Phân lập và nhận diện một số dòng vi sinh vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid trong nước thải của các cơ sở chế biến thủy sản

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sản phẩm thực đạt được  Quy trình phân lập một số dòng vi sinh vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid trong nước thải của các cơ sở chế biến thuỷ sản.. 

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH

DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN GIẢI LIPID TRONG NƯỚC THẢI CỦA

CÁC CƠ SỞ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Số hợp đồng: 2017.01.56 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Giang Cẩm Tú

Đơn vị công tác: Khoa CNSH & MT

Thời gian thực hiện: 12 tháng

TP Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 08 năm 2018

NTTU-NCKH-05

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

-

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH

DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016-2017

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN GIẢI LIPID TRONG NƯỚC THẢI CỦA

CÁC CƠ SỞ CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Số hợp đồng: 2017.01.56 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Giang Cẩm Tú

Đơn vị công tác: Khoa CNSH & MT

Thời gian thực hiện: 12 tháng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tác động của nước thải chế biến thủy hải sản đến môi trường 2

1.1.1 Tác hại của các chất hữu cơ (chủ yếu là thành phần protein) 2

1.1.2 Tác hại của các chất lơ lửng 2

1.1.3 Tác hại của dầu mỡ 3

1.2 Vi sinh vật phân giải Lipid 3

1.3 Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải Lipid 4

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới 4

1.3.2 Nghiên cứu trong nước 5

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 8

2.2 Vật liệu nghiên cứu 8

2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 8

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 8

2.2.3 Hóa chất thí nghiệm 8

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Thí nghiệm 1: Thu mẫu và phân lập các dòng vi sinh vật 10

2.3.2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc các dòng vi sinh vật và mô tả hình thái tế bào vi khuẩn 11

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải Lipid trên môi trường Tween 20 13

2.3.4 Thí nghiệm 4: Định danh vi khuẩn có khả năng phân giải Lipid 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

3.1 Kết quả phân lập 14

3.2 Đặc điểm và hình thái khuẩn lạc 14

3.2 Khảo sát khả năng phân giải Lipid trong môi trường Tween 20 của các dòng vi sinh vật 17

3.3 Kết quả định danh bằng phương pháp Sinh học phân tử 26

3.4 Quy trình phân lập vi sinh vật có khả năng phân giải lipid 27

3.4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình 27

3.4.2 Thuyết minh quy trình 28

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30

4.1 Kết luận 30

4.2 Đề nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

PHỤ LỤC: KẾT QUẢ GIẢ TRÌNH TỰ 34

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A Tandoii: Acinetobacter tandoii

P Aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang Hình 3.1 Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường LB 15 Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 3 ngày của các dòng vsv thu tại TP.HCM ……… 16 Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 4 ngày của các dòng vsv thu tại TP.HCM……… 17 Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 5 ngày của các dòng vsv thu tại TP.HCM ……… 19 Hình 3.5 Kết quả thử hoạt tính của dòng TSB1……… 20 Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 2 ngày của các dòng vsv tại Cần Thơ……… 21 Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 2 ngày của các dòng vsv tại Cần Thơ ……… 21 Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 4 ngày của các dòng vsv tại Cần Thơ……… 22 Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 5 ngày của các dòng vsv tại Cần Thơ ……… 22

Hình 3.10 Kết quả thử hoạt tính của dòng M1A2- 2……… 24

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang Bảng 2.1 Môi trường phân lập vi sinh……….9 Bảng 2.2 Môi trường dinh dưỡng LB……… 9 Bảng 2.3 Môi trường Tween 20 kiểm tra hoạt tính lipase……… 10 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc những dòng vi sinh vật phân lập được… 15 Bảng 3.2 Bảng đặc điểm hình thái những vi sinh vật phân lập được………16 Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính của các dòng vi khuẩn phân lập ở TP.HCM sau 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày……… 20 Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính các dòng vi khuẩn sau 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày sau khi đã được xử lý thống kê……….24

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Sản phẩm thực đạt được

 Quy trình phân lập một số dòng vi sinh

vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid

trong nước thải của các cơ sở chế biến

thuỷ sản

 Một số chủng vi sinh vật có khả năng

phân giả lipid

 Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài

 Bài báo khoa học đăng trên tạp chí khoa

học chuyên ngành

 2 luận văn tốt nghiệp

Sản phẩm đăng kí trong thuyết minh

 Quy trình phân lập một số dòng vi sinh vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid trong nước thải của các cơ sở chế biến thuỷ sản

 Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giả lipid

 Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài

 Bài báo khoa học đăng trên tạp chí khoa học chuyên ngành

 2 luận văn tốt nghiệp

Thời gian đăng ký : từ ngày 04/2017 đến ngày 07/2018

Thời gian nộp báo cáo: ngày

MỞ ĐẦU

Nước thải thủy sản chứa phần lớn các chất thải hữu cơ trong đó lipid gây ảnh hưởng lớn đến môi trường vì không tan trong nước nên khó bị thủy phân Khi xả vào nguồn nước, lớp váng lipid còn tồn tại trên mặt nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước và ảnh hưởng đến vi sinh vật sử dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ Hiện nay, có nhiều phương pháp được thực hiện loại bỏ lớp váng lipid từ nước thải thủy sản như là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học cũng mang lại hiệu quả tốt tuy nhiên cả hai phương pháp này tốn nhiều chi phí khi phát triển trên quy mô lớn Dựa vào hoạt động sống của vi sinh vật mà các kỹ thuật xử lý chất thải bằng vi sinh ở quy mô phòng thí nghiệm thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học nước ngoài tuy nhiên số lượng nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực này còn khá hạn chế

Trong nghiên cứu này, từ các mẫu nước thải được thu thập từ công ty thủy sản tại Cần Thơ và thành phố Hồ Chí Minh, sau khi phân lập, sàng lọc và thử khả năng sinh

Lipase trên môi trường Tween 20 bước đầu sàng lọc được 33 dòng vi sinh vật trong đó có

22 dòng có khả năng phân giải lipid Chọn ra 5 dòng có khả năng phân giải cao để định

danh phân tử, kết quả được 3 loài là: Pseudomonas otitidis, Pseudomonas aeruginosa và

Acinetobacter tandoii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tác động của nước thải chế biến thủy hải sản đến môi trường [3],[1], [14]

Nước thải chế biến thuỷ sản có hàm lượng các chất ô nhiễm cao nếu không được xử

lý sẽ gây ô nhiễm các nguồn nước mặt và nước ngầm trong khu vực

Đối với nước ngầm, tầng nông, nước thải chế biến thuỷ sản có thể thấm xuống đất

và gây ô nhiễm nước ngầm Các nguồn nước ngầm nhiễm các chất hữu cơ, dinh dưỡng và

vi sinh vật rất khó xử lý thành nước sạch cung cấp cho sinh hoạt Đối với các nguồn nước mặt, các chất ô nhiễm có trong nước thải chế biến thuỷ sản sẽ làm suy thoái chất lượng nước, tác động xấu đến môi trường và sinh vật thủy sinh

Các chất hữu cơ chứa trong nước thải chế biến thuỷ sản chủ yếu là dễ bị phân hủy Trong nước thải chứa các chất như cacbonhydrat, protein, chất béo khi xả vào nguồn nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng ôxy hòa tan

để phân hủy các chất hữu cơ

Nồng độ oxy hòa tan dưới 50% bão hòa có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát triển của tôm, cá Oxy hòa tan giảm không chỉ gây suy thoái tài nguyên thủy sản mà còn làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho sinh hoạt và công nghiệp

1.1.1 Tác hại của các chất hữu cơ (chủ yếu là thành phần protein)

Lượng chất hữu cơ trong nước quá cao sẽ dẫn đến suy giảm nồng độ oxy hoà tan trong nước, do vi sinh vật sử dụng oxy hoà tan để phân huỷ các chất hữu cơ Nồng độ oxy hoà tan dưới 50% nồng độ oxy bão hoà có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát hiển của tôm cá

Oxy hoà tan giảm không chỉ gây tác hại nghiêm trọng đến tài nguyên thủy sinh mà còn

làm giảm khả năng tự làm sạch của nước

1.1.2 Tác hại của các chất lơ lửng

Các chất rắn lơ lửng làm hạn chế độ sâu tầng nước được ảnh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng đến quá trình quang họp của rong, tảo do đó cũng là tác nhân gây ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên thuỷ sinh

Các chất lơ lửng cũng là tác nhân gây tắc cống, làm tăng độ đục các nguồn nước, bồi lắng lòng kênh, ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh, đồng thời gây tác hại về mặt cảm quan

1.1.3 Tác hại của dầu mỡ

Dầu mỡ khi xả vào nguồn nước sẽ loang trên mặt nuớc tạo thành màng dầu gây cạn kiệt oxy của nuớc, một phần nhỏ hoà tan trong nuớc hoặc tồn tại ở dạng nhũ tương Cặn chứa dầu khi lắng xuống sẽ tích tụ trong bùn đáy

Ô nhiễm dầu mỡ dẫn đến mất khả năng tự làm sạch của các nguồn nuớc do giết chết các vi sinh vật phiêu sinh, sinh vật đáy tham gia vào quá trình tự làm sạch

Ngoài ra, dầu trong nuớc còn có tác động tiêu cực đến đời sống thủy sinh và ảnh huởng đến mục đích cấp nuớc sinh hoạt, nuôi trồng thủy sản

1.2 Vi sinh vật phân giải Lipid

Có rất nhiều loài phân giải chất béo Các chi Pseudomonas, Vibrio, Sarcine,

Bacillus, Alcaligenes, Burkholderia, Chromobacterium,…có khả năng sản sinh ra

enzyme lipase nội bào và ngoại bào, chuyển triglyceride trong phản ứng thủy phân thành

sản phẩm glycerin và acid béo Sau đó, glycerin và acid béo lại được chuyển hóa thành nhiều sản phẩm khác

Hiện nay, đã tìm ra được các chủng vi khuẩn như Acinetobacter sp SOD-1 từ nghiên cứu của Sugimori et al.,2002 [28], Acinetobacter sp SS192 và Pseudomonas

aeruginosa SS-219 của Sugimori và Utsue, 2012 [27] hay Bacillus sp của Okuda et al.,1991 có khả năng phân giải lipid [24]

Bacillus subbtilis: được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg

và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium” Năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis

Bacillus subtilis: là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước

nhiệt độ tối thích cho chúng sinh trưởng và phát triển là 360 _ 500 C, tối đa khoảng 600C,

bào tử chịu nhiết khá cao Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển của Bacillus subtilis là

10 – 15% Bacillus subtilis BN 1010 đang được sử dụng rất phổ biến trong các hệ thống

xử lý nước thải công nghiệp có chứa Lipid [10]

Acinetobacter là các loài vi khuẩn gram âm hiếu khí phân bố rộng trong đất và

nước, đôi khi phân lập được từ da, màng nhầy, chất bài tiết và cả môi trường bệnh viện

Vi khuẩn có dạng cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn, trên lam nhuộm chúng rất giống với họ Nesseriae

Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng, hiếu khí, có khả

năng di động nhờ vào một sợi chùm cực Pseudomonas aeruginosa dễ dàng phát triển

trên môi trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 370C, có thể phát triển được ở nhiệt độ 150C – 550C Tính chất đặc trưng của P aeruginosa là sinh sắc tố, chất thơm, sinh lipase… P aeruginosa tiết ra nhiều loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam

- lục), sắc tố huỳnh quang (vàng - lục, hiện tại được gọi là pyoverdin) và pyorubin (đỏ - nâu) [23]

1.3 Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải Lipid

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

Nhiều thành phần chất béo có trong mỡ động vật vi sinh vật có thể thủy giải thành Glycerol và acid béo Cả hai loại này có thể được một số loài vi sinh vật phân hủy chất

béo để lấy năng lượng và carbon cần thiết [Error! Reference source not found.6]

Theo “Letter Applied Microbiologi”, Ruiz C và cộng sự [25] đã phân lập được 724

dòng vi khuẩn hầu hết thuộc chi Bacillus trong đất có chứa nhiều chất hữu cơ và dầu ăn Nhiều chi khác cũng được tìm thấy như Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter,

Escherichia và nấm men

cứu chọn lọc và phối hợp nhiều chủng hay loại vi sinh vật trong chế phẩm, xử lý chất béo

để tìm kiếm, chọn lọc và thử nghiệm trên nhiều loại chất béo khác nhau để có hiệu quả tốt nhất [21]

Okuda và các đồng sự vào năm 1991 đã hoàn thành nghiên cứu về việc xử lý nước thải lipid nhờ vào việc sử dụng vi khuẩn để đồng hóa lipid Một số dòng vi khuẩn có khả

năng đã tăng trưởng trong môi trường có chứa dầu ô liu là được phân lập từ hai nhà máy thịt ở quận Sendai của Nhật Bản Tất cả các chủng được thử nghiệm đồng hóa mỡ bò, mỡ lợn, dầu ô liu và dầu của hạt có dầu được sử dụng như một nguồn carbon duy nhất trong

sự tăng mật số vi khuẩn Một trong những phân lập trên, dòng 351, tiêu hóa chất béo hiệu

quả nhất Vi khuẩn này được xác định là vi khuẩn Bacillus sp.[24]

Sugimori cùng các đồng sự vào năm 2002 đã công bố nghiên cứu vi khuẩn phân giải

lipid Acinetobacter sp dòng SOD – 1 và Acinetobacter sp SOD – 1 được phân lập từ đất,

có khả năng nhanh chóng phân giải dầu Dòng SOD - 1 cho thấy tăng trưởng tốt và phân giải 68,7 ± 2,7 và 83,0 % của một 3000ppm dầu ban đầu trong 24 giờ ở 200C, pH 7.0 và

ở 350C ở pH tương ứng là 8.0 Tỷ lệ suy giảm phụ thuộc vào độ pH, nhiệt độ, nồng độ phosphate, và mật độ tế bào ban đầu.[28]

Một nghiên cứu của Sugimori và Utsue (2012) về hiệu quả của các loại dầu ăn bị

phân hủy trong điều kiện kiềm đã phân lập được Acinetobacter sp SS192 và

Pseudomonas aeruginosa SS - 219 từ đất Nhật Bản Nồng độ lipid cao chứa trong nước

thải ức chế sự hoạt động của vi sinh vật trong các hệ thống xử lý nước thải sinh học như bùn hoạt tính và lên men metan Để làm giảm tác dụng ức chế các vi sinh vật có khả năng làm giảm hiệu quả các loại dầu ăn đã được sàng lọc từ các nguồn môi trường khác nhau,

từ đất Nhật Bản, phân lập 2 chủng vi khuẩn với khả năng phân giải lipid cao ở pH kiềm

mà không tiêu thụ các nhu cầu oxy sinh học Acinetobacter sp dòng SS - 192 và

Pseudomonas aeruginosa dòng SS - 219 phân giải 77,5 ± 0,6 % và 89,5 ± 1,5 %, tương

ứng, 3.000 ppm dầu hỗn hợp gồm mỡ dầu, mỡ lợn, thịt bò ở 37 0C và pH 9.0 trong 24h, phân giải hiệu quả của hai chủng xảy ra ở pH 8-9 và 25-40 0C.[27]

1.3.2 Nghiên cứu trong nước

Phân giải lipid là vấn đề đang được quan tâm trong nước nhưng các nghiên cứu về chúng còn nhiều hạn chế

Dương Minh Lam cùng các cộng sự năm 2011 đã công bố nghiên cứu tuyển chọn

Bacillus sinh lipase kiềm từ rừng ngập mặn của trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Hà

Nội Enzyme lipase đang được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến và công nghiệp dược phẩm trên toàn thế giới Hiện nay, enzyme lipase giữ vị trí thứ 2 về lượng

này, đã lựa chọn được 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh lipase kiềm mạnh trong số 250

chủng vi khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn Cả 8 chủng biểu hiện hoạt tính mạnh tại giá trị pH 9 và môi trường 3 % NaCl Tất cả các chủng nghiên cứu đều là các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus [9]

Theo Võ Hồng Chi (2011) tổng kết về “Nghiên cứu quá trình phân hủy chất hữu cơ giàu dầu mỡ trong điều kiện kỵ khí” chỉ nghiên cứu nước thải trong điều kiện kỵ khí để tái sử dụng năng lượng thông qua công cụ sinh học, nhưng các nghiên cứu thuần túy là các nghiên cứu cơ bản chưa có kết quả ứng dụng chủ yếu là bùn thải chứa nhiều dầu mỡ động vật Các nghiên cứu chủ yếu thông qua các hệ thống biogas kỵ khí để thu lại năng lượng mà cụ thể ở đây là khí methan chứ không chủ động nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi sinh vật để phân hủy dầu mỡ vốn chúng thường nhẹ hơn nước và nổi trên bề mặt nước thải [3]

Năm 2014, nhóm nghiên cứu do TS Lê Thị Nhi Công, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã Nghiên cứu thành công sự hình thành màng sinh học (BIOFILM) từ các vi sinh vật phân lập tại Việt Nam nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý ô nhiễm dầu mỏ Kết quả nghiên cứu đã được công bố trên Tạp chí Journal of Science, Natural Science and Technology, tạp chí Sinh học của Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Tạp chí Khoa học - Đại học Quốc gia Hà Nội Từ các mẫu nước thải khu công nghiệp Từ Liêm, Hà Nội Nhóm nghiên cứu phân

lập được chủng Bacillus sp B8 vừa có khả năng tạo màng sinh học cao vừa có khả năng

phân hủy dầu diesel tốt Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA, chủng B8 đã được định

tên là Bacillus sp.B8 với mã số đăng ký trên GenBank là JQ764732 Bằng thực nghiệm

đã xác định được một số điều kiện sinh lý sinh hóa tối ưu cho sự hình thành màng và khả năng hoạt động bề mặt của chủng là: nhiệt độ 300C, pH 7, nồng độ NaCl 0,5 % Dưới các điều kiện tối ưu này, mật độ quang học ở bước sóng 570 nm của màng sinh học do chủng B8 tạo thành đạt gần 27,89 và khả năng đánh tan dầu đạt 68 % Nuôi tĩnh chủng B8 dưới các điều kiện bổ sung 1% dầu diesel, sau 5 ngày ở dưới dạng màng sinh học cao, hoạt động bề mặt lớn và phân hủy tốt dầu diesel, chủng B8 có tiềm năng ứng dụng trong xử lý nước bị ô nhiễm dầu [2]

Vào năm 2014, Nguyễn Văn Trương đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học với

đề tài: phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid trong nước thải từ quán ăn, cơ sở chế biến của ba phường An Thới, Long Tuyền và Thới An Đông của trường Đại học Cần Thơ,Cần Thơ Đề tài đã phân lập, nhận diện và định danh được một số dòng vi khuẩn phân giải lipid cao trong quy mô phòng thí nghiệm [13]

Theo Ngô Thanh Phong (2014) “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy chất béo từ nước thải ở thành phố Cần Thơ” Cũng đã đưa ra dòng vi sinh vật phân hủy chất béo nhưng nồng độ và thành phần lipid có trong mẫu nước thải tương đối thấp cho với mẫu nước thải trong chế biến thủy hải sản Chính vì lẽ đó, điều cấp thiết là phải chọn lọc được các dòng vi sinh vật có khả năng phân giải các chất thải gây ô nhiễm dưới các điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH và dinh dưỡng khác nhau có khả năng phân hủy lipid ở nồng

độ cao [11]

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại khoa NNCNC & CNSH trường Đại Học Nguyễn Tất Thành và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học TP HCM

Thời gian thực hiện : từ 04/2017 đến 07/2018

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ thu và trữ mẫu: hũ nhựa có nắp, muỗng

Dụng cụ phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que trải, ống hút mẫu, micropipette, đèn cồn, bình tam giác, lame, lamelle, bao nilon chịu nhiệt, chai đựng mẫu…

Dụng cụ pha chế môi trường: Bình tam giác, ống đong, cốc đong (10ml,100ml,200ml)

Tủ an toàn sinh học, tủ ủ, nồi hấp khử trùng nhiệt ướt, cân điện tử (0,01g), kính hiển vi, máy đo pH, máy lắc, tủ mát, máy Vortex SCI ROGEX

2.2.3 Hóa chất thí nghiệm

Các hóa chất pha môi trường phân lập, nuôi cấy vi khuẩn, môi trường kiểm tra hoạt tính phân giải lipid:

* Môi trường phân lập: [13]

Bảng 2.1 Môi trường phân lập vi sinh

*Môi trường Luria Bertani (LB)( Bennasar et al., 1998)

Bảng 2.2 Môi trường dinh dưỡng LB

* Môi trường Tween 20 ( El- Bestawy et al., 2005)

Bảng 2.3 Môi trường Tween 20 kiểm tra hoạt tính lipase

Bổ sung 1% Tween 20 ( Tween 20 được khử trùng nhiệt ướt ở 1210C trong

20 phút trước khi được bỏ vào môi trường) và điều chỉnh pH = 7,5

Môi trường Tween 20 là môi trường dùng để kiểm tra hoạt tính lipase của các chủng vi sinh vật sau khi được tách dòng từ môi trường LB Môi trường Tween 20 chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cho hầu hết vi sinh vật phát triển đồng thời có bổ sung thêm Tween 20 là chất giúp chỉ thị chủng vi sinh nào có hoạt tính lipase thông qua vòng kết tủa halo xung quanh khuẩn lạc

* Thuốc nhuộm Gram: crystal violet, dung dịch Lugol, cồn 96%, Fushin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thí nghiệm 1: Thu mẫu và phân lập các dòng vi sinh vật

2.3.1.1 Thu mẫu chất thải

14 mẫu gồm 6 mẫu được thu tại các ống xả nước thải của các công ty chế biến thủy sản thuộc KCN Tân Tạo A, TP.HCM và 8 mẫu thu trong các bể chứa nước thải ở các khu vực chế biến và đóng gói thuộc công ty Thủy sản Miền Nam, Cần Thơ

Mẫu lấy được sẽ lưu trữ trong lọ nhựa có nắp Mẫu sau khi thu về được bảo quản trong tủ mát và được sử dụng trong vòng 3 ngày kể từ ngày thu

thủy hải sản Sài Gòn

5 SGA Công ty Cổ phần chế biến

thủy sản Trung Sơn

[*]Vị trí lấy mẫu: Khoảng cách thu mẫu nước đối với ống xả nước thải xuôi theo dòng chảy

Dùng micropipette P200 hút 100µl mẫu từ môi trường phân lập vào tâm của đĩa môi trường LB, trãi mẫu nước vừa nhỏ ra khắp các bề mặt của môi trường cấy Thao tác này rất quan trọng vì khi trãi kỹ chúng ta sẽ thu được nhiều khuẩn lạc rời khác nhau tăng hiệu suất phân lập

Sau đó tiến hành bảo quản trong tủ ủ 300C trong khoảng 1-2 ngày để vi khuẩn có thời gian thích nghi với môi trường và phát triển

2.3.2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc các dòng vi sinh vật và mô tả hình thái tế bào vi khuẩn

2.3.2.1 Mục tiêu

Làm thuần những mẫu vi sinh vật có trong nước thải thủy sản đã thu về, quan sát khuẩn lạc, hình thái vi sinh vật, nhuộm Gram để chuẩn bị cho bước khảo sát hoạt tính phân giải lipid của vi sinh vật

2.3.2.2 Bố trí thí nghiệm

* Kỹ thuật làm ròng vi khuẩn

Mẫu sau khi vi sinh vật đã phát triển dựa vào đặc điểm, hình dạng, màu sắc, kích thước tiến hành cấy chuyền các dạng khuẩn lạc nhiều lần sang môi trường LB mới cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc rời Làm ròng là hình thức tách rời từng tế bào vi sinh vật, mỗi tế bào sẽ phát triển thành khuẩn lạc độc lập Khi đó tế bào vi khuẩn đã đươc tách ròng Dùng kính hiển vi quang học để kiểm tra độ ròng và lưu trữ mẫu trong ống nghiệm chứa môi trường LB

* Mô tả hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào vi khuẩn

Sau khi được tách ròng mỗi chủng vi khuẩn được mô tả sơ lược về hình dạng đường kính, dạng bìa, màu sắc, độ nổi của khuẩn lạc Sau đó dùng kính hiển vi ở vật kính 40X để quan sát, mô tả hình dạng tế bào vi khuẩn [11]

* Nhuộm Gram:

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy

24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

- Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí

- Quan sát dưới vật kính 40X, 100X, (có sử dụng dầu soi)

Kết quả: vi khuẩn Gram + có thành tế bào phủ lớp peptidoglycan dày (chiếm 90% vỏ tế bào), nên trong quá trình nhuộm, nó sẽ bắt màu của dung dịch crystal violet (màu xanh tím), nhóm vi khuẩn Gram - do có lớp peptidoglycan mỏng hơn (10%) nên nó không bắt được màu tím kết tinh mà sẽ bắt màu hồng của chất nhuộm Fushin

50-2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải Lipid trên môi trường Tween 20

- Nuôi lỏng trong môi trường LB: Khuẩn lạc sẽ được nuôi lỏng trong môi trường

LB không có agar trong máy lắc ủ nhiệt 300C, 120 rpm, trong thời gian 3 ngày để tăng sinh khối

- Thử hoạt tính trên môi trường Tween 20

- Tạo giếng trên môi trường Tween 20 bằng cách dùng đầu cone đường kính 5mm đục lỗ trên môi trường thạch để tạo giếng nhỏ 20µl dịch vi khuẩn phân lập trong môi trường LB vào giếng

- Tiến hành ủ 300C sau đó tiến hành quan sát và đo đường kính các vòng halo ở các mốc thời gian 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, thí nghiệm được lặp lại 3 lần và ghi nhận kết quả đạt được Căn cứ vào vòng phân giải xung quanh điểm đã cấy, chọn lọc ra những mẫu có vi sinh vật phân giải được Lipid và loại bỏ những mẫu không đạt yêu cầu Mẫu không đạt yêu cầu là mẫu vi sinh vật không có khả năng tạo vòng phân giải Lipid hoặc khả năng phân giải thấp

- Ghi nhận số liệu đo được, xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê

2.3.4 Thí nghiệm 4: Định danh vi khuẩn có khả năng phân giải Lipid

2.3.4.1 Mục tiêu

Từ thí nghiệm 1, 2 và thí nghiệm 3 tìm ra được những dòng vi sinh vật có khả năng phân giải Lipid tốt nhất góp phần vào việc xử lý chất thải trong các nhà máy chế biến thủy sản Nhằm tìm hiểu rõ hơn những dòng vi sinh vật này, dựa vào những đặc điểm hình thái đã quan sát được, tiếp tục định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

2.3.4.2 Bố trí thí nghiệm

Những mẫu sau khi thử hoạt tính trên môi trường Tween 20 có khả năng kết tủa vòng Halo lớn nhất sẽ được chọn đem mẫu khuẩn lạc đi định danh tại Công ty TNHH Dịch vụ & Thương mại Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, Phường Tân Hưng, Quận

7, TPHCM)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập

Từ 6 mẫu nước thải lấy tại các ống nước thải của các công ty thủy sản tại TP.HCM phân lập được 13 dòng vi sinh vật và 8 mẫu nước thải từ công ty Thủy sản miền Nam thu được 20 dòng vi sinh vật có đặc điểm và hình dạng khác nhau Các dòng vi khuẩn này có chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện hiếu khí

3.2 Đặc điểm và hình thái khuẩn lạc

Sau khi phân lập và nuôi cấy trên môi trường thạch LB thu được khuẩn lạc của các

dòng thuần, nhận thấy rằng hầu hết các dòng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển sau 2

ngày trong điều kiện ủ là 300C

Về đặc điểm hình thái khuẩn lạc: phần lớn các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục hoặc trắng trong; một số ít khuẩn lạc có dạng không đều, độ nổi lài, màu vàng đục và nâu đục

Đặc điểm màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa của các dòng vi khuẩn trên môi trường LB sau khi nuôi cấy được thể hiện ở Phụ lục 1 và Hình 3.1

Hình 3.1 Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường LB A: Dòng TSA1 có khuẩn lạc dạng tròn, có bìa nguyên, màu trắng đục, độ nổi lài; B: Dòng SGB2 có khuẩn lạc dạng tròn, có bìa nguyên, màu vàng chanh, độ nổi mô C: Dòng M 1 A 1 - 2: khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô D: Dòng M1A1- 1: khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc những dòng vi sinh vật phân lập được

Trong tổng số 33 dòng có 14 dòng tế bào vi sinh vật hình cầu và 19 dòng tế bào vi sinh vật hình que và trong đó 11 dòng là vi khuẩn Gram (+) 22 dòng là Gram (-)

Bảng 3.2 Bảng đặc điểm hình thái những vi sinh vật phân lập được

Chú thích: (+): Gram dương (-): Gram âm

3.2 Khảo sát khả năng phân giải Lipid trong môi trường Tween 20 của các dòng vi sinh vật

Sau khi đã tiến hành phân lập và làm ròng được mẫu vi sinh vật, mẫu được nuôi lỏng trong môi trường LB dạng lỏng, nuôi trong điều kiện lắc ủ nhiệt 300 C qua 3 ngày Kết thúc quá trình nuôi lỏng sau 3 ngày, tiến hành thử hoạt tính trên môi trường Tween

20 Với kết quả sau 2 ngày một số mẫu đã xuất hiện những điểm kết tủa quanh giếng nhưng chưa có hình dạng rõ rệt

Tiếp tục thử hoạt tính sau 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày cho các dòng vi khuẩn kết quả ghi nhận được như sau:

3.2.1 Đối với các dòng vi khuẩn phân lập từ nước thải ở KCN Tân Tạo A,

Kết quả cho thấy có 9/13 mẫu xuất hiện vòng kết tủa halo rõ rệt Trong đó 4 mẫu

không tạo vòng halo chứng tỏ không có khả năng sinh lipase gồm: TSA2, SGB1, SGB2,

SGB3 Tiến hành đo đường kính vòng halo của 9 mẫu, kết quả đo được thể hiện ở Bảng 3.3, Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4 và Hình 3.5

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 3 ngày của các dòng vsv thu tại

TP.HCM

1.3

3.07 2.83 3.28

0

3.65

2.13 3.12 3.15

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 4 ngày của các dòng vsv thu tại TP.HCM

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 5 ngày của các dòng vsv thu tại TP.HCM

Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính của các dòng vi khuẩn phân lập ở TP.HCM sau 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày

STT Tên mẫu Đường kính vòng Halo (cm)

Kết quả thử khả năng sinh lipase ngày thứ 3 đường kính các vòng Halo giữa các dòng vi khuẩn có khác biệt rõ rệt Ở dòng TSB1 có đường kính lớn nhất (tương ứng với đường kính là 2.4cm) kế tiếp là dòng SGA2 (đường kính 1.96cm), hai dòng này có giá trị tương đương nhau về

ý nghĩa thống kê Bên cạnh đó, các dòng vi khuẩn SGA1, TSB2, THA1, THB2 có đường kính dao động khoảng 1.3 – 1.76cm Những dòng vi khuẩn còn lại TSA1, THA2, THB1 có đường kính bằng nhau (đường kính 0.63) có ý nghĩa về mặt thống kê

Đến ngày thứ 4 đường kính của vòng phân giải halo giữa các dòng tăng đột biến Dòng THB1 và dòng TSA1 lần lượt tăng từ 0.63cm lên thành 3.06cm và 3.28cm bắt kịp đường kính vòng phân giải của những mẫu trước đó Sự khác biệt này là do đặc tính sinh trưởng và phát triển khác nhau giữa các dòng vi khuẩn nên đường kính vòng halo cũng khác nhau Kết quả thử hoạt tính ở ngày thứ 4 cũng cho thấy dòng TSB1 có vòng halo lớn nhất (tương đương đường kính 3.65cm)

Sang ngày thứ 5, dựa vào số liệu từ Bảng 3.3 cho thấy đường kính vòng halo của các dòng

vi khuẩn tăng chậm lại Đường kính vòng halo giữa các dòng vi khuẩn dao động từ 2.73cm – 3.95cm Riêng dòng TSB1 vẫn có đường kính lớn nhất 4.05cm và dòng THA2 có mức tăng thấp nhất, từ ngày thứ 3 đường kính 0.63cm sang ngày thứ 5 đường kính 1.83cm