Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi tảo spirulina sp để thu nhận sinh khối có hàm lượng protein và hoạt tính hống oxy hóa cao

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina.. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

TRẦN HUỲNH PHONG

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI TẢO SPIRULINA SP ĐỂ THU

NHẬN SINH KHỐI CÓ HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH

CHỐNG OXY HÓA CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TP HCM – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bài khóa luận này là của riêng tôi; các kết quả và số liệu trong báo cáo khóa luận tốt nghiệp không sao chép bất kỳ nguồn nào Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này

TP.HCM, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Trần Huỳnh Phong

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Võ Hồng Trung - Trưởng Bộ môn Hóa sinh – Độc chất, trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô và Cán bộ trong khoa Dược, trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi trân trọng cảm ơn các bạn moniter trong Bộ môn Độc chất – Hóa sinh:

Nguyễn Thị Bích Ngọc, Đào Thị Thu Hiền, Vũ Thị Thu Hồng, Nguyễn Mộng Thảo Uyên, Văn Lưu Thi Đan đã tận tình giúp đỡ, động viên để tôi có thể hoàn

thành tốt khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

TP.HCM, ngày tháng năm 2019

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH MỤC BẢNG vii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về Spirulina sp 3

2.2 Đặc điểm sinh học của Spirulina sp 4

2.2.1 Phân loại 4

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Spirulina 4

2.2.3 Đặc điểm về sinh lý của Spirulina 6

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 10

2.3 Protein của Spirulina sp 12

2.4 Khả năng chống oxy hóa của Spirulina 13

2.5 Ứng dụng nuôi trồng của Spirulina sp 14

2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước: 15

2.7 Tình hình nghiên cứu ngoài nước: 16

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

3.1 Chủng Spirulina sp và môi trường nuôi cấy 17

3.2 Các phương pháp phân tích 18

3.2.1 Quan sát hình thái tế bào Spirulina sp 18

3.2.2 Xác định sinh khối khô tế bào Spirulina sp 18

3.2.3 Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu 18

3.2.4 Xác định hàm lượng protein của Spirulina sp bằng phương pháp Bradford 18

ii

3.2.5 Xác định hàm lượng phenolic tổng 19

3.2.6 Xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng 19

3.3 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 20

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 20

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sánh xanh dương lên tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 21

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đỏ và xanh dương lên tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 22

3.4 Xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 25

4.1 Kết quả 25

4.1.1 Ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của Spirulina 25

4.1.1.1 Ảnh hưởng của các nồng độ NPK lên hình thái tế bào tảo Spirulina 25

4.1.1.2 Ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng của Spirulina 27

4.1.1.3 Ảnh hưởng của NPK lên hàm lượng protein của Spirulina 28

4.1.1.4 Ảnh hưởng của NPK lên hàm lượng phenolic tổng của Spirulina 29

4.1.1.5 Ảnh hưởng của NPK lên khả năng chống oxy hóa của Spirulina 31

4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng xanh lên tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 32

4.1.2.1 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh dương lên tế bào tảo Spirulina 32

4.1.2.2 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh lên tăng trưởng của tảo Spirulina 34

4.1.2.3 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh lên hàm lượng protein của tảo Spirulina 35

4.1.2.4 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh lên hàm lượng phenolic tổng của tảo Spirulina 36

iii

4.1.2.5 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh lên khả năng chống oxy hóa của tảo

Spirulina 38

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng xanh và đỏ ảnh hưởng lên tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 39

4.1.3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh và đỏ lên hình thái tế bào tảo Spirulina 39

4.1.3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh và đỏ ảnh hưởng lên tăng trưởng của tảo Spirulina 41

4.1.3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh và đỏ ảnh hưởng lên hàm lượng protein của tảo Spirulina 42

4.1.3.4 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh và đỏ ảnh hưởng lên hàm lượng phenolic tổng của tảo Spirulina 44

4.1.3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh và đỏ ảnh hưởng lên khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 46

4.2 Bàn luận 47

4.2.1 Ảnh hưởng của NPK lên tốc đô tăng trưởng, protein, phenolic và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 47

4.2.2 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh dương lên tốc độ tăng trưởng, protein, phenolic và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 49

4.2.3 Ảnh hưởng của ánh sáng xanh dương và đỏ lên tốc độ tăng trưởng, protein, phenolic và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina 51

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Hình thái tế bào của Spirulina sp 5

Hình 2.2 Một phần của trichome xoắn ốc của Spirulina platensis 6

Hình 2.3 Sơ đồ vòng đời của tảo Spirulina 10

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina 21

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện ánh sáng khác nhau 22

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện ánh sáng khác nhau 24

Hình 4.1 Hình thái tế bào của tảo Spirulina ở các nồng độ NPK 26

Hình 4.2 Trọng lượng khô (g/L) của Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau 27

Hình 4.3 Tốc độ tăng trưởng (g/L/ngày) của Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau 28

Hình 4.4 Hàm lượng protein (g/L) (a) và phần trăm (%) (b) của Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau 29

Hình 4.5 Hàm lượng phenolic tổng (mg/L) (a) và (mg/g) (b) của Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau 30

Hình 4.6 Hoạt tính chống oxy hóa (I%/ml) của tảo Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau 31

Hình 4.7 Hoạt tính chống oxy hóa (I%/g) của tảo Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau 32

Hình 4.8 Hình thái tế bào tảo Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 33

Hình 4.9 Trọng lượng khô (g/L) của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 34

Hình 4.10 Tốc độ tăng trưởng (g/L/ngày) của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 35

Hình 4.11 Hàm lượng protein (g/L) (a) và phần trăm (%) (b) của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 36

Hình 4.14 Hoạt tính chống oxy hóa (I%/ml) (a) và (I%/g) (b) của tảo Spirulina

trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 39

Hình 4.15 Hình thái tế bào tảo Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác nhau 40 Hình 4.16 Trọng lượng khô (g/L) của Spirulina trong các điều kiện ánh sáng khác

Hình 4.21 Hoạt tính chống oxy hóa (I%/ml) của tảo Spirulina trong các điều kiện

ánh sáng khác nhau 46

Hình 4.22 Hoạt tính chống oxy hóa (I%/g) của tảo Spirulina trong các điều kiện ánh

sáng khác nhau 47

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina so với trọng lượng khô 10

Bảng 2.2 Thành phần vitamin của tảo Spiruina so với trong lượng khô 11

Bảng 2.3 Thành phần chất khoáng của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô 11

Bảng 3.1 Thành phần của môi trường Zarrouk 17

Bảng 3.2 Bảng ký hiệu viết tắt của thí nghiệm 2 21

Bảng 3.3 Bảng ký hiệu viết tắt của thí nghiệm thứ 3 23

viii

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2014 – 2019

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI TẢO SPIRULINA SP ĐỂ THU

NHẬN SINH KHỐI CÓ HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG

OXY HÓA CAO

Trần Huỳnh Phong Hướng dẫn khoa học: TS Võ Hồng Trung

Mở đầu: Spirulina được biết đến là thực phẩm xanh của thế giới, không chứa các

thành phần có hại như cholesteron và các acid béo no khác Spirulina còn cung cấp các acid amin thiết yếu cho con người Để có một sản phẩm từ Spirulina vừa chất lượng

vừa mang lại hiệu quả kinh tế, các điều kiện nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định đến vấn đề này

Đối tượng: Tảo Spirulina sp Phương pháp nghiên cứu: Quan sát hình thái tế bào,

xác định sinh khối khô, xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu, phương pháp Bradford, xác định hàm lượng chất chống oxy hóa

Kết quả: Trọng lượng khô cực đại trong điều kiện NPK 0,5g/L (1,2 g/L), ở điều kiện

kết hợp ánh sáng xanh và đỏ (6,62 g/L) Hàm lượng protein cực đại ở NPK 0,5 g/L (0,22 g/L), ở điều kiện kết hợp ánh sáng đỏ và xanh dương (0,3 g/L) Hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa ở điều kiện NPK 0,5 g/L lần lượt là 0,0086 g/L và 28,61%; ở điều kiện kết hợp ánh sáng đỏ và xanh dương lần lượt là 0,007 g/L

và 21,37%

Kết luận: Nuôi cấy tảo Spirulina trong môi trường Zarrouk có nồng độ NPK 0,5 g/L

và kết hợp ánh sáng đỏ, xanh dương vào điều kiện nuôi cấy giúp tảo đạt được trọng lượng khô cao cũng như hàm lượng protein và hàm lượng các chất chống oxy hóa

Từ khóa: Spirulina sp., phương pháp Bradford, nitrate, protein, amino acid, chống

oxy hóa

ix

Fina essay for the degree of BS Pharm – Academic year 2014 – 2019

OPTIMIZING THE CONDITIONS OF RAISING SPIRULINA SP FOR

COLLECTING BIOMASS WITH THE HIGHEST CONTENT PROTEIN AND

ANTIOXIDANT CAPACITY Tran Huynh Phong Suppervisor: Dr Vo Hong Trung

Introduction: Spirulina has been known as “green food”, doesn’t contain harmful

ingredient such as cholesterone and other saturated fatty acids Spirulina also provides essential amino acids to humans To have a product of Spirulina ,which has both

quality and economical for users, culture conditions are an important determinant of this issue

Subject: Spirulina sp Method: Observing cell morphology, determination of dry

biomass, specific growth rate, Bradford method, determination of antioxidant content

Results: Maximum dry weight in NPK 0,5g/L (1,2 g/L), under conditions of

combinning blue and red light (6,62 g/L) Maximum protein content at NPK 0,5g/L (0,22 g/L), under conditions of combining red and blue light (0,3 g/L) The total phenolic content and antioxidant capacity at NPK 0,5 g/L respectively are 0,0086g/L and 28,61%; under conditions of combining red and blue light, respectively are 0,007

g / L and 21,37%

Conclusion: Culturing Spirulina in Zarrouk medium with NPK concentration of 0,5 g

/ L and combining red and blue light in culture conditions helps algae achieve high dry weight as well as protein and content of antioxidants

Key words: Spirulina sp., Bradford method, nitrate, protein, amino acid, antioxidant

capacity

x

PHIẾU XÁC NHẬN SỬA CHỮA

Nội dung khóa luận đã được chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng

(ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên)

1

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Tảo Spirulina được chọn làm thực phẩm trong nhiều thế kỷ nay Tảo

Spirulina được biết đến chứa: beta-carotene, vitamin E, carotenoid, chlorophyll

và phycocyanin (được biết đến là sắc tố có vai trò kháng oxy hóa, ngăn ngừa ung

thư) Các loài Spirulina có hoạt tính sinh học đa dạng và ý nghĩa về dinh dưỡng

do chúng có hàm lượng cao các chất dinh dưỡng tự nhiên, có vai trò điều hòa

chức năng sinh học và miễn dịch Spirulina là loại vi tảo được tiêu thụ nhiều nhất

do hàm lượng protein cao và các lợi ích dinh dưỡng bổ sung, bao gồm chống tăng huyết áp, bảo vệ thận, chống tăng lipid máu và chống tăng đường huyết

Nhiều Spirulina ảnh hưởng lên hệ thống miễn dịch thông qua tăng hoạt tính của

đại thực bào, kích thích tạo ra kháng thể, cytokine, tăng tích lũy tế bào NK (Natural Killer Cell) trong các mô, tăng sự hoạt động và di chuyển của tế bào T

và B [25] Spirulina là một nguồn giàu protein, chứa hàm lượng cao acid hypocholesterolemic γ-linoleic (GLA), vitamin B và các phycobiliprotein tự do [43] Do đó nó đã được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) gán danh hiệu là “siêu

thực phẩm” Như một minh chứng cho điều này, Spirulina có lượng canxi nhiều

hơn 180% so với sữa, protein nhiều hơn 67% so với đậu hũ, hơn 31% β-carotene

so với cà rốt và chất sắt nhiều hơn 51% rau bina

Nắm bắt được tiềm năng kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng từ Spirulina

nhiều nghiên cứu từ quy mô nhỏ như trong phòng thí nghiệm đến quy mô lớn như sản xuất trong công nghiệp được thực hiện nhằm tìm ra phương pháp nuôi trồng để đạt được hiệu suất cao nhất Điển hình như: môi trường MS, Zarrouk…

là một trong những môi trường mang lại hiệu quả cao và tiết kiệm với những điều kiện chuẩn về chế độ dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, ánh sáng [50]

Hiện nay, đã có nhiều công trình trong nghiên cứu về các điều kiện nuôi

trồng Spirulina mang lại hiệu suất tối ưu Tuy nhiên, ở Việt Nam còn rất nhiều

hạn chế về lĩnh vực này Dựa vào cơ sở đó, đề tài: “Tối ưu hóa điều kiện nuôi

cấy vi tảo Spirulina sp để thu nhận sinh khối có hàm lượng protein và hoạt tính chống oxy hóa cao” thực hiện với mục đích:

2

 Khảo sát điều kiện tăng tưởng của vi tảo Spirulina sp trong điều kiện

dinh dưỡng có chứa Ni tơ và Phốt pho (dùng muối NPK)

 Khảo sát điều kiện tăng tưởng của vi tảo Spirulina sp dưới tác động

của ánh sáng

 Phân tích hàm lượng protein và hoạt tính chống oxy hóa trong các điều kiện nuôi cấy

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về Spirulina sp

Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben (Đức) đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina Do hình dạng “lò xo

xoắn” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi nên

được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt nguồn từ

chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là thuộc chi

Spirulina Spirulina thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh

vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryote) [12]

Vào thế kỷ XVI, khi quân xâm lược Tây Ban Nha xâm chiếm Mexico, họ phát hiện ra rằng người Aztec sống ở thung lũng Mexico ở thủ đô Tenochtitlan đang thu thập một món ăn lạ từ hồ Các nhà sử học Tây Ban Nha đã mô tả, ngư dân dùng lưới để thu thập một loại bùn (họ gọi nó Techuitlatl) màu xanh da trời này từ đầm lầy và sử dụng nó để làm một chiếc bánh màu xanh lam, đây được xem như thức ăn dùng cho các thợ săn Aztec trong các chuyến săn dài ngày Techuitlatl đã được đề cập bởi các nhà tự nhiên học vào cuối thế kỷ XVI, nhưng không được nghiên cứu kĩ ở tại thời điểm ấy [21]

Vào năm 1967 Spirulina được xem là “nguồn thực phẩm của tương lai”

được nhắc đến tờ International Association of Applied Microbiology Các nhà nghiên cứu đã phân tích các thành phần dinh dưỡng có trong loại tảo này và nhận

ra tảo chứa hàm lượng protein rất cao chiếm 60 – 70% trọng lượng khô Cũng vào thời điểm đó, nhằm nuôi với sinh khối lướng để sản xuất các loại thực phẩm, công ty Sosa-Texcoco Ltd tại Mexico, đã thực hiện một số nghiên cứu về sinh trưởng và các yếu tố sinh lý của tảo Các nghiên cứu này được thực hiện bởi tiến

sĩ Zarrouk vào năm 1966, ông đã phát hiện ra môi trường nuôi cấy tối ưu giúp tảo đạt sinh khối cao thuận lợi cho sản xuất ở quy mô công nghiệp Để vinh danh ông, môi trường này được đặt theo tên ông [21]

4

Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng và

dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa [4]

Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng

Spirulina ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 tại

xí nghiệp nước suối Vĩnh Hảo (Bình Thuận)

2.2 Đặc điểm sinh học của Spirulina sp

2.2.1 Phân loại

Tảo (algae) là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp được các chất hữu cơ

từ các chất vô cơ dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời [1]

Tảo Spirulina thuộc [2]:

Lãnh giới (domain): Bacteria

Ngành (phylum): Cyanophyta

Lớp (class): Cyanophyceae

Bộ (ordo): Oscillatoriales

Họ (familia): Oscillatoniaceae ( Nostocales)

Chi (genus): Spirulina

Có hai loài quan trọng là Spirulina maxima và Spirulina platensis

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc tế bào Spirulina

Tảo lam được xếp vào nhóm vi khuẩn lam, loài vi sinh vật đầu tiên có khả năng quang hợp và sinh ra khí oxy được phát hiện từ 3,5 tỷ năm trước [24] (Hình 1.1)

Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau

không phân nhánh Đường kính xoắn khoảng 35 – 50 µm, bước xoắn 60 µm,

chiều dài thay đổi có thể đạt 250 µm Nhiều trường hợp tảo Spirulina có kích

thước lớn hơn (Hình 1.2)

5

Thành tế bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa cellulose mà chứa

mucopolyme pectin và các loại polysaccharide khác Màng tế bào nằm sát ngay bên dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp nằm rải rác trong nguyên sinh chất [1]

Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân là vùng giàu acid

nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất Ngoài ra, tế

bào Spirulina không có không bào thực, chỉ có không bào chứa khí làm chức

năng điều chỉnh tỷ trọng tế bào Nhờ có không bào chứa khí và hình dạng xoắn

mà Spirulina có thể nổi lên mặt nước

Mặc dù không có ty thể và mạng lưới nội chất song tế bào Spirulina vẫn có

ribosom và một số thể vùi như các hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin, carboxysome và hạt mesosome [1]

Hình 2.1 Hình thái tế bào của Spirulina sp [48]

6

2.2.3 Đặc điểm về sinh lý của Spirulina

Tảo Spirulina có thể phân bố rộng rãi trong đất, đầm lầy, nước sạch, nước

mặn, nước biển và suối nước nóng Do là một vi sinh vật quang dưỡng bắt buộc nên ngoài hàm lượng chất dinh dưỡng cần thiết cho tảo là nguồn carbon và

nguồn nito, phosphore; sự sinh trưởng của Spirulina còn phụ thuộc vào các yếu

tố vật lý như sau:

Hình 2.2 Một phần của trichome xoắn ốc của Spirulina platensis; trong đó p là

độ cao và d đường kính ngoài của xoắn ốc [48]

7

a) Yếu tố ánh sáng:

 Là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển

của tảo Spirulina ít bị chi phối bởi chu kỳ sáng/tối và đạt giá trị sinh khối cao

khi được chiếu sáng liên tục Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng: 25,000 - 30,000 lux [1]

 Theo J.P.Pandey cường độ của ánh sáng chi phối đến việc sinh trưởng của quần thể Spirulina, cũng giúp tảo tạo ra hàm lượng protein cao ( lượng

protein tính theo sinh khối khô) [36]

 Việc sử dụng ánh sáng đỏ, xanh dương và trắng trong thử nghiệm của

P.Soundarapandian and B Vasanthi nhằm tìm ra điều kiện ánh sáng nào

giúp tăng sinh khối, cho ra hàm lượng Chlorophyll cao trong tảo Spirulina

Kết quả thí nghiệm cho thấy ánh sáng đỏ giúp cho sinh khối, hàm lượng Chlorophyll đạt giá trị cao nhất trong 10 ngày thí nghiệm Sau ngày thứ 20, kết quả này là tương đương giữa ánh sáng đỏ và trắng Ngoài ra thí nghiệm cũng chỉ

ra việc sử dụng ánh sáng xanh dương để kích thích tảo sản xuất nhiều hơn phycocianin cũng đạt kết quả khả quang Thí nghiệm cũng chỉ ra cường độ ánh sáng đỏ trong khoảng 100 – 200 µmol photon/m2/s giúp tảo đạt sinh khối cao hơn [34]

 Trong thí nghiệm của Chainapong, bà và các đồng sự tập trung vào sự

khác nhau giữa các sắc tố quang hợp được sản xuất bởi Spirulina ở các điều kiện

ánh sáng khác nhau (các ánh sáng này được tách ra từ ánh sáng mặt trời) Trong quá trình thực hiện, họ xem ánh sáng trắng cũng là một loại ánh sáng màu Thí nghiệm đã chỉ ra ánh sáng trắng giúp tảo đạt được sinh khối tối đa tuy nhiên hàm lượng sắc tố quang hợp trong tảo lại giảm xuống [9]

 Na Na Kim và Choi đã chỉ ra rằng, ánh sáng đỏ và lục giúp cho tốc độ

tăng trưởng của tảo Spirulina cao hơn các ánh sáng khác, còn ánh sáng trắng và

lam giúp tảo sản xuất ra nhiều sắc tố quang hợp hơn [11]

 Trong khảo sát của Feng Tian và Wang Tongming, họ đã kết hợp ánh

sáng xanh dương và đỏ nhằm kích thích Spirulina sản xuất ra nhiều

8

phycocyanin Với tỉ lệ xanh dương và đỏ là 3:1 cho ra hiệu suất sản xuất phycocyanin cao hơn các tỉ lệ khác Họ cũng đã chứng minh hàm lượng của phycocyanin tỉ lệ nghịch với sinh khối (biomass) [17]

b) Yếu tố nhiệt độ: Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao Người ta phát hiện

chúng sống ở những suối nước nóng đến 690C Chúng có khả năng phát triển ở khoảng nhiệt độ 350C - 370C ở điều kiện phòng thí nghiệm Spirulina phát triển

rất chậm dưới 250C [39]

c) Yếu tố dinh dưỡng:

 Theo Danesi và các cộng sự đã nghiên cứu, nguồn nitrate lấy từ Urea (thay vì dùng KNO3) làm tăng tốc độ phát triển của tảo Spirulina, cũng như giúp

cho tảo sản xuất lượng lớn Chlorophyll [14]

 Theo nghiên cứu của Steffii Ffried vào năm 2003, việc tăng nồng độ Nitrate và Phosphate trong quá trình nuôi Spirulina, cũng dẫn đến việc tăng sản

xuất Chlorophyll ở tảo Nghiên cứu cũng chỉ ra trong cùng một nồng độ Nitrate, nồng độ Phosphate tăng lên 1,3 lần thì lượng Chlorophyll/Biomas tăng gần 2 lần [18]

 Theo Ankita Kumari, việc thay đổi nguồn cung cấp nitrate trong môi

trường nuôi cấy của Spirulina (từ NaNO3 thành NPK) kèm theo kết hợp sử dụng ánh sáng xanh dương đã giúp tảo sản xuất hàm lượng protein, lipid cũng như chlorophyll cao hơn việc chỉ sử dụng môi trường cơ bản Thí nghiệm cũng chỉ ra

nồng độ NPK nếu cao hơn 1,5 g/L sẽ kìm hãm tốc độ tăng trưởng của Spirulina

Nồng độ của NPK trong khoảng 0,76 g/L được Ankita xem như là nồng độ tối ưu giúp tảo tăng tốc độ tăng trưởng, tăng khả năng sản xuất ra lipid, protein và chlorophyll [28]

 Trong thí nghiệm của mình Sara và Zamani đã chỉ ra việc thay đổi

nồng độ nitrate và phosphate trong môi trường sinh trưởng của tảo Spirulina sẽ

gây ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, sinh khối cũng như các sản phẩm thứ cấp như: carotenoid, mycosporine,… Bà Sara và các cộng sự của mình đã chứng minh với việc tăng nồng độ của NaNO3 và K2HPO4 (cụ thể lần lượt là 2,5g/L và

 Yahia và các cộng sự của mình đã so sánh tốc độ tăng trưởng của

Spirulina thông qua nguồn cung cấp nitrate là urea (0,12g/L) và NaNO3 (nồng độ thường dùng là 2,5g/L) Kết quả cho thấy tốc độ tăng trưởng của tảo khi dùng urea chưa vượt trội hơn NaNO3 trong 8 ngày đầu của thí nghiệm, nhưng lại tăng cao gấp 0,5 lần từ ngày 12 của thí nghiệm Mặc dù vậy nhưng giá thành của urea thấp hơn nhiều lần so với NaNO3 cho nên đây có thể xem như là nguồn cung cấp nitrate thay thế, qua đó có thể giảm nhiều về chi phí trong sản xuất [16]

 Cyanobacteria nói chung hay Spirulina nói riêng đều có một hệ thống

enzymes chuyên biệt giúp chống lại các tác nhân oxy hóa mạnh như H2O2, OH

-,… Các enzyme được biết đến như superoxide dismutase (SOD), peroxidases (PODs), glutathione reductase, ascorbate (AsA) và glutathione Trong nghiên cứu của mình Raziye Öztürk Ürek và Leman Tarhan đã chỉ ra đươc tầm ảnh hưởng rất lớn của nồng độ nitrate lên hệ thống enzyme trên Cụ thể với nồng độ nitrate

khoảng 30 – 50 mM sẽ kích thích tế bào Spirulina tiết ra nhiều enzymes giúp tảo

chống lại các tác nhân oxy hóa như AsA, SOD, PODs,… Cũng với khoảng nồng

độ ấy thì hàm lượng chlorophyll và carotenoid cũng được sản xuất ra nhiều hơn (tại ngày thứ 8 của thí nghiệm và đạt giá trị cưc đại vào ngày 17) so với việc dùng nitrate với nồng độ thấp (10mM) [47]

 Chu kỳ phát triển của tảo rất ngắn, thường xảy ra trong 24 giờ như tảo

Chlorella Tảo lam Spirulina có hai hình thức sinh sản:

1 Sinh sản sinh dưỡng: thực hiện bằng cách đứt từng khúc ở chỗ có tế bào dị hình trên sợi tảo, từ đó tạo ra sợi mới

2 Sinh sản vô tính: thực hiện bằng cách tạo bào tử giống ở vi khuẩn trong điều kiện không thuận lợi

10

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Tảo Sprirulina chứa hàm lượng protein rất cao, cao hơn cả tảo Chlorella Ngoài ra chúng còn chưa đầy đủ các vitamin và khoáng chất [3] (bảng 2.1, 2.2 và 2.3)

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tảo Spirulina so với trọng lượng khô

11

Bảng 2.2 Thành phần vitamin của tảo Spirulina so với trọng lượng khô [19]

Bảng 2.3 Thành phần chất khoáng của tảo Spirulina so với % trọng lượng khô [19]

12

Tuy nhiên, nồng độ hàm lượng các thành phần hóa học của tảo thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi trồng

Các acid béo bão hòa và không bão hòa cũng có mặt trong thành phần của

Spirulina và chiếm tới 1.95g/100g chất khô Hàm lượng cholesterol khoảng

<0,1mg/100g chất khô, trong khi đó hàm lượng cholesterol trong 100g chất khô

của trứng lên đến 600mg Điều này giải thích tại sao bột Spirulina được dùng bổ

sung thức ăn cùng với protein đồng thời nó kiểm soát việc tăng trọng lượng quá mức [3]

2.3 Protein của Spirulina sp

Đặc điểm sinh hóa nổi bật của Spirulina là có hàm lượng protein rất cao,

chiếm khoảng 55 – 70% trọng lượng khô của tế bào, trong khi các thực phẩm được coi là giàu chất đạm như đậu nành, thịt bò, photmat cũng chỉ có 18 – 37 %

đạm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng protein trong Spirulina hoàn toàn

không có hại Cường độ đồng hóa protein rất cao: sau 18 giờ thì 58% protein

được tiêu hóa và đồng hóa Protein của tảo Spirulina có chứa acid amin thiết yếu

và acid amin không thiết yếu bên cạnh đó tỷ lệ của các acid amin này khá cân đối Trong số các acid amin có 4 loại không thể thay thế và có vai trò quan trọng như: lyzin, methionine, phenylanalin, tryptophan [3]

Ngoài ra, trong thành phần của protein của Spirulina còn chứa các

phycobiliprotein – một loại protein tan trong nước - một loại sắc tố lam có vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp của Tảo lam, Tảo đỏ Hàm lượng

13

phycobiliprotein chiếm đến 20 – 25% trong tổng lượng protein của tế bào; bao gồm 2 loại sắc tố: C-phycocyanin và allophycocyanin [7] Chất này có hoạt tính sinh học cao đã được nghiên cứu và thử nghiệm trong lĩnh vực y học Một số bằng sáng chế liên quan đến hoạt tính sinh học có lợi của phycobiliproteins cũng

đã được công bố về các ứng dụng sinh học như chống oxy hóa, chống viêm, chống virus, chống khối u, bảo vệ thần kinh, và các hoạt động bảo vệ gan [26]

2.4 Khả năng chống oxy hóa của Spirulina

Những năm gần đây, người ta đã bắt đầu nghiên cứu một số hoạt tính sinh

học ở tảo Spirulina và ứng dụng của chúng Một trong số đó, khả năng chống

oxy là hoạt tính đang được chú ý nhiều nhất

Do protein của Spirulina chứa phycobiliprotein có khả năng phát huỳnh

quang nên chúng được ứng dụng để đánh dấu các kháng thể đơn dòng trong việc chuẩn đoán và phát hiện một số bệnh Điều đáng được biết thêm là,

phycobiliprotein trong Spirulina đã được phát hiện như là một tác nhân chống

ung thư tuyến tụy ở chuột đực nhờ khả năng chống oxy hóa và chống tăng sinh tế bào [26] Vấn đề này đang được các nhà khoa học quan tâm thí nghiệm ở các đối tượng khác

Một nhóm hoạt chất có tác dụng sinh học quan trọng khác của Spirulina là

các carotenoid, tổng lượng chất này là 346 mg/100g trọng lượng chất khô Tảo

Spirulina có tới 10 carotenoid khác nhau: oscillaxanthin, epoxy--carotene,

myxoxanthophyll, zeaxantin, -carotene, cismyxoxanthophyll, -cryptoxantin, echinenone và hydroxyl-echinenone Trong đó đáng lưu ý là myxoxanthophyll, zeaxantin, -carotene, echinenone là nhóm carotenoid đặc trưng cho cả ngành Tảo Lam [15] Đặc biệt, tảo Spirulina là loại thực vật chứa hàm lượng -carotene, chiếm 52% trong tổng hàm lượng carotenoid (tiền Vitamin A) cao nhất, gấp 10 lần hàm lượng -carotene có trong cà rốt, được biết đến như loại rau quả thông dụng giàu -carotene nhất trong thực phẩm hàng ngày -carotene trong

Spirulina là chất chống oxy hóa mạnh, giúp tiêu diệt các gốc tự do là nguyên

2.5 Ứng dụng nuôi trồng của Spirulina sp

Hiện nay, Spriulina được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau Ngoài những ứng dụng về dinh dưỡng và y tế trong một vài nghiên cứu, loài tảo này được nuôi trồng ứng dụng trong các mô hình tiết kiệm chi phí và bảo vệ môi trường như: sử dụng các nguồn carbon, nito hay phosphore có sẵn trong tự nhiên

để phát triển sinh khối và một số hoạt chất

Điển hình như một mô hình đã được khảo sát tại Braxil, Spirulina được

nghiên cứu để nuôi trồng trên mô hình sử dụng nguồn CO2 có trong không khí kết hợp với monoethanolamine (MEA) – một chất hấp thụ CO2 và chuyển đổi thành bicarbonate vừa góp phần giảm thải lượng carbon gây ô nhiễm môi trường vừa có thể thu lại lượng sinh khối cao thu hoạch làm phân bón hoặc thức ăn cho gia cầm và thủy sản Kết quả của thí nghiệm này khá khả thi, ở nồng độ MEA 0,10, 0,20 và 0,41 mmol/L Spirulina tăng trưởng cao hơn và có hàm lượng

protein cao hơn 17% so với sử dụng NaOH làm chất hấp thụ CO2 [13]

Ở Việt Nam, nhiều cơ sở nuôi trồng, sản xuất và chế biến các sản phẩm từ

tảo Spirulina được được thành lập với công nghiệp nuôi tảo trên các bể nông cây

bằng xi măng và sử dụng khí CO2 của công nghệ tạo nguồn carbon, nguồn CO2

trực tiếp lấy từ các nhà máy bia, cồn, rượu… nén hóa lỏng vào bình chứa Đó là các cơ sở ở Vĩnh Hảo (Bình Thuận), Châu Cát, Lòng Sông (Thuận Hải), Suối Nghệ (Đồng Nai),… Nguồn CO2 từ lò nung vôi (sau khi lọc bụi) và các hầm chứa khí biogas cũng được nghiên cứu tận dụng để phát triển nuôi trồng tảo và

cũng đã thu được một số kết quả Thử nghiệm nuôi trồng Spirulina bằng nước

thải hầm biogas không chỉ là biện pháp mở rộng sản xuất và hạ giá thành sản

15

phẩm, mà còn giải quyết các vấn đề về môi trường sinh thái cho nông thôn Tảo này còn được sử dụng để xử lý nước thải giàu NH4 từ nhà máy sản xuất urea thuộc xí nghiệp Liên hiệp Phân đạm Hóa chất Hà Bắc, kết quả cho thấy nước thải sau khi pha loãng và bổ sung thêm một số khoáng chất cần thiết rồi dùng nuôi

Spirulina đã mang lại năng suất cao và có tác dụng bảo vệ môi trường

Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ cao Hòa Lạc (Bộ Khoa học và

Công nghệ) đã nhân nuôi thành công tảo xoắn Spirulina VNU A03, giống tảo

này có hàm lượng protein, cũng như hàm lượng -carotene cao hơn giống của Pháp, Nhật Bản Sau 5 năm, phân tích, theo dõi sự phát triển con giống trong các điều kiện môi trường của Việt Nam, tháng 9/2018 các nhà khoa học ở tại Viện

nghiên cứu Hòa Lạc đã chọn giống Spirulina VNU A03 và xây dựng thành công

quy trình nuôi cấy thông thường và quy mô công nghiệp

2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước:

 Đề tài do tác giả Hoàng Sỹ Nam, Đặng Diễm Hồng (Viện Công nghệ sinh học) thực hiện đánh giá khả năng sinh trưởng và chất lượng của các chủng tảo trong 3 môi trường nước khoáng thuộc 3 địa điểm Đồng thời đánh giá các chỉ tiêu hóa lí của môi trường trước và sau khi nuôi tảo làm cơ sở cho việc thiết lập quy trình nuôi đại trà làm giảm chi phí đầu tư, kéo dài thời gian và thu sinh khối tảo tối đa giữa các đợt nuôi

 Đáng quan tâm là gần đây với một sáng kiến rất quan trọng tảo xoắn

Spirulina đã được sản xuất tại Hòa Lạc (Hà Nội) và Đà Nẵng từ nguồn nước

ngầm thông thường (bí quyết này đang đợi đánh giá theo bản quyền sở hữu trí tuệ) và như vậy là mở ra khả năng có thể sản xuất sinh khối tảo xoắn ở mọi nơi trên nước ta

 Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ cao Hòa Lạc (Bộ Khoa học

và Công nghệ) đã nhân nuôi thành công tảo xoắn Spirulina VNU A03,giống tảo

này có hàm lượng protein, cũng như hàm lượng -carotene cao hơn giống của Pháp, Nhật Bản Sau 5 năm, phân tích, theo dõi sự phát triển con giống trong các điều kiện môi trường của Việt Nam, tháng 9/2018 các nhà khoa học đã chọn

16

giống Spirulina VNU A03 và xây dựng thành công quy trình nuôi cấy thông

thường và quy mô công nghiệp

2.7 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

 Vào thế kỷ 21, tảo Spirulina đã được bộ y tế của nhiều nước trên thế

giới và WHO công nhận không chỉ là thực phẩm sạch mà còn là giải pháp cho việc phòng và chữa bệnh

 Một nghiên cứu khác đã cho thấy tảo Spirulina có tác dụng phòng

chống ung thư cho các nạn nhân của sự cố Nhà máy Điện hạt nhân Chernobyl

Sau khi sử dụng tảo Spirulina lượng chất phóng xạ đã được đào thải khỏi đường

tiểu của các nạn nhân bị nhiễm phóng xạ rất cao Nghiên cứu này đã được biểu dương tại hội nghị quốc tế về tảo 1998 ở Cộng hòa Czech

17

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Chủng Spirulina sp và môi trường nuôi cấy

Chủng tảo Spirulina sp Nhật được cung cấp bởi Tiến sĩ Trần Ngọc Đức,

Phòng Công nghệ Tảo, Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia TP HCM

Spirulina Nhật được nuôi cấy trên môi trường Zarrouk, pH = 8,5 - 9,0; cường độ

ánh sáng 30 µmol photon/m2/s liên tục, nhiệt độ 25 ± 20C [35]

Pha môi trường Zarouk và chỉnh pH = 8,5, rồi đem đi hấp tiệt trùng, chú ý không cho muối bicarbonate Pha stock muối bicarbonate với nồng độ 1M, pH = 8,5 lọc tiệt khuẩn bằng màng lọc thủy tinh, bổ sung vào môi trường đã tiệt khuẩn vừa

1

1 0,2 0,04 0,01 0,08 16,8 1mL 1L Dung dịch nguyên tố vi lượng: H3BO3: 2,86, MnCl2.4H2O: 1,81, ZnSO4.4H2O: 0,222, CuSO4.5H2O: 0,079 (g/L)

18

3.2 Các phương pháp phân tích

3.2.1 Quan sát hình thái tế bào Spirulina sp

Hình thái tế bào Spirulina sp được quan sát bằng kính hiển vi quang học

(X40) sau mỗi 5 ngày nuôi cấy

3.2.2 Xác định sinh khối khô tế bào Spirulina sp

Lấy 20 ml dịch nuôi cấy tảo được lọc qua màng sợi thủy tinh, với đường kính màng là 47 mm, đường kính lỗ 0,7 µm Sau đó tảo được rửa với 40ml nước cất và sấy khô ở 60°C suốt 12 tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi [A(g)] Cân A(g) và ghi nhận kết quả [52]

3.2.3 Xác định tốc độ tăng trưởng đặc hiệu

Sinh khối tế bào ở hai thời điểm khác nhau trong quá trình tăng trưởng của mẫu được dùng để tính tốc độ tăng trưởng đặc hiệu (G: g/L/ngày) trong khoảng thời gian đó theo công thức [29]:

19

 Đường chuẩn protein:

Sử dụng nồng độ protein chuẩn 10 đến 120 µg/ml được pha từ Bovine serum

albumin và xác định nồng độ protein trong mẫu Spirulina sp bằng phương trình

 Lấy 0,5 ml dịch chiết cho vào eppendorf 2ml, cho thêm 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu’s phenol, tiếp tục cho từ từ 0,5 ml dung dịch Na2CO3 10%

 Ủ 90 phút trong tối, chú ý không đóng nắp eppendorf

 Đo quang ở bước sóng 750nm

 Đường chuẩn phenolic:

Sử dụng nồng độ acid gallic chuẩn 10 đến 200mg/L và xác định nồng độ

phenolic tổng trong mẫu Spirulina sp bằng phương trình: y = 30,263x – 0,0638;

R² = 0,9948

3.2.6 Xác định hàm lượng chất oxy hóa tổng

 Pha thuốc thử DPPH: pha dung dịch thuốc thử DPPH với nồng độ 0,004% trong methanol [46], [51]

 Lấy 1,0 ml dung dịch tảo ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, loại bỏ dịch, cắn được rửa nhiều lần với 1ml nước cất (hấp vô trùng) bằng cách ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút Thêm 1ml ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều và ủ 4 tiếng ở

40C Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, bỏ cắn lấy dịch chiết

 Ủ 30 phút trong tối, ở nhiệt độ phòng Đo quang ở bước sóng 517nm

 Khả năng chống oxy hóa (I%/ml) được tính theo công thức [6], [46], [51] :

I% = 𝐴𝑀ẫ𝑢 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔 𝐴 −𝐴𝑀ẫ𝑢 𝑡ℎử

𝑀ẫ𝑢 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔 𝑥 100

20

Trong đó:

I%: Tỷ lệ phần trăm ức chế (Percentage inhibition)

A Mẫu trắng : Độ hấp thu của mẫu trắng tại bước sóng 517 nm

A Mẫu thử : Độ hấp thu của mẫu thử tại bước sóng 517 nm

3.3 Phương pháp thiết kế thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và khả năng

chống oxy hóa của tảo Spirulina

Spirulina sp Nhật đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 7 ngày nuôi cấy

trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 - 9,0; cường độ ánh sáng 30 µmol/photon/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố trí thí nghiệm [35]

Thí nghiệm thực hiện trên các bình erlen 500ml bao gồm: 100ml dịch tảo đạt giai đoạn tăng trưởng và thể tích môi trường Zarrouk vừa đủ 500ml; sục khí liên tục và được chiếu sáng ở cường độ 100 µmol photon/m2/s (với chu kỳ sáng: tối, 12h: 12h) trong điều kiện ánh sáng cho hiệu suất tối ưu với 4 nồng độ NPK như sau: 0,05g/L; 0,1g/L; 0,5g/L; 1g/L Sau mỗi 2 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm thức gồm:

 Sinh khối khô của tế bào

 Hàm lượng protein tổng

 Hàm lượng phenolic tổng

 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng

21

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sánh xanh dương lên tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng và

khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina

Spirulina sp Nhật đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 7 ngày nuôi cấy

trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 - 9,0; cường độ ánh sáng 30 µmol/photon/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố trí thí nghiệm [35]

Thí nghiệm thực hiện trên các bình erlen 500ml bao gồm: 100ml dịch tảo đạt giai đoạn tăng trưởng và thể tích môi trường Zarrouk vừa đủ 500ml (với nồng

độ NPK dùng trong môi trường là 0,5g/L); sục khí liên tục, trong điều kiện NPK cho hiệu suất tối ưu với 4 điều kiện ánh sáng như bảng 3.2:

Bảng 3.2 Bảng ký hiệu viết tắt của thí nghiệm 2

(với chu kỳ chiếu sáng lần lượt là 12h: 4h)

W+B (12h:4h)

2 (với chu kỳ chiếu sáng lần lượt là 12h: 8h) Ánh sáng trắng – xanh dương (12h:8h) W+B

(với chu kỳ chiếu sáng lần lượt là 12h: 12h)

W+B (12h:12h)

4 (với chu kỳ chiếu sáng là 12h) Ánh sáng trắng (12h) W

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina

ở các điều kiện NPK khác nhau

22

Sau mỗi 2 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm thức gồm:

 Sinh khối khô của tế bào

 Hàm lượng protein tổng

 Hàm lượng phenolic tổng

 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đỏ và xanh dương lên tăng trưởng, hàm lượng protein, hàm lượng phenolic tổng

và khả năng chống oxy hóa của tảo Spirulina

Spirulina sp Nhật đạt giai đoạn tăng trưởng sau khoảng 7 ngày nuôi cấy

trên môi trường Zarrouk; pH = 8,5 - 9,0; cường độ ánh sáng 30 µmol/photon/m2/s, nhiệt độ 25 ± 20C được sử dụng để bố trí thí nghiệm [35]

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina

ở các điều kiện ánh sáng khác nhau

Bảng 3.3 Bảng ký hiệu viết tắt của thí nghiệm thứ 3 Tên thí

1 (với chu kỳ chiếu sáng lần lượt là 12h:4h+ 12h) Ánh sáng trắng – xanh dương + đỏ (12h: 4h +12h) W+B+R

(với chu kỳ chiếu sáng lần lượt là 12h: 8h+ 12h)

W+B+R (12h: 8h +12h)

3 (với chu kỳ chiếu sáng lần lượt là 12h: 12h) Ánh sáng trắng – đỏ (12h:12h) W+R

4 (với chu kỳ chiếu sáng là 8h: 12h) Ánh sáng trắng – xanh dương (8h:12h) W+B

5 (với chu kỳ chiếu sáng là 12h) Ánh sáng trắng (12h) W Sau mỗi 2 ngày nuôi cấy, tiến hành phân tích các nghiệm thức gồm:

 Sinh khối khô của tế bào

 Hàm lượng protein tổng

 Hàm lượng phenolic tổng

 Hàm lượng chất chống oxy hóa tổng

24

3.4 Xử lý số liệu

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013 và phân tích one way ANOVA bằng phần mềm SPSS 20.0 với sai số ý nghĩa p< 0,05 Tất cả các số liệu trong thí nghiệm được trình bày dưới dạng: Trung bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE)

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nuôi cấy Spirulina ở các điều kiện ánh sáng khác nhau

Chiếu sáng tuần hoàn liên tục: 100 μmol photon/m 2 /s

25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kết quả

4.1.1 Ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng, hàm lượng protein,

hàm lượng phenolic tổng và khả năng chống oxy hóa của Spirulina

4.1.1.1 Ảnh hưởng của các nồng độ NPK lên hình thái tế bào tảo

Spirulina

Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ NPK khác nhau có ảnh hưởng đến

hình thái tế bào của tảo Spirulina Cụ thể vào ngày 8 và 10 của thí nghiệm tế bào

tảo ở cả 4 điều kiện khảo sát đều giãn xoắn và số lượng tế bào bắt đầu tăng lên Tuy nhiên ở nồng độ NPK 1g/L tế bào bắt đầu chuyển vàng vào ngày 8 đến ngày

12 của thí nghiệm Trong khi đó, các nồng độ NPK khác thì tế bào vẫn giữ màu xanh trong suốt quá trình thí nghiệm (hình 4.1)

NPK (1 g/L)

NPK (0,5 g/L)

NPK (0,1 g/L)

Hình 4.1 Hình thái tế bào của tảo Spirulina ở các nồng độ NPK

27

4.1.1.2 Ảnh hưởng của NPK lên sự tăng trưởng của Spirulina

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nồng độ NPK trong môi trường nuôi cấy có

ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của quần thể tảo Spirulina sp Tảo được nuôi cấy

trong môi trường có nồng độ NPK (0,5g/L), cho trọng lượng khô đạt được (1,2g/L) tại ngày 12 cao hơn so với các điều kiện NPK khác (0,05 g/L, 0,1 g/L và 1g/L) với các trọng lượng khô tương ứng (0,53g/L, 0,79 g/L và 0,99g/L) ở ngày 12

và có sự khác biệt về ý nghĩa giữa nồng độ NPK 0,5 g/L với các nồng độ còn lại (p < 0,05) (hình 4.2, phụ lục A.1)

Tốc độ tăng trưởng của Spirulina đạt cực đại ở tại nồng độ NPK 0,5g/L với

giá trị là 0,4 g/L/ngày (hình 4.3) Vẫn có sự khác biệt về ý nghĩa giữa các điều kiện khảo sát tại ngày 12 (p < 0,05) (phụ lục A.1)

1 g/l

Hình 4.2 Trọng lượng khô (g/L) của Spirulina trong các điều kiện NPK khác nhau