Nghiên cứu phát triển kỹ thuật lấy mẫu thụ động POCIS cho các chất bảo vệ thực vật phân cực trong nước nhằm quan trắc và đánh giá chất lượng môi trường nước mặt

TÓM TẮT Lần đầu tiên một phương pháp lấy mẫu thụ động trong nước áp dụng cho các chất bảo vệ thực vật BVTV phân cực đã được phát triển tại Việt Nam.. Từ những dữ liệu RS và ku thu được c

MỤC LỤC

TÓM TẮT viii

ABSTRACT ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH MỤC CÁC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ xii

Lời cảm ơn xiii

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1

1.1 GIỚI THIỆU 1

1.2 CÁC CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT PHÂN CỰC NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 3

1.2.1 Tính chất các chất BVTV nghiên cứu 3

1.2.2 Phương pháp HPLC-UV xác định các chất BVTV phân cực 5

1.3 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỤ ĐỘNG CHO HỢP CHẤT HỮU CƠ PHÂN CỰC 5

CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 12

2.1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 12

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 12

2.1.2 Hóa chất 12

2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT HỢP CHIẾT PHA RẮN 12

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng đầu dò tử ngoại (LC-UV) 12

2.2.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích chất BVTV phân cực 13

2.2.1.2 Định danh 14

2.2.1.3 Khoảng tuyến tính 15

2.2.2 Xử lý mẫu – kỹ thuật chiết pha rắn 16

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết pha rắn 16

2.2.2.2 Đánh giá phương pháp xử lý mẫu nước xác định các chất BVTV 20

2.2.2.3 Đánh giá phương pháp phân tích 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỤ ĐỘNG BẰNG POCIS 22

2.3.1 Chế tạo vòng thép cho POCIS 22

2.3.2 Sự ổn định của chất BVTV trong pha rắn Oasis HLB 23

2.3.3 Các bước chuẩn bị và cách tiến hành trên POCIS 24

(i) Chuẩn bị bột pha rắn Oasis HLB 24

(ii) Lắp POCIS 24

(iii) Gỡ POCIS 25

(iv) Chiết chất phân tích trong POCIS 25

2.3.4 Hiệu chuẩn POCIS trong phòng thí nghiệm 25

2.3.3.1 Mục đích hiệu chuẩn POCIS trong phòng thí nghiệm 25

2.3.3.2 Chuẩn bị bể thí nghiệm 25

2.3.3.3 Xác định chất phân tích có trong bể nước hiệu chuẩn 26

2.3.3.4 Xác định chất tích lũy trong POCIS, tính k u và R S 27

2.3.5 POCIS lấy mẫu ngoài hiện trường 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

TÓM TẮT

Lần đầu tiên một phương pháp lấy mẫu thụ động trong nước áp dụng cho các chất bảo vệ thực vật (BVTV) phân cực đã được phát triển tại Việt Nam Những khảo sát ban đầu cho 7 chất BVTV phân cực simazine, thiodicarb, carbofuran, chlortoluron, atrazine, isoproturon, diuron với phương pháp lấy mẫu thụ động POCIS đã được thực hiện Chúng tôi đã xác định được tốc độ lấy mẫu RS cho các chất này là từ 0,369 – 0,962 L ngày-1 Từ những dữ liệu RS và ku thu được cho thấy sự ảnh hưởng quan trọng của những yếu tố môi trường như tốc độ dòng chảy lên khả năng tích hợp của các chất BVTV phân cực trong quá trình lấy mẫu thụ động Phương pháp này có thể

áp dụng để xác định 7 chất BVTV phân cực trong nước bề mặt tại nồng độ vết, đáp ứng được tiêu chuẩn Châu Âu về nồng độ dư lượng các chất BVTV trong nước (< 0,1µg L-1)

ABSTRACT

The first time in Vietnam a passive sampling method has been developed to analyse the polar pesticides in surface water The initial investigations of POCIS were performed for 7 polar pesticides as simazine, thiodicarb, carbofuran, chlortoluron, atrazine, isoproturon, diuron We determined the sampling rates RS for these substances ranged from 0.369 to 0.962 L day-1 The obtained values of ku and RS showed the important influence of environmental factors such as flow

on the ability to integrate polar pesticides in passive sampling process This method can be applied

to determine these 7 polar pesticides in surface water at trace levels according to European standards for pesticide residues in water (< 0.1 μg L-1)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrile

BVTV: Bảo Vệ Thực Vật

CTPT: Công thức phân tử

GF/F: Glass fiber filter

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

HSTH: Hiệu suất thu hồi

KLPT: Khối lượng phân tử

POCIS: Polar Organic Chemical Integrative Sampler

PRC: Performance Reference Compound

RS: Tốc độ lấy mẫu

RSD: Relative Standard Deviation

SPE: Solid Phase Extraction

TWA: Time weighted average

UV: Ultraviolet

WBL: Water boundary layer

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1: Tính chất của các chất nghiên cứu trong đề tài 4

Bảng 2 1: Kiểm chứng sự ổn định của thời gian lưu các chất BVTV theo thời gian 15

Bảng 2 2: Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất BVTV 16

Bảng 2 3: Kết quả khảo sát loại dung môi rửa giải trên cột SPE-C18 17

Bảng 2 4: Kết quả thể tích methanol rửa giải trên cột C18 và Oasis HLB 18

Bảng 2 5: Kết quả khảo sát tỉ lệ methanol trong dung dịch rửa tạp 19

Bảng 2 6: Hiệu suất thu hồi chất BVTV thêm chuẩn sau lọc 21

Bảng 2 7: Hiệu suất thu hồi chất BVTV thêm chuẩn trước và sau lọc 21

Bảng 2 8: Kết quả xác định MDL, MQL 22

Bảng 2 9: Hiệu suất thu hồi chất BVTV sau khi tẩm vào bột Oasis HLB 24

Bảng 2 10: Các thông số hóa lý của nước máy trong bể thí nghiệm hiệu chuẩn 26

Bảng 2 11: Khối lượng Oasis HLB trong các POCIS trước và sau phơi nhiễm 28

Bảng 2 12: Nồng độ các chất BVTV trong bể nước và POCIS theo thời gian 31

Bảng 2 13: Tốc độ lấy mẫu RS của các chất BVTV sau 7 ngày hấp thu 33

Bảng 2 14: So sánh tốc độ lấy mẫu RS của các chất BVTV với các nghiên cứu khác 34

Bảng 2 15: So sánh tốc độ lấy mẫu RS của các chất BVTV với các nghiên cứu khác (tiếp theo)35 Bảng 2 16: So sánh hằng số hấp thu ku của các chất BVTV với các nghiên cứu khác 36

Bảng 2 17: Kết quả phân tích các chất BVTV phân cực hấp thu vào POCIS 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Các bộ lấy mẫu thụ động phổ biến nhất trong môi trường nước 2

Hình 1 2: Cấu trúc của 7 chất BVTV nghiên cứu trong đề tài 4

Hình 1 3: Cấu trúc của POCIS 6

Hình 1 4: Cấu trúc của pha rắn hấp thu Oasis HLB 6

Hình 1 5: Sự khuếch tán chất phân tích (chấm đỏ) từ nước vào pha hấp thu 7

Hình 1 6: Đường hấp thu của chất phân tích từ nước vào pha hấp thu 8

Hình 1 7: So sánh tốc độ lấy mẫu của giữa hiện trường và phòng thí nghiệm 10

Hình 1 8: POCIS với 2 môi trường lấy mẫu khác nhau: ít (bên trái) và nhiều biofouling (bên phải) 11

Hình 2 1: Phổ hấp thu UV của 7 chất BVTV 13

Hình 2 2: Sắc ký đồ chuẩn của 7 chất BVTV ở nồng độ 4 mg L-1 15

Hình 2 3: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của 7 chất BVTV 16

Hình 2 4: Quy trình làm sạch và làm giàu mẫu trên cột chiết SPE –Oasis HLB 20

Hình 2 5: Bể thí nghiệm hiệu chuẩn POCIS – xác định RS của các chất BVTV 26

Hình 2 6: Sắc ký đồ các chất BVTV trong bể 80 lít nước máy lúc chưa thêm chuẩn (màu hồng) và thêm chuẩn 1 µg L-1 (màu đen) 27

Hình 2 7: Sắc ký đồ 7 chất BVTV trong POCIS sau 7 ngày 28

Hình 2 8: Đồ thị biểu diễn nồng độ chất BVTV trong bể theo thời gian khảo sát 29

Hình 2 9: Đồ thị biểu diễn hệ số nồng độ các chất BVTV theo thời gian phơi nhiễm 32

Hình 2 10: Lắp POCIS vào lồng để phơi nhiễm trong mẫu hiện trường 38

Hình 2 11: Hình ảnh POCIS được lấy lên sau 14 ngày phơi nhiễm ở hiện trường 38

Hình 2 12: POCIS Kênh Xáng được rửa với nước cất để loại các chất bẩn 39

Hình 2 13: POCIS lấy mẫu sau khi rửa sạch với nước cất 2 lần, và bảo quản 39

Hình 2 14: Bản đồ khu vực lấy mẫu tại Trà Vinh 39

Lời cảm ơn

Nhóm nghiên cứu chân thành cám ơn sự hỗ trợ kỹ thuật của các đồng nghiệp tại Phòng thí nghiệm Hóa học về Nước (Laboratoire de Chimie des Eaux) trực thuộc Đơn vị Nghiên cứu về Mạng lưới nước, Hệ thống thanh lọc nước và Chất lượng nước (Unité de Recherche Réseaux, Epuration et Qualité des Eaux – UR REBX) thuộc Viện Nghiên cứu về Khoa học và Kỹ thuật cho Môi trường tại Pháp (National Research Institude of Science and Technology for Environment and Agriculture - IRSTEA de Bordeaux)

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU

Để đánh giá đúng tình trạng ô nhiễm nước sông, một quá trình gồm nhiều giai đoạn phải được nghiên cứu áp dụng bao gồm: quá trình lấy mẫu nước, quá trình phân tích các chỉ tiêu lý-hóa-sinh và tổng hợp đánh giá kết quả Trong đó, quy trình lấy mẫu nước cực kỳ quan trọng vì nó liên quan trực tiếp đến việc phản ánh sự hiện diện của các chất cần phân tích trong nước

Hiện tại, ở Việt Nam, phương pháp lấy mẫu nước sông nói riêng và mẫu nước bề mặt, nước ngầm nói chung vẫn là phương pháp lấy mẫu trực tiếp tức là nước tại nơi cần khảo sát được lấy vào một thời điểm nào đó trong ngày rồi cho vào bình chứa, cố định bằng hóa chất (nếu cần) rồi chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích Cách thức lấy mẫu này bộc lộ một nhược điểm lớn đó

là không phản ánh được chính xác sự hiện diện của chất gây ô nhiễm trong một quá trình Một ví

dụ cụ thể để hiểu rõ hơn về nhược điểm này là việc theo dõi các chất bảo vệ thực vật (pesticides) trong nước Nếu quá trình lấy mẫu được thực hiện trước khi người dân phun thuốc thì hàm lượng chất cần khảo sát sẽ rất nhỏ (hoặc có thể không phát hiện được nếu không có được một phương pháp phân tích đủ nhạy) nhưng nếu lấy mẫu một thời gian ngắn sau khi người dân dùng thuốc và nếu trời mưa ngay sau đó thì hàm lượng chất chảy ra sông tìm được sẽ rất lớn Để giải quyết vấn

đề này, một giải pháp cũng đã và đang được áp dụng tại các nước tiên tiến là phương pháp lấy mẫu

tự động (automatic sampling) tức là một thiết bị khá cồng kềnh và phức tạp được lắp đặt tại điểm lấy mẫu để có thể lấy mẫu trực tiếp liên tục nhiều ngày theo chương trình định sẵn trong máy tính

Ưu điểm của phương pháp này là phản ánh chính xác mức độ ô nhiễm theo thời gian nhưng lại có nhược điểm là thiết bị đắt tiền, phức tạp, số lượng mẫu cần phân tích rất lớn Do vậy, hiện nay trên thế giới có xu hướng nghiên cứu và áp dụng quy trình thu giữ mẫu thụ động – là một giải pháp có tính trung gian khắc phục những nhược điểm của hai phương pháp lấy mẫu trực tiếp và lấy mẫu

tự động

Như vậy, cách lấy mẫu nước truyền thống chỉ có hiệu quả xác định được nồng độ chất ô nhiễm trong nước tại thời điểm thu thập mẫu, có thể bỏ lỡ những ảnh hưởng của sự thay đổi trong chế độ dòng chảy, hóa chất đầu vào, hoặc ảnh hưởng của mưa… lên kết quả của chất phân tích trong điều kiện tự nhiên Phương pháp lấy mẫu thụ động cho kết quả khách quan hơn thông qua xác định nồng độ trung bình của chất ô nhiễm theo thời gian Phương pháp giúp xác định nồng độ rất nhỏ của chất ô nhiễm trong nước mà phương phấp lấy mẫu trực tiếp không làm được thông qua quá trình tích hợp dài ngày Quá trình lấy mẫu này không cần sự giám sát cũng là một ưu điểm

của phương pháp Vì vậy, bộ lấy thụ động là một ứng dụng rất tốt cho quan trắc môi trường và ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới

Phương pháp lấy mẫu thụ động áp dụng trong môi trường nước là một kỹ thuật được phát triển mạnh trong vòng 15 năm trở lại đây trên thế giới [1-4] Nguyên tắc của phương pháp dựa trên

sự khuếch tán các chất gây ô nhiễm có trong môi trường nước vào trong pha thu giữ có trong thiết

bị lấy mẫu Pha thu giữ này có thể là một chất lỏng (Semi-Permeable Membrane Device – SPMD), một polymer (polyetylen mật độ thấp, Low Density PolyEthylene – LDPE) hoặc một chất hấp thu

vi lỗ xốp (Polar Organic Chemical Integrative Sampler – POCIS) [3, 5] Bộ thu mẫu thụ động sẽ được nhấn chìm trong nước trong những khoảng thời gian khác nhau từ vài ngày cho đến hơn mô ̣t tháng Có nhiều bộ lấy mẫu thụ động tùy theo chất ô nhiễm cần nghiên cứu chủ yếu dựa vào độ phân cực của những chất này trong nước Với những phân tử hữu cơ kỵ nước (logKOW >3) bộ thu mẫu SPMD và những màng bằng LDPE hoặc silicone được sử dụng phổ biến nhất [6, 7] Trong khi

đó với những hợp chất hữu cơ ưa nước (logKOW = 0 – 4) thông thường POCIS và Chemcatchers

sẽ được sử dụng [8, 9] Còn đối với những hợp chất vô cơ như kim loại thì DGT (Diffusive Gradient

in Thin Film) được sử dụng nhiều nhất [10] (Hình 1.1)

Hình 1 1 Các bộ lấy mẫu thụ động phổ biến nhất trong môi trường nước Cách thức lấy mẫu nước thụ động này có nhiều ưu điểm nổi bật như sau [3, 11]:

 Các chất gây ô nhiễm sẽ được thu giữ liên tục nên sẽ phản ánh tốt hơn sự hiện diện của chất ô nhiễm trong nước; điều này sẽ tránh được sai sót của phương pháp lấy mẫu trực tiếp

 Chất phân tích sẽ được cô đặc trên pha hấp thu cho phép hạ thấp giới hạn phát hiện trong nước

 Tiết kiệm thời gian và công sức

 Thiết bị đơn giản, không cần bảo trì đặc biệt

Phương pháp lấy mẫu thụ động

Theo sự hiểu biết của chúng tôi thì hiện tại ở thành phố Hồ Chí Minh nói riêng và Việt Nam nói chung chỉ có nghiên cứu của nhiều nhóm khác nhau về bộ thu mẫu thụ động áp dụng cho

ô nhiễm môi trường khí nhưng chưa có nghiên cứu nào về bộ thu mẫu thụ động áp dụng cho môi trường nước đặc biệt là POCIS Lý thuyết và kỹ thuật của phương pháp này khá phức tạp, đòi hỏi nhiều khảo sát công phu, kỹ lưỡng và lâu dài nhưng ứng dụng của nó thì rất lớn, kết quả thu được

sẽ phản ánh chính xác hơn mức độ ô nhiễm môi trường nước

Đề tài này sẽ là bước khởi đầu quan trọng cho một hướng nghiên cứu mới về quy trình lấy mẫu thụ động trong môi trường nước tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận thuộc lưu vực sông Sài Gòn – Đồng Nai Các bộ thu mẫu thụ động sẽ được chế tạo và lắp đặt theo yêu cầu cụ thể của đề tài và đặc điểm của hệ thống sông tại nơi lấy mẫu Số liệu khảo sát thu được sẽ là tiền đề quan trọng cho những nghiên cứu về sau và làm cơ sở vững chắc cho việc đánh giá chất lượng nước sông Sài Gòn – Đồng Nai

1.2 CÁC CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT PHÂN CỰC NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH

1.2.1 Tính chất các chất BVTV nghiên cứu

Bên cạnh những giá trị tích cực mang lại, chất BVTV là một trong những nhân tố gây mất cân bằng môi trường do con người lạm dụng, sử dụng mất kiểm soát, không đúng qui định và độc tính phát sinh trong quá trình sử dụng Nhiều mặt tiêu cực của chất BVTV đã làm đảo lộn các mối quan hệ giữa các sinh vật trong thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái, đặc biệt quan trọng hơn khi những chất BVTV tan trong nước sẽ dễ dàng theo nguồn nước đi vào chuỗi thức ăn của chính con người [12, 13]

Trong số các chất BVTVtan nhiều trong nước thì nhóm triazine (simazine, atrazine), phenylurea (diuron, chlortoluron, isoproturon) và một số carbamate được sử dụng rất nhiều trong

các sản phẩm nông nghiệp như phụ lục bảng 1 Đặc biệt carbofuran, atrazine, mirex (chứa hoạt

chất diuron), thiodicarb nằm trong danh sách cấm sử dụng ở Châu Âu [14], carbofuran và mirex cấm sử dụng ở Mỹ [15], ở nước ta carbofuran hạn chế sử dụng [16] do độc tính cao và bền trong môi trường

Sau các khảo sát sơ bộ chúng tôi chọn nghiên cứu trên các chất BVTV phân cực gồm nhóm diệt cỏ triazine (simazine và atrazine), nhóm phenylurea (chlortoluron, isoproturon, diuron), nhóm carbamate (carbofuran, thiodicarb) với hằng số logKow, độ tan và một số tính chất khác [17-25] được

thể hiện trong Bảng 1.1 và Hình 1.2

Bảng 1 1: Tính chất của các chất nghiên cứu trong đề tài

Tên chất Họ CTPT, KLPT

(g mol -1 )

LogKow (25 o C)

Độ tan trong nước

ở 25 o C (mg L -1 )

Thời gian bán hủy (ngày)

Độ độc LD50 (mg kg -1 ) trên chuột

Qua da > 2000 Qua miệng > 87

M = 215.68 2.7 70 >120

Qua da > 5000 Qua miệng > 1075 Thiodicarb

Carbamate

C10H18N4O4S3

M = 354.5 1.62 8 – 78

>200 (22 °C)

Qua da > 6310 Qua miệng > 66

M =221.25 2.32 320 28 Qua miệng 8–14 Chlorotoluron

Phenyl urea

Qua da > 5000 Qua miệng > 1017

Thiodicarb Hình 1 2: Cấu trúc của 7 chất BVTV nghiên cứu trong đề tài

1.2.2 Phương pháp HPLC-UV xác định các chất BVTV phân cực

Elvira Grou và cộng sự [26] đã xác định chất BVTV carbamate trong đất và nước bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV ở bước sóng 254 nm Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với mẫu nước từ 0,005 – 0,01 mg L-1, đối với mẫu đất từ 0,05 – 0,1 µg g-1 Đây

là một phương pháp phổ biến để xác định các hợp chất hữu cơ phân cực, vận hành đơn giản, dễ trang bị cho các phòng thí nghiệm Phương pháp kết hợp kỹ thuật làm giàu mẫu sẽ giúp hạ thấp giới hạn phát hiện

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đang được ứng dụng rộng rãi để xác định dư lượng các chất BVTV carbamate và phenylurea rất hiệu quả Việc sử dụng đầu dò khối phổ cho phép phân tích đồng thời các chất BVTV với độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh

Do sự hạn chế về kinh phí thực hiện đề tài chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng đầu

dò UV để xác định đồng thời 7 chất BVTV phân cực trong nước bề mặt sông Trong trường hợp cần thiết thì sẽ xác nhận lại bằng sắc ký lỏng đầu dò khối phổ

1.3.1 Cơ chế hấp thu thụ động POCIS

Sự tích hợp của các chất ô nhiễm phân cực vào POCIS là kết quả của các quá trình liên tiếp xảy ra trên bề mặt của màng và bên trong POCIS [27]

Đầu tiên, chất phân tích tan trong nước sẽ đi qua lớp biên giới nước – màng (Water

Boundary Layer – WBL) bằng sự khuếch tán Tiếp theo là vận chuyển chất phân tích qua màng PES thông qua các lỗ xốp đầy nước của nó Cuối cùng, các chất di chuyển từ màng PES đến vật liệu hấp thu - Oasis HLB

1.3.2 Cấu tạo bộ lấy mẫu POCIS

POCIS được sắp xếp theo cấu trúc một chiếc bánh sandwich (Hình 1.3) gồm màng (PES –

polyethylenesulfone) - chất hấp thu (Oasis HLB) – màng (PES – polyethersulfone) POCIS được chuẩn bị theo những bước như sau [28]:

(i) Màng PES đầu tiên được đặt trên vòng thép đầu tiên (vòng thép được làm bằng thép không gỉ, có đường kính trong 5.1 cm, đường kính ngoài 8.9 cm)

(ii) Chất hấp thu được đặt vào trung tâm của màng PES

(ii) Đặt màng PES thứ hai trên chất hấp thu và nén lại bằng vòng thép thứ 2 Tổng diện tích

bề mặt của màng PES chứa chất hấp thu khoảng 41 cm2 và tỷ số giữa diện tích bề mặt màng trên khối lượng chất hấp thu khoảng 200 cm2 g-1

(iv) Vặn chặt bằng 3 ốc vít để giữ và ngăn chặn sự mất chất hấp thu (Hình 1.4)

Hình 1 3: Cấu trúc của POCIS

1.3.3 Màng khuếch tán polyethersulfone (PES)

Chất liệu màng polyethersulfone cho tỷ lệ chất phân tích đi qua màng cao nhất khi so với màng cellulose, nylon, … PES có thể loại trừ các phần tử nhiễu tốt nhờ kích thước lỗ màng rất nhỏ, hạn chế tốt nhất sự phát triển của các sinh vật trên bề mặt màng, PES có độ bền cao nên có thể lấy mẫu trong thời gian dài [8, 29]

1.3.4 Chất hấp thu Oasis HLB

Oasis HLB là một copolymer cân bằng ưa nước – ưa dầu (N-vinylpyrolidon và

divinylbenzen) rất thích hợp cho lấy mẫu đồng thời các chất hữu cơ phân cực (Hình 1.4), nên Oasis

HLB rất thích hợp để chiết thu lấy các chất BVTV phân cực [9]

Hình 1 4: Cấu trúc của pha rắn hấp thu Oasis HLB

1.3.5 Nguyên tắc phương pháp lấy mẫu POCIS

Lấy mẫu thụ động dựa trên dòng chảy tự do của chất phân tích từ môi trường nước đi vào pha hấp thu qua một màng lọc cho tới khi cân bằng được thiết lập hoặc cho tới khi ngừng lấy mẫu

(Hình 1.5) [30]

Hình 1 5: Sự khuếch tán chất phân tích (chấm đỏ) từ nước vào pha hấp thu

Sự hấp thu chất phân tích lên bề mặt màng PES của bộ lấy mẫu POCIS tuân theo định luật Langmuir [31] và hệ số nồng độ Cf được biểu diễn theo công thức:

Cf=CPOCISCwater = ku

Trong đó:

ku: là hệ số tích lũy của chất phân tích từ môi trường vào POCIS, L g−1 ngày−1

ke: là hệ số giải hấp của chất phân tích từ POCIS ra ngoài môi trường, ngày−1

t: là thời gian phơi nhiễm (ngày)

CPOCIS:là nồng độ chất ô nhiễm trong POCIS sau thời gian phơi nhiễm, μg g-1

Cwater: là nồng độ trung bình của chất ô nhiễm trong thời gian lấy mẫu, μg L-1

Cf: là tỷ số nồng độ của chất phân tích có trong POCIS và trong môi trường nước

Sự tích hợp các chất hữu cơ phân cực vào POCIS diễn ra qua 3 giai đoạn (Hình 1.6)

 Giai đoạn 1 - trạng thái động học: là thời gian mà các hợp chất tích hợp một cách tuyến tính,

lúc này hệ số nồng độ Cf sẽ phụ thuộc tuyến tính theo thời gian tích hợp

 Giai đoạn 2: sự tích lũy là đường cong do xuất hiện hiện tượng giải hấp (ke) chất phân tích ra khỏi POCIS

 Giai đoạn 3 - trạng thái cân bằng, tốc độ chất hấp thu vào POCIS bằng tốc độ giải hấp của các

chất này từ POCIS ra môi trường nước

Cf= ku

Thời gian của mỗi giai đoạn tùy thuộc vào chất phân tích và điều kiện môi trường nơi lấy mẫu Để đánh giá nồng độ trung bình theo thời gian của chất ô nhiễm, các POCIS sẽ được phơi nhiễm trong giai đoạn tích lũy tuyến tính (giai đoạn 1), nồng độ trung bình theo thời gian (time weighted average – TWA) được tính như sau:

TWA = Cwater = CPOCIS×MPOCIS

Trong đó:

MPOCIS : khối lượng chất hấp thu cho vào trong mỗi POCIS, g

RS: tốc độ lấy mẫu, L ngày-1

KSW: hằng số phân bố của chất phân tích giữa POCIS và môi trường nước

TWA: nồng độ trung bình theo thời gian, µg L-1

Hình 1 6: Đường hấp thu của chất phân tích từ nước vào pha hấp thu

1.3.6 Tốc độ lấy mẫu R S

Tốc độ lấy mẫu (sampling rate) được định nghĩa là thể tích nước chứa chất phân tích đi qua dụng cụ lấy mẫu trên đơn vị thời gian cụ thể [29]

Để tính nồng độ chất gây ô nhiễm trong môi trường, chúng ta phải hiệu chỉnh xác định tốc

độ lấy mẫu của mỗi chất phân tích dưới điều kiện phòng thí nghiệm (RS-lab), sử dụng nước vô trùng, nước đề ion, nước cất, nước máy hoặc nước giếng [32]

Thực tế trong quá trình phơi nhiễm tại hiện trường lấy mẫu luôn có sự hấp thu các chất BVTV vào POCIS và sự giải hấp chúng ra khỏi POCIS, được đặc trưng bởi hằng số hấp thu ku và hằng số giải hấp ke Chúng ta có thể xác định ku dựa vào thí nghiệm hiệu chuẩn, nhưng để xác định

ke còn gặp phải nhiều khó khăn Do vậy hiện nay có xu hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất tham chiếu hiệu năng (Performance Reference Compounds – PRCs) để xác định ke và cũng để hiệu chỉnh lại (RS-corr) cho các điều kiện khác nhau ở hiện trường lấy mẫu

Điều kiện của một PRC:

 Có tính chất gần với chất phân tích

 Không hiện diện trong môi trường

 Tương thích với thiết bị đang sử dụng phân tích

Thông thường PRCs là các đồng vị deuterium của các chất phân tích PRCs được thêm vào chất hấp thu trong POCIS trước khi hiệu chuẩn và trước khi phơi nhiễm ngoài hiện trường Sau thời gian phơi nhiễm, ke PRC-lab và ke PRC-insitu được tính toán theo công thức:

RS-lab xem như tương ứng với RS-insitu

Trong đó:

Co PRC-lab: nồng độ ban đầu của PRC thêm vào POCIS để hiệu chuẩn phòng thí nghiệm, µg g-1

Ct PRC-lab: nồng độ của PRC còn lại trong POCIS hiệu chuẩn phòng thí nghiệm sau thời gian t,

µg g-1

Co PRC-insitu: nồng độ ban đầu của PRC thêm vào POCIS để lấy mẫu hiện trường, µg g-1

Ct PRC-insitu: nồng độ của PRC còn lại trong POCIS lấy mẫu hiện trường sau thời gian t, µg g-1

TWA =CPOCIS× MPOCIS

RS−corr× t

RS-lab: tốc độ lấy mẫu của chất phân tích hiệu chuẩn trong phòng thí nghiệm, L ngày-1

RS-corr: tốc độ lấy mẫu của chất phân tích sau khi hiệu chỉnh bằng cách sử dụng PRC, L ngày-1

ke PRC – lab: hằng số giải hấp của PRC khi phơi nhiễm POCIS trong phòng thí nghiệm, ngày-1

ke PRC – insitu: hằng số giải hấp của PRC khi phơi nhiễm POCIS ở hiện trường lấy mẫu, ngày-1

1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng lên sự tích lũy chất phân tích vào POCIS

Sự hấp thu của các chất phân tích phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

(i) Tính chất của chất hấp thu và màng

(ii) Tính chất hóa lý của các chất phân tích

(iii) Điều kiện môi trường (nhiệt độ, ánh sáng, pH, độ mặn, lưu lượng dòng nước,

biofouling…[3, 9]

Nghiên cứu của Harman và cộng sự [27] cho thấy rằng ảnh hưởng của pH đến tốc độ lấy mẫu phụ thuộc vào loại chất phân tích: với pH môi trường từ 3-9 thì các chất base có RS tăng trong khi đó những chất acid có RS giảm, chất trung tính thì RS không bị ảnh hưởng Tuy nhiên cần có những nghiên cứu thêm để đưa ra một kết luận chung và đúng nhất

Độ khuấy trộn của dòng chảy ảnh hưởng rất nhiều đến sự tích lũy chất phân tích vào POCIS Nghiên cứu của Alvarez và cộng sự [8] cho thấy sự khuấy trộn làm tốc độ lấy mẫu của các chất BVTV và dược phẩm (logKow < 3) vào POCIS tăng 4 – 9 lần Do đó, giá trị RS thu được trong phòng thí nghiệm theo các điều kiện nêu trên có thể không phù hợp với nước mặt ngoài hiện trường Kết quả thu được từ các nghiên cứu của Harman và cộng sự [27] cho thấy tốc độ lấy mẫu

của các chất phân tích thay đổi khá lớn trong các môi trường nước khác nhau (Hình 1.7)

Hình 1 7: So sánh tốc độ lấy mẫu của giữa hiện trường và phòng thí nghiệm

Trong đó: DW là nước sông hạ nguồn; EW là nước thải; Lab là phòng thí nghiệm; EDC: chất ảnh hưởng nội tiết (endocrine-disrupting chemical); E1:Oestrone; E2:17α-ethinylestradiol; BPA: Bisphenol A

Khi nhiệt độ tăng, tốc độ lấy mẫu của hấu hết các chất tăng theo kết quả nghiên cứu phụ lục bảng 2 [27]

Biofouling là sự tích tụ của vi sinh vật, thực vật, tảo, các loài động vật trên một bề mặt ướt,

(Hình 1.8) Màng PES tương đối ít nhạy với biofouling, tuy nhiên PES không phải miễn dịch hoàn

toàn với biofouling mà tùy thuộc vào môi trường phơi nhiễm, vào hợp chất và tùy vào ái lực của các chất phân tích khác nhau với lớp biofouling [3, 27]

Hình 1 8: POCIS với 2 môi trường lấy mẫu khác nhau: ít (bên trái) và nhiều biofouling (bên phải)

CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ HPLC của hãng SHIMADZU với bơm LC-20AD

- Đầu dò SPD-20A (Shimadzu)

- Máy quang phổ UV-1800 SHIMADZU

- Cột sắc kí: cột Kromasil 100-3.5, C18 với chiều dài 150 mm, đường kính cột 4.6 mm, kích thước hạt pha tĩnh 5 µm

- Máy siêu âm Elma S18H

- Cân phân tích Mettler Toledo

- Bộ rút chân không của hãng Agilent

- Các vỏ cột SPE Varian rỗng, cốc thủy tinh các loại, phễu, pasteur pipet, pipet các loại, ống COD thể tích 10 mL đã được vạch sẵn đến 1 mL

- Vòng POCIS làm bằng thép không gỉ (chế tạo tại Pháp)

2.1.2 Hóa chất

Dung môi accetonitril (ACN) (Merck), methanol (MeOH), ethyl acetatate (EA), và acetone (A) (Labscan), acid formic loại tinh khiết (Merck), nước cất hai lần

Hạt pha tĩnh C18 (Agilent), hạt pha tĩnh Oasis HLB (Waters, 60 µm)

Các chất chuẩn simazine (99,5%), thiodicarb (99,8%), carbofuran (99,9%), chlortoluron (99,6%), atrazine (100%), isoproturon (99,6%) và diuron (100%) được mua từ TechLab (Pháp) Các dung dịch chuẩn được pha riêng ở nồng độ 1000 mg L-1 và 100 mg L-1 trong methanol (HPLC grade ≥ 99,9%)

Trong các thí nghiệm khảo sát, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian

có nồng độ các chất phân tích (như phụ lục bảng 4)

Tùy vào thí nghiệm cụ thể và nồng độ cần khảo sát mà các chất chuẩn được pha với nồng

độ khác nhau

2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT HỢP CHIẾT PHA RẮN

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng đầu dò tử ngoại (LC-UV)

Để phát triển phương pháp lấy mẫu thụ động POCIS cho mẫu nước, vì không có sẵn phương pháp xác định nên chúng tôi phát triển phương pháp để xác định các chất BVTV trong

mẫu nước sông Theo đó sẽ áp dụng để so sánh xác định đồng thời các chất BVTV nghiên cứu trong nước sông theo 2 phương thức lấy mẫu, đó là lấy mẫu chủ động và lấy mẫu thụ động

2.2.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích chất BVTV phân cực

Để phát triển phương pháp lấy mẫu thụ động POCIS cho mẫu nước, vì không có sẵn phương pháp xác định nên chúng tôi phát triển phương pháp để xác định các chất BVTV trong mẫu nước sông Theo đó sẽ áp dụng để so sánh xác định đồng thời các chất BVTV nghiên cứu trong nước sông theo 2 phương thức lấy mẫu chủ động và thụ động

Các thông số thiết bị sẽ được khảo sát để tìm ra điều kiện phân tích cụ thể nhằm đi đến một kết quả phân tích chính xác Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát với những thông số: (i) bước sóng hấp thu cực đại của chất phân tích trên đầu dò UV, (ii) tỉ lệ pha động acetonitril và nước

Hình 2 1: Phổ hấp thu UV của 7 chất BVTV Nhằm xác định bước sóng hấp thu cực đại của các chất BVTV nghiên cứu, các chất (10 mg

L-1) được quét phổ hấp thu trên máy đo quang UV-1800 SHIMADZU Simazine, atrazine, thiodicarb và chlorotoluron hấp thu cực đại ở vùng 220 nm – 230 nm, isoproturon và diuron lại

cho tín hiệu cao ở 240 nm – 260 nm (Hình 2.1) Carbofuran cho hấp thu mạnh ở bước sóng 202

nm Tuy nhiên, do đầu dò UV trên hệ sắc ký lỏng chỉ có thể xác định đồng thời hai bước sóng nên chúng tôi chọn 220 nm và 254 nm cho 7 chất BVTV ở trên

Trên hệ sắc ký lỏng cố định pha tĩnh C18 của phòng thí nghiệm chúng tôi, pha động là yếu

tố quan trọng quyết định khả năng rửa giải của các chất phân tích Theo tài liệu tham khảo [18],

phân tích chất BVTV thường sử dụng pha động là ACN và nước (hoặc đệm) Đề tài cũng hướng đến quy trình phân tích đơn giản và áp dụng được cho đầu dò khối phổ về sau này nên 2 loại dung môi pha động được khảo sát là (i) ACN/HCOOH 0,1% và (ii) ACN/H2O với các thông số cố định:

o Tốc độ dòng: 1,00 mL phút-1

o Thể tích tiêm: 20 µL

o Bước sóng: 220 và 254 nm

Kết quả thu được cho thấy hai loại pha động trên đều cho khả năng tách như nhau ở cùng tỷ

lệ pha động nhưng hệ ACN/H2O cho tỉ lệ nhiễu nền trên tín hiệu của chất phân tích thấp hơn nên chúng tôi chọn pha động là ACN/H2O

Thành phần ACN trong pha động càng cao, các chất càng rửa giải nhanh, thành phần nước càng cao, hệ số phân giải giữa 2 chất càng lớn Chúng tôi đã thay đổi tỷ lệ ACN và nước để khả năng tách của các chất là tốt nhất và thời gian phân tích nhanh Qua kết quả khảo sát, chúng tôi chọn hệ ACN/H2O (35/65, v/v) làm pha động Chi tiết các khảo sát được nêu trong khóa luận tốt nghiệp của Lê Thị Hồng Tân [33]

Thông số trên thiết bị:

2.2.1.2 Định danh

Tổng hợp của 3 tương tác: (i) chất phân tích và pha tĩnh, (ii) chất phân tích và pha động, (iii) pha tĩnh và pha động sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất và ngược lại Thứ tự rửa giải các chất BVTV như sau: simazine, thiodicarb,

carbofuran, chlortoluron, atrazine, isoproturon, diuron (Hình 2.2)

Chúng tôi cũng kiểm chứng sự ổn định thời gian lưu của các chất BVTV theo thời gian Nếu thời gian lưu các chất sai lệch quá nhiều (trên 0,1 phút) thì chúng tôi sẽ tiếp tục kiểm tra trên

khối phổ Bảng 2.1 cho thấy trên hệ HPLC – UV của phòng thí nghiệm chúng tôi, các chất BVTV

có thời gian lưu rất ổn định với RSD ≤ 1,0 %, cho phép định lượng chính xác chất phân tích và phát triển phương pháp lấy mẫu thụ động – POCIS

Bảng 2 1: Kiểm chứng sự ổn định của thời gian lưu các chất BVTV theo thời gian

(T.8)

t’R(T.9)

t’R(T.10)

t’R(T.12) t’R-TB

RSD (%) Simazine 6,837 6,818 6,816 6,821 6,823 0,14 Thiodicarb 8,070 8,012 8,005 8,018 8,026 0,37

Carbofuran 10,064 9,967 9,929 9,823 9,946 1,0

Chlorotoluron 10,973 10,853 10,840 10,826 10,873 0,62

Atrazine 12,192 12,052 12,042 12,067 12,088 0,58 Isoproturon 13,497 13,375 13,373 13,419 13,416 0,43

chuẩn trong Bảng 2.2 và đường chuẩn Hình 2.3 thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích của

7 chất BVTV, với hệ số tương quan R2 thu được từ 0,9985 đến 0,9994

0 25000 50000 75000 uV

Bảng 2 2: Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất BVTV

Speak = y, Cmg L-1= x

R²

Bậc tuyến tính

Cmin(mgL-1)

Cmax (mgL-1) Simazine y = 210201,56x – 5044,374 0,9994 104 0,003 10,10 Thiodicarb y = 37955,06x + 5134,11 0,9987 6,66x103 0,012 80,20

Chlorotoluron y = 65252,90x – 35378,16 0,9985 104 0,009 90,20

Isoproturon y = 60701,90x – 937,56 0,9988 104 0,009 90,40 Diuron y = 100805,84x – 43137,07 0,9994 104 0,012 120,00

*Do hạn chế hóa chất, mặt khác nồng độ các chất này trong môi trường rất thấp nên chúng tôi chỉ khảo sát đến 10 mg L -1

C min : nồng độ khảo sát thấp nhất của các chất BVTV trong khoảng tuyến tính

C max : nồng độ khảo sát lớn nhất của các chất BVTV trong khoảng tuyến tính.

Hình 2 3: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của 7 chất BVTV

2.2.2 Xử lý mẫu – kỹ thuật chiết pha rắn

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết pha rắn

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000

Hàm lượng chất BVTV trong nước bề mặt được quy định khá nghiêm ngặt, giới hạn chất BVTV trong nước theo tiêu chuẩn Châu Âu là 0,1 µg L-1 [34], của tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ

là 40 µg L-1 (carbofuran), 3µg L-1 (atrazine), 4 µg L-1 (simazine) [35], và ở Việt Nam vẫn chưa quy định giới hạn các chất này trong nước bề mặt [36] Vì vậy quy trình làm giàu mẫu cùng với loại tạp

là rất quan trọng nên kỹ thuật chiết pha rắn được sử dụng Do tính chất của các chất BVTV phân tích nên 2 loại pha tĩnh C18 và Oasis HLB được khảo sát [37]

Các bước chúng tôi chọn khảo sát:

i Dung môi rửa giải

ii Thể tích dung môi rửa giải

iii Dung môi rửa tạp

iv Thể tích dung dịch mẫu chiết qua cột SPE

Chọn dung môi rửa giải phải đảm bảo lôi kéo hoàn toàn chất phân tích ra khỏi cột chiết pha rắn Khảo sát bước đầu trên cột C18 chúng tôi nhận thấy các dung môi đều rửa giải hiệu quả các chất BVTV ra khỏi cột C18 nhưng methanol được chọn do ưu việt hơn so với các dung môi còn

Chlortoluron 114,4 98,0 (0,55) 103,6 (3,1) 98,8 (1,2) 99,2 (6,3)

Isoproturon 120,8 98,7 (0,26) 99,8 (3,3) 102,4 (2,0) 100,3 (6,2) Diuron 155,2 98,2 (0,62) 104,4 (3,5) 99,7 (0,94) 99,5 (7,3)

(*)

Do hóa chất chưa về kịp nên chúng tôi chỉ khảo sát trên 5 chất BVTV phân cực

Chúng tôi sử dụng dung môi rửa giải được chọn ở trên tiếp tục khảo sát đồng thời cho 2 cột chiết C18 và Oasis HLB với thể tích methanol rửa giải Sử dụng 25 mL nước cất 2 lần thêm chuẩn

các chất BVTV để làm nền khảo sát Kết quả thu được thể hiện ở Bảng 2.4

Bảng 2 4: Kết quả thể tích methanol rửa giải trên cột C18 và Oasis HLB

*Do hóa chất chưa về kịp nên chúng tôi chỉ khảo sát trên 5 chất BVTV phân cực

Cấu trúc của các hạt pha tĩnh Oasis HLB có nhóm N-vinylpyrrolidone phân cực sẽ tương tác

mạnh với các chất BVTV phân cực hơn C18, do đó cần phải sử dụng nhiều methanol hơn để rửa giải hoàn toàn chất phân tích ra khỏi cột nên chúng tôi chọn 3 mL methanol

Chúng tôi cũng khảo sát thành phần hỗn hợp rửa tạp trên cả hai loại cột bằng cách thay đổi

tỷ lệ methanol/nước ở 5, 7 và 10%, với thể tích cố định 10 mL Mẫu nước sông Sài Gòn (lấy mẫu tại cầu Calmette) được lọc qua màng GF/F 0,70 µm và thêm chuẩn các chất BVTV 200 mL mẫu nước sông Sài Gòn thêm chuẩn này được đưa qua cột chiết SPE Sử dụng 3 mL methanol rửa giải,

dung dịch cuối cùng đưa về 1 mL với methanol Kết quả khảo sát được trình bày trong Bảng 2.5

Pha tĩnh C18 lưu giữ các chất BVTV phân cực kém hơn Oasis HLB nên ở cùng tỷ lệ methanol 7 % trong nước thì sự mất chất phân tích trên cột C18 nhiều hơn cột Oasis HLB Khi thành phần methanol càng tăng (10 %), cả cột C18 và Oasis HLB đều bị mất chất phân tích Vậy, dung dịch rửa tạp thích hợp cho cột chiết Oasis HLB là 7 % methanol trong nước

(2,0)

88,6 (7,5)

97,5 (1,0)

96,7 (5,2)

100,1 (3,8)

93,2 (2,4)

Thiodicarb 157,6 99,6

(1,5)

80,0 (8,1)

99,2 (1,4)

90,9 (2,5)

103,4 (2,4)

91,8 (7,8)

Chlotoluron 114,4 99,1

(1,4)

92,6 (8,9)

98,5 (2,3)

97,7 (4,5)

101,1 (3,1)

96,4 (3,6)

Isoproturon 120,8 104,0

(0,80)

94,9 (12)

101,8 (2,6)

98,5 (4,6)

105,1 (4,9)

96,1 (4,4)

(0,80)

89,4 (7,4)

98,2 (1,8)

96,0 (4,2)

101,5 (3,5)

96,6 (3,0)

Bảng 2 5: Kết quả khảo sát tỉ lệ methanol trong dung dịch rửa tạp

(3,7)

98,5 (1,2)

91,4 (6,2)

102,6 (2,5)

71,2 (1,2)

90,7 (1,0)

(3,6)

83,1 (0,50)

78,9 (3,7)

87,9 (5,4)

62,1 (7,5)

77,3 (6,4)

Chlotoluron 14,3 100,8

(2,5)

92,1 (1,9)

88,2 (5,5)

94,8 (3,4)

72,9 (2,6)

85,1 (1,6)

Isoproturon 15,1 99,7

(5,2)

90,1 (1,6)

88,7 (3,5)

93,1 (0,90)

71,5 (0,70)

81,9 (2,5)

(1,9)

91,6 (3,1)

87,5 (5,6)

94,3 (1,4)

70,2 (1,4)

84,0 (5,7)

*Do hóa chất chưa về kịp nên ban đầu chúng tôi chỉ khảo sát trên 5 chất BVTV phân cực

Các thể tích dung dịch mẫu qua cột chiết pha rắn cũng được khảo sát và trình bày chi tiết trong khóa luận tốt nghiệp của Lê Thị Hồng Tân [33] Thể tích này càng lớn thì hệ số làm giàu mẫu càng lớn, giúp hạ thấp giới hạn phát hiện Tuy nhiên, thể tích mẫu quá lớn sẽ làm tắt nghẽn cột chiết, chất phân tích có thể bị kéo ra khỏi cột chiết theo dung môi hòa tan mẫu [34] nên chúng tôi

cố định 200 mL mẫu tải qua cột chiết pha rắn Mục tiêu của đề tài là đi đến phát triển bộ lấy mẫu thụ động POCIS cho các chất BVTV phân cực với chất hấp thu là Oasis HLB nên chúng tôi sử

dụng quy trình chiết trên cột SPE – Oasis HLB cho các khảo sát tiếp theo (Hình 2.4)