Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khoáng, BA, kinetin, IAA, IBA, NAA đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng juliet (rosa hybrid l) in vitro

Nội dung - Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet Rosa hybrida - Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của Hoa hồng Juliet.. 11 2.4.2 Thí nghiệm

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH

PHẦN KHOÁNG, BA, KINETIN, IAA, IBA, NAA

ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY HOA HỒNG JULIET(Rosa hybrid L)

NGUYỄN TẤT THÀNH THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC THÀNH PHẦN KHOÁNG, BA, KINETIN, IAA, IBA, NAA ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA

CÂY HOA HỒNG JULIET(Rosa hybrid L)

IN VITRO

Sinh viên thực hiện : Phan Thị Thúy Quỳnh

Mã số sinh viên : 1611540375 Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Mai Thị Phương Hoa ThS Đỗ Tiến Vinh

TP HCM, 2020

- -oOo -

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1 Đầu đề luận văn:

Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khoáng, BA, Kinetin, IAA, IBA,

NAA đế sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrid L) in

vitro

Mục tiêu

- Xác định được thành phần khoáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp

để nhân giống cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrida) in vitro

2 Nội dung

- Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrida)

- Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của Hoa hồng Juliet

- Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây Hoa hồng Juliet

- Khảo sát ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến quá trình tạo rễ của Hoa hồng Juliet

4 Thời gian thực hiện: tháng 10/2019 đến 4/2020

5 Người hướng dẫn chính: ThS Mai Thị Phương Hoa

Người hướng dẫn phụ: ThS Đỗ Tiến Vinh

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn

TP HCM, ngày tháng năm 2020

ThS Mai Thị Phương Hoa

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học, trường

Đại học Nguyễn Tất Thành đã giúp đở trong suốt 04 năm học qua

Đặc biệt tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Mai Thị Phương Hoa - Thầy

Đỗ Tiến Vinh đã tận tình giúp đở và trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thành

tốt luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn gia đình đã tạo mội điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình

học Đồng thời, tôi xin cảm ơn tập thể lớp 16DSH1A và các bạn thực tập tại phòng

Nuôi cấy mô Thực vật Khoa Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đở tôi trong quá

trình làm khóa luận tốt nghiệp Để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của

mình

Phan Thị Thúy Quỳnh

Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

ĐẶT VẤN ĐỀ ix

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1Cây hoa hồng Juliet 1

1.1.1 Phân loại khoa học 1

1.1.2 Đặt điểm thực vật 1

1.1.3 Giá trị kinh tế 2

1.2 Phương pháp nhân giống cây hoa hồng Juliet 2

1.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 2

1.2.2 Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học 3

1.3 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật 3

1.3.1 Các gia đoạn của nuôi cấy mô thực vật 3

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 3

1.4 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 7

1.4.1 Công trình nghiên cứu trong nước 7

1.4.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài 8

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nơi thực hiện 10

2.2 Nội dung nghiên cứu 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.4 Nội dung nghiên cứu 11

2.4.1 Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet 11

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Hoa hồng Juliet 12

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây hoa hồng Juliet 12

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng IAA, IBA, NAA đến quá trình tạo rễ của hoa hồng Juliet 13

2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 13

2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu 13

2.5.2 Xử lý số liệu 14

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Kết quả thí nghiệm 1: Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet 15

3.2 Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của Hoa hồng Juliet 18

3.3 Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây hoa hồng Juliet 20

3.4 Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng IAA, IBA, NAA đến quá trình tạo rễ của hoa hồng Juliet 23

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤ LỤC 29

TÓM TẮT

Hoa hồng Juliet (Rosa Hydrida L) là một loại hoa hồng ngoại đẹp, có giá trị

kinh tế cao, được nhiều người ưa chuộng Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của các

thành phần khoáng, BA, Kinetin, IAA, IBA, NAA đế sự sinh trưởng và phát

triển của cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrid L) in vitro

” được thực hiện từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 04 năm 2020 tại phòng nuôi cấy mô thực vật, khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thành với mục tiêu xác định được thành phần khoáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp để

nhân giống cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrid L) in vitro

Đề tài có 4 nội dung: Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet; Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của hoa hồng Juliet; Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây hoa hồng Juliet; Khảo sát ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến quá trình tạo rễ của hoa hồng Juliet Các thí nghiệm được bố trí theo cách hoàn toàn ngẫu nhiên

Những kết quả đạt được sau quá trình nghiên cứu

1 Xác định được nồng độ Javel 75% trong 10 phút là thích hợp nhất để vô trùng mẫu đốt thân cây hoa hồng Juliet

2 môi trường WPM là môi trường khoáng thích hợp nhất để nhân giống cây hoa hồng Juliet

3 Nồng độ BA 1 mg/l là thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi cây hoa hồng Juliet

4 Nồng độ IAA 0,5 mg/l là thích hợp nhất cho quá trình tạo rễ cây hoa hồng Juliet

SUMMARY

Juliet Rose (Rosa Hydrida L) are beautiful of infrared rose, high economic value,

is popular with many people The project " To determine the growth medium BA, Kinetin, IAA, IBA, NAA for in vitro propagation of Juliet Rose (Rosa Hydrida L) in

vitro" was implemented from September 2019 to April 2020 at the Department of Plant

Tissue Culture, Department of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University To

determine the growth medium and concentration of growth regulators suitable for in vitro propagation of Juliet Rose (Rosa Hydrida L)

The thesis consist of 4 inspections: Inspect of samples sterilization; Inspect of basic growth medium for propagation of Juliet Rose; Inspect the effect of BA, Kinetin

to the ability creating buds of Juliet Rose; Inspect the effect of growth IAA, IBA, NAA

to rooting process of Juliet Rose

The results achieved after the research process:

1 Javel 50% for 5 min is most suitable for sterilizing the samples

2 WPM growth media is the most suitable for growth and development of Juliet Rose

3 BA 1 mg / l has the highest ability of creating buds in Juliet Rose

4 IAA 0,5 (mg/l) gives the best rooting result in Juliet Rose

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây Hoa Hồng Juliet 1

Hình 3.1 Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet (NT-1.5) 17

Hình 3.3 Kết quả thí nghiệm 2 19

Hình 3.3 Kết quả thí nghiệm 3 22

Hình 3.4 Kết quả thí nghiệm 4 24

Hình 3.5 Cây hoa hông Juliet sau 60 ngày nuôi cấy (NT4.2) 26

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Các nghiệm thức vô trùng mẫu vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet 12 Bảng 3.1 Kết quả vô trùng của cây hoa hồng Juliet 16 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh

trưởng và phát triển của Hoa hồng Juliet. 18 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của

cây hoa hồng Juliet 21 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng IAA, IBA, NAA đến quá

trình tạo rễ của hoa hồng Juliet 25

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BA: Benzyladenine

B5: Môi trường Gamborg 1968

IBA: Indolebutyric acid

LV: Môi trường Litvay 1985

MS: Môi trường Murashige-Skoog 1962

NAA: α-Naphthalene acetic acid

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Tính cấp thiết của đề tài

Những năm gần đây, hoa hồng Juliet rất được thị trường ưa chuộng nhưng nguồn cung trong nước không đủ để đáp ứng Nguồn cung cấp cây hoa hồng Juliet chủ yếu được nhập từ Anh nên giá thành thường khá cao, đối với cây trưởng thành từ 1,5 - 3 năm có giá 10 - 20 triệu đồng/cây Nắm bắt được nhu cầu đó một số khu ở Hà Nội, Lâm Đồng, Hồ Chí Minh,…đã tiến hành nhập cây về và nhân giống, cho thấy được loại cây này thích nghi khá tốt với khí hậu tại Việt Nam

Hoa hồng Juliet được nhân giống bằng phương pháp truyền thống như giâm cành, ghép cành Phương pháp này có thể tạo ra cây giống mang đặc tính của cây ban đầu, thời gian phát triển được rút ngắn Tuy nhiên cho hệ số nhân giống thấp, cây dễ bị nhiễm bệnh, nhiễm virus, việc thụ phấn chéo sẽ xảy ra và đặc điểm của giống được trộn lẫn, cây dễ bị thoái hóa, rễ cây yếu Phương pháp chiết cành, giâm cành không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được truyền từ cây mẹ sang Riêng đối với phương pháp ghép cành thì giống hoa hồng Juliet sẽ được ghép với một gốc hoa hồng nội địa để tăng khả năng thích ứng của cây nhưng sao một thời gian chúng có thể làm thay đổi chất lượng hoa không như ban đầu Vì vậy nguồn cung trong nước không đảm bảo về chất lượng, số lượng và cũng không đáp ứng đủ nhu cầu thị thường Nên việc nghiên cứu nhân giống cây hoa hồng Juliet là rất cần thiết

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là phương pháp thích hợp nhất để nhân giống cây hoa hồng Juliet nhằm nhân nhanh giống cây trồng, tạo ra được giống cây trồng sạch bệnh, đảm bảo chất lượng và tính đồng nhất về mặt di truyền của giống giúp

hạ giá thành sản phẩm mà vẫn đảm bảo được chất lượng của giống

Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khoáng, BA, Kinetin, IAA, IBA, NAA đế sự sinh trưởng

và phát triển của cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrid L) in vitro.

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được thành phần khoáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích

hợp để nhân giống cây hoa hồng Juliet (Rosa hybrida) in vitro

Đề tài thực hiện từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 04 năm 2020 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây hoa hồng Juliet

1.1.1 Phân loại khoa học

Giới: Plantae

Bộ: Rosales

Họ: Posaceae

Chi: Rosa

Loài: Rosa hybrida

Hình 1.1 Cây Hoa Hồng Juliet

(https://www.vuonhongvanloan.com)

Hoa Hồng Juliet (Rosa hybrid L), ngoài ra còn có tên khác là AUSjamson 1 là một loại hoa hồng cổ điển ở nước Anh, thuộc bộ Rosales Hoa hồng Juliet là loại hoa hồng thân bụi, hoa có màu vàng hoặc vàng cam, hoa to có dạng hình trứng có đường kín từ 5 - 10 cm số cánh hoa có thể lên tới 90 cánh, thường mọc thành chùm ở đầu cành mỗi chùm thường có 3 - 4 hoa, có độ lặp lại tốt cứ 5 - 6 tuần là cho hoa một lần Hoa hồng Juliet có hương trà xanh nhẹ Cây phân nhánh nhiều từ gốc, vì thế cây được trồng thành bụi ở sân vườn, công viên, nhà hàng, khách sạn, Bông hoa hồng Juliet còn là lựa chọn hàng đầu trong việc trang trí hoa cầm tay cô dâu, hoa cưới và các sự kiện trọng đại

1.1.2 Đặt điểm thực vật

Cây hoa hồng Juliet là giống hồng thân bụi, cây có chiều cao khoảng 1,5 m, chiều cao tối đa đạt 2,5 m với tán rộng 1 - 1,5 m Hoa Hồng Juliet còn có hoa liên tục hầu như quanh năm, cây đặc biệt sai hoa khi thời tiết mát Nụ hoa có dạng hình trứng, khi các cánh hoa bắt đầu nở thường có đường kính khoảng 1,3 cm và dài khoảng 2 cm đài hoa có màu xanh lá ôm trọn cánh hoa vào trong Hoa hồng Juliet thường cho hoa thành cụm, một cụm hoa có từ 3 - 4 hoa, đối với hoa được trồng với mục đích cắt cành thì chúng thường được cắt bớt đi hoa chỉ để loại 1 bông trên một cụm để hoa to và đẹp hơn Hoa có dạng hình trứng, thường có màu vàng hoặc màu vàng cam, các cánh hoa được sắp xếp một cách tinh tế, độc đáo và đẹp mắt Hoa Hồng Juliet có đường kính

khoảng 5 - 10 cm với hơn 90 cánh hoa Lá hoa hồng Juliet thuộc dạng lá kép, ở cuốn

có 3 - 6 lá nhỏ, lá có hình bầu dục, phiến lá có nhiều răng cưa nhỏ Chúng có kích thước: dài 4cm, rộng 3cm đối với lá non; dài 8 cm, rộng 4 cm đối với lá già Khi lá còn non có màu xanh nhạt và sẽ đậm dần khi lá già Rễ của cây hoa hồng Juliet có dạng rễ chùm, khi bộ rễ lớn phát triển thêm nhiều rễ phụ ăn sâu xuống đất giúp cây có thể hấp thụ tốt nhiều chất dinh dưỡng đồng thời giúp cây có thể đứng vững, chống lại các yếu

tố bất lợi của thời tiết

Nhiệt độ: Hoa hồng Juliet phát triển tốt nhất ở điều kiện khí hậu mát, nhiệt độ khoảng từ 17 – 25°C Khi cây được trồng trong nhà kính nơi có nhiệt độ ổn định thì sẽ cho hoa có năng xuất tốt nhất, cây sẽ ích bị sâu bệnh Đối với cây hoa hồng bụi nhập ngoại, chỉ tưới nước khi bề mặt chậu hơi khô và hạn chế tưới vào buổi tối (tưới vào buổi sáng là tốt nhất) Với các cây có dấu hiệu bị bệnh nấm hoặc đen thân thì chú ý hạn chế tưới nước Các cây có dấu hiệu bị bệnh trĩ hoặc bệnh nhện đỏ trên cây hoa hồng thì tăng cường bổ sung thêm nước Giá thể trông hoa hồng Juliet phải đảm bảo

độ tơi xớp, thoát nước và đầy đủ dinh dưỡng thích hợp cho cây phát triển tốt nhất

1.1.3 Giá trị kinh tế

Trên thị trường hiện nay loại hoa hồng Juliet được nhân giống tại Việt Nam với cây trưởng thành từ 2 - 3 năm có giá giao động từ 3 - 4 triệu một cây Đối với cây giống 3 - 4 tháng (cao khoảng 30 – 50 cm tính từ gốc) từ chiết cành, ghép cành có giá khoảng 200.000đ - 400.000đ Giá khá đắt nhưng giống hoa hồng này luôn được nhiều người lựa chọn

1.2 Phương pháp nhân giống cây hoa hồng Juliet

1.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống

Chiết cành, giâm cành là phương pháp thường được sử dụng trước đó và tạo ra nhiều cây bụi giống thích hợp hơn cho những nơi bị phơi nhiễm Ưu điểm của phương pháp chiết cành, giâm cành là cây tạo ra mang đặc tính của cây ban đầu, thời gian phát triển được rút ngắn Nhược điểm của phương pháp này là cho hệ số nhân thấp, dễ bị nhiễm virus, việc thụ phấn chéo sẽ xảy ra và đặc điểm của giống được trộn lẫn, cây dễ

bị thoái hóa, rễ cây yếu Phương pháp chiết cành, giâm cành không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể được truyền từ cây mẹ sang

1.2.2 Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học

Nuôi cấy mô, tế bào thực vậy là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy, nguyên liệu thường hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Nuôi cấy mô, tế bào thực vật bao gồm nuôi cấy cây non và cây trưởng thành, nuôi cấy cơ quan, nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn 2

Ưu điểm của nhân giống in vitro là hệ số nhân giống cao, tạo ra được giống cây

trồng sạch bệnh, đảm bảo chất lượng và tính đồng nhất về mặt di truyền Ngoài những

ưu điểm vượt trội thì bên cạnh đó nhược điểm của nuôi cấy mô là cây con có kích thước nhỏ, xảy ra đột biến biến dị làm xuất hiện những cây không mong muốn, cây con dễ bị thoái hóa sau nhiều lần cấy truyền, cần sử dụng các thiết bị đặc biệt

1.3 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những phương pháp được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các cơ quan thực vật như: hạt, thân, lá, rễ,… trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện nuôi cấy vô trùng và nhiệt độ thích hợp

Sự thành công của việc nuôi cấy mô thưc vật chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tố như: môi trường nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng cần thiết, sự vô trùng, nhiệt độ, ánh sáng,… Ngoài ra việc chọn mẫu ban đầu là rất quan trọng chúng quyết định sự thành công ban đầu cho cả quá trình nuôi cấy

1.3.1 Các gia đoạn của nuôi cấy mô thực vật

Có 04 gia đoạn trong quá trình nuôi cấy mô thực vật: giai đoạn 1 là vô trùng mẫu; giai đoạn 2 là nhân nhanh, giai đoạn 3 là giai đoạn kéo dài, kích thích tạo rễ, tạo thuần; giai đoạn 4 là giai đoạn nuôi thuần dưỡng Trong đó giai đoạn 2 là giai đoạn quyết định số lượng cây có thể tạo ra

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.2.1 Vô trùng mẫu cấy

Mẫu cấy trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy nhân tạo thì thường tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi sinh vật, nấm,…Nên việc xử lí vô trùng mẫu ban đầu là rất cần thiết Ở mỗi mẫu có mức độ nhiễm khác nhau và đặc điểm cũng khác nhau nên việc xử lí vô trùng mẫu cần phải có sự nghiên cứu nhằm thu được lượng mẫu nhiều mà ít tốn nguyên liệu ban đầu Các loại hóa chất khử trùng thường

được sử dụng trong để vô trùng mẫu là Javel, Hg2Cl,… Khả năng tiêu diệt vi sinh vật

và nấm của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy

Thời gian khử trùng rất quan trọng chúng phụ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ chất khử trùng và đặc điểm của mẫu cấy Thời gian quá lâu, hóa chất khử trùng sẽ thấm sâu vào mẫu làm tổn thương mô có thể gây chết mẫu Thời gian quá ngắn, hóa chất khử trùng không đủ thời gian để tiêu diệt các vi sinh vật và nấm nên mẫu có thể bị nhiễm

Sau giai đoạn xử lí vô trùng, mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy nhân tạo trong đó thành phần hóa học trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng

1.3.2.2 Ảnh hưởng của các thành phần hóa học trong môi trường

Thành phần trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triễn hình thái của mẫu Thành phần và tỉ lệ của môi trường thay đổi tùy theo tùng loại thực vật, mô, cơ quan của cây Tuy có sự đa dạng về thành phần

và nồng độ các chất hóa học nhưng tất cả các môi trường nuôi cấy mô bao gồm các thành phần: nguyên tố đa lượng, nguyên tố vi lượng, nguồn cacbon, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng

- Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1% khối lượng khô của thực vật Bao gồm các nguyên tố như nitơ, phospho, kali, magiê, canxi và lưu huỳnh là các muối vô cơ Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng như diệp lục, protein, acid nucleic, acid amin…, tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào

Photpho (P): Trong môi trường nuôi cấy, photpho được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium chúng tham gia vào quá trình vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia cấu trúc của màng Vì vậy photpho là một yếu tố quan trọng trong đời sống thực vật

Nitơ (N): Mô, tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng 2 nguồn nitrogen là nguồn nitrogen khoáng (aminonium và nitrate) và nitrogen hữu cơ (amino acid) Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3 Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 Tổng nồng độ của NO3

và NH4 trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy và mục đích nghiên cứu Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ Nitrat tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ Nitrat có thể được dự trữ ở không bào và thực hiện chức năng quan trọng trong việc điều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trồng

Kali (K): Trong môi trường nuôi cấy, Ion K+ được cung cấp dưới dạng muối KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4 Vai trò chính của ion K+ điều hòa áp suất thẩm thấu và

pH của môi trường nội bào vì vậy sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước

Magiê (Mg): Mg là nguyên tử trung tâm trong phân tử chlorophyl của hệ quang hợp I và II Trong phân tử chlorophyl, ATP và NADPH được tạo ra nhờ photon được hấp thụ tạo ra dòng điện tử có vai trò quan trọng đối với cố định ở lục lạp Nồng độ cao các ion Mg và K là cần thiết để duy trì pH khoảng 6,5 – 7,5 trong lục lạp và tế bào chất, trái với ở không bào pH chỉ vào khoảng 5 - 6 Trong một chừng mực nào đó, pH xác định cấu trúc của protein và enzym nên nó ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein và chức năng của lục lạp

Canxi (C): Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin

- Nguyên tố vi lượng: là những nguyên tố cây cần rất ít nhưng không thể thiếu

cho sự sinh trưởng phát triển bình thường Bao gồm các nguyên tố như: Mangan (Mn), Iốt (I), Đồng (Cu), cobalt (Co), Bo (B), Molybden (Mo), kẽm (Zn), sắt (Fe) Các yếu tố

vi lượng này có vai trò hoạt hóa các enzyme

- Nguồn Cacbon: các mẫu nuôi cấy mô nói chung không thể quang hợp hay quang hợp rất ít khi thiếu clorophin, nồng độ CO2 và các điều kiện khác Vì vậy cần phải đưa thêm vào môi trường nuôi cấy một lượng cacbohydrate và lượng chất cacbohydrate thường được sử dụng là đường sucrose Ngoài ra, một số loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng Đường sucrose vừa là nguồn cung cấp cacbohydrate trong môi trường nuôi cấy đồng thời đóng vai trò quan trọng trong sự điều chỉnh thẩm thấu qua màng Nếu hàm lượng đường cao sẽ dẫn đến mẫu khó hút nước Nếu hàm lượng đường thấp sẽ đẫn đến tình trạng mẫu bị mọng nước

- Vitamin: là những chất hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác các quá trình sinh dưỡng ở thực vật Một số loại vitamin cơ bản mà thực vật có thể tổng hợp được nhưng rất ít Vì vậy cần bổ sung thêm một hay một số loại vitamin khác để đảm bảo cây sinh trưởng và phát triển tốt Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol,… Trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật Vitamin B1 thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 - 10 mg/l Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật Pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1 - 10 mg/l Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng độ 0,1- 5 mg/l Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng vào phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp chúng có vai trò như nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy

- Các chất điều hòa sinh trưởng: có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Hiệu quả tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của nó và mẫu ban đầu Tỷ lệ cytokinin

và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập tạo trồi và rễ Một tỉ lệ cao cytokinin và auxin thấp thích hợp cho sự tạo rễ, còn ở mức độ trung gian thích hợp cho tạo mô sẹo

Auxin: được chia thành hai loại là auxin tự nhiên và auxin tổng hợp auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là Idole-3- acid acetic (IAA) và auxin tổng hợp Idole-3- butyric acid (IBA), 2,4-dichlorphenolxyacetic acid (2,4-D), I-napthalene acetic acid (NAA), IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp và khử trùng

và IAA không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp khử trùng Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính

Cytokinin: Zeatin là cytokynin tự nhiên được trích từ hạt bắp nảy nầm Kinetin

và 6- benzyl adenine được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây người ta đã chứng minh là được tạo ra ở một vài loại cây Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành

và sinh trưởng của trồi nuôi cấy mô Đồng thời, nó ức chế sự tạo rễ và hình thành mô sẹo Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chết sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

1.3.2.3 Các yếu tố khác

- pH môi trường: pH của môi trường nuôi cấy cũng là một yếu tố rất quan trọng,

ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự phân hủy các chất, …Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5.7 tới 5.9

- Nhiệt độ: Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Đối với thực vật, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hình thái, chức năng sinh lý và khả năng sinh sản

- Ánh sáng: Ánh sáng có vai trò rất quan trọng trọng trong qua sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu Tùy vào từng mục đích nuôi cấy ta có thể điều chỉnh cường đội chiếu sáng và thời gian chiếu sang sau cho thích hợp với từng loại cây như ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo thì không cần ánh sáng Thông thường trong nuôi cấy, người ta sử dụng ánh sáng huỳnh quang chiếu sáng 8 giờ/ngày với cường độ 2.000 - 3.000 lux

- Than hoạt tính : bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường có tác dụng khử độc Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các chất phenol, …trong trường hợp các yếu tố đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên tối hơn vì thấy thuận lợi cho việc kích thích ra rễ

1.4 Công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Công trình nghiên cứu trong nước

Bùi Thị Thu Hương và cộng sự (2017) với nghiên cứu nhân nuôi cây hoa hồng

cổ Sapa (Rosa gallica L) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro đã xác định được môi trường tối ưu nhất cho sự bật chồi in vitro là: MS + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetin +

30 g/l sucrose với tỷ lệ bật chồi là 91,67% Môi trường nhân nhanh chồi in vitro tối ưu

nhất là MS + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetin+ 30 g/l sucrose Môi trường ra rễ tối ưu

là ¼ MS với tỷ lệ mẫu ra rễ đạt 98,89% Mô sẹo được hình thành từ mảnh lá in vitro

khi được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IBA 0,5 mg/l Các mô sẹo này tái sinh chồi trên môi trường có bổ sung 0,75 mg/l BA 3

Công bố của Nguyễn Ngọc Quỳnh Thơ và cộng sự (2018) khi nghiên cứu tạo

chồi in vitro cây hoa hồng Tỷ Muội (Rosa chinensis Jac Var minima Redh) Kết quả

nghiên cứu đã xác định chất khử trùng thích hợp cho quá trình tạo chồi in vitro cây

hoa hồng tỷ muội từ nuôi cấy mẫu đốt thân là sử dụng dung dịch HgCl2 0,2% trong 10 phút Môi trường nuôi cấy tạo chồi thích hợp là môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l Kinetin 0,5 mg/l, than hoạt tính 0,5 g/l, sucrose 30 g/l 4

Kết quả nghiên cứu về nhân nhanh và cảm ứng ra hoa in vitro cây hoa hồng

Cơm (Rosa sericea LINDL) của Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự (2015) đã

nghiên cứu và xác định được Môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi hoa hồng cơm in

vitro là MS có bổ sung 1,5 mg/l BA với hệ số nhân đạt 2,73 lần sau 6 tuần Môi trường

thích hợp để cảm ứng tạo rễ cho chồi hoa hồng cơm là ¼ MS, đạt tỷ lệ ra rễ 100% sau

6 tuần nuôi cấy Môi trường tốt nhất cho hình thành hoa in vitro hoa hồng cơm là MS

có bổ sung 30µM AgNO3, cho tỉ lệ hoa nở 50% và hoa bền trong 14 ngày kể từ ngày

nở hoa 5

1.4.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài

Công bố của Naphaporn Nak-Udom và cộng sự (2009) khi nghiên cứu vi nhân

giống từ dốt thân cây hoa hồng Rosa hybrida L cv ‘Perfume Delight’ đã xác định được môi trường tối ưu nhất để tạo chồi in vitro là môi trường: MS có bổ sung BA

3mg/l, NAA 0.03 mg/l Môi trường MS có bổ sung BA 3 mg/l, NAA 0.03 mg/l là môi

trường thích hợp nhất cho việc ra hoa in vitro 6

Kết quả nghiên cứu về nhân giống in vitro cây hoa hồng Rosa hybrida L cv

Al-Taif Rose plant của Attia O Attia và cộng sự vào năm 2012 cho thấy được môi trường

MS có bổ sung BAP 2mg/l và Kinetin 1mg/l là môi trường thích hợp nhất đề tạo chồi

in vitro cho tỉ lệ 85% 7

Công bố của Nosheen Hameed và cộng sự (2006) khi nghiên cứu Vi nhân giống

in vitro cây hoa hồng ( Rosa indica L) đã xác định được môi trường tối ưu nhất để tạo

chồi in vitro là môi trường: MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l, 100% tạo chồi sao 7.4 ngày

trên môi trường nuôi cấy 8

Tuy nhiên, chưa có công bố hoàn chỉnh nào về nhân giống in vitro cây hoa hồng Juliet Nên việc xây dựng quy trình nhân giống cây hoa hồng Juliet in vitro này

là rất cần thiết

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nơi thực hiện

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật khoa Công nghệ sinh hoc, trường Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện đề tài: 6 tháng (từ tháng 10/2019 đến tháng 04/2020)

Vật liệu thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành từ đốt thân cây hoa hồng Juliet do công ty Happy Tree cung cấp

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet

- Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của Hoa hồng Juliet

- Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây Hoa hồng Juliet

- Khảo sát ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến quá trình tạo rễ của Hoa hồng Juliet

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở 1 atm, 121°C trong 15 phút; pH của môi trường 5,8; nhiệt độ phòng nuôi cấy 25 ± 2°C; cường độ ánh sáng 2.000 - 3.000 lux; thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD), gồm 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức ở từng lần lặp lại được cấy 3 chai, có chứa 50 ml môi trường nuôi cấy

2.4 Nội dung nghiên cứu

Vô trùng mẫu hoa hồng Juliet

Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi

trường khoáng đến sự sinh trưởng và

phát triển của Hoa hồng Juliet

Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin

đến khả năng tạo chồi của cây Hoa hồng

Juliet

Khảo sát ảnh hưởng của IAA, IBA,

NAA đến quá trình tạo rễ của Hoa hồng

Juliet

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quan nội dung nghiên cứu 2.4.1 Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet

- Mục tiêu: Xác định nồng độ Javel thích hợp để vô trùng cây Hoa hồng Juliet

- Vật liệu thí nghiệm: Chồi ngọn cây hoa hồng Juliet

- Môi trường nuôi cấy: MS 9 có bổ sung đường sucrose 30 g/l, agar 8 g/l

- Tiến hành: Đoạn thân có mầm ngủ của cây Hoa hồng Juliet được khử trùng với Javel có nồng độ lần lượt là 50% và 75% trong khoảng thời gian lần lượt là 5 phút, 10 phút, 15 phút Sau khi khử trùng bằng Javel, đoạn thân của cây hoa hồng Juliet được cấy vào môi trường MS

- Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm (%), tỷ lệ mẫu vô trùng (%)

- Thời gian thí nghiệm: 20 ngày

Cây hoa hồng Juliet do vườn cây giống Happy Tree cung cấp

Các loại môi trường khoáng

½ MS, WPM, LV, B5

BA (0,1: 0,5: 1: 2 mg/l) Kinetin (0,1: 0,5; 1;2 mg/l

IAA (0,1; 0,5; 1 mg/l) IBA (0,1; 0,5; 1 mg/l) NAA (0,1; 0,5; 1 mg/l)

Bảng 2.1 Các nghiệm thức vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến

sự sinh trưởng và phát triển của cây Hoa hồng Juliet

- Mục tiêu: Xác định được môi trường khoáng thích hợp cho sự sinh trưởng và

phát triển của cây Hoa hồng Juliet in vitro

- Vật liệu: Chồi cây Hoa Hồng Juliet in vitro

- Môi trường: MS 9, ½ MS 9, WPM 9, B5 9 có bổ sung đường sucose 30 g/l, Agar

8 g/l

- Tiến hành: Cây hoa hồng Juliet được cắt thành các đoạn có chiều dài 2 cm, có 2

lá sau đó được cấy vào các môi trường thí nghiệm

- Chỉ tiêu khảo sát: Chiều cao cây (cm), số lá (lá), số chồi (chồi), số rễ (rễ), chiều dài rễ (cm) đặc điểm thân

- Thời gian thí nghiệm: 30 ngày

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng tạo chồi của cây hoa hồng Juliet

- Mục tiêu: Xác định nồng chất điều hòa sinh trưởng thích hợp trong quá trình tạo chồi của cây hoa hồng Juliet

- Vật liệu: Chồi cây hoa hồng Juliet in vitro

- Môi trường khoáng: Theo kết quả thí nghiệm 2

- Điều hòa sinh trưởng: BA (0,1; 0,5; 1; 2 mg/l), Kinetin (0,1; 0,5; 1; 2 mg/l)

- Tiến hành: Cây hoa hồng Juliet (thí nghiệm 2) được cắt thành các đoạn có chiều dài 2 cm, có 2 lá sau đó được cấy vào môi trường thí nghiệm có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng lần lượt là BA (0,1; 0,5; 1; 2 mg/l), Kinetin (0,1; 0,5; 1; 2 mg/l)

- Chỉ tiêu khảo sát: Chiều cao (cm), số lá (lá), số chồi (chồi), số rễ (rễ), chiều dài rễ, đặc điểm thân

- Thời gian thí nghiệm: 30 ngày

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng IAA, IBA, NAA đến quá trình tạo rễ của hoa hồng Juliet

- Mục tiêu: Xác định hàm lượng của IAA, IBA, NAA thích hợp trong quá trình hình thành rễ của hoa hồng Juliet

- Vật liệu thí nghiệm: Chồi cây hoa hồng Juliet in vitro

- Môi trường khoáng: theo kết quả thí nghiệm 2

- Điều hòa sinh trưởng: IAA (0,1; 0,5; 1 mg/l), IBA (0,1; 0,5; 1 mg/l), NAA (0,1; 0,5; 1 mg/l)

- Tiến hành: Cây hoa hồng Juliet được cắt thành các đoạn có chiều dài 2 cm, có 2

lá sau đó được cấy vào môi trường thí nghiệm có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng lần lượt là IAA (0,1; 0,5; 1 mg/l), IBA (0,1; 0,5; 1 mg/l), NAA (0,1; 0,5; 1 mg/l)

- Chỉ tiêu khảo sát: Chiều cao (cm), số lá (lá), số chồi (chồi), số rễ (rễ), chiều dài rễ, đặc điểm thân

- Thời gian thí nghiệm: 30 ngày

2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu

- Tỷ lệ mẫu vô trùng (%) = (tổng số mẫu vô trùng/tổng số mẫu ban đầu) x 100

- Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = (tổng số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu vô trùng) x 100

- Tỷ lệ sống (%) = (tổng số cây sống/ tổng số cây ban đầu) x 100

- Số lá phát sinh được tính bằng cách đếm số lá sau 4 tuần trừ cho số lá ban đầu

- Số chồi phát sinh được tính bằng số chồi sau 4 tuần nuôi cấy trừ cho số chồi ban đầu

- Chiều cao của chồi được tính từ phần tiếp giáp giữa thân với rễ tới đỉnh chồi cao nhất

- Chiều dài rễ được tính từ phần tiếp giáp giữa thân với rễ đến chóp rễ của rễ dài nhất

- Số rễ được tính bằng cách đếm số rễ sau 4 tuần nuôi cấy

2.5.2 Xử lý số liệu

- Xử lý thống kê: Sử dụng phần mềm SAS 9.1 Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và thực hiện độc lập Kết quả của các nghiệm thức được trình bày thông qua các bảng

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả thí nghiệm 1: Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet

Cây ở môi trường ngoài vào phòng thí nghiệm thường bị nhiễm các loại vi sinh vật, nấm Nên việc xử lý vô trùng mẫu ban đầu là rất cần thiết Ở rất nhiều loài, mẫu cấy của các cơ quan khác nhau có tỷ lệ sinh trưởng và tái sinh khác nhau, trong khi có những mẫu hoàn toàn không thể sinh trưởng Vì thế việc lựa chọn nguồn mẫu ban đầu

là rất quan trọng, cần phải lựa chọn nguồn vật liệu nuôi cấy ban đầu sau cho mẫu cấy

dễ tái sinh chồi nhất, việc xử lý vô trùng mẫu dễ dàng nhất để có thể thu được kết quả tốt nhất

Mẫu được chọn ở các cơ quan trên mặt đất thì việc xử lí vô trùng mẫu sẽ dễ dàng hơn so với những mẫu ở dưới mặt đất Một vài mẫu như chóp rễ, củ thường khó để tái sinh chồi và đễ bị nhiễm các vi sinh vật nhất, gây trở ngại trong quá trình nuôi cấy Các vi sinh vật đất nhất định có thể tạo thành liên kết rất chặt chẽ thậm chí sống ngay bên trong các bộ phận nằm trong đất Rất khó để có thể loại bỏ chúng hoàn toàn mà không làm ảnh hưởng đến mẫu cấy Các cơ quan ở bên trên mặt đất (thân, lá, chồi, hoa…) cũng thường chứa nhiều vi sinh vật không mong muốn Tuy nhiên, chúng thường dễ dàng loại bỏ được bằng cách rửa nhẹ và phần còn sót lại có thể diệt bằng cách khử trùng bề mặt vì hầu hết các chủng vi sinh vật bề mặt không hình thành liên kết chặt chẽ với các mô thực vật

Trong thí nghiêm này, đoạn thân có mầm ngủ của cây hoa hồng Juliet được chọn

là vật liệu nuôi cấy vì khi sử dụng đoạn thân có mầm ngủ thì sẽ dễ bật trồi hơn so với việc sử dụng các bộ phận còn lại, việc xử lí vô trùng mẫu sẽ dể dàng hơn và đạt được kết quả tốt hơn Mẫu được lựa chọn thường là từ đốt thứ 3 đến đốt thứ 5 tính từ đốt ngọn trở vào vì ở đoạn thân này cây không bị quá non hoặc quá già Nếu đoạn thân quá già thì sẽ khó trong quá trình thao tác, mẫu dễ bị dập dẫn đến cây chết cây Nếu đoạn thân qua non thì mẫu rất nhanh bị tổn thương mẫu đễ bị nhiễm, dễ chết sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

Trong quá trình vô mẫu thường bị ảnh hưởng bởi các chất khử trùng, tùy theo đặc điểm của chất khử trùng, thời gian khử trùng và thao tác thực hiện mà mức độ tổn

thương của mẫu sẽ thể hiện trong qua trình quan sát Các chất khử trùng thường được

sử dụng là: Canxihypocloric, Natrihypocloric, HgCl2, Javel,…thí nghiệm lựa chọn chất khử trùng là Javel vì Javel là chất khử trùng thường được sử dụng nhiều trong giai

đoạn tạo mẫu in vitro ở thực vật do hiệu quả khử trùng cao mà ít ảnh hưởng đến mẫu

nuôi cấy, chi phí thấp, dễ sử dụng, ít độc hại hơn các chất khử trùng khác Nồng độ thường dùng trong các thí nghiệm là Javel 25%, 50%, 75% Theo Wang và cộng sự,

2002 đã tiến hành khử trùng mẫu hoa hồng với tỉ lệ mẫu sống cao được dựa trên các bước nhảy với thời gian 5 phút, 10 phút, 15 phút kết hợp với nồng độ Javel từ 25%, 50%, 75% trên môi trường nền MS

Bảng 3.1 Kết quả vô trùng của cây hoa hồng Juliet

Nghiệm

thức

Nồng độ javel (%)

Thời gian (phút)

10 phút, 15 phút Xét về tỷ lệ bật chồi cũng có sự khác biệt và có ý nghĩa về mặt thống

kê Cụ thể ở nghiệm thức NT1.1 (50% - 5 phút) có tỉ lệ bật chồi thấp nhất 27,73% Ở

2 nghiệm thức NT1.5 (75% - 10 phút), NT1.6 (75% - 15 phút) tỉ lệ mẫu vô trùng đều

đạt 100% Tuy nhiên, khi xét về mặt tỷ lệ bật chồi thì có sự khác nhau giữa hai nghiệm thức, ở nghiệm thức NT1.5 (75% - 10 phút) cao hơn 2,38% so với NT1.6 (75% - 15 phút)

Sau khi vô trùng đoạn thân cây hoa hồng Juliet, đoạn thân cây hoa hồng Juliet được cấy trên môi trường MS, sau 7 ngày cây bắt đầu mọc mầm, sau 20 ngày nuôi cấy thu được kết quả về sự phát triển của cây hoa hồng Juliet như sau:

Hình 3.1 Vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet (NT-1.5)

(A)Mẫu đã được vô trùng; (B) Mẫu sau 7 ngày; Mẫu sau 10 ngày (C)

Mẫu sau 15 ngày (D); Mẫu sau 20 ngày (E) (F) Như vậy, thời gian khử trùng mẫu và nồng độ chất khử trùng có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống của mẫu cấy Với NT1.5( nồng độ Javel 75% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh, cho tỷ lệ sống cao Do đó, chúng tôi chọn nồng

độ Javel 75% trong 10 phút là nồng độ Javel thích hợp nhất để vô trùng mẫu cây hoa hồng Juliet để tạo nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

B

3.2 Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự sinh trưởng và phát triển của hoa hồng Juliet

Trong nuôi cấy in vitro, thành phần trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất

quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triễn hình thái của mẫu Thành phần và

tỉ lệ của môi trường thay đổi tùy theo từng loại thực vật, mô, cơ quan của cây Tuy có

sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất hóa học nhưng tất cả các môi trường nuôi cấy mô điều bao gồm các thành phần: nguyên tố đa lượng, nguyên tố vi lượng, nguồn cacbon, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng Các loại môi trường khoáng thường được sử trong nuôi cấy mô là: môi trường MS, LV, WPM, B5,…các loại môi trường này khác nhau về một số thành phần hóa học, liều lượng nhưng chúng điều có một điểm chung là cung cấp các đa lượng cần thiết cho cây như là: nito, photpho, kali, giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt

Trong thí nghiêm này, bốn loại môi trường được sử dụng là WPM, ½ MS, LV, B5 có bổ sung sucrose 30 g/l, agar 8 g/l Vật liệu được sử dụng là chồi hoa hồng Juliet được cấy ở thí nghiệm trước được cấy vào các môi trường thí nghiệm và theo dõi trong 30 ngày Sau 30 ngày ta thu được bảng số liệu sau

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng đến sự

sinh trưởng và phát triển của Hoa hồng Juliet

Chỉ tiêu khảo sát Chiều cao