Experimental research on CC14 induced liver cirrhosis treatment using stem cell therapy

- Tạo thành công chuột xơ gan sử dụng hóa chấtCCl4 - Thử nghiệm điều trị chuột xơ gan bằng cấy ghép tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người và tuỷ xương chuột theo các phác đồ ghép

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii

BÁO CÁO TÓM TẮT ix

MỞ ĐẦU x

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU LIÊN QUAN xii

ĐẾN ĐỀ TÀI xii

1.1 Giới thiệu về bệnh xơ gan 1

1.2 Dịch tễ học xơ gan 1

1.3 Nguyên nhân gây bệnh 2

1.4 Hậu quả 2

1.5 Biện pháp điều trị xơ gan hiện tại và các hạn chế 2

1.6 Mô hình chuột xơ gan do CCL4 3

1.7 Cơ sở lý thuyết của việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan 4

1.8 Nội dung nghiên cứu của đề tài 8

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Phương pháp thu nhận máu cuống rốn 13

2.3 Phương pháp thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn 14

2.4 Phương pháp phân lập tế bào gốc trung mô ứng viên 14

2.5 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô ứng viên 15

2.6 Thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc ứng viên từ tủy xương chuột 16

2.7 Các nguyên tắc xác định tế bào gốc trung mô ứng viên 17

2.8 Phương pháp xác định hình thái tế bào 18

2.9 Phương pháp colony assay 18 2.10 Phương pháp xác định tiềm năng biệt hóa- Biệt hóa thành tế bào tạo mỡ

18

2.11 Phương pháp nhuộm hóa tế bào bằng Oil Red 20

2.12 Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch 20

2.13 Phương pháp gây xơ gan chuột bằng CCl4 21

2.14 Đánh giá hoạt độ các men AST, ALT, trong huyết tương chuột 22

2.15 Đánh giá Bilirubin và albumin trong huyết tương chuột (theo hướng dẫn của NSX bộ kít) 23

2.16 Phương pháp đánh giá sự biểu hiện các gen liên quan đến sự xơ hóa (procollagen α1(I), fibronectin, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã) 23

2.17 Phương pháp đánh giá cấu trúc mô học gan 26

2.18 Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch 27

2.19 Phương pháp cấy ghép tế bào lên chuột xơ gan 28

2.20 Phương pháp đánh dấu huỳnh quang bằng GFP trên tế bào 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 30

3.1 Kết quả nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy và xác định đặcđiểm tế bào gốc 31

3.1.1 Kết quả thu nhận MSC máu cuống rốn 31

3.1.2 Thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương chuột 39

3.2 Kết quả nội dung 2: Xây dựng mô hình chuột xơ gan do CCl4 45

3.2.1 Kết quả khảo sát nồng độ CCL4 45

3.2.2 Kết quả tạo chuột xơ gan với quy trình và nồng độ đã được chuẩn hóa (1.0ml/kg) 50

a Kết quả so sánh mức độ biểu hiện gen bằng real time RT-PCR 51

3.3 Kết quả nội dung 3: Kết quả thử nghiệm cấy ghép tế bào gốc trên mô hình chuột xơ gan 58

3.3.1 Kết quả điều trị xơ gan gằng liệu phép BM-MSC 58

3.3.2 Kết quả điều trị xơ gan gằng liệu phép UCB 66

3.3.3 Kết quả đánh giá vai trò của tế bào ghép 74

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 79

Tài liệu tham khảo 81

TÓM TẮT

Trong các phương pháp điều trị bệnh suy thoái tế bào gan hay xơ gan hiện nay, phương pháp ghép tế bào và mô gan là hiệu quả nhất; tuy nhiên số lượng tế bào/mô gan cần cho cấy ghép ở người là khá lớn (dẫn đến tình trạng cung không đủ cầu), điều này dẫn tới sự thúc đẩy việc tìm kiếm các nguồn tế bào khác Việc cấy ghép tế bào gốc hoặc

tế bào tiền thân trong các nghiên cứu gần đây, so sánh với việc cấy ghép tế bào gan trưởng thành đã và đang được triển khai và thu nhận kết quả khả quan hơn Nghiên cứu

về vai trò của việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan là cần thiết và đầy hứa hẹn trong trị liệu xơ gan

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành gây tạo chuột xơ gan bằng hóa chất CCL4 và đánh giá hiệu quả điều trị xơ gan trên chuột của tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người và tủy xương chuột

Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau:

- Phân lập, nuôi cấy và đã đánh giá được các đặc điểm của tế bào gốc trung mô từ

máu cuống rốn người (MSC) Các tế bào sau khi thu nhận và nuôi cấy biểu hiện profile marker: CD14-/CD34-/CD45-/HLA-DR-/CD13+/CD44+/CD90+/CD166+ Các MSC sau nuôi cấy có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành xương và mỡ Các MSC hiện đang được lưu trữ tại PTN Tế bào gốc ở 2 dạng: 1 Trữ lạnh trong

Nitơ lỏng; 2 Nuôi cấy và duy trì trong điều kiện in vitro

- Phân lập, nuôi cấy và đã đánh giá được các đặc điểm của tế bào gốc trung mô từ

tủy xương chuột Các tế bào sau khi thu nhận và nuôi cấy biểu hiện marker bề mặt như sau: CD117-/CD34-/CD45-/ CD44+/CD90+/Sca-1+Các mMSC có khả năng tự làm mới và biệt hoàn thành xương và mỡ mMSC hiện được lưu trữ tại PTN Tế bào gốc ở 2 dạng: 1 Trữ lạnh trong Nitơ lỏng; 2 Nuôi cấy và duy trì trong điều

kiện in vitro

- Tạo thành công chuột xơ gan sử dụng hóa chấtCCl4

- Thử nghiệm điều trị chuột xơ gan bằng cấy ghép tế bào gốc trung mô từ máu

cuống rốn người và tuỷ xương chuột theo các phác đồ ghép khác nhau (tĩnh mạch cửa gan và tĩnh mạch đuôi) trên mô hình chuột xơ gan Kết quả ghi nhận cho thấy

sự cải thiện các chỉ tiêu chức năng gan như albumin, bilirubin, sự biểu hiện các

In this study, we generated cirrhosis miceusing CCl4 chemicals and evaluate the effectiveness of treatment in cirrhosis mice of umbilical cord blood and mouse bone marrow - derived mesenchymal stem cells

We have achieved some results follows:

- Isolation, culture and assess the characteristics of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood (MSC) The collected cells after culture and marker expression profile: CD14-/CD34-/CD45-/HLA-DR-/CD13 + / CD44 + / CD90 + / CD166 + The MSCs have capableb of self-renewal and differentiation into bone and fat The MSCs are currently stored stem cells in the laboratory in two forms: 1 Cryopreserved in liquid nitrogen; 2 Maintained in vitro conditions

- Isolation, culture and assess the characteristics of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow The collected cells have surface marker expression as follows: CD117-/CD34-/CD45- / CD44 + / CD90 + / Sca-1 + The mMSCsare capable of self-renewal and differentiation into bone and fat mMSCs are stored stem cells in the laboratory in two forms: 1 Cryopreserved in liquid nitrogen; 2 Maintained in vitro conditions

- Create cirrhotic mice successfully using chemical CCl4

- Evaluation effects of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood and bone marrow transplantation (hepatic portal vein and tail vein) in mouse model of liver fibrosis Results reported showed an improvement in liver function as albumin, bilirubin, the expression of the gene fibrosis and histological structure

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BM-MSC Tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương

CD Cluster of Differentiation

PAS Periodic acid-Schiff stain

Placebo-Po Đối chứng tiêm PBS và tĩnh mạch cửa gan

Placebo-Ta Đối chứng tiêm PBS vào tĩnh mạch đuôi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng chỉ số hoạt tính mô học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI) 9

Bảng 3.1 Các marker dùng để nhận diện TBG trung mô ứng viên 35 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá marker bề mặt của MSC ứng viên 43 Bảng 3 3 Phần trăm chuột sống (tỷ lệ sống) ở các liều CCl4 tại thời điểm tuần 0, tuần 8

45 Bảng 3 4 Giá trị men AST, ALT ở các lô thí nghiệm tại thời điểm tuần 0 và tuần 8 46 Bảng 3 5 Bảng kết quả mức độ viêm và xơ gan trên chuột (theo hệ thống tính điểm của

Knodell- Ishak index (Ishak Modified HAI) 50 Bảng 3 6 Bảng giá trị men AST, ALT, bilirubin và albumin tại thời điểm tuần 0 và tuần

11 51

Bảng 3 7 Mức độ viêm và xơ gan dựa trên đánh giá mô học theo thang điểm

Knodell-Ishak index (Knodell-Ishak Modified HAI) 62

Bảng 3 8 Chỉ tiêu sinh hóa chuột tiêm UCB 66 Bảng 3 9 Kết quả biểu hiện gen xơ hoá của chuột sau ghép UCB 68

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Hướng chiến lược điều trị bệnh gan bằng liệu pháp tế bào 3

Hình 2 1 Thao tác thu máu cuống rốn từ dây rốn 13

Hình 2 2 Thao tác cho chuột uống 22

Hình 2 3 Thao tác lấy máu chuột 23

Hình 2 4 Thao tác sinh thiết gan chuột 25

Hình 2 5 Tiểu thùy gan bình thường với 3 vùng tế bào 27

Hình 3 1 Thu nhận tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly tâm gradient tỷ trọng 31

Hình 3 2 Quần thể tế bào đơn nhân 31

Hình 3 3 Quần thể TBG trung mô ứng viên 32

Hình 3 4 Quần thể TBG trung mô ứng viên 32

Hình 3 5 Cụm TBG trung mô ứng viên hình thành 33

Hình 3 6 Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của TBG trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền 34

Hình 3 7 Tế bào đối chứng (a) và tế bào tạo mỡ sau 21 ngày cảm ứng (b) 38

Hình 3 8 Tế bào tạo mỡ được nhuộm với Oil red 39

Hình 3 9 (a) Tế bào vừa thu nhận từ tủy xương; (b) Quần thể tế bào sau 24 giờ nuôi cấy (Độ phóng đại 100 lần) 39

Hình 3 10 Tế bào tuỷ xương sau nuôi cấy 40

Hình 3 11 (a) Quần thể tế bào sau 8 ngày nuôi cấy; (b) Quần thể tế bào sau 15 ngày nuôi cấy ( Độ phóng đại 40 lần) 40

Hình 3 12 (a) Tế bào sau cấy chuyền 5 ngày; (b) Tế bào sau cấy chuyền 7 ngày (Độ phóng đại 100 lần) 41

Hình 3 13Một số kiểu hình tập đoàn của MSC khi nuôi cấy ở mật độ thấp (Độ phóng đại 100 lần và 40 lần) 42

Hình 3 14 Kết quả phân tích Flow cytometry của MSC ứng viên 43

Hình 3 15 Kết quả nhuộm Oil red 44

Hình 3 16 Biểu đồ so sánh khối lượng chuột 46

Hình 3 17 Biểu đồ so sánh hoạt độ men AST và ALT ở các lô thí nghiệm tại thời điểm tuần 0 và tuần 8 47

Hình 3 18 Cấu trúc đại thể của gan chuột sau 8 tuần 48

Hình 3 19 Kết quả nhuộm H&E cấu trúc vi thể ở các lô chuột tuần 8 49

Hình 3 20 Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện gen Fibronectin, Intergrin, Nt5e, Procollagen và TGF-B sau 8 tuần xử lý CCL4 52

Hình 3 21 Gan chuột bình thường 54

Hình 3 22 Gan chuột uống CCl4 sau 8 tuần 54

Hình 3 23 Gan chuột bình thường nhuộm Hematoxylin và Eosin 55

Hình 3 24 Cấu trúc vi thể mẫu gan xơ hóa 1/6 nhuộm Masson trichrome 56

Hình 3 25 Cấu trúc vi thể mẫu gan xơ hóa 2/6 nhuộm Masson trichrome 56

Hình 3 26 Cấu trúc vi thể mẫu gan xơ hóa 3/6 và 5/6 nhuộm Masson trichrome 57

Hình 3 27 Cấu trúc vi thể gan bệnh nhân xơ gan nhuộm Masson trichrome 57

Hình 3 28 Kết quả AST, ALT, Bilirubin và Albumin trên các nhóm thí nghiệm điều trị bằng BM-MSC 59

Hình 3 29 Kết quả thay đổi sự biểu hiện các gen xơ hoá trên các nhóm thí nghiệm điều trị bằng BM-MSC 60

Hình 3 30 Kết quả nhuộm HE và Trichrome trên các nhóm thí nghiệm điều trị bằng BM-MSC 61 Hình 3 31 Kết quả nhuộm collagen type 1 và α-SMA trên các nhóm thí nghiệm điều trị bằng BM-MSC 63 Hình 3 32 Kết quả thay đổi sự biểu hiện các gen xơ hoá trên các nhóm thí nghiệm điều trị bằng UCB 67 Hình 3 33 Cấu trúc mô học các nhóm chuột thí nghiệm được nhuộm H&E 69 Hình 3 34 Cấu trúc mô học các nhóm chuột thí nghiệm được nhuộm Masson's trichrome 70 Hình 3 35 Cấu trúc mô học các nhóm chuột thí nghiệm được nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể kháng collagen type 1 72 Hình 3 36 Cấu trúc mô học các nhóm chuột thí nghiệm được nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể kháng SMA-α 72 Hình 3 37 Các vùng mô phát sáng ở chuột được ghép tế bào 75 Hình 3 38 Tế bào ghép tồn tại trong mô gan phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang 76 Hình 3 39 Tế bào dương tính GFP, AAT, ALB trong mô gan chuột ghép tĩnh mạch đuôi 77 Hình 3 40 Tế bào dương tính GFP, AAT, ALB trong mô gan chuột ghép tĩnh mạch cửa gan 77 Hình 3 41 Tế bào sau khi ghép tồn tại ở gan và dương tính với hAFP, hAlb 78 Hình 3 42 Tế bào sau khi ghép tồn tại ở gan và dương tính với AAT a Tế bào dương tính với AAT, b Tế bào dương tính với GFP, c ghép chồng hình a và b (Hong Li và

cs 2010) 78

BÁO CÁO TÓM TẮT

MỞ ĐẦU

Gan là cơ quan có khả năng tái sinh nhưng trong các trường hợp tổn thương mạn tính khả năng tự tái tạo của gan không còn và sau đó dẫn đến tình trạng xơ hóa.Xơ gan là một bệnh nguy hiểm, tần suất cao, điều trị khó khăn.Việt Nam là nước có tỷ lệ viêm gan và xơ gan rất cao (~20%) so với nhiều nước trên Thế giới.Các biện pháp điều trị xơ gan hiện tại chưa thực sự mang lại kết quả như mong đợi.Hiện tại, phương pháp điều trị có hiệu quả cho xơ gan (xơ hóa gan) là cấy ghép gan.Ghép gan là một cách chữa trị hiệu quả cao cho

xơ gan giai đoạn cuối Ghép gan thường cần đến khi các biến chứng như bệnh não, cổ trướng hay giãn tĩnh mạch xuất huyết không thể kiểm soát được hoặc khi chức năng sinh hóa bị suy giảm nghiêm trọng Các chuyên gia sẽ xác định các nguy cơ và lợi ích của ghép gan cho từng bệnh nhân.Tỉ lệ tử vong đã được cải thiện hơn nhiều năm qua nhờ sử dụng các thuốc suy giảm miễn dịch và giữ cho gan được ghép vào không bị tấn công và tổn thương.Trung bình hơn 80% bệnh nhân được ghép gan có thể kéo dài cuộc sống sau năm năm.Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân cần ghép gan vượt xa số lượng gan hiến tặng.Một bệnh nhân cần ghép gan phải trải qua một quá trình đánh giá phức tạp trước khi được cho vào danh sách chờ ghép gan Nói chung, gan được ghép cho những bệnh nhân được tiên đoán có cơ hội sống sót dài nhất sau khi cấy ghép Sự sống sót sau khi ghép gan cần theo dõi chặt chẽ và kết hợp với sự chăm sóc chu đáo Mặc dù cấy ghép gan là liệu pháp tốt giúp kéo dài đời sống cho bệnh nhân, nhưng việc hiến tặng cơ quan là rào cản lớn nhất của liệu pháp.Số lượng bệnh nhân chờ ghép gan ngày càng tăng, trong khi

mô hiến tặng thì ngày một khan hiếm

Với các kiến thức nền tảng và chuyên sâu về tế bào gốc và y học tái tạo, các nhà khoa học có thể đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc trong tái tạo mô gan ở các bệnh nhân

xơ gan Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, có thể ghép tự thân, vượt qua rào cản về đạo lí

Việc phát triển liệu pháp mới ứng dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan là rất cấp thiết

và sẽ mở ra 1 hướng mới trong điều trị xơ gan nói riêng và các bệnh về thoái hoá tế bào nói chung Do đó, đề tài nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột xơ gan do CCl4 bằng liệu pháp tế bào gốc được đề xuất với các mục tiêu chính như sau:

Mục tiêu chung:

Nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột bệnh xơ gan bằng tế bào gốc

Mục tiêu cụ thể:

- Thu nhận được tế bào gốc người từ các nguồn mẫu: máu cuống rốn, tủy xương chuột

- Gây được tình trạng xơ gan trên chuột bằng CCl4

- Phân tích và đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm của tế bào gốc được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau (máu cuống rốn, tủy xương chuột) trên chuột bệnh xơ gan

theo các phác đồ khác nhau

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU LIÊN QUAN

ĐẾN ĐỀ TÀI

1.1 Giới thiệu về bệnh xơ gan

Xơ gan là một loại bệnh gan mãn tính Các kiểu xơ gan lần đầu tiên được giới thiệu bởi

Laennec năm 1826 Nó có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “scirrhus” và được sử dụng để mô

tả mẫu sinh thiết gan có bề mặt màu cam và hung nâu

Nhiều dạng tổn thương gan là dấu hiệu của xơ gan Sự xơ hóa được định nghĩa là sự tập trung quá mức của các thành phần mạng lưới ngoại bào (bao gồm collagens, glycoprotein, proteoglycans) trong gan Đáp ứng với sự tổn thương, gan vốn dĩ có khả năng tự sửa chữa và phục hồi tổn thương Nhưng trong hầu hết các trường hợp, xơ gan lại

là một quá trình không tự hồi phục được Việc điều trị chỉ có thể giúp giảm tiến trình bệnh và ngăn ngừa biến chứng

Xơ gan được định nghĩa mô học như một quá trình khuếch tán đặc trưng của gan xơ hóa và biến đổi cấu trúc gan bình thường thành các nốt cấu trúc bất thường Sự tiến triển của tổn thương gan đến xơ gan có thể xảy ra trong vài tuần tới vài năm Thật vậy, bệnh nhân bị viêm gan C có thể bị viêm gan mãn tính từ 40 năm trước khi tiến triển đến xơ gan Mối tương quan giữa những phát hiện mô học và triệu chứng lâm sàng lại tương đối không rõ ràng Một bệnh nhân xơ gan có thể hoàn toàn không có triệu chứng rõ ràng và sống lâu, trong khi ở bệnh nhân khác lại có nhiều triệu chứng nặng của bệnh gan giai đoạn cuối và thời gian sống rất ngắn Dấu hiệu thường gặp và triệu chứng thể hiện ở suy giảm chức năng gan, giảm khả năng giải độc của gan, tăng huyết áp ở tĩnh mạch cửa gan

1.2 Dịch tễ học xơ gan

Xơ gan là nguyên nhân gây bệnh và tử vong ngày càng tăng ở nhiều nước phát triển Nó

là nguyên nhân dẫn đến 1.03 triêu cái chết mỗi năm trên thế giới, 170 nghìn ca tử vong ở châu Âu và 33 539 ca ở USA mỗi năm Xơ gan là nguyên nhân chỉ dẫn chủ yếu của 5500

ca cấy ghép gan mỗi năm ở châu Âu Nguyên nhân xơ gan chính ở các nước phát triển là nhiễm virus HCV, lạm dụng rượu và ngày càng tăng là bệnh gan không do rượu Nhiễm virus HBV là nguyên nhân phổ biến ở Saharan Africa và hầu hết châu Á Sự phổ biến của

xơ gan khó để có thể đánh giá hết được, vì giai đoạn ban đầu của nó không biểu hiện thành triệu chứng rõ rệt, vì vậy tỉ lệ này có thể cao hơn so với những gì đã được báo cáo [86] Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ bệnh nhân mắc bệnh xơ gan cao và có

xu hướng ngày càng tăng

Trong một khảo sát ở 187 nước từ năm 1980 đến 2010 cho thấy, số ca tử vong ở bệnh nhân mắc xơ gan tăng từ 676.000 người (giai đoạn 1980), chiếm 1.54% tổng số người

chết trong năm, lên tới hơn 1 triệu người (năm 2010)., chiếm 2% tổng số.Một khảo sát khác trên 235 nguyên nhân gây bệnh trong giai đoạn 1990-2010, xơ gan đứng thứ 12 trong 25 nguyên nhân gây tử vong cao nhất, ung thư gan đứng thứ 24 (năm 1990) tăng

lên thứ 16 (năm 2010) [81, 73, 75]

1.3 Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây xơ gan chủ yếu là do nhiễm virus (virus viêm gan C đóng vai trò chủ yếu gần 26% trường hợp, virus viêm gan B, D gần 15% trường hợp), rượu (gần 21% trường hợp), các nguyên nhân khác như rối loạn chuyểnhóa(hemochromtosis, thiếu men

-antitrypsin), bệnh đường mật kéo dài, nghẽn tĩnh mạch gan, rối loạn miễn dịch, nhiễm độc (methotrexate, amiodarone), suy dinh dưỡng, nhiễm trùng, bẩm sinh…

1.4 Hậu quả

Hậu quả chính của xơ gan là gây suy chức năng gan và tăng huyết áp tĩnh mạch cửa Suy chức năng gan làm giảm khả năng tổng hợp protein huyết thanh; giảm tổng hợp chất chống đông máu gây bầm tím, chảy máu; giảm chức năng tiết mật, chế biến bilirubin gây vàng da; thay đổi chuyển hóa đạm gây giảm chức năng não, hay quên, mất tập trung, khó ngủ do các chất đạm cần cho não như ammonia không được cung cấp đủ; giảm khả năng giải độc của gan, giảm khả năng chuyển hóa thuốc… Tăng huyết áp ở tĩnh mạch cửa gây

ra các chứng bệnh cổ chướng, lách to, giãn mạch thực quản, tăng huyết áp phổi, gây khó thở … Ngoài ra còn gây giảm khả năng miễn dịch, tăng nguy cơ mắc bệnh do nhiễm trùng, tăng nguy cơ ung thư gan dẫn đến tử vong, dễ nghẽn tĩnh mạch gan, không cung cấp đủ máu cho thận gây suy thận (tỷ lệ tử vong rất cao)…

1.5 Biện pháp điều trị xơ gan hiện tại và các hạn chế

Ngăn ngừa tiếp xúc với tác nhân gây xơ gan

Ở những bệnh nhân bị xơ gan do tắc mật nguyên phát, mức bilirubin tăng biểu thị một tiên lượng xấu và những bệnh nhân này nên được cân nhắc ghép gan ngay khi nồng độ

bilirubin bắt đầu tăng Các chuyên gia sẽ xác định các nguy cơ và lợi ích của ghép gan cho từng bệnh nhân.Tỉ lệ tử vong đã được cải thiện hơn nhiều năm qua nhờ sử dụng các thuốc suy giảm miễn dịch và giữ cho gan được ghép vào không bị tấn công và tổn thương.Trung bình hơn 80% bệnh nhân được ghép gan có thể kéo dài cuộc sống sau năm năm.Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân cần ghép gan vượt xa số lượng gan hiến tặng.Một bệnh nhân cần ghép gan phải trải qua một quá trình đánh giá phức tạp trước khi được cho vào danh sách chờ ghép gan Nói chung, gan được ghép cho những bệnh nhân được tiên đoán có cơ hội sống sót dài nhất sau khi cấy ghép Sự sống sót sau khi ghép gan cần theo dõi chặt chẽ và kết hợp với sự chăm sóc chu đáo Trước tình hình đó, nhiều liệu pháp mới

ra đời nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, có thể kể đến như: liệu pháp gene, liệu pháp dẫn thuốc đến đúng mục tiêu, trong đó liệu pháp tế bào dựa trên nhữngkết quả thínghiệm trên

mô hình chuột và trên bệnh nhân hứa hẹn nhiều triển vọng và tiềm năng ứng dụng cao

Hình 1 1 Hướng chiến lược điều trị bệnh gan bằng liệu pháp tế bào

(Theo Wenxia Zhang et al 2010, Advanced Drug Delivery Reviews 62 (2010) 814–

826)

1.6 Mô hình chuột xơ gan do CCL4

Cacbon tetraclorua hay tetraclorua là một hợp chất hóa học có công thức hóa học CCl4

Nó là một chất lỏng, không màu, có mùi "thơm" Cacbon tetraclorua là một trong những chất độc mạnh nhất đối với gan và được sử dụng trong nghiên cứu khoa học để đánh giá các chất bảo vệ gan.CCl4 cũng được sử dụng trong mô hình chuột chuyển gen để đánh giá sự xơ hóa và xơ gan Việc sử dụng CCl4để gây xơ hóa và xơ gan trên chuột dẫn đến tỉ

lệ tử vong rất cao [65] Đường cong tỉ lệ sống sót thấp tương ứng với liều lượng CCl4 tăng lên.Ở các trường hợp xử lý với các phương pháp khác nhau cũng cho tỉ lệ sống sót khác nhau.Ở liều lượng cao, xử lý CCl4 qua đường tiêm phúc mạc cho sức sống cao hơn

so với đường uống [11].Trong mô hình này tế bào gan bị tổn thương rõ rệt và phản ứng viêm tạo ra các đặc trưng mô học trong suốt giai đoạn đầu của quá trình phơi nhiễm Bên cạnh sự hoại tử của tế bào gan, sự thoái hóa và viêm nhiễm, sự tái sinh của tế bào gan, sự tăng sinh của tế bào Ito và sự tích tụ của của mô liên kết là những đặc trưng mô học quan trọng sau 6-9 tuần phơi nhiễm Tổn thương ngoài gan ở các cơ quan khác gây bởi sự phơi nhiễm này rất nhỏ[15, 29, 30, 53]

Cơ chế gây độc của CCl4

CCl4 là một chất độc gây suy gan cả cấp tính và mạn tính Khi CCl4 vào cơ thể, chúng sẽ

bị hệ enzyme gần tĩnh mạch, cytochrome P450 mà chủ yếu là P450 2E1 bắt giữ và chuyển hóa thành gốc tự do CCl3 Chúng có thể kết hợp với O2 để hình thành gốc tự do mới trichloromethyl peroxi (CCl3OO) Gốc •OOCCl3 có ái lực điện tử hơn so với gốc

•CCl3 và có khả năng tấn công các acid béo không no tạo ra cacbon nằm ở trung tâm các gốc lipid.Những gốc lipid này nhanh chống kết hợp với phân tử oxy để tạo thành các gốc peroxyl lipid, từ đó bắt đầu quá trình peoroxy hóa lipid (LPO) Ngoài ra (• CCl 3) có thể phản ứng với nhóm sulfhydryl, như giảm glutathione (GSH) và các thiol protein, mà cuối cùng dẫn đến bất thường chức năng protein, peoroxy hóa lipid màng, và từ đó làm tổn hại

ti thể và hạt nhân dẫn đến suy giảm chức năng sinh lý của tế bào gan và cuối cùng là hoại

tử tế bào gan [11] Sự suy yếu của tế bào gan tạo tín hiệu cho quá trình viêm và quá trình

xơ hóa nhờ hoạt hóa tế bào Kupffer tiết TNF-, IL-, INF-,… Ngoài CCl4 còn có nhiều hợp chất gây độc đã được sử dụng trên mô hình động vật trong các nghiên cứu về cơ chế gây tổn thương gan như: -naphthyl-isothiocyanate (ANIT), allyl alcohol (AA), 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC) [78, 85, 72]

1.7 Cơ sở lý thuyết của việc sử dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan

Sự tăng sinh, sự biệt hóa, sự tiết và các chức năng của tế bào cấy ghép và tế bào nội sinh tại gan bị ảnh hưởng bởi vi môi trường tại vùng xơ gan Các bệnh liên quan đến sự suy thoái tế bào như xơ gan đều do sự ảnh hưởng của vi môi trường ngoại bào Chứng cứ ban đầu của sự tái tạo gan là sau khi cắt bỏ 1 phần gan, người ta nhận thấy sự xuất hiện các tín hiệu quan trọng từ prostaglandin; đây là yếu tố quyết định cho sự tái tạo gan.Tín hiệu này liên quan đến sự tăng yếu tố tăng trưởng TGF-beta 1 Gan bị xơ hóa có nồng độ

TGF-beta 1 cao, điều này dẫn đến sự apoptosis của tế bào gan cũng như tác động sự kháng phân bào và sự xơ hóa

Không chỉ có vi môi trường của cơ thể chủ ảnh hưởng đến các tế bào ghép, các tín hiệu

do tế bào ghép tiết ra cũng làm thay đổi vi môi trường Sự thay đổi tại vi môi trường vùng xơ gan góp phần cho sự thành công của các ca ghép gan Việc cấy ghép các tế bào gốc trong điều trị xơ gan trên động vật đã chỉ ra vai trò của tế bào gốc tại vi môi trường vùng xơ gan Một số nghiên cứu đã chỉ ra khả năng tiết các yếu tố kích thích sự phân chia

tế bào, các yếu tố ngoại bào dẫn đến sự tái tạo nội sinh ở cơ thể chủ và giúp cơ thể sống sót (Makowka et al.).Chẳng hạn, các tế bào gốc trung mô có thể tiết ra một số các yếu tố

ức chế các cytokine đáp ứng viêm trên mô hình chuột bệnh xơ hóa phổi Các tế bào ghép vào vùng tổn thương giúp làm giảm đáp ứng viêm tại vi môi trường vùng tổn thương, tiết các yếu tố kích thích tế bào gốc nội sinh do đó giúp cải thiện tình trạng tổn thương Mặt khác MSC có thể được cảm ứng để tuần hoàn vào máu ngoại vi trong mô hình động vật trong điều kiện cụ thể Tín hiệu hóa ứng động để dẫn dụ tế bào gốc vào vi môi trường thích hợp hoặc cảm ứng sự luân chuyển của nó vẫn chưa được hiểu rõ Một số chemokine được đề xuất như SDF-1 và các yếu tố tăng trưởng (Growth factor_GF) được cho là các yếu tố hóa hướng động trên MSC, tuy nhiên cơ chế điều hòa của nó thì vẫn chưa được hiểu rõ Điều này giải thích cho khả năng “di cư” của tế bào gốc đến vùng tổn thương

Điều trị xơ gan bằng cấy ghép tế bào gan tự thân

A.Schwarz và cộng sự tại viện Angewandte Zellkultur (Đức) đã tiến hành thử nghiệm phương pháp điều trị xơ gan bằng cách chuyển tế bào gan tự thân cùng một lượng nhỏ tế bào tụy lên một tấm scaffold bằng polymer Sau đó chuyển ngược lại vào cơ thể bệnh nhân Bằng phương pháp này đã ứng dụng điều trị trên 57 bệnh nhân bị xơ gan, tỉ lệ sống sót sau một năm cấy tế bào là 75% trên tổng số bệnh nhân

Cấy ghép tế bào tiền thân gan (tế bào oval)

J.M Lemire et al (1991) và X Wang et al (2003) chứng minh rằng tế bào oval có khả năng biệt hoá thành các tế bào gan trưởng thành và tế bào biểu mô ống mật M.I Yovchev

et al (2008) đã cấy ghép tế bào oval cho thấy sự tăng sinh và hoà nhập với 90% tế bào gan ở gan nhận được thay thế bởi tế bào oval cho trên mô hình chuột C.X Wu et al (2009), tiêm tế bào oval vào gan chuột Wistar bị xơ gan có thể tăng tỉ lệ sống sót

Điều trị xơ gan bằng ghép tế bào gốc tuỷ xương

Năm 2004, Isao Sakaida, Shuji Terai, Naoki Yamamoto, Koji Aoyama, Tsuyoshi Ishikawa, Hiroshi Nishina, và Kiwamu Okita cấy ghép tế bào gốc tuỷ xưởng kết hợp với CCl4vào chuột bị xơ hoá gan trong báo cáo “Transplantation of Bone Marrow Cells Reduces CCl4 Induced Liver Fibrosis in Mice” Kết quả cho thấy, chuột mô hình bệnh xơ gan giảm đáng kể sự xơ hoá gan

Các nhà khoa học Nhật bản thuộc đại học Y Yamaguchi và đại học y Tokyo đã tiến hành thử nghiệm điều trị xơ gan trên mô hình chuột bị gây xơ gan bằng CCl4 Tế bào từ tủy xương được chuyển GFP để quan sát sự di cư và biệt hóa của tế bào ghép Từ quan sát cho thấy các tế bào tủy xương tập trung tại mô gan bị xơ và biệt hóa thành tế bào gan sản xuất albumin, và biểu hiện mạnh metalloproteinases (MMPs), làm tăng cường chức năng gan, đặc biệt là sự biểu hiện hoạt tính của MMP-9, làm tăng cường tỷ lệ sống sót của chuột bị xơ gan

F Anjos-Afonso et al (2004), dùng tế bào gốc tuỷ xương chuột cấy ghép qua tĩnh mạch đuôi cho thấy sự chuyển biệt hoá thành tế bào giống tế bào gan trong chuột nhận NOD/SCID M.R Alison et al (2000), thử nghiệm lâm sàng trên người, sử dụng nhiễm sắc thể giới tính để phân biệt tế bào cấy ghép từ người nhận có giới tính khác biệt M Korbling et al (2002), và N.D Theise et al (2000), tế bào gốc từ tuỷ xương có thể hoà nhập vào gan và chuyển biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành S Nikeghbalian et al.,

2011, ghép tự thân tế bào đơn nhân và có CD133+ từ tủy xương vào các bệnh nhân cho kết quả khả quan trong việc điều trị xơ gan

Sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ

A Banas et al (2009) cấy ghép tế bào gốc từ mô mỡ thông qua tiêm tĩnh mạch đuôi chuột , kết quả cho thấy có sự biệt hoá của tế bào ghép thành tế bào gan trưởng thành ở chuột BALB/c nude bị xơ gan do cảm ứng CCl4

Sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn

P.C Tsai et al (2009) tiến hành tiêm 5x105 tế bào vào thuỳ phải gan chuột bị xơ, kết quả cho thấy có sự kiềm chế xơ gan, dù chúng không biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành Tác giả đề nghị: các tế bào gốc không biệt hoá có thể tiết ra các cytokine nhất định như human cutaneous T cell-attracting chemokine, leukemia inhibitory factor, và prolactin sẽ giúp duy trì chức năng gan và kích thích sự tái tạo gan nội sinh

Nhóm tác giả của giáo sư Philip N Newsome đã sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn trong điều trị xơ gan trên mô hình chuột (Philip N Newsome, 2003) Kết quả cho thấy, tế bào gốc người đã biệt hoá thành công thành tế bào gan trưởng thành với khả năng tiết mật bình thường trong điều kiện in vivo của cơ thể chuột NON-SCID

Sử dụng tế bào gốc trưởng thành từ máu ngoại vi để điều trị bệnh xơ gan

Bệnh viện Hammersmith tại London, Anh đã điều trị cho hơn 30 bệnh nhân với phương pháp này và đã thu được những kết quả đầy hi vọng máu của bệnh nhân được thu nhận sau đó thu lấy tế bào và nuôi cấy tăng sinh tế bào và đưa tế bào ngược trở lại gan thông qua động mạch Có sự giảm đáng kể bilirubin sau 12 tuần tiêm tế bào và giảm alanine transaminase và aspartate transaminase sau một tuần tiêm tế bào

Sử dụng tế bào gốc phôi trong điều trị xơ gan

D.C Hay et al., (2008) chỉ ra rằng tế bào gốc phôi có khả năng biệt hoá thành tế bào giống tế bào gan Y Kumashiro et al (2005) tiến hành cấy ghép tế bào gan thu từ tế bào gốc phôi vào lách hoặc gan tổn thương của 3 chuột nhận[10], tình trạng xơ gan được hạn chế, chức năng gan và khả năng sống được cải thiện J Cai et al (2007), dùng tế bào gốc phôi người cấy vào lách của chuột suy giảm miễn dịch cho thấy các tế bào cấy ghép có thể hoà nhập vào gan tổn thương.[25]

Sử dụng tế bào gốc cảm ứng đa tiềm năng (iPS) trong điều trị xơ gan

D Xu et al (2008), cấy ghép tế bào tiền thân nội mô biệt hoá từ tế bào iPS vào gan chuột bị bệnh ưa chảy máu giúp cải thiện hội chứng và tỉ lệ sống, iPS có thể sử dụng cho

các rối loạn di truyền ở người trong tương lai[25, 70, 64]

1.8 Nội dung nghiên cứu của đề tài

Nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy và xác định đặc điểm của tế bào gốc

Trong nội dung này, các tế bào gốc được thu nhận từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như máu cuống rốn, tủy xương chuột Các nguồn thu nhận này đều nhằm hướng đến việc cấy ghép tự thân để hạn chế khả năng thải loại miễn dịch

Nội dung 1.1 Thu nhận tế bào gốc từ máu cuống rốn

Quy trình thu nhận tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn người được tiến hành sau đây tham khảo từ quy trình của Taina Jaatimen và Jarmo Laine, 2007 Phương pháp chọn lọc tế bào gốc trung mô ứng viên được tiến hành theo phương pháp của Oscar K Lee và cs (2004) Quần thể tế bào bám dính được đánh giá marker bề mặt: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD166, HLA-DR, khả năng tự làm mới

và khả năng biệt hóa Quần thể tế bào biểu hiện marker đặc trưng ở độ tinh sạch 90% trở lên sẽ được sử dụng cho các nội dung tiếp theo

Nội dung 1.2 Thu nhận tế bào gốc từ tủy xương

Tế bào gốc trung mô được chọn lọc dựa trên các marker bề mặt, khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa

Mẫu tủy xương sau khi được thu nhận được nuôi cấy trong môi trường DMEM-F12 bổ sung 15% FBS cho tế bào bám dính Quần thể tế bào bám dính được đánh giá marker bề mặt: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD166, HLA-DR, khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa

Quần thể tế bào biểu hiện marker đặc trưng ở độ tinh sạch 90% trở lên sẽ được sử dụng cho các nội dung tiếp theo

Nội dung 2: Xây dựng mô hình chuột bệnh xơ gan bằng CCl4

CCl4 là một tác nhân gây độc gan điển hình, được sử dụng rộng rãi trong nhiều mô hình thực nghiệm khác nhau trên thế giới và Việt Nam Liều xử lý CCl4 thường sử dụng gây độc gan trong khoảng 0,5 – 1 ml/kg (Ming-Ling Chang và cộng sự, 2005; Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2007) Chuột được uống/tiêm CCl4 liều 0,5 - 1 ml/kg pha trong olive, 2 lần/ tuần liên tục trong 8 tuần Sau khi kết thúc xử lí CCl4tiến hành đánh giá sự xơ gan dựa trên các chỉ tiêu:

Chỉ tiêu 1: Xét nghiệm sinh hóa (ALT, AST, bilirubin và albumin huyết thanh)

Chỉ tiêu 2: Đánh giá mức độ biểu hiện các gen xơ hóa: procollagen, intergrin beta 1,

CD73, TGF beta bằng phương pháp Realtime RT-PCR sử dụng các primer chuyên biệt Chỉ tiêu 3: Đánh giá mô học

Nhuộm HE, trichrome, nhuộm kháng thể kháng collagen type I và sma-anfa Tình trạng viêm và xơ hóa theo thang điểm HAI gồm các đặc điểm: hoại tử quanh khoảng cửa, hoại

tử quanh tĩnh mạch trung tâm, hoại tử trong tiểu thùy, viêm khoảng cửa, giai đoạn xơ hóa Chúng tôi đánh giá mức độ viêm gan và giai đoạn xơ hóa dựa theo chỉ số hoạt tính mô học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI):

Bảng 1.1.Bảng chỉ số hoạt tính mô học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI)

+ Mức độ viêm

Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm + rải rác hoại tử bắc cầu giữa khoảng

cửa và tĩnh mạch trung tâm

4

Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm + nhiều hoại tử bắc cầu giữa khoảng

cửa và tĩnh mạch trung tâm

5

+ Giai đoạn xơ hóa

Hóa sợi lan rộng ở hầu hết các khoảng cửa với rải rác dải xơ bắc cầu giữa

2 khoảng cửa (cửa-cửa)

3

Hóa sợi lan rộng ở các khoảng cửa với nhiều dải xơ bắc cầu giữa 2

khoảng cửa, khoảng cửa và tĩnh mạch trung tâm (cửa-cửa; cửa-tĩnh mạch

trung tâm)

4

Nhiều dải xơ bắc cầu giữa 2 khoảng cửa hoặc khoảng cửa và tĩnh mạch

trung tâm với nốt xơ không hoàn toàn

Nội dung 3: Thử nghiệm điều trị chuột bệnh xơ gan bằng cấy ghép tế bào gốc

Tế bào gốc thu nhận từ nội dung 1 và chuột xơ gan từ nội dung 2 được sử dụng cho

nội dung nghiên cứu này Chuột xơ gan bằng CCL4 đạt yêu cầu về chỉ tiêu sinh hóa và

mô học sẽ được sử dụng để nghiên cứu Trong nghiên cứu này gồm các nghiệm thức sau: Tiến hành theo các nghiệm thức sau:

1 Nghiệm thức 1: chuột xơ gan đối chứng không ghép tế bào (tiêm PBS)

2 Nghiệm thức 2: chuột không gây mô hình bệnh (chuột thường)

3 Nghiệm thức 3,4: ghép 106 tế bào từ máu cuống rốn vào lần lượt tĩnh mạch, tĩnh mạch

cửa gan

4 Nghiệm thức 5,6: ghép 106 tế bào từ tủy xương vào lần lượt tĩnh mạch, tĩnh mạch cửa gan Chuột sau khi ghép tế bào sẽ được kiểm tra, đánh giá sự hồi phục dựa trên các chỉ tiêu:

Về sự phục hồi sức khỏe chuột và phục hồi bệnh

- Sự thay đổi cấu trúc mô học

- Sự thay đổi men gan thông qua các xét nghiệm sinh học (AST, ALT)

- Mức độ biểu hiện các gen xơ hóa: procollagen, intergrin beta 1, CD73, TGF beta

Về vai trò của tế bào gốc

- Sự di cư/cư trú của tế bào ghép sau khi ghép

- Sự biệt hóa tế bào ghép sau khi sát nhập

- Sự hình thành khối u sau khi ghép

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Các mẫu máu cuống rốn thu nhận từ bệnh viện phụ sản Hùng Vương – TP

Hồ Chí Minh Các mẫu thu nhận là các mẫu đảm bảo những tiêu chuẩn sau:

- Mẫu phải còn bánh nhau và dây rốn nguyên vẹn và được thu nhận từ trẻ sơ sinh khỏe mạnh, đủ tháng

- Mẫu phải được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và một số bệnh truyền nhiễm khác

- Mẫu được thu nhận ngay khi sản phụ sinh và sử dụng trong 4 giờ sau đó

 Chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) trưởng thành, khỏe mạnh,

sạch bệnh, được mua từ Viện Pasteur Tp.HCM Chuột được nuôi và thí nghiệm tại PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh

Nguyên tắc: Trẻ vừa được sinh ra, cơ thể trẻ được dính với nhau thai thông qua

một đoạn cuống rốn dài Để đảm bào chất lượng mẫu cho nghiên cứu, mẫu máu từ cuống rốn được thu nhận ngay sau khi sản phụ vừa sinh

Hình 2 1 Thao tác thu máu cuống rốn từ dây rốn

- Thu nhận khoảng 20 – 25 ml máu vào túi chứa có sẵn chất chống đông máu CPDA

- Toàn bộ quy trình thu mẫu cần đảm bảo vô trùng

- Mẫu máu sau khi thu nhận được bảo quan ở nhiệt độ mát và chuyển ngay về phòng thí nghiệm

Đánh giá kết quả: Những mẫu máu được sử dụng cho phân lập TBG trung mô

phải đồng đều, không xuất hiện các cục máu đông trong túi máu, thể tích máu không quá

100 ml

Nguyên tắc: Tỉ lệ TBG trung mô trong máu cuống rốn là rất thấp Do vậy, để nâng

cao hiệu quả thu nhận, cần phải tiến hành làm giàu phân đoạn tế bào đơn nhân bằng phương pháp ly tâm đẳng tỉ trọng, sử dụng gradient Ficoll-paque Trong phương pháp này, mẫu máu được pha loãng, sau đó đặt nhẹ nhàng lên trên bề mặt dung dịch Ficoll-paque, tiến hành ly tâm Trong suốt quá trình ly tâm, hồng cầu và bạch cầu hạt sẽ lắng về đáy ống ly tâm do có tỉ trọng lớn Các tế bào có tỉ trọng thấp hơn như bạch cầu và tế bào đơn nhân sẽ lắng tại một lớp phân cách giữa lớp Ficoll-paque bên dưới và lớp huyết tương bên trên.Đây là phân đoạn có chứa TBG trung mô ứng viên cần phân lập

Phương pháp tiến hành:

- Máu cuống rốn được pha loãng với PBS theo tỉ lệ 1:1

- Đặt nhẹ nhàng hỗn hợp máu cuống rốn và PBS lên trên Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml) theo tỉ lệ 2:1

- Ly tâm 2000 vòng/phút trong 20-30 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi li tâm, phân lớp tế bào đơn nhân nằm giữa phân lớp Ficoll-Hypaque và phân lớp huyết tương có thể quan sát thấy bằng mắt thường

- Chuyển phân lớp chứa tế bào đơn nhân sang vào ống li tâm mới

- Rửa tế bào bằng PBS và ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút

- Đổ bỏ dịch nổi, tái huyên phù cặn tế bào trong PBS và lặp lại quy trình rửa 2 lần

- Cuối cùng, tái huyên phù tế bào trong một thể tích môi trường nuôi cấy nhất định

Đánh giá kết quả: mẫu tế bào đơn nhân thu nhận được phải thấy bằng mắt thường,

có màu trắng đục Những mẫu có màu hơi đỏ được loại bỏ do còn lẫn nhiều hồng cầu

Nguyên tắc: Quần thể tế bào đơn nhân sau khi được thu nhận, chủ yếu tồn tại ba

quần thể tế bào baogồm: tế bào hồng cầu còn sót lại sau quá trình thu nhận tế bào đơn nhân,

tế bào bạch cầu và TBG (trong đó có chứa quần thể TBG trung mô ứng viên) Các tế bào hồng cầu và bạch cầu trưởng thành là những tế bào không có khả bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy.Vì thế, có thể loại bỏ hai quần thể tế bào này trong quá trình nuôi cấy qua một tới hai lần cấy chuyền đầu tiên Ngoài các tế bào bạch cầu non có khả năng bám dính, quần thể TBG trong máu cuống rốn rất đa dạng gồm sáu quần thể tế bào khác nhau: TBG trung mô, TBG sinh dưỡng không giới hạn, TBG giống thể phôi từ máu cuống rốn, tế bào tiền thân đa tiềm năng từ máu cuống rốn, tế bào tiền thân nội mô Trong các loại tế bào trên, chỉ có TBG tạo máu không có khả năng bám dinh trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, 5 loại TBG còn lại đều có khả năng này Việc chọn lọc TBG trung mô được tiến hành trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt chỉ cho phép TBG trung mô ứng viên sống sót và tăng sinh Nghiên cứu phân lập TBG trung mô ứng viên được tiến hành theo phương pháp của Lee (2004)

Phương pháp tiến hành:

- Tái huyền phù cặn tế bào đơn nhân trong môi trường nuôi cấy (IMDM, với 2

mM L-glutamine, bổ sung với 20% FBS, 1% Antibiotic-mycobiotic, 10ng/ml bFGF, 5 ng/ml EGF)

- Nuôi các TBG trung mô ứng viên trong các flask 25 cm2 với mật độ 106 tế bào/cm2 trong môi trường nuôi

- Nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, 5% CO2 trong tủ ấm

Đánh giá kết quả: TBG trung mô ứng viên bám trải trên dụng cụ nuôi cấy, có hình

thái giống với nguyên bào sợi người và có thể quan sát thấy được bằng kính hiển vi đảo ngược

Nguyên tắc: Khi mật độ TBG máu cuống rốn trong bình nuôi đạt khoảng 70 –

80%, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào tăng sinh và phát triển đạt hiệu quả cao

khỏi bề mặt dụng cụ nuôi cấy và có dạng hình tròn Tế bào phải có khả năng bám dính trở lại dụng cụ nuôi cấy sau 6-10 giờ cấy chuyền

Nguyên tắc: Trong tủy xương, các quần thể tế bào có thể thu nhận được là: 1 Tế

bào hồng cầu (trưởng thành và chưa trưởng thành); 2 Tế bào bạch cầu (trưởng thành và chưa trưởng thành); 3 Tế bào nền tủy xương; 4 Tế bào mỡ; 5 Tế bào gốc Trong các quần thể tế bào trên, quần thể hồng cầu, bạch cầu trưởng thành và tế bào mỡ là không có khả năng bám vào bề mặt nuôi cấy hoặc chỉ trong thời gian ngắn Vì vậy, trong điều kiện nuôi cấy bám dính, các tế bào này sẽ bị loại bỏ sau các lần thay môi trường Tế bào bạch cầu chưa trưởng thành, một số tế bào nền tủy xương có khả năng bám dính chọn lọc, tuy nhiên điều kiện môi trường nuôi cấy không thích hợp nên đời sống của các tế bào này rất ngắn Quần thể tế bào gốc chứa 2 loại chính: tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô, trong 2 loại này chỉ có tế bào gốc trung mô là có khả năng bám dính và tăng sinh vô hạn

trong điều kiện in vitro

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chọn lọc tế bào gốc trung mô từ tủy xương theo phương pháp của Nadri, S et al (2007), kết hợp với một số biến đổi của nhóm tác giả Masoud Soleimani & Samad Nadri (2009) và phương pháp này đã được áp dụng thành công bởi nhóm nghiên cứu của chúng tôi

Quy trình tiến hành:

- Giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ

- Phẫu thuật thu nhận phần đùi và cẳng chân, loại bỏ phần lông bằng cách kéo ngược về 2 phía (phía lên đầu và phía xuống chân)

- Bảo quản phần đùi và cẳng chân trong dung dịch PBS có chứa kháng sinh

- Trong tủ cấy an toàn sinh học, sử dụng dụng cụ phẫu thuật loại bỏ phần cơ để thu nhận phần xương có chứa tủy bên trong

- Cắt bỏ đầu bao xương, sử dụng kim 27G chứa khoảng 10 ml môi trường nuôi cấy (DMEM/F12, 2mM Glutamine, 10% FBS và 1% Antibiotic-antimycotic 100X) để dội rửa và thu nhận phần tủy xương (bằng cách bơm dịch từ đầu này sang đầu kia của xương)

- Lọc dịch thu được qua màng lọc 70 µm nhằm loại bỏ các mảnh xương hình kim,

cơ và các tế bào bị vón thành cụm

- Nuôi tế bào tủy xương ở mật độ 25 x 106 tế bào/ml trong bình nuôi 25cm2

- Đặt các bình nuôi ở nhiệt độ 370C và 5% CO2 trong tủ ấm nuôi tế bào

- Sau thời gian từ 3-24 giờ (khi có các tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy), tiến hành thay bỏ môi trường cũ và bổ sung môi trường nuôi cấy mới

- Thay môi trường mỗi 3-4 ngày đến khi có các tế bào có hình dạng như nguyên bào sợi (hình thoi)

- Sau 2 tuần, tế bào có thể đạt mật độ 65%-70%, tiến hành cấy chuyền bằng 0,5ml trypsin 0,25% Nuôi tế bào trong bình nuôi mới với mật độ 1.105 tế bào/bình nuôi Các tế bào đảm bảo yêu cầu sau được xem là các tế bào gốc trung mô ứng viên và

có thể sử dụng để khẳng định là tế bào gốc trung mô:

- Tế bào không nhiễm vi khuẩn và nấm

- Tế bào bám có hình dạng tương tự nguyên bào sợi

Nguyên tắc:TBG trung mô được phân lập và nhận diện từ nhiều nguồn khác nhau

như tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ và được nhân diện dựa tiêu chí của Ủy ban TBG phôi và trung mô của hiệp hội liệu pháp tế bào quốc tế (ISCT) đưa ra để xác định TBG trung mô Thứ nhất, khả năng bám dính, tăng sinh và cóhìnhdạng giốnghìnhdạngcủanguyênbàosợi khi được nuôi cấy trong môi trường phù hợp Thứ hai, các tế bào nuôi cấy phải biểu hiện một số marker liên quan tới lớp trung mô như CD73, CD90, CD105, đồng thời âm tính với các marker của tế bào máu như CD14, CD34, CD45 và một số marker khác như CD11b, CD79a hay CD19, HLA-DR Thứ ba, các tế bào này phải có khả năng biệt hóa thành một số dòng tế bào thuộc lớp trung mô như tế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn

Phương pháp tiến hành:

- Quan sát hình thái tế bào thông qua kinh hiển vi đảo ngược

- Phân tích sự biểu hiện các marker bề mặt của quần thể TBG trung mô ứng viên bằng kỹ thuật flow cytometry

- Đánh giá tiềm năng biệt hóa của quần thể tế bào phân tích bằng môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ, tế bào tiết insulin và tế bào cơ tim

Đánh giá kết quả: Trong nghiên cứu này TBG trung mô từ máu cuống rốn và tủy

xương chuột được định danh dựa trên ba tiêu chí cơ bản: 1 Hình thái và khả năng bám dính của tế bào trong quá trình nuôi cấy 2 Về marker bề mặt: các human MSC dương tính với CD13, CD44, CD90, CD105, CD166 và âm tính với các marker như CD14,

CD34, CD45, CD106, HLA-DR; các MSC từ tủy xương chuột dương tính với CD44, Sca-1 và CD90 trong khi đó lại âm tính với CD34, CD11b, CD31, CD106 (Vcam-1), CD117 (c-kit) và CD135 3 Tiềm năng biệt hóa thành tế bào mỡ hay xương

Nguyên tắc: Dựa trên hình thái tế bào (bám trải, hình thoi) để phân biệt TBG trung

mô ứng viên với các tế bào khác (tế bào bám dính hay không bám dính) trong quá trình nuôi cấy

Phương pháp tiến hành: quan sát tế bào bằng kính hiển vi đảo ngược

Đánh giá kết quả: Các tế bào trung mô ứng viên có khả năng bám dính trên bề mặt

dụng cụ nuôi cấy, có hình thái tương đối giống với nguyên bào sợi người

Nguyên tắc: Một tế bào đơn có khả năng phân bào sẽ tạo thành cụm tế bào trong

nuôi cấy Do vậy, có thể xác định khả năng hình thành tập đoàn (colony) sau một thời gian nuôi cấy nếu tế bào được nuôi cấy ở mật độ thấp

có thể quan sát và đếm được bằng kính hiển vi đảo ngược Số lượng tế bào trong một tập đoàn phải nhiều hơn 40 tế bào

mỡ

Nguyên tắc:Sự biệt hóa tạo mỡ của TBG trung mô có một số điểm quan trọng Sự

biệt hóa của TBG trung mô thành tế bào xương và mỡ được điều hòa một cách tinh tế Với việc bổ sung dexamethasone (0,5 µM), IBMX (0,5 µM –0,5mM), và indomethacin (50–100 µM), TBG trung mô nuôi cấy lớp đơn đi vào quá trình tạo mỡ Quá trình biệt hóa sử dụng một số tác chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa TBG trung mô thành tế bào tạo mỡ.Dexamethasone là một glucocorticoid steroid có tác

dụng quan trọng trong cảm ứng biệt hóa hình thành tế bào tạo mỡ Insulin là hormon giúp cho tế bào hấp thu và dự trữ glucose trong tế bào, một nguồn nguyên liệu cần thiết cho quá trình tạo mỡ Trong khi đó, IBMX là chất ức chế phosphodiesterase, cũng như quá trình gắn adenosin vào thụ thể, do đó làm ức chế sự chuyển cAMP thành 5’AMP Điều này thúc đẩy sự biểu hiện của hormon nhạy cảm Lipase (HSL) HSL sẽ chuyển Triacyl Glyceride thành Glycerol và acid béo tự do, bắt đầu quá trình tạo mỡ trong tế bào Và Indomethacin là ligand của PPAR giúp biểu hiện yếu tố phiên mã ức chế tín hiệu Wnt, tín hiệu quan trọng trong sự hình thành mỡ Ngoài ra, Indomethacin còn kích thích sự cảm ứng của ADRP ở những tế bào chưa biệt hóa, cũng như làm gia tăng lượng mRNA

và protein của ADRP ở các tế bào đã biệt hóa ADRP được xem là gen có vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào tạo mỡ

Nhận diện tế bào mỡ:

Nhuộm Oil Red hay Sudan Black là phương pháp tiến hành nhuộm mô phổ biến.Các tế bào này được cố định bằng methanol trong 45 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red

Phương pháp tiến hành:

- Tế bào được cảm ứng bằng môi trường cảm ứng biệt hóa mỡ DMEM bổ sung Dexamethazone: 10 μM, Insulin: 10 μg/ ml, Indomethacine: 200 μM, IBMX: 0,5 mM,

10 % FBS và 1 % antibiotic – antimycotic

- Mật độ tế bào khi tiến hành biệt hóa khoảng 70-80 % diện tích bề mặt nuôi cấy

- Môi trường biệt hóa được thay 2 lần trong một tuần Thời gian tiến hành cảm ứng biệt hóa 3 tuần

- Quan sát các giọt lipid trong tế bào chất bằng kính hiển vi đảo ngược sau 1 tuần cảm ứng biệt hoá

- Tế bào nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy không bổ sung tác nhân cảm ứng biệt hóa, sử dụng làm đối chứng

Đánh giá kết quả: Tế bào sau 3 tuần cảm ứng được đánh giá bằng sự tích tụ các giọt mỡ

trong tế bào chất bằng cách quan sát dưới kính hiển vi và nhuộm bằng Oil Red Sự hiện diện của các tế bào tích tụ giọt mỡ chứng tỏ quá trình biệt hóa đã thành công

2.11 Phương pháp nhuộm hóa tế bào bằng Oil Red

Nguyên tắc: Oil red là thuốc nhuộm có khả năng bắt màu với lipid Vì vậy, Oil red

thường được dùng để phát hiện các tế bào tạo mỡ hay tế bào mỡ.Sau khi nhuộm, các tế bào mỡ thường có màu đỏ tươi

Phương pháp tiến hành:

- Loại bỏ môi trường nuôi

- Cố định tế bào bằng methanol trong 45 phút ở nhiệt độ phòng

- Nhuộm tế bào với Oil red và ủ trong 10-20 phút

- Loại bỏ thuốc nhuộm và rửa lại bằng PBS

- Kiểm tra quả dưới kính hiển vi đảo ngược

Đánh giá kết quả: những tế bào mỡ sẽ có tích trữ các giọt mỡ màu đỏ của thuốc

nhuộm

Nguyên tắc: Flow cytometry là phương pháp định lượng và phân tích đa đặc điểm

của đơn vật thể, thông thường là tế bào khi chúng chảy thành dòng xuyên qua một chùm ánh sáng Các tính chất được định lượng bao gồm kích thước, tính chất hạt hoặc mức độ phức tạp bên trong và mật độ phát huỳnh quang Các đặc điểm này được xác định bởi hệ thống: quang học – điện tử, nhằm ghi nhận sự phát quang của tế bào Trong nghiên cứu này, các tế bào ở lần cấy chuyền 3-5 được lựa chọn để phân tích marker đặc trưng cho TBG trung mô dựa theo quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry theo hướng dẫn của BD Bioscience

Phương pháp tiến hành:

- Các tế bào nuôi cấy bám dính được tách khỏi bề mặt nuôi cấy bằng enzyme Trypsin/EDTA 0,25% (Sigma - Aldrich)

- Tiến hành ly tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận phần cặn

tế bào ở đấy ống ly tâm

- Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (pH=7,4) bổ sung 1% BSA và ly tâm ở tốc độ

2000 vòng/phút trong 5 phút

- Tạo huyền phù tế bào ở mật độ 1x106 tế bào/ml trong dung dịch PBS/BSA

- Bổ sung kháng thể (có gắn với hạt huỳnh quang Flourochrome thích hợp) ở độ pha loãng thích hợp theo hướng dẫn nhà sản xuất BD Bioscience Sau đó, tiến hành trộn đều mẫu tế bào và kháng thể và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Tiếp tục ủ mẫu tế bào sau khi nhuộm kháng thể ở 40C trong 15 phút để làm lạnh mẫu trước khi phân tích

- Khi tiến hành phân tích, các kháng thể đặc trưng có gắn với FITC hay PE

- Phân tích mẫu bằng máy Flow cytometer và tất cả các dữ liệu được phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro ở 10.000 – 30.000 tế bào

Đánh giá kết quả: Tế bào phân tích được cho là âm tính với một marker khi được

đánh giá bằng kĩ thuật flow cytometry phải có tỉ lệ phần trăm dương tính nhỏ hơn 2% trong tổng số tế bào dương tính Và một marker được cho là dương tính trong quần thể tế bào phân tích khi tỉ lệ dương tính từ 95% trở lên

Carbon tetrachloride là một hợp chất hữu cơ không màu, có mùi giống ether, có công thức phân tử CCl4, khối lượng phân tử 153,82 g/mol CCl4 đã và đang được sử dụng rộng rãi để gây tổn thương gan trong nhiều mô hình thực nghiệm khác nhau nhằm làm sáng tỏ cơ chế gây độc gan (Plaa GL., 2000) CCl4 cũng được sử dụng trong mô hình chuột chuyển gen để đánh giá sự xơ hóa và xơ gan

Có nhiều phương pháp đưa CCl4 vào cơ thể các động vật mô hình như: tiêm dưới

da, tiêm phúc mạc bụng, cho uống hoặc cho hít thở Vấn đề lớn nhất liên quan đến việc

sử dụng CCl4 để gây xơ hóa và xơ gan cho chuột nhắt là tỉ lệ tử vong cao (Ming-Ling Chang và cộng sự, 2004), khả năng sống sót tỷ lệ nghịch với liều lượng CCl4 Đưa thuốc vào cơ thể chuột bằng các phương thức khác nhau cũng cho tỉ lệ sống sót khác nhau Ở liều cao, xử lý CCl4 qua đường tiêm phúc mạc cho sức sống cao hơn so với đường uống (Ming-Ling Chang và cộng sự, 2004).Tỷ lệ tử vong thấp hơn và hiệu quả gây xơ cao hơn khi chuột được cho hít CCl4 trong các khoảng thời gian và nồng độ xác định (Marco Domenicali và cộng sự, 2009)

Mô hình xơ gan gây bởi CCl4 có sự tương đồng với xơ gan ở người trong một vài khía cạnh hình thái học và sinh lý bệnh học.Ví dụ như trong cả hai trường hợp sự tái sinh của tế bào gan xảy ra sau khi hoại tử, và sự thâm nhiễm của xơ hóa hầu như không thể đảo ngược ở giai đoạn xơ gan tiến triển.Xơ hóa gây bởi CCl4 cũng được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các tác nhân kháng xơ hóa và xác định mối quan hệ giữa các đặc điểm

mô bệnh học của gan với các marker xơ hóa có trong huyết thanh

Quy trình cho uống

Người thao tác giữ vùng sau gáy chuột bằng ngón trỏ và ngón cái (hình 2.3 a), ngón

út giữ chặt đuôi chuột vào lòng bàn tay Giữ sống lưng chuột thẳng đứng, đầu hơi ngửa, đưa mũi kim cho uống nhẹ nhàng vào thực quản chuột rồi bơm dung dịch vào thực

quảnchuột

Hình 2 2Thao tác cho chuột uống

Nguyên tắc: Khi tế bào gan bị tổn thương, các enzyme trong dịch bào (bao gồm các enzyme transaminase) rò rỉ vào trong máu nên chúng có thể được đo lường để chỉ thị cho

sự hoại tử của tế bào ALT (Alanine transaminase) và AST (Aspartate transaminase) là hai enzyme thuộc họ enzyme transaminase, còn gọi là GPT (Glutamate pyruvate transaminase) và GOT (Glutamate oxaloacetate transaminase) ALT tăng đáng kể trong viêm gan và tổn thương gan cấp tính AST tương tự như ALT nhưng AST còn được tìm thấy ở các mô khác nên không đặc hiệu cho gan như ALT Trong viêm gan siêu vi và các dạng bệnh gan liên quan đến sự hoại tử, mức ALT và AST trong máu tăng trước cả khi xuất hiện các dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng

Tiến hành:

- Máu được thu vào eppendorf 1.5 ml từ tĩnh mạch cảnh ngoài của chuột, sau đó được ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Huyết tương thu được có màu hơi vàng

(a) Giữ chuột (b) Lấy máu (c) Huyết tương

Hình 2 3Thao tác lấy máu chuột

- Xác định hoạt độ ALT trong huyết tương (Theo quy trình của nhà sản xuất Atlas Medical)

Đánh giá kết quả

Hoạt độ ALT (U/L) = ΔA/phút × Factor = ΔA/phút × 1750

- Xác định hoạt độ ALT trong huyết tương (Theo quy trình của nhà sản xuất Atlas Medical)

Đánh giá kết quả

Hoạt độ ALT (U/L) = ΔA/phút × Factor = ΔA/phút × 1750

của NSX bộ kít)

(procollagen α1(I), fibronectin, ecto-5’-nucleotidase ở mức phiên mã)

Nguyên tắc : Xơ hóa tiến triển sẽ có sự tích tụ bất thường chất nền, đặc biệt là do nhiều dãy collagen (loại I, III, và V), fibronectin di động, và proteoglycans Kết quả là ECM tổng số trong gan tăng lên hơn mười lần so với bình thường Collagen là protein cấu trúc quan trọng trong gan bình thường và xơ, trong hơn hai mươi loại collagen khác nhau được mô tả, có ít nhất chín loại được thể hiện trong gan, và tất cả tăng lên ở bệnh nhân xơ gan Collagen loại III là collagen đầu tiên biểu hiện tăng trong bệnh gan mãn tính và nó vẫn còn biểu hiện rất cao, mặc dù khi xơ hóa tiến triển thì collagen I gia tăng

Fibronectin là một glycoprotein gồm nhiều domain và đa chức năng, đó là một thành phần trung tâm của các chất nền Fibronectin và những thành phần khác trong chất nền tạo nên bộ khung cho nguyên bào sợi di cư Fibronectin cũng cung cấp sự hướng hóa

và tín hiệu tăng sinh cho nguyên bào sợi Sự tăng sinh, di cư của nguyên bào sợi đến mô tổn thương và tăng tổng hợp chất nền ngoại bào là một đáp ứng tổn thương tự phục hồi bình thường của cơ thể Tuy nhiên, tại thời điểm mà quá trình phục hồi bình thường thất bại, kết quả dẫn đến là xơ hóa kéo dài Sau chấn thương, fibronectin, đặc biệt là fibronectin di động đồng dạng EDA-extra domain A và EDB-extra domain B, là một trong các protein chất nền đầu tiên tăng, đặc biệt là trong các dải xơ, không gian của Disse và vùng cửa Các yếu tố tăng trưởng TGF-β kích thích tế bào nội mô xoang mạch

để sản xuất fibronectin EDA, và lần lượt gây ra kích hoạt nguyên bào sợi (myofibroblastic) của gan tế bào hình sao và tiền chất myofibroblast khác

Adenosine là một nucleosid được giải phóng từ hầu hết các mô và cơ quan ở động vật hữu nhũ Adenosine là chất điều hòa nội sinh trong mô tổn thương, hoạt động như một chất tự tiết và cận tiết và điều hòa các quá trình sinh lý khác nhau Một số thí nghiệm

đã chứng minh adenosine, được hình thành ngoại bào từ adenin, đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học xơ hóa gan và sự ức chế tổng hợp adenosine hay khóa thụ thể adenosine có thể giúp ngăn xơ hóa Sự tổng hợp adenosine ngoại bào được trung gian bởi enzyme ecto-5’-nucleotidase (CD73) đóng một vai trò quan trọng trong xơ hóa gan CD73 được điều hòa tăng mức sau khi thiếu oxy và có tác động lên sự tăng mức adenosine cục bộ Do đó, CD73 góp phần vào tác động được trung gian bởi adenosine trên mạch vành và trong thận Zhongsheng Peng và cộng sự vào năm 2008 đã nghiên cứu

về vai trò của CD73 trong sự phát triển xơ hóa gan Nhóm này đã thu được kết quả cho thấy gan từ chuột chủng hoang dại được xử lý với CCl4, ethanol, và TAA giải phóng mức adenosine cao gấp 2 đến 3 lần so với gan chuột bị bất hoạt gen mã hóa CD73 (CD73 Knockout, CD73KO) do bị xử lý hóa chất Chuột CD73KO được bảo vệ khỏi xơ hoá với lượng collagen ít hơn đáng kể so với chuột hoang dại sau khi xử lý hóa chất

Tiến hành

- Giải phẫu và sinh thiết gan chuột (hình)

(a) Chuột được gây mê và sát trùng trước

khi sinh thiết

(b) Chuột được mở ổ bụng với vết mổ dài

0,5 - 0,7 cm

Hình 2 4Thao tác sinh thiết gan chuột

Quy trình tách chiết RNA tổng số bằng Easy-BLUE Intron (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

Quy trình RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) và RTPCR được tiến hành 2 bước: 1 Thực hiện phản ứng RT chuyển RNA thành cDNA theo chu trình nhiệt (420C 60 phút; 700C 5 phút; 40C giữ mẫu); 2 Phản ứng PCR sử dụng các primer (theo bảng) theo chu trình nhiệt :940C 2 phút; (940C 20s; 580C 15s; 720C 40s) 35 chu kì; 720C 5 phút; 40C giữ mẫu

Realtime-Sản phẩm khuếch đại được điện di và phân tích kết quả

Bảng : Trình tự các cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm

bắt cặp

Kích thước sản phẩm (bp)

R: TGGAGGAGGAAGAAAAGCAA

Nguyên tắc: Nhuộm Hematoxylin và Eosin là một phương pháp nhuộm phổ biến trên nhiều loại mô khác nhau, nhằm kiểm tra sự thay đổi hình thái mô học, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh, đặc biệt trong chẩn đoán ung thư Hai thành phần chính hoạt động trong thuốc nhuộm là Hematoxylin và Eosin

Hematoxylin (công thức phân tử: C16H14O6, phân tử lượng: 302,28 g/mol) được chiết xuất từ gỗ cây huyết mộc Sản phẩm oxy hóa của Hematoxylin là haematin, một hợp chất tạo phức hợp màu mạnh với các ion kim loại đặc biệt là Fe (III) và Al (III) Các phức hợp kim loại-haematein được sử dụng để nhuộm nhân tế bào Các cấu trúc bắt màu xanh với Hematoxylin là những cấu trúc ưa base

Eosin có màu đỏ là do hoạt động của brom trên flourescein Eosin được sử dụng để nhuộm tế bào chất, collagen và các sợi cơ.Cấu trúc bắt màu với Eosin là những cấu trúc

ưa acid.Hầu hết tế bào chất là ưa acid.Tế bào hồng cầu được nhuộm màu hoàn toàn đỏ với Eosin.Có 2 loại thuốc nhuộm Eosin phổ biến là Eosin Y (Eosin ellowish là dẫn xuất tetrabromo của flourescein) màu vàng nhạt; và Eosin B (Eosin Bluish là dẫn xuất

dibromo dinitro của flourescein) màu xanh nhạt

Tiến hành: theo quy trình của bệnh viện Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

tế bào chất sẽ có một màu xanh khác biệt Do vậy, thuốc nhuộm này cho biết nhiều thông tin về cấu trúc với các gợi ý về chức năng đặc trưng Sự thoái hóa mỡ tế bào gan được quan sát thấy khi các tế bào gan sưng phồng, có tích tụ các nang mỡ.Vị trí của các tế bào

thoái hoá có thể cho biết được nguyên nhân của sự thoái hoá Có thể chia một tiểu thuỳ gan thành ba vùng từ ngoài khoảng cửa đi vào trong tĩnh mạch trung tâm: vùng A1, A2

và A3

Hình 2 5Tiểu thùy gan bình thường với 3 vùng tế bào

CV: tĩnh mạch trung tâm (central vein), PT: vùng cửa (portal trial), A1: vùng số 1;

A2: vùng số 2; A3: vùng số 3

Thoái hoá mỡ do ngộ độc: hoá chất đi từ tĩnh mạch cửa vào tĩnh mạch trung tâm nên vùng tế bào bị ảnh hưởng đầu tiên là vùng A1 Thoái hoá mỡ do rượu thường ở vị trí giữa tiểu thuỳ – vùng A2 Thoái hoá mỡ do suy tim sẽ có vị trí ở quanh tĩnh mạch trung tâm – vùng A3, do lượng oxy cung cấp cho các tế bào ở vùng này là ít nhất trong ba vùng (oxy cung cấp đi từ khoảng cửa vào) gây rối loạn biến dưỡng ở các tế bào này Thoái hoá

mỡ do suy dinh dưỡng thường không phân vùng và phân bố rải rác trong tiểu thuỳ

Hoại tử gan được đánh giá dựa trên sự mất trật tự của các phiến tế bào gan, sự thâm nhập các tế bào gây viêm ở vùng quanh khoảng cửa, tế bào chất đồng nhất, nhân kết đặc, màng nhân có thể rách vỡ, nhân phân mảnh và dần dần có thể biến mất Sự xơ hóa được xác định khi có sự hiện diện của các dải sẹo sợi trong nhu mô gan Khi các vùng xơ hóa phát triển, có sự bắt cầu giữa các khoảng cửa bao quanh các nhu mô đang tái sinh còn lại tạo thành các nốt nhỏ dày đặc, các dấu hiệu này được chẩn đoán là xơ gan

Mô gan được cố định trong 4% paraformaldehyde (Merck Millipore, Đức) Lát cắt (slide) paraffin được deparaffinization và tái hydrate hóa bằng sodium citrate (10mM, pH 6) tại

95 - 1000C trong 20 phút Các slide được làm lạnh xuống khoảng 20 - 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, các slide được block trong 30 phút ở nhiệt độ phòng với blocking buffer

(2% huyết thanh dê, 1% BSA, 0.1% Triton X100, 0,05% Tween 20, 0,01 M PBS pH 7,4, 0,05% sodium azide) Slides được nhuộm kháng thể kháng collagen I (Santa Cruz Biotechnology, Inc) hoặc anti-sma-Anfa (Santa Cruz Biotechnology, Inc) với nồng độ pha loãng 1: 100 trong TBS 1% BSA qua đêm ở 40C Peroxidase nội sinh được block bằng peroxidase blocking buffer (3% H2O2 trong PBS) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng horseradish peroxidase- conjugated secondary goat-anti-rabbit antibody trong TBS 1% BSA được nhuộm trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Kết quả nhuộm kháng thể được kiểm tra bằng cách sử dụng ACE kit (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) theo hướng dẫn Nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin-Gill III (Merck Millipore, Đức) Slides đã được rửa sạch bằng Tween 20 TBS (2-3 lần) giữa mỗi bước

Tế bào được thu nhận và huyền phù trong dung dịch PBS 1 triệu tế bào/0.1 ml PBS được tiêm vào chuột theo đường tĩnh mạch đuôi hoặc tĩnh mạch cửa gan

Nguyên tắc: Protein phát huỳnh quanh xanh (GFP – Green flourescene protein) là phân tử protein có khả năng hấp thu ánh sáng bước sóng mầu lam (395nm) rồi phát ra ánh sáng

có bước sóng mầu lục (509nm), khả năng này dựa vào cấu trúc phân tử đặc biệt của nó Đồng thời, protein này không độc cho tế bào cũng như cơ thể sống, có tính ổn định cao trong điều kiện nhiệt độ và PH khác nhau Do đó, protein này thường được dùng như một phân tử đánh dấu tế bào để nhận biết sự hiện diện của tế bào trong nuôi cấy hay trong cơ thể sống, nếu tế bào đó được chuyển gen và biểu hiện GFP Lentivirus là một loại virus thuộc họ retrovirus, với khả năng xâm nhiễm đa dạng vào các dòng tế bào khác nhau và

bộ gen của virus xác nhập vào tế bào chủ có thể biểu hiện một cách ổn định lâu dài Do

đó, Lentivirus thường được sử dụng làm vector chuyển gen mục tiêu vào tế bào chủ, bằng cách thiết kế bộ gen virus có chứa trình tự gen mục tiêu đi kèm với đó là promoter cho gen có thể biểu hiện và một gen kháng kháng sinh (thường dùng là puromycin) để chọn lọc tế bào chuyển gen thành công

Quy trình: