Gần đây, các nhà khoa học nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp terpene ở loài cà chua Solanum lycopersicum có bộ gene vừa được giải mã hoàn toàn đã công bố sự hiện diện của các gene T
Trang 1trans-như geranyl diphosphate (GPP, C10), farnesyl diphosphate (FPP, C15), geranylgeranyl diphosphate
(GGPP, C20) Các trans-prenyldiphosphate trên được chuyển hóa thành monoterpene, sesquiterpene
và diterpene tương ứng bởi các enzyme thuộc họ terpene synthase (TPS)
Gần đây, các nhà khoa học nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp terpene ở loài cà chua
Solanum lycopersicum có bộ gene vừa được giải mã hoàn toàn đã công bố sự hiện diện của các gene
TPS phân bố ở đầu NST 8 bao gồm TPS19, 20 và 21 mã hóa cho các TPS có trình tự protein rất tương
tự nhau (hơn 95%) và đều là những terpene synthase sử dụng các cis-prenyldiphosphate thay vì
trans-prenyldiphosphate làm cơ chất chính Kề cận với ba gene TPS ở đầu NST 8 này còn có hai gene mã
hóa enzyme thuộc họ cis-prenyltransferase (CPT) bao gồm CPT1 mã hóa enzyme neryl diphosphate synthase có khả năng xúc tác tổng hợp NPP (đồng phân cấu hình cis của GPP) và CPT2 mã hóa enzyme nerylneryl diphosphate synthase có khả năng xúc tác tổng hợp NNPP (đồng phân cấu hình cis của GGPP) từ DMAPP và IPP Những nghiên cứu sơ bộ về hoạt tính enzyme in vitro của TPS19,
TPS20 và TPS21 đã đề nghị rằng cả hai enzyme TPS19 và TPS20 đều sử dụng NPP thay vì GPP làm
cơ chất chính để tổng hợp các monoterpene, còn TPS21 sử dụng NNPP thay vì GGPP làm cơ chất chính để tổng hợp diterpene
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát sự biểu hiện tái tổ hợp của các protein TPS19,
TPS20 và TPS21 trong tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3) Bởi vì các cơ chất cis-prenyldiphosphate
mà những terpene synthase này sử dụng không sẵn có trong vi khuẩn E coli, chúng tôi đã biểu hiện đồng thời trong E coli BL21(DE3) mỗi TPS này cùng với một enzyme họ cis-prenyltransferase mà có khả năng tổng hợp cơ chất cis-prenyldiphosphate tương ứng cho enzyme TPS Cụ thể, khi biểu hiện đồng thời cDNA mã hóa CPT1 và TPS19 hoặc CPT1 và TPS20 trong E coli BL21(DE3), enzyme
CPT1 đã tổng hợp NPP từ cơ chất nội sinh IPP và DMAPP có trong tế bào chủ, đồng thời enzyme TPS19 đã sử dụng NPP sinh ra làm cơ chất để tổng hợp β-ocimene trong khi TPS20 đã chuyển hóa
NPP thành β-phellandrene Khi biểu hiện đồng thời CPT2 và TPS21 trong E coli BL21(DE3), chúng
tôi ghi nhận có sự hiện diện của một diterpene, được dự đoán là lycosantalene dựa theo thông tin khối phổ của nó và hợp chất này không được phát hiện trong dịch tế bào vi khuẩn chỉ biểu hiện TPS21
Các kết quả của đề tài là tiền đề để tiếp tục nghiên cứu cải biến con đường sinh tổng hợp
terpenoid ở vi sinh vật thông qua cơ chất mới cis-prenyldiphosphate Những kết quả nghiên cứu của
đề tài đã được nhóm nghiên cứu công bố trong hai bài báo được đăng trên Tạp chí Sinh học và Tạp chí Công nghệ sinh học Ở khía cạnh đào tạo, các nội dung thuộc đề tài nghiên cứu đã được triển khai trong đề tài khóa luận tốt nghiệp đại học của sinh viên Phạm Lê Hoàng Yến (tốt nghiệp Cử nhân Sinh học tháng 11/2015) và đề tài luận án Thạc sĩ Chuyên ngành CNSH của Học viên Cao học La Ngọc Thùy Vân (K24)
Trang 2
ABSTRACT
Terpenoids are a structurally diverse group of natural products All terpenoids are synthesized from C5–units isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP) A head-to-tail
addition of IPP units to DMAPP by various prenyltransferases yields prenyldiphosphates with longer
hydrocarbon chains such as geranyl diphosphate (GPP, C10), farnesyl diphosphate (FPP, C15),
geranylgeranyl diphosphate GGPP (C20) These trans-prenyldiphosphates are subsequently converted
to monoterpenes, sesquiterpenes and diterpenes by terpene synthases (TPS)
Most TPSs use trans-prenyldiphosphates as their precursors Recent studies on terpene biosynthesis in the cultivated tomato Solanum lycopersicum identified a cluster of TPS genes at the tip
of chromosome 8 including TPS19, 20 and 21 that specify the synthesis of monoterpenes and diterpenes from cis-prenyldiphosphates, substrates that are synthesized by enzymes encoded by cis- prenyl transferase (CPT) genes also located within the same cluster Two of the TPS genes, TPS19 and TPS20, were shown to encode monoterpene synthases that use NPP, the product of CPT1 (= neryl diphosphate synthase 1, or NDPS1) The third functional TPS gene in this cluster, TPS21, was shown
to encode a protein that in vitro uses NNPP to produce a previously unknown diterpene that was
subsequently structurally characterized and named lycosantalene NNPP is the product of the second CPT, CPT2, that is present in the gene cluster on chromosome 8
In this study, we examined the expression of recombinant proteins including TPS19, TPS20
and TPS21 in E coli BL21(DE3) cells As the E coli cells are not capable of providing the required substrate for the cis-prenyldiphosphate-utilizing TPS enzymes, we expressed each of the TPS along with a plasmid that overexpresses a suitable cis-prenyltransferase Introduction of CPT1 into the
E.coli cells led to the production of a functional neryl diphosphate synthase, which catalyzes the in vivo synthesis of neryl diphosphate (NPP) from endogenous isoprenoid precursors, IPP and DMAPP,
and therefore generated a new pool of NPP substrate for TPS19 and TPS20 enzymes Characterization
of functional coexpression of CPT1 and either TPS19 or TPS20 in E coli BL21(DE3) for the in vivo
synthesis of monoterpenes from newly identified substrate NPP revealed that both TPS19 and TPS20 could synthesize monoterpenes from NPP, the substrate that is synthesized by the CPT1 Coexpression of CPT1 and TPS20 led to a significant increase in levels of β-phellandrene produced compared to expression of only TPS20 while coexpression of CPT1 and TPS19 resulted only in a modest increase in levels of β-ocimene compared to expression of TPS19 Functional coexpression of
CPT2 and TPS21 in E coli BL21(DE3) led to the formation of a diterpene that was predicted to be a
lycosantalene based on its mass spectra
The results of the project could form a basis for future studies on metabolic engineering of the
terpenoid biosynthetic pathway from the newly identified substrates, cis-prenyldiphosphates The
results of the research project have been published in two papers in Journal of Biology and Journal of Biotechnology The project also makes significant contribution to education The content of the project has primarily been implemented in the undergraduate thesis of Pham Le Hoang Yen, who graduated in 11/2015, and the master thesis of La Ngoc Thuy Van
Trang 3DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALT2 Acyl-lipid thioesterase 2
FPP Farnesyl pyrophosphate (farnesyl diphosphate)
GC-FID Gas chromatography - flame ionization detector
GGPP Geranylgeranyl pyrophosphate
HEPES 4-(2-hydroyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
IPP Isopentenyl pyrophosphate (isopentenyl diphosphate)
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
MEP 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate
MEV (MVA) Mevalonic acid
NNPP Nerylneryl pyrophosphate (nerylneryl diphosphate)
NPP Neryl pyrophosphate (neryl diphosphate)
NTA Nitrilotriacetic acid
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Trang 4Hình 7: Kết quả kiểm tra kích thước plasmid pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI 23
Hình 8: Kết quả giải trình tự CPT1 trên plasmid pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI với mồi M13
Forward 24
Hình 9: Kết quả sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10/ pACYCDuet-1-CPT1 bằng PCR
khuẩnlạc 24
Hình 10: Kết quả kiểm tra kích thước plasmid pACYCDuet-1-CPT1 24
Hình 11: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein CPT1 bằng phương pháp điện di SDS-PAGE (vạch nhuộm được đóng khung tương ứng với protein CPT1) 25
Hình 12: Sắc ký đồ mô tả sự hiện diện của nerol khi thủy phân dịch chiết tế bào E coli
BL21(DE3) biểu hiện tái tổ hợp CPT1 với alkaline phosphatase 26
Hình 13: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein từ dịch chiết tế bào vi khuẩn E coli BL21
(DE3) mang plasmid pACYCDuet-1-CPT1 và pEXP5-NT-TOPO-TPS19 27
Hình 14: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein từ dịch chiết tế bào vi khuẩn E coli BL21
(DE3) mang plasmid pACYCDuet-1-CPT1 và pEXP5-NT-TOPO-TPS20 28
Trang 5Hình 15: Sắc ký đồ mô tả kết quả phân tích thành phần monoterpene trong dịch chiết hexane bằng kỹ thuật sắc ký khí 30
Hình 16: Con đường sinh tổng hợp monoterpene từ IPP và DMAPP trong tế bào E coli
BL21(DE3) được biến nạp vector mang trình tự mã hóa CPT1 (pACYCDuet-1-CPT1) và vector mang trình tự mã hóa TPS20 (pEXP5-CT-TOPO-TPS20) 31
Hình 17: Kết quả phản ứng PCR khuếch đại đoạn trình tự mã hóa CPT2 32
Hình 18: Kết quả sàng lọc dòng tế bào E coli TOP10/pACYCDuet-1-CPT2 bằng PCR khuẩn
Hình 22: Con đường sinh tổng hợp NNPP từ IPP và DMAPP trong tế bào E coli BL21(DE3)
được biến nạp vector mang trình tự mã hóa CPT2 (pACYCDuet-1-CPT2) và vector mang trình tự mã hóa TPS21 (pEXP5-CT-TOPO-TPS21) 35
Trang 6LỜI CẢM ƠN
Đề tài nghiên cứu này được thực hiện tại Bộ môn Sinh hóa – Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM Nhóm thực hiện đề tài chân thành cảm ơn Phòng Khoa học – Công nghệ, Phòng Kế hoạch – Tài chính, Ban Chủ nhiệm Khoa, Bộ môn Sinh hóa
đã quan tâm và hỗ trợ nhóm nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài
Nhóm nghiên cứu cũng cảm ơn PTN Phân tích trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã hỗ trợ phân tích mẫu bằng kỹ thuật sắc ký khí GC-FID Đặc biệt, chúng tôi chân thành cảm ơn Giáo sư Eran Pichersky (Đại học Michigan, Hoa Kỳ) đã cung cấp nguồn gene được sử dụng trong nghiên cứu này
Trang 7Chương I - TỔNG QUAN
Terpenoid bao gồm terpene và dẫn xuất của chúng là nhóm hợp chất thứ cấp đa dạng về mặt cấu trúc, được hình thành từ những đơn vị 5 nguyên tử carbon là isopentenyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) thông qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) thường gặp ở vi khuẩn và lạp thể (plastid) của thực vật hoặc con đường mevalonate (MEV) diễn ra ở tế bào chất (cytosol) của các sinh vật có nhân thực (eukaryote) 4 Sự kết hợp đầu-đuôi (head-
to-tail) giữa IPP và DMAPP dưới sự xúc tác của các enzyme trans-prenyltransferase tạo ra các chất trung gian trans-prenyldiphosphate có số nguyên tử carbon lớn hơn như geranyl diphosphate (GPP,
C10), farnesyl diphosphate (FPP, C15), geranylgeranyl diphosphate (GGPP, C20)2 Các
trans-prenyldiphosphate trên được chuyển hóa thành monoterpene, sesquiterpene và diterpene tương ứng bởi các enzyme thuộc họ terpene synthase (TPS)
Ở thực vật, đa số các enzyme họ terpene synthase (TPS) xúc tác phản ứng chuyển hóa các cơ
chất trans-prenyldiphosphate thành các terpene và dẫn xuất của terpene Gần đây, vài nghiên cứu đã cho thấy một số terpene synthase sử dụng cis-prenyldiphosphate thay vì trans-prenyldiphosphate làm
cơ chất Cụ thể, những nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp terpene ở loài cà chua Solanum
lycopersicum có bộ gene vừa được giải mã hoàn toàn đã công bố sự hiện diện của các gene TPS phân
bố ở đầu NST 8 bao gồm TPS19, 20 và 21 mã hóa cho các TPS có trình tự protein rất tương tự nhau
và đều là những terpene synthase sử dụng các cis-prenyldiphosphate làm cơ chất chính 5 Ở loài cà
chua S lycopersicum, β-phellandrene synthase 1 (PHS1), được mã hóa bởi gene TPS20, sử dụng chủ
yếu cơ chất NPP để tổng hợp β-phellandrene Enzyme monoterpene synthase 19, được mã hóa bởi
gene TPS19, xúc tác sự tạo thành hai monoterpene β-myrcene và β-ocimene với tỷ lệ khác nhau tùy
theo cơ chất enzyme sử dụng là NPP hay GPP 5 Kết quả phân tích những thông số động học của
enzyme TPS19 tinh sạch được tổng hợp từ E coli cho thấy rằng giá trị Km và Kcat của TPS19 đối với NPP lần lượt là 29.6 µM và 1.30 s-1 trong khi giá trị Km của enzyme này đối với GPP quá cao để có thể được xác định bằng thực nghiệm Nói cách khác, đối với TPS19, NPP là cơ chất được sử dụng ưu thế hơn GPP 5 Enzyme terpene synthase 21, được mã hóa bởi gene TPS21 có trình tự nucleotide tương đồng hơn 95% với trình tự gene TPS19 hoặc TPS20, sử dụng NNPP làm cơ chất chính để tổng
hợp diterpene lycosatalene 6
Song song với việc phát hiện các gene mã hóa enzyme terpene synthase sử dụng prenyldiphosphate thay vì trans-prenyldiphosphate làm cơ chất cho sự sinh tổng hợp terpenoid ở một
cis-số loài thực vật, các nhà khoa học cũng đã xác định được các gene mã hóa enzyme có khả năng tổng
hợp các cis-prenyldiphosphate trên Cụ thể, gene mã hóa enzyme cis,cis-farnesyl diphosphate synthase xúc tác tổng hợp (Z,Z)–FPP đã được xác định ở cả loài cà chua hoang dại S habrochaites 9 và cà chua
thuần hóa S lycopersicum 1 Các nhà khoa học cũng đã xác định được ở loài cà chua thuần hóa S
Trang 8lycopersicum sự hiện diện của gene mã hóa enzyme neryl diphosphate synthase (NDPS) hay còn gọi
là cis-prenyltransferase 1 (CPT1) có khả năng tổng hợp NPP, đồng phân cấu hình cis của GPP và gene
mã hóa enzyme nerylneryl diphosphate synthase hay còn gọi là cis-prenyltransferase 2 (CPT2), có khả năng xúc tác phản ứng tạo cơ chất nerylneryl diphosphate (NNPP), đồng phân cấu hình cis của
GGPP1, 10 Cả hai gene CPT1 và CPT2 đều phân bố ở đầu NST 8 của cà chua Solanum lycopersicum, gần kề với ba gene TPS19, 20 và 21 3
Terpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên đa dạng về mặt cấu trúc và có nhiều ứng dụng trong đời sống hàng ngày của con người Từ lâu, terpene và các dẫn xuất của chúng đã được con người sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau: làm thuốc, làm gia vị, làm hương liệu và gần đây được quan tâm như
là nguồn nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học Phần lớn các hợp chất terpenoid chỉ được tìm thấy ở một số loài với số lượng hạn chế và trong những điều kiện nhất định, khiến cho nguồn cung cấp thường không chắc chắn và không đủ đáp ứng nhu cầu dẫn đến giá thành cao và dễ biến động 7 Do
đó, việc sử dụng hệ thống vi khuẩn biểu hiện gene tái tổ hợp để tổng hợp các loại terpenoid khác nhau
có thể được xem là một giải pháp bổ sung hoặc thay thế Sự khám phá ra các gene có vai trò trong sự
sinh tổng hợp terpene thông qua cơ chất cis-prenyldiphosphate ở cà chua Solanum lycopersicum và
một số loài thực vật khác gần đây đã khơi mào cho những nghiên cứu sử dụng con đường sinh tổng
hợp các terpene từ nguồn cơ chất mới là neryl diphosphate (NPP), (2z,6z)-farnesyl diphosphate ((2z,6z)-FPP), nerylneryl diphosphate (NNPP) thông qua cải biến con đường trao đổi chất ở vi sinh
vật Tuy nhiên, sự biểu hiện vượt mức của các gene mã hóa enzyme terpene synthase này trong các hệ thống vi sinh vật vẫn không đủ để quá trình sinh tổng hợp terpenoid diễn ra do sự vắng mặt hoặc sự hiện diện hạn chế của các cơ chất trong tế vào vi sinh vật biểu hiện Cho đến nay, chưa có nghiên cứu
nào cho thấy E coli có khả năng tích lũy các cơ chất cis-prenyldiphosphate Vì vậy, việc tạo ra và sử dụng chủng vi khuẩn E.coli biểu hiện vượt mức enzyme CPT1 có khả năng tổng hợp NPP – cơ chất chính của TPS19 và TPS20 và chủng vi khuẩn E.coli biểu hiện vượt mức enzyme CPT2 có khả năng tổng hợp NNPP – cơ chất chính của TPS21 là cần thiết để khảo sát hoạt tính enzyme in vitro của các
enzyme TPS được đề cập đến trong nghiên cứu này
Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu hoạt tính enzyme in vivo của TPS19, TPS20 và TPS21 trong hệ thống biểu hiện E coli, làm cơ sở để mở rộng các nghiên cứu cải biến con đường sinh tổng hợp terpene và các dẫn xuất terpene từ các cơ chất mới cis-prenyldiphosphate (thay vì từ các cơ chất
trans-prenyldiphosphate) trong hệ thống biểu hiện vi khuẩn E coli
Chương II - VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
II.1 Vật liệu nghiên cứu
Vector biểu hiện pACYCDuet-1 mang gene kháng Chloramphenicol thuộc hệ thống vector Duet (Novagen)
Trang 9Plasmid mang cDNA mã hóa terpene synthase 19 (pEXP5-NT-TOPO-TPS19), TPS20 (pEXP5-NT-TOPO-TPS20) và TPS21 (pEXP5-NT-TOPO-TPS21) Các gene TPS19, TPS20 và
TPS21 đã được phân lập từ loài cà chua Solanum lycopersicum và được tối ưu hóa khả năng mã
(codon usage) cho sự biểu hiện trong E coli
Plasmid pGEM-T-CPT1 mang cDNA mã hóa cis-prenyltransferase 1 (CPT1) hoàn chỉnh và plasmid pGEM-T-CPT2 mang cDNA mã hóa cis-prenyltransferase 2 (CPT2) hoàn chỉnh được phân lập từ cà chua Solanum lycopersicum
Chủng vi khuẩn E coli TOP10 (Invitrogen) được dùng cho nhân bản plasmid và chủng E coli
BL21 (DE3) (Invitrogen) được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp với sự cảm ứng của IPTG
II.2 Phương pháp nghiên cứu
Hình 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
II.2.1 Phương pháp khảo sát sự biểu hiện tái tổ hợp của các gene TPS phân bố ở đầu NST
8 của cà chua Solanum lycopersicum trong E coli C41(DE3) (Nội dung 1)
II.2.1.1 Biến nạp plasmid mang gene TPS19, TPS20, TP21 vào E coli C41(DE3)
Gene TPS19, TPS20 và TPS21 phân lập được từ cây cà chua Solanum lycopersicum đã được tối ưu hóa khả năng mã (codon usage) cho sự biểu hiện trong tế bào chủ E.coli đã được tạo dòng vào
Trang 10vector biểu hiện pEXP5-NT/TOPO có gắn His-tag ở đầu N Các plasmid mang gene TPS được biến
nạp vào dòng tế bào vi khuẩn E coli C41 (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt
II.2.1.2 Biểu hiện protein tái tổ hợp TPS19/ TPS20 / TPS21 trong E coli C41(DE3)
Một khuẩn lạc E coli C41 (DE3) đã được biến nạp plasmid pEXP5-NT/TOPO-TPS (19, 20,
21) được cho vào 1 ml môi trường LB 100 µg/mL ampicillin, nuôi lắc ở 37oC qua đêm 1 ml dịch nuôi cấy trên được cấy chuyền vào 50 ml môi trường LB chứa 100 µg/mL ampicillin và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 37oC cho tới khi đạt giá trị OD từ 0.6 đến 1 thì cảm ứng sự biểu hiện của protein tái tổ hợp với 0.4mM IPTG tại 20oC trong 16 giờ
II.2.1.3 Tinh sạch các protein enzyme được mã hóa bởi các gene TPS19, 20 và 21
50 ml dịch nuôi cấy trên được ly tâm và phần tủa thu được chứa tế bào vi khuẩn E coli
C41(DE3) biểu hiện TPS19/ TPS20/ TPS21 Tủa được huyền phù trong 1 ml dung dịch đệm A chứa 20mM HEPES pH 7.5, 300mM KCl, 10mM Imidazole, 5mM DTT và 5% glycerol Dịch huyền phù tế bào vi khuẩn được xử lý với sóng siêu âm để phá vỡ màng tế bào Tiến hành ly tâm dịch tế bào thu được sau xử lý với sóng siêu âm: phần dung dịch nổi bên trên chứa protein hòa tan được ủ với 125 µl
Ni2+ agarose tại 4oC trong 1 giờ, sau đó được cho qua cột Rửa cột với 12ml (4ml x 3 lần) dung dịch đệm rửa (20mM HEPES pH 7.5, 300mM KCl, 20mM Imidazole, 5mM DTT và 5% glycerol) Chỉ
protein TPS19/ TPS20/ TPS21 có gắn His được giữ lại trong cột Ni2+ agarose do gắn kết với Ni2+ và sau đó được thôi ra khỏi cột bằng 1.5ml (300µl x 5 lần) dung dịch rửa giải (20mM HEPES pH 7.5, 300mM KCl, 300mM Imidazole, 5mM DTT và 5% glycerol) Mẫu protein thu được sau bước thôi giải được điện di song song với thang chuẩn để xác định sự hiện diện của protein TPS
II.2.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme in vivo của các protein được mã hóa bởi gene TPS19 và TPS20 trong tế bào vi khuẩn E coli (Nội dung 2)
II.2.2.1 Phương pháp PCR khuếch đại trình tự mã hóa cis-prenyltransferase 1 (CPT1) không bao gồm đoạn peptide tín hiệu ở đầu N
Phương pháp PCR được sử dụng để tổng hợp đoạn DNA mã hóa protein CPT1 không bao gồm
đoạn peptide tín hiệu ở đầu N (transit peptide) và có gắn thêm trình tự cắt giới hạn NdeI ở đầu 5’ và
XhoI ở đầu 3’ (được gọi tắt là đoạn NdeI-CPT1-XhoI) Trình tự mã hóa CPT1 không bao gồm đoạn
peptide tín hiệu được khuếch đại bằng enzyme Phusion DNA Polymerase (Thermo Scientific) từ khuôn là plasmid pGEM-T-flCPT1 mang cDNA mã hóa protein CPT1 hoàn chỉnh từ loài cà chua
Solanum lycopersicum Mồi xuôi (NdeI-CPT1-F: 5’-CATATGTCTGCTCGTGGACTCA-3’) và mồi
ngược (CPT1-XhoI-R: 5’-CTCGAGTCAATATGTGTGTCCAC-3’) được thiết kế có gắn thêm trình
tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn NdeI và XhoI nhằm hỗ trợ việc chèn đoạn gene CPT1 vào vùng
MCS2 của vector pACYCDuet-1 ở các bước sau Chi tiết chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch
đại CPT1 như sau: 98oC/30 giây; 35 x (98oC/10 giây, 58oC/20 giây, 72oC/35 giây); 72oC/5 phút;
Trang 114oC/∞ Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1 % và được tinh sạch bằng bộ kit ScientificGeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific)
II.2.2.2 Phương pháp tạo dòng đoạn NdeI-CPT1-XhoI vào vector pGEM-T
Để thu nhận hiệu quả đoạn NdeI-CPT1-XhoI có hai đầu so le cần cho bước tạo dòng vào vector biểu hiện pACYCDuet-1, đoạn NdeI-CPT1-XhoI được tạo dòng vào vector pGEM-T
(Promega) trước
Đoạn NdeI-CPT1-XhoI được gắn thêm adenine vào đầu 5’ của mỗi mạch thông qua phản ứng
A-tailing được xúc tác bởi Taq Polymerase (New England BioLabs) và được chèn vào vector
pGEM-T thông qua phản ứng nối được xúc tác bởi enzyme pGEM-T4 DNA ligase tạo plasmid pGEM-pGEM-T-NdeI-CPpGEM-T1-
pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào tế bào khả nạp E coli TOP10 bằng phương pháp sốc
nhiệt Các thể biến nạp E coli TOP10/pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI được sàng lọc bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi NdeI-CPT1-F và CPT1-XhoI-R
Sau quá trình sàng lọc, dòng tế bào E coli TOP10 mang plasmid pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI
được nhân sinh khối và tách chiết plasmid bằng bộ kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo
Scientific) Plasmid sau khi tách chiết được cắt bằng enzyme cắt giới hạn XhoI và được điện di song
song với thang DNA chuẩn 1 kb trên gel agarose 1 % để kiểm tra kích thước Vùng trình tự mã hóa
CPT1 không bao gồm đoạn peptide tín hiệu trên pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI được giải mã với mồi
M13 Forward để so sánh với trình tự CPT1 đã biết và phát hiện các đột biến điểm có thể xảy ra trong quá trình tạo dòng
II.2.2.3 Phương pháp tạo dòng trình tự mã hóa CPT1 không bao gồm đoạn peptide tín hiệu vào vector pACYCDuet-1
Plasmid pGEM-T-NdeI-CPT1-XhoI được cắt bởi hai enzyme cắt giới hạn NdeI và XhoI và sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1 % Đoạn NdeI-CPT1-XhoI tương ứng với trình tự mã hóa
CPT1 không bao gồm đoạn peptide tín hiệu và có hai đầu so le được thu hồi và tinh sạch từ gel
agarose, sau đó được nối với vector pACYCDuet-1 đã được cắt mở vòng tạo đầu so le với NdeI và
XhoI Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào tế bào khả nạp E coli TOP10 Dòng tế bào E coli
TOP10 mang plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được sàng lọc thông qua phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi DuetUp2 và CPT1-R-XhoI, với chu trình nhiệt 98oC/30 giây; 35 x (98oC/10 giây, 55oC/20 giây, 72oC/35 giây); 72oC/5 phút; 4oC/∞ Dòng tế bào E coli TOP10/pACYCDuet-1-CPT1 được nuôi nhân sinh khối và plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được tách chiết Plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được cắt mở vòng với enzyme XhoI và được điện di song song với thang DNA chuẩn 1 kb trên gel agarose
1% để kiểm tra kích thước
II.2.2.4 Kiểm tra sự biểu hiện của protein CPT1 bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Trang 12Tế bào mang plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 14–16 giờ
ở 37oC trong môi trường LB lỏng có bổ sung 34 µg/µl chloramphenicol đến khi OD600 đạt giá trị 0,8 thì tiếp tục cảm ứng với 0,4 mM IPTG và nuôi lắc ở điều kiện 37oC hoặc 20oC trong 16 giờ
10 ml dịch môi trường nuôi cấy E coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CPT1 có cảm ứng với
IPTG được ly tâm thu sinh khối Hòa tan sinh khối trong 500 μL đệm ly giải (100 mM NaCl; 10 mM Tris; 1 mM EDTA; 10% glycerol; pH 8) và phá vỡ màng tế bào bằng sóng siêu âm Dịch sau khi phá màng tế bào được chia làm hai phần: phần 1 (100 μL) được sử dụng làm dịch protein tổng số, phần 2 (300 μL) được ly tâm Sau khi ly tâm, phần dịch nổi chứa protein tan, còn phần tủa chứa các protein không tan được huyền phù lại trong 300 μL đệm ly giải Tiến hành điện di SDS-PAGE dung dịch chứa protein tổng số, protein tan, và protein không tan để phân tích sự biểu hiện của CPT1 trong tế
bào E coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CPT1 Thí nghiệm đối chứng được thực hiện tương tự với dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CPT1 không được cảm ứng với
IPTG
II.2.2.5 Phương pháp xác định NPP gián tiếp thông qua sự thủy phân với alkaline phosphatase
Tế bào mang plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 14–16 giờ
ở 37oC trong môi trường LB lỏng có bổ sung 34 µg/µl chloramphenicol đến khi OD600 đạt giá trị 0,8 thì tiếp tục cảm ứng với 0,4 mM IPTG và nuôi lắc ở điều kiện 20oC trong 16 giờ Ly tâm 20 ml dịch nuôi cấy biểu hiện CPT1 với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút và thu tủa Rửa tủa hai lần bằng 1,5ml đệm FastAP (10 mM Tris-HCl pH 8; 5 mM MgCl2; 0,1 M KCl; 0,02% Triton X-100; 0,1 mg/ml BSA), sau đó phá màng tế bào bằng sóng siêu âm trong 1,5 ml đệm FastAP Dịch sau khi phá màng tế bào được ly tâm 15000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận dịch nổi chứa thành phần protein tan và ủ với enzyme alkaline phosphatase (Thermo Scientific) ở 37oC trong 1 giờ Phản ứng được thực hiện trong ống thủy tinh (vial) nhỏ và kín để sản phẩm dễ bay hơi được tạo ra trong phản ứng thủy phân không bị thất thoát
II.2.2.6 Phương pháp đồng biểu hiện CPT1 và TPS trong E coli BL21(DE3)
Plasmid pACYCDuet-1-CPT1 được biến nạp vào tế bào khả nạp E coli BL21(DE3) bằng
phương pháp sốc nhiệt Sau đó, plasmid pEXP5-NT-TOPO-TPS19 được biến nạp vào tế bào khả nạp
E coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1-CPT1 Tế bào mang hai plasmid pACYCDuet-1-CPT1 và
pEXP5-NT-TOPO-TPS19 được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, thời gian 14 – 16 giờ ở 37oC trong môi trường
LB lỏng có bổ sung 100 µg/µl ampicillin và 34 µg/µl chloramphenicol đến khi OD600 đạt giá trị 0,8 thì tiếp tục bổ sung 0,4 mM IPTG và nuôi lắc ở nhiệt độ 20oC trong 16 giờ để cảm ứng sự biểu hiện
protein Dịch nuôi cấy tế bào E coli BL21(DE3) chỉ biểu hiện CPT1 hoặc chỉ biểu hiện TPS19/
TPS20 được sử dụng làm đối chứng
Trang 13II.2.2.7 Phương pháp xác định thành phần các chất dễ bay hơi bằng kỹ thuật sắc ký khí (Gas Chromatography - GC)
Nerol sinh ra từ sự thủy phân NPP với alkaline phosphatase hoặc monoterpene sinh ra trong dịch nuôi cấy vi khuẩn được thu nhận bằng kỹ thuật chiết hexane và được phân tích bằng kỹ thuật sắc
ký khí Hệ thống GC Agilent 6890N được sử dụng với cột HP innowax có chiều dài 30 m x 250 µm x 0,25 µm (chịu nhiệt độ cao nhất là 250oC) và đầu dò FID Đối với phân tích nerol, chương trình nhiệt
độ chạy trong 20 phút như sau: nhiệt độ tiêm (giải hấp) 250oC, nhiệt độ đầu dò 250oC, nhiệt độ đầu
400C giữ trong 1 phút, tăng 15oC/1 phút đến 240oC, giữ trong 5 phút Đối với phân tích monoterpene, chương trình nhiệt độ chạy trong 31 phút như sau: nhiệt độ tiêm (giải hấp) 250oC, nhiệt độ đầu dò
250oC Nhiệt độ đầu 50oC, tăng 15oC/1 phút đến 180oC, tăng 5oC/ 1 phút đến 240oC giữ trong 10 phút
II.2.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme in vivo của protein được mã hóa bởi gene TPS21 (Nội dung 2)
Cách tiến hành tương tự như mô tả ở mục II.2.2 Tuy nhiên do nhóm nghiên cứu không có nguồn chất chuẩn tương ứng, nerylnerol sinh ra từ sự thủy phân với alkaline phosphatase của NNPP
có trong dịch protein hòa tan của tế bào E.coli chỉ biểu hiện CPT2 và lycosantalene sinh ra trong dịch
nuôi cấy vi khuẩn đồng biểu hiện CPT2 và TPS21 được phân tích bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS Hệ thống sắc ký GC17-A nối với QP5000 (Shimadzu) được sử dụng với cột HP-5MS có chiều dài 30 m x 250 µm x 0,25 µm Chương trình nhiệt độ như sau: nhiệt độ tiêm (giải hấp) 250oC, nhiệt độ đầu dò 280oC, nhiệt độ đầu 50oC giữ trong 2 phút, tăng 10oC/1 phút đến 275oC, giữ ở 275oC trong 10 phút
Trang 14Chương III - KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
III.1 Khảo sát sự biểu hiện tái tổ hợp của các gene TPS phân bố ở đầu NST 8 của cà chua
Solanum lycopersicum trong E coli C41(DE3) (Nội dung 1)
III.1.1 Biểu hiện và tinh sạch các protein enzyme được mã hóa bởi các gene TPS19, 20 và 21
Khả năng biểu hiện của các TPS ở dạng protein hòa tan trong điều kiện nuôi cấy và cảm ứng
đã được sử dụng trong nghiên cứu khảo sát hoạt tính enzyme in vitro của chúng 5 cần được khẳng định
lại trong nghiên cứu này nhằm có cơ sở để thiết kế các thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme in vivo của các protein TPS19, TPS20 và TPS21 trong hệ thống biểu hiện E.coli ở nội dung nghiên cứu 2 Kết
quả tinh sạch sơ bộ các protein TPS bằng phương pháp sắc ký ái lực thông qua cột Ni2+ agarose được
mô tả ở Hình 2, Hình 3 và Hình 4
Hình 2: Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein thu được từ tế bào vi khuẩn E coli biểu hiện gene TPS19
Giếng 1: Protein tổng số; Giếng 2: Protein hòa tan; Giếng 3: Dung dịch chứa protein hòa tan không gắn với Ni2+ được rửa
ra khỏi cột; Giếng 4: Thang protein chuẩn; Giếng 5-8: Dung dịch protein thu được sau thôi giải lần 1, 2, 3, 4
Trang 15Hình 3: Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein thu được từ tế bào vi khuẩn E coli biểu hiện gene TPS20
Giếng 1: Dung dịch chứa protein hòa tan không gắn với Ni2+ được rửa ra khỏi cột; Giếng 2: Protein tổng số; Giếng 3: Protein hòa tan; Giếng 4: Thang protein chuẩn; Giếng 5-8: Dung dịch protein thu được sau thôi giải lần 1, 2, 3, 4
Hình 4: Kết quả điện di SDS-PAGE các mẫu protein thu được từ tế bào vi khuẩn E coli biểu hiện gene TPS21
Giếng 1: Dung dịch chứa protein hòa tan không gắn với Ni2+ được rửa ra khỏi cột; Giếng 2-4: Các phân đoạn rửa lần 1, 2,
3; Giếng 5: Thang protein chuẩn; Giếng 6-10: Dung dịch protein thu được sau thôi giải lần 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy ở các phân đoạn thôi giải có sự hiện diện của vạch protein (vạch được chỉ ra bằng mũi tên trong Hình 2, Hình 3 và Hình 4) nằm giữa vạch 66.3 kDa và 97.4 kDa (Hình 2 và Hình 3) hoặc giữa vạch 70 kDa và 95 kDa (Hình 4) của thang chuẩn, phù hợp với kích thước được dự đoán của các protein TPS19 (85.9kDa), TPS20 (86kDa) và TPS21 (86,8 kDa)