phát triển của CPV-2 ở Brazil 25

Năm 2018, Purpari Giuseppa và cộng sự đã công bố nghiên cứu về việc khảo sát của CPV ở Sicily (Italy) bằng sinh học phân tử Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tổng số 673 mẫu từ 370 con chó, thu nhận được 265 mẫu (39,38%) dương tính và được phân tích thêm bằng cách phân tích đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP) và phân tích trình tự DNA Nghiên cứu cho thấy các chủng CPV-2c hiện đang lưu hành rộng rãi ở Sicily (79,56% số chó dương tính với CPV), tăng rõ rệt so với giai đoạn từ 1995-2005, tăng từ 23,43% lên đến 50%, lý do cho vấn đề này có thể là do khu vực địa

lý, tỷ lệ tiêm chủng cũng như sự lây lan từ các chủng xuất hiện ở Châu Âu có nguồn gốc Châu Á Kết quả phân tích trình tự và phát sinh loài còn cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các chủng CPV-2a và CPV-2c từ Châu Âu với các châu lục khác trên thế giới Cho thấy CPV-2c đang được phân phối rộng rãi trên toàn thế giới và biến chủng này cũng ảnh hưởng đến những con chó đã thực hiện việc tiêm chủng, cần có những

nỗ lực hướng tới sự phát triển vaccine mới 26

Năm 2019, Kenneth Ikejiofor Ogbu và cộng sự đã nghiên cứu bộ gen gần đầy đủ

của các chủng Parvovirus ở Nigeria Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 59 mẫu được

chọn để phân tích thêm bằng các xét nghiệm phân tử khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ phổ biến của CPV-2c (91,5%) so với biến thể CPV-2a (8,5%) Các trình tự gen VP2 cho thấy sự khác biệt so với các chủng được phân tích vào năm 2010 ở Nigeria và có mối liên hệ chặt chẽ hơn với các chủng CPV có nguồn gốc châu Á Việc phân tích gen không cấu trúc đã chứng minh những thay đổi acid amin chưa từng được báo cáo trước đây Phân tích phân tử dựa trên trình tự bộ gen đã chứng minh mô hình phân bố địa lý của các chủng được phân tích, cho thấy nguồn gốc tiến hóa chung tiềm năng với CPV

có nguồn gốc châu Á Nghiên cứu này đại diện cho đặc điểm phân tử CPV đầu tiên

bao gồm tất cả các trình tự gen mã hóa được tiến hành ở lục địa Châu Phi và góp phần xác định sự lây lan địa lý hiện tại của các biến thể CPV trên toàn thế giới 27

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nơi thực hiện

Đề tài trên được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 6/2020 – 9/2020

2.2 Nội dung nghiên cứu

− Thiết kế mồi PCR phục vụ nhu cầu giải trình tự gần đầy đủ bộ gen của CPV

− Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên các chủng CPVs phân lập tại Việt Nam

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.1 Danh sách các thiết bị sử dụng

2.3.2 Các hóa chất sử dụng

Bảng 2.3 Danh mục các hóa chất sử dụng

2 Phosphate Buffered Saline 8 Agarose

6 6X Gelred loading dye buffer 12 TopPURE®Genomic Extraction kit

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu thập trình tự mẫu

Sử dụng nguồn cơ sở dữ liệu National Center for Biotechnology Information

(NCBI) để thu nhận các bộ gen đầy đủ của Canine parvovirus Các từ khóa tìm kiếm

sử dụng là “Canine parvovirus, complete genome” Các trình tự sau khi thu nhận được

lưu dưới định dạng file FASTA

2.4.2 Sắp gióng cột trình tự

Sau khi thu nhận trình tự, ta sử dụng phần mềm CLUSTAL X 2.1 28 và BioEdit 7.2 29 để so sánh các điểm tương đồng của các vùng trình tự

Bước 1: khởi động phần mềm CLUSTAL X 2.1

Bước 2: nhấn File/Load sequences, chọn file Fasta các trình tự full genome đã tìm được

Bước 3: chọn Alignment/Do complete alignment, chờ 15 đến 20 phút để thu được kết quả so sánh các vùng trình tự

Bước 4: kết quả sẽ trực tiếp dẫn qua phần mềm BioEdit 7.2

Từ đó, ta xác định các vùng bảo tồn của các trình tự và bắt đầu thiết kế mồi

2.4.3 Thiết kế mồi

Sau khi xác định vùng bảo tồn, ta sử dụng phần mềm Primer-BLAST 20 để thực hiện việc thiết kế mồi và chọn ra các cặp mồi thích hợp

Bước 1: truy cập vào phần mềm Primer-BLAST theo đường dẫn https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi

Bước 2: chọn vùng trình tự và kích thước sản phẩm mong muốn để tạo đoạn mồi thích hợp

Bước 3: chọn các thông số kỹ thuật để tạo ra đoạn mồi khuếch đại vùng trình tự mong muốn Chọn kích thước sản phẩm PCR (PCR product) nằm trong khoảng từ 100 – 1500 bp Nhiệt độ nóng chảy nằm từ khoảng 50 - 65 oC Khoảng cách nhiệt độ nóng chảy hai mồi không vượt quá 3 oC

Bước 4: nhấn Get Primers để bắt đầu việc thiết kế mồi và chọn ra đoạn mồi thích hợp với các điều kiện đặt ra

Sau khi thiết kế, ta sẽ gửi các thông số cũng như trình tự các cặp mồi cho công ty

http://www.phusabiochem.com/vi/.html) thực hiện việc tổng hợp và tạo mồi

2.4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi sau khi thiết kế

Sử dụng các mẫu đã được định danh là Canine parvovirus thu nhận từ các phòng khám Thú y tại Thành phố Hồ Chí Minh bởi cùng một nhóm nghiên cứu về Canine

parvovirus gây bệnh tiêu chảy trên chó

DNA được tách chiết theo TopPURE®Genomic Extraction kit cho virusđược sản xuất bởi công ty TNHH Giải pháp y sinh ABT:

- Bước 1: huyền phù mẫu trong 200 µL PBS Thêm 20 µL Proteinase K

- Bước 2: thêm 200 µL CL buffer, vortex đều và ủ khoảng 10 phút ở 60 oC

- Bước 3: thêm 200 µL Ethanol, trộn đều và chuyển hỗn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút Giữ cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Bước 4: đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Thêm 500 µL WB1 buffer và ly tâm ở tốc

độ 13.000 vòng trong 1 phút Giữ cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

- Bước 5: thực hiện tương tự bước 4, thay WB1 buffer thành WB2 buffer

- Bước 6: đặt lại cột vào tube 2 mL cũ Làm khô cột bằng cách ly tâm 13.000 vòng trong 1 phút