Utilisation of laccase and CMC to preserve fresh fruit (mango)

Sử dụng CMC làm chất tạo màng chỉ có ý nghĩa trong việc loại O2, loại bỏ tác động của vi sinh vật, còn dẫn xuất chitosan được tạo ra nhờ laccase lại mang theo hoạt tính sinh học tốt để t

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT 4

BÁO CÁO TÓM TẮT 5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 10

DANH MỤC CÁC BẢNG 11

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ 13

LỜI CẢM ƠN 17

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 18

1.1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN XOÀI HIỆN NAY 18

1.1.1 Bảo quản xoài bằng hóa chất 18

1.1.2 Bảo quản bằng chiếu xạ 18

1.1.3 Bảo quản nhiệt độ lạnh 19

1.1.4 Bảo quản bằng điều chỉnh không khí 19

1.2 BẢO QUẢN TRÁI CÂY BẰNG MÀNG BAO 20

1.3 CHITOSAN 23

1.3.1 Chitosan 23

1.3.2 Hoạt tính sinh học chitosan 24

1.3.3 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản trái cây 27

1.4 ACID FERULIC 27

1.4.1 Acid ferulic 27

1.4.2 Cấu trúc hóa học 28

1.4.3 Một số ứng dụng trong thực phẩm 28

1.5 LACCASE 30

1.5.1 Định nghĩa 30

1.5.2 Cấu trúc phân tử 31

1.5.3 Cơ chế xúc tác 33

1.5.4 Tính chất hóa sinh 34

1.5.5 Một số ứng dụng trong thực phẩm 35

1.6 SỰ GẮN HỢP CHẤT ACID PHENOLIC LÊN CHITOSAN 36

1.6.1 Phương pháp hóa học 36

1.6.2 Phương pháp sinh học 38

1.6.3 Hoạt tính sinh học của dẫn xuất chitosan 38

1.7 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG ĐỀ TÀI 40

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 42

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 43

PHẦN 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 44

2.1 VẬT LIỆU 44

2.1.1 Vật liệu dùng cho tổng hợp dẫn xuất C-FA 44

2.1.2 Hóa chất 44

2.1.3 Thiết bị 44

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 44

2.2.1 Sử dụng CMC làm chất tạo màng 45

2.2.2 Sử dụng chitosan làm chất tạo màng 45

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.3.1 Sử dụng CMC làm chất tạo màng 46

2.3.2 Sử dụng chitosan làm chất tạo màng 47

2.3.3 Phương pháp thực hiện 51

2.3.4 Bằng chứng hóa học của sự biến đổi của chitosan 56

PHẦN 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 57

3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ION KIM LOẠI LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP LACCASE Ở NẤM Pleurotus sp 57

3.1.1 Ảnh hưởng của Co2+ 57

3.1.2 Ảnh hưởng của Cd2+ 58

3.1.3 Ảnh hưởng của Hg2+ 58

3.1.4. Ảnh hưởng của Mn2+ 58

3.1.5. Ảnh hưởng của Cu2+ 59

3.1.6 Ảnh hưởng của thời gian bổ sung CuSO4 và thời gian nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp

laccase 59

3.2 KHẢ NĂNG BÀO QUẢN XOÀI TỪ MÀNG CMC KẾT HỢP VỚI LACCASE 60

3.2.1 Kết quả theo dõi cảm quan 61

3.2.2 Kết quả theo dõi trọng lượng 63

3.2.3 Kết quả theo dõi hàm lượng đường tổng 64

3.2.4 Kết quả theo dõi hàm lượng vitamin C 65

3.2.5 Kết quả theo dõi hàm lượng acid 66

3.3 KHẢ NĂNG BẢO QUẢN XOÀI CỦA DẪN XUẤT CHITOSAN – ACID FERULIC 68

3.3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp dẫn xuất chitosan-acid ferulic 68

3.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học của dẫn xuất C-FA 84

3.3.3 Bằng chứng hóa học cho sự biến đổi của chitosan 92

3.3.4 Kết quả khảo sát khả năng bảo quản xoài từ dẫn xuất C-FA 6.0 100

3.3.5 Kết quả khảo sát khả năng bảo quản xoài từ dẫn xuất C-FA 4.5 105

PHẦN 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 118

4.1 KẾT LUẬN 118

4.2 ĐỀ NGHỊ 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO 120

TÓM TẮT

Hợp chất ferulic acid được gắn lên chitosan dưới sự xúc tác của laccase từ nấm

bào ngư Pleurotus sp Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, dưới điều kiện lắc liên

tục Việc khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng gắn đã tạo được dẫn xuất chitosan (C-FA 6.0) với khả năng bắt gốc tự do DPPH đạt giá trị IC50 là 173.53 µg/ml và khả năng bắt gốc ABTS.+ đạt được IC50 là 471.36 µg/ml So với chitosan, dẫn xuất chitosan (C-FA 6.0) thu được cho khả năng bắt gốc tự do DPPH cao gấp 31 lần và khả năng bắt gốc ABTS.+ cao gấp 7 lần

Dẫn xuất chitosan (C-FA 6.0) có màu vàng cam ổn định Phân tích phổ nhận thấy

có độ hấp thu cao trong vùng 240nm - 600nm so với nguyên liệu ban đầu (chitosan và ferulic acid) khi đo quang phổ UV/Vis, có sự hình thành mũi mới tại 1505 cm-1 khi đo quang phổ hồng ngoại và có sự xuất hiện 1 tín hiệu mới tại 6.32 ppm ứng với proton của nhóm phenyl

Dẫn xuất chitosan tổng hợp ở pH 4.5 (C-FA 4.5) có khả năng tạo màng bảo quản xoài Trong các thử nghiệm bảo quản xoài, các lô đối chứng (không bọc màng hoặc bọc màng chitosan) hàm lượng đường tổng tăng nhanh từ ngày 0-ngày 3 (0.34% - 1.18%) sau

đó giảm dần đến ngày 9 thì bị hư, trong khi đó lô xoài được bảo quản bằng màng dẫn xuất chitosan-FA có hàm lượng đường tổng tăng dần và đến ngày 9 vẫn chưa giảm Ngoài ra khả năng bảo quản xoài của màng dẫn xuất còn được thể hiện qua mức giảm trong lượng và lượng vitamin C khá chậm so với lô đối chứng

ABSTRACT

Ferulic acid, a phenolic compound, can be grafted on chitosan by biological catalytic process with laccase catalysis The reactions were carried out at room temperature and continuous shake The IC50 values in scavenging DPPH and ABTS of chitosan derivative (C-FA 6.0) which was created in the most suitable reaction condition were 173.53 µg/ml, 471.36 µg/ml, respectively Comparing with chitosan control, the DPPH scavenging activity of the chitosan derivative was 31 times and the ABTS.+ scavenging activity increased 7 times

The chitosan derivative presented a yellow-orange color stable The spectroscopic analyses indicated that it had a large increase of absorbance between 240 – 600nm when compared with those of chitosan and ferulic acid in the UV/Vis spectrum, the formation

of a new band at 1505 cm-1 in the measurement of FT-IR spectra, a new peak at 6.32 ppm belonging to the phenyl protons in the 1H NMR spectra

At pH 4.5, the oxidation reactions produce membranes that able to preserve mango

In mango preservation experiments, the total sugar in the control groups quickly increased from the first day to the third day (0.34% - 1.18%) then regularly decreased and became bad fruit in the ninth day, while this content of the mangoes preserved by chitosan-FA membrane regularly increased and hadn’t decreased in the ninth day Besides that, mango preservation ability was also expressed in slowly decreasing mass and vitamin C when compared with the control groups

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1

ABTS: 2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothi-azoline-6-sulphonic acid)

C&FA: Hỗn hợp Chitosan và acid ferulic

C-FA: Dẫn xuất Chitosan- Acid ferulic

Bảng 3.1 Chỉ số cảm quan của xoài biến đổi sau 3 ngày

Bảng 3.2 Chỉ số cảm quan của xoài sau 6 ngày và sau 9 ngày

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo dẫn xuất C-FA đến hiệu suất bắt gốc

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ acid ferulic phản ứng tạo dẫn xuất C-FA đến hiệu

suất bắt gốc ABTS.+ ở những nồng độ khác nhau (%)

Bảng 3.11 So sánh giá trị IC50 của dẫn xuất C-FA chúng tôi tạo thành (1) với dẫn xuất

C-FA từ nghiên cứu Abdulhadi Aljawish và cộng sự (2)

Bảng 3.12 Hiệu suất bắt gốc tự do DPPH và ABTS.+ của mẫu C, mẫu C&FA, dẫn xuất

C-FA 4.5, dẫn xuất C-FA 6.0

Bảng 3.13 Đường kính vòng kháng khuẩn của các chất thử nghiệm

Bảng 3.14 Kết quả cảm quan của xoài đối chứng (Lô A1) (xoài không bọc màng), ở

Bảng 3.18 Kết quả cảm quan của xoài bọc màng C-FA 6.0 (lô E1), ở nhiệt độ lạnh

Bảng 3.19 Kết quả cảm quan của xoài đối chứng (lô A2) (xoài không bọc màng) ở nhiệt

độ phòng

Bảng 3.20 Kết quả cảm quan của xoài bọc màng chitosan (lô B2), ở nhiệt độ phòng Bảng 3.21 Kết quả cảm quan của xoài được bọc màng C-FA 4.5 (lô C2), nhiệt độ phòng Bảng 3.22 Kết quả cảm quan của xoài đối chứng (D2) (xoài không bọc màng), nhiệt độ

lạnh

Bảng 3.23 Kết quả cảm quan của xoài bọc màng chitosan (E2), nhiệt độ lạnh

Bảng 3.24 Kết quả cảm quan của xoài bọc màng C-FA 4.5 (F2), nhiệt độ lạnh

Bảng 3.25 Phần trăm độ giảm trọng lượng theo thời gian

Bảng 3.26 Hàm lượng đường tổng của xoài theo thời gian

Bảng 3.27 Hàm lượng vitamin C của xoài theo thời gian

Bảng 3.28 Hàm lượng acid hữu cơ trong xoài theo thời gian

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Bảo quản trái cây không bọc màng

Hình 1.2 Bảo quản trái cây có bọc màng

Hình 1.3 Loại trừ O2 từ thực phẩm

Hình 1.4 Cấu trúc của acid ferulic

Hình 1.5 Trung tâm hoạt động của laccase

Hình 1.6 Sơ đồ biểu thị quá trình oxy hóa cơ chất bởi laccase trong sự không có mặt (a)

hay sự có mặt (b) của chất trung gian hóa học

Hình 1.7 Con đường phản ứng của chitosan gắn với acid gallic thông qua các tác nhân

gắn

Hình 1.8 Các cơ chế của chitosan gắn với acid caffeic (phía trên) và acid gallic (phía

dưới) bằng sự xúc tác của laccase ở các pH khác nhau

Hình 1.9 Sự biến đổi chitosan với những quinone đã được tạo thành bởi laccase

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chitosan làm chất tạo màng

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Co2+ lên hoạt tính laccase

Hình 3.2.: Ảnh hưởng của nồng độ Cd2+ lên hoạt tính laccase

Hình 3.3.: Ảnh hưởng của nồng độ Hg2+ lên hoạt tính laccase

Hình 3.4.: Ảnh hưởng của nồng độ Mn2+ lên hoạt tính laccase

Hình 3.5.: Ảnh hưởng của nồng độ Cu2+ lên hoạt tính laccase

Hình 3.6.: Ảnh hưởng của thời gian bổ sung Cu2+ vào môi trường lên hoạt tính laccase

theo thời gian nuôi cấy

Hình 3.7 Xoài bảo quản ở điều kiện thường (Lô A)

Hình 3.8 Xoài bảo quản xoài ở nhiệt độ 10oC (lô B)

Hình 3.9 Xoài bọc màng CMC bảo quản ở nhiệt độ phòng (lô C)

Hình 3.10 Xoài có bọc màng CMC chứa laccase (tổng hoạt tính laccase là 1UI) bảo quản

ở điều kiện thường (lô D)

Hình 3.11 Xoài bọc màng CMC có chứa laccase (tổng hoạt tính laccase 10UI) bảo quản

ở điều kiện thường

Hình 3.12 Xoài bọc màng CMC có laccase (tổng hoạt tính 10UI) và ABTS bảo quản ở

điều kiện thường

Hình 3.13 Độ hao hụt trọng lượng theo thời gian

Hình 3.14 Sự thay đổi hàm lượng đường tổng theo thời gian

Hình 3.15 Sự giảm hàm hượng vitamin C theo thời gian

Hình 3.16 Sự giảm hàm lượng acid theo thời gian

Hình 3.17 Dẫn xuất Chitosan- Acid ferulic (C-FA) tạo thành ở 0h- (1) ; 4h- (2); 18h- (3);

24h- (4); 48h- (5)

Hình 3.18 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian phản ứng tạo dẫn xuất C-FA đến hiệu

suất bắt gốc DPPH (A) và ABTS.+ (B) ở những nồng độ khác nhau

Hình 3.19 Biểu đồ thể hiện nồng độ dẫn xuất C-FA có thể trung hòa được 50 % gốc tự

do DPPH và ABTS.+

Hình 3.20 Dẫn xuất C-FA tạo ra ở hoạt tính laccase 0.05 U/ml- (1); 0.1 U/ml- (2); 0.2

U/ml- (3); 0.3 U/ml- (4); 0.4 U/ml- (5)

Hình 3.21 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của hoạt tính laccase phản ứng tạo dẫn xuất C-FA

đến hiệu suất bắt gốc DPPH (C) và ABTS.+ (D) ở những nồng độ khác nhau Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện nồng độ dẫn xuất C-FA có thể trung hòa được 50 % gốc tự

do DPPH và ABTS.+

Hình 3.23 Dẫn xuất C-FA tạo thành ở các pH 4.0- (1); pH 4.5- (2); pH 5.0- (3); pH 5.5-

(4); pH 6.0- (5); pH 6.5- (6)

Hình 3.24 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH phản ứng tạo dẫn xuất C-FA đến hiệu suất

bắt gốc DPPH (E) và ABTS.+ (F) ở những nồng độ khác nhau

Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện nồng độ dẫn xuất C-FA có thể trung hòa được 50 % gốc tự

do DPPH và ABTS.+

Hình 3.26 Dẫn xuất C-FA tạo thành ở các nồng độ acid ferulic 30 mM- (1); 40mM- (2);

50mM- (3); 60mM- (4); 70 mM- (5)

Hình 3.27 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ FA phản ứng tạo dẫn xuất C-FA đến

hiệu suất bắt gốc DPPH (G) và ABTS.+ (H) ở những nồng độ khác nhau

Hình 3.28 Biểu đồ thể hiện nồng độ dẫn xuất C-FA có thể trung hòa được 50 % gốc tự

do DPPH và ABTS.+

Hình 3.29 Chitosan- (A); dẫn xuất C-FA- (B)

Hình 3.30 Biểu đồ thể hiện hiệu suất bắt gốc tự do DPPH và ABTS.+ của dẫn xuất C- FA

4.5; dẫn xuất C-FA 6.0 so sánh với mẫu C; mẫu C &FA

Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hoạt tính kháng khuẩn của dẫn xuất C-FA 6.0 so với các mẫu

đối chứng

Hình 3.32 Khả năng kháng khuẩn của dẫn xuất chitosan đối với các chủng vi khuẩn

Bacillus cereus (A), Staphylococcus aureus (B), Pseudomonas aeruginosa (C), Salmonella typhi (D) 1- Tetracylin 10 µg/ml pha trong acid acetic 2%; 2- Acid

acetic 2%; 3- Chitosan pha trong acid acetic 2%; 4- Dẫn xuất chitosan ở pH 6.0 pha trong acid acetic 2%

Hình 3.33 Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ đục của môi trường nuôi cấy Bacillus cereus có

bổ sung các chất thử nghiệm

Hình 3.34 Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ đục của môi trường nuôi cấy Staphylococcus

aureus có bổ sung các chất thử nghiệm

Hình 3.35 Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ đục của môi trường nuôi cấy Pseudomonas

aeruginosa có bổ sung các chất thử nghiệm

Hình 3.36 Đồ thị thể hiện sự thay đổi của mối trường nuôi cấy Salmonella có bổ sung

các chất thử nghiệm

Hình 3.37 Dẫn xuất C-FA 6.0- (5); Dẫn xuất C-FA 4.5- (4); Chitosan- (3); C&FA- (2);

Acid ferulic - (1)

Hình 3.38 Quang phổ UV/Vis của dẫn xuất chitosan tạo ra ở pH 6.0 (C-FA 6.0), dẫn

xuất chitosan tạo ra ở pH 4.5 (C-FA 4.5), mẫu chitosan đối chứng (C), mẫu acid ferulic (FA) và mẫu chitosan với acid ferulic không có sự tham gia của laccase (C&FA)

Hình 3.39 Phổ IR của chitosan (C)

Hình 3.40 Phổ IR kết hợp dẫn xuất C-FA 6.0 và chitosan

Hình 3.41 Phổ IR kết hợp dẫn xuất C-FA 4.5 và chitosan

Hình 3.42 Phổ 1H-NMR của chitosan trong CD3COOD và D2O

Hình 3.43 Phổ 1H-NMR của C-FA 4.5 trong CD3COOD và D2O

Hình 3.44 Phổ 1H-NMR của C-FA 6.0 trong CD3COOD và D2O

Hình 3.45 Đồ thị thể hiện phần trăm độ giảm trọng lượng theo thời gian

Hình 3.46 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường tổng theo thời gian

Hình 3.47 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng vitamin C theo thời gian

Hình 3.48 Đồ thị biểu diễn sự giảm hàm lượng acid theo thời gian

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Bảo quản bằng hóa chất

Bảo quản bằng hóa chất là phương pháp dùng hóa chất để diệt vi sinh vật gây thối hỏng rau quả trong quá trình bảo quản

Nhúng nước ấm: Để kiểm soát bệnh than, nhúng vào nước ấm 5 phút ở 55oC,

15 phút ở 50-53oC hay 20 phút ở 47oC Khi nhúng như vậy, màng sáp bên ngoài của xoài bị bong, đồng thời làm sạch đất cát, vết bám [1]

Nhúng hóa chất: Để kiểm soát nấm gây hại trên xoài, người ta sử dụng Benomyl, Thiabendazol, Captan Ở Nam Phi người ta khuyên dùng dung dịch Benmyl 1 g/l để vừa chống nấm than vừa chống thối mềm Có thể cho thêm hydraure maleic để làm chậm chín [1]

Xông hóa chất: Ở Ấn độ, người ta xông etylen dibromua (EDB) với liều 28 g/m3 để diệt ruồi quả Ở Nam Phi xông với liều 16 mg/l trong 6h Ở Mỹ xông 2h ở

21oC [1]

Gói giấy tẩm hóa chất: Xoài được bọc trực tiếp bằng giấy tẩm hóa chất, tốt nhất là giấy sợi tẩm diphenyl (4.5-6.0 g/m2) [1]

Phương pháp bảo quản bằng hóa chất là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện

và có thể áp dụng ở quy mô lớn Tuy nhiên, khi sử dụng cần phải xem xét bởi việc dùng một loại hóa chất nào đó đều ít nhiều làm giảm khả năng tự đề kháng của rau quả tươi và ảnh hưởng đến chất lượng của nó, mặt khác có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người dùng

1.1.2 Bảo quản bằng chiếu xạ

Chiếu xạ là phương pháp sử dụng các tia ion hóa như tia X, α, β, γ,… có thể làm mất khả năng tích tụ ATP, thậm chí phá vỡ liên kết ATP, giảm hoạt độ enzyme tổng hợp ARN và ADN Tùy theo liều chiếu xạ mà tác dụng lên xoài sẽ khác nhau: diệt ruồi quả (0.5 kGy), diệt mọt hạt (2.5 kGy), làm chậm chín (10-15 kGy), tồn trữ được 12-13 ngày ở 25-30oC (12-25 kGy) [1]

Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, thuận tiện, có thể rau quả để trong bao bì khi xử lý và quan trọng là không có dư lượng hóa chất độc hại trên nguyên liệu Tuy nhiên, chi phí cho phương pháp này khá cao, làm giảm sức đề kháng của nguyên liệu, và sản phẩm có “mùi phóng xạ”

1.1.3 Bảo quản nhiệt độ lạnh

Lạnh là phương pháp bảo quản rau quả tươi vừa cổ nhất, vừa phổ biến nhất Tuy nhiên, xoài là loại trái cây nhạy cảm với lạnh Khi “xoài” bị cảm lạnh, ban đầu

sẽ xuất hiện các vết nâu ngoài vỏ, rồi các vết này lan toàn mặt vỏ, kém chống chịu bệnh than Vì thế, không bảo quản xoài chín dưới 12-13oC Tuy nhiên cũng có giống xoài trữ được ở 10oC mà không bị “cảm lạnh” [1]

Ở Ấn Độ, giống xoài xuất khẩu chủ lực Alphonso có thể bảo quản ở 5-6.5 oC được sau 7 tuần, 7-9oC được 4-5 tuần Ở Ôxtrâylia, xoài bảo quản ở 13oC được 3 tuần [1]

1.1.4 Bảo quản bằng điều chỉnh không khí

Bảo quản trong không khí được kiểm soát

Bảo quản trong khí quyển kiểm soát (controlled atmosphere –CA) là phương pháp bảo quản trong điều kiện phòng bảo quản kín, lạnh hoặc không lạnh, có hệ thống thông gió và cung cấp các khí oxy, nitơ, cacbonic với thiết bị đo nhiệt độ, độ

ẩm, các khí được kiểm soát một cách chặt chẽ Trong điều kiện CA: 5% CO2, 5%

O2, ở 8.3-10oC, xoài Alphonso của Ấn Độ bảo quản được 7 tuần [1]

Bảo quản trong không khí cải biến

Bảo quản trong không khí cải biến (modified atmosphere –MA) là phương pháp bảo quản bằng cách đựng rau quả tươi trong các túi chất dẻo như polyetylen (PE), polyvinyl clorua (PVC), butadiene-styren (BS), không khí sẽ bị thay đổi do hô hấp của rau quả chứa trong đó Ở Việt Nam, xoài cát Hòa Lộc bảo quản trong bao

PE có độ thấm oxy 2000 ml/m2.h được 15 ngày ở 10oC và 20oC Nếu dùng bao PE

có độ thấm oxy 4000ml/m2.h hay bao PVC- Styren chỉ được 5-10 ngày Nếu bảo quản trong không khí 13oC thì chỉ được 2-3 tuần [1]

Hiện nay, phương pháp tốt nhất để kéo dài thời gian bảo quản rau quả tươi là phương pháp hạ nhiệt độ môi trường bảo quản kết hợp với điều chỉnh không khí sẽ làm chậm quá trình sinh hóa xảy ra trong rau quả một cách hiệu quả mà không phải dùng đến hóa chất Tuy nhiên, các phương pháp này khá phức tạp, thiết bị đắt tiền, chi phí bảo quản cao và thay đổi đối với các loại và các giống rau quả khác nhau nên phương pháp này ít phổ biến

Bảo quản bằng sử dụng 1 lớp màng bao

Màng bao là một loại màng dùng để bọc rau quả Màng bao cần phải tạo các

lỗ hở li ti để có thể trao đổi khí ở mức độ cần thiết

Màng bao có thể là màng sáp (hỗn hợp sáp tự nhiên từ các loại trái cây có bổ sung thêm chất diệt nấm và phụ gia) Cụ thể, dung dịch Shellac 6 % hay sáp 7 % có chứa 0.25 % diphenyl, kéo dài thêm 12.5 % thời gian trữ lạnh với xoài xanh, và 66-

100 % với xoài chín (so với mẫu đối chứng) Nhũ tương S có 2.7 % chất khô, tăng thời hạn tồn trữ lên 83 % [1]

Vì xu hướng chung là phát triển bền vững, đòi hỏi phương pháp, hóa chất không độc hại, thân thiện với môi trường nên hiện nay màng chitosan đang được quan tâm nhiều bởi màng có vô số những lỗ nhỏ cho sự trao đổi khí ở mức cần thiết,

có tính sát khuẩn và diệt nấm tốt Xuan Zhu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của màng chitosan trong việc bảo quản xoài, tác giả nhận định sự ứng dụng màng bao chitosan có thể làm chậm quá trình chín của trái xoài [65]

MA là phương pháp đem lại hiệu quả kinh tế cao vì không cần hệ thống điều chỉnh khí đắt tiền Tuy nhiên, đây là một kĩ thuật khó thực hiện, ứng dụng vì sự tương tác giữa trái cây và màng bọc rất phức tạp

Khi bảo quản không sử dụng màng bọc, cường độ hô hấp cao và mất nhiều nước, vi sinh vật dễ dàng xâm nhập vào trái cây, làm cho trái cây chín nhanh và mau hư hỏng

Hình 1.1 Bảo quản trái cây không bọc màng

Trái cây bảo quản bằng màng bọc giúp giảm độ hấp thu O2 nên giảm cường

độ hô hấp Màng ngăn chặn sự thoát nước, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật, làm cho trái cây chậm chín, kéo dài thời gian bảo quản

Hình 1.2 Bảo quản trái cây có bọc màng

Một số loại màng theo kĩ thuật này đã được áp dụng trong bảo quản như: Polyetylen, Polyvinyl chloride, Low Density Polyetylen, Hight Density Polyetylen, sáp, CMC, chitosan, màng có thể ăn được (polysaccharide, protein, lipid)

Sử dụng màng bao có chứa glucose oxydase và catalase để loại trừ O 2

Glucose bị oxy hóa bởi oxy dưới tác dụng của glucose oxydase tạo ra gluconate làm lượng oxy trong thực phẩm giảm, quá trình hô hấp bị ức chế, nên thực phẩm kéo dài thời gian bảo quản

Sự thoát hơi nước

Sự thoát hơi nước

O2

CO2

Sự xâm nhập của tác nhân oxy hóa và vi sinh vật gây bệnh Tác nhân oxy hóa và

vi sinh vật gây bệnh

Bảo quản

Hình 1.3 Loại trừ O2 từ thực phẩm Dựa trên nguyên lí này, laccase cũng có khả năng loại trừ oxy trong quá trình bảo quản thực phẩm

Laccase (polyphenol-oxydase) sử dụng oxy làm chất nhận điện tử, nếu laccase được cố định và có khả năng hoạt động trong vật liệu tạo màng bọc trái cây thì có thể làm giảm quá trình hô hấp của trái cây, ức chế hoạt động của một số loài

vi sinh vật hiếu khí gây hư hỏng trái cây

Ưu nhược điểm của phương pháp bảo quản bằng enzyme

 Ưu điểm

Một số enzyme ứng dụng làm tác nhân bảo quản bởi chúng xúc tác phản ứng hóa học cực nhanh Enzyme không bị biến đổi trong phản ứng và có thể tái hoạt động sau phản ứng biến đổi cơ chất Bên cạnh đó, phương pháp sử dụng enzyme trong bảo quản an toàn đối với sức khỏe người tiêu dùng và thân thiện với môi trường

 Nhược điểm

Enzyme dễ bị tác động bởi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, pH, điều kiện hoạt động của enzyme rất khắc khe Phương pháp này đòi hỏi phải có một tiến trình kỹ thuật đặc biệt trong việc sáp nhập enzyme vào vật liệu tạo màng và có

Glucose

thể hoạt động trong màng bọc thực phẩm Phương pháp này được chấp nhận song

Trong khi đó laccase là một enzyme oxy hóa khử sử dụng oxy phân tử làm

chất nhận điện tử Theo tài liệu “Laccase và các ứng dụng của chúng” (Laccase and

their applications: a patent view) của tác giả Adinarayana Kunamneni và các cộng

tác viên, laccase còn được sử dụng khử oxy trong các sản phẩm chất béo (dẩu olive) tăng thời hạn bảo quản Việc lấy đi oxy phân tử trong không khí có ý nghĩa rất quan trọng trong việc loại bỏ tác động của vi sinh vật cũng như ngăn ngừa một số quá trình trao đổi chất đối với trái cây sau thu hoạch Cùng với việc tạo màng cũng làm giảm độ hấp thu O2 (giảm cường độ hô hấp), ngăn sự thoát hơi nước, ngăn sự xâm nhập của các loài vi sinh vật

Sử dụng CMC làm chất tạo màng chỉ có ý nghĩa trong việc loại O2, loại bỏ tác động của vi sinh vật, còn dẫn xuất chitosan được tạo ra nhờ laccase lại mang theo hoạt tính sinh học tốt để tăng cao hiêu quản bảo quản xoài

Bên cạnh đó khả năng phân hủy các chất hữu cơ khó phân hủy hoặc chất trừ sâu, chất diệt cỏ cũng có thể giúp cho việc loại bỏ các chất này trên vỏ bên ngoài của trái cây bị nhiễm vào trong quá trình trồng trọt Tuy nhiên trong phạm vi đề tài, nhóm thực hiện chưa đề ra mục tiêu này

1.3 CHITOSAN

Chitosan là một polymer tự nhiên có hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm

và chúng có khả năng tạo màng tốt Do đó chitosan là một trong những lựa chọn trong việc sử dụng bảo quản trái cây

1.3.1 Chitosan

Chitosan được cấu tạo bởi các đơn phân glucose, nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glycoside, là sản phẩm của phản ứng deacetyl hóa của chitin [21]

β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-Chitosan có 3 nhóm chức năng phản ứng: một nhóm amine ở vị trí C-2, một nhóm hydroxyl sơ cấp ở vị trí C-3 và một nhóm hydroxyl thứ cấp ở vị trí C-6 [10]

Độ hòa tan, khả năng phân hủy sinh học, khả năng phản ứng hóa học và hấp thu của chitosan phụ thuộc nhiều vào số nhóm amine tự do trên mạch polymer, có nghĩa là phụ thuộc nhiều vào thành phần của các đơn phân D-glucosamin bị acetyl hóa và không bị acetyl hóa [9] Các nhóm amine tự do (có pKa từ 6.2 đến 7.0) nhận proton trong môi trường acid có pKa nhỏ hơn 6.2 khiến cho chitosan có thể hòa tan tạo dung dịch đồng nhất [9]

1.3.2 Hoạt tính sinh học chitosan

Hoạt tính kháng vi sinh vật

Allan và Hadwiger (1979) là những người đầu tiên công bố về khả năng kháng khuẩn của chitosan, họ nhận thấy chitosan có tác động kháng đa dạng các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men và vi nấm) [53]

Một số cơ chế kháng khuẩn của chitosan :

+ Sự tương tác tĩnh điện của nhóm amine tích điện dương (-NH3+) ở vị trí

C-2 của monomer glucosamine ở điều kiện pH thấp hơn pKa (~6.3) với những gốc tích điện âm ở bề mặt tế bào của nhiều loại nấm và vi khuẩn Kết quả của sự tương tác này là làm thay đổi lớn bề mặt tế bào và tính thấm của màng tế bào dẫn tới việc

rò rỉ thành phần nội bào như protein, amino acid, glucose, lactate dehydrogenase và chất điện giải; ngăn cản sự vận chuyển các chất thiết yếu đi vào tế bào [7], [22], [24], [51], [53]

+ Chitosan tích điện dương có khả năng liên kết với DNA và nhờ vậy chitosan có khả năng ức chế tổng hợp RNA và protein [24], [51], [53]

+ Chitosan có thể hoạt động như là tác nhân kìm kẹp kim loại, những yếu tố

vi lượng, hay các chất dinh dưỡng thiết yếu để sinh vật không dùng được [38], [51]

+ Chitosan có khả năng gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và dẫn đến giết chết tế bào [41]

Một số nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được cho rằng phụ thuộc chủ yếu vào khối lượng phân tử (Mw) và độ deacetyl hóa (DD) của nó [51]

Liu và cộng sự (2001) đã quan sát những oligomer chitosan đã được đánh

dấu với Mw từ 5 – 8 kDa bên trong tế bào vi khuẩn E coli cho thấy chúng đã thể

hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt [33] Xia và Wu (1996), Zheng và Zhu (2003) cho

kết quả hoạt tính kháng khuẩn E.coli của chitooligosaccharide (COS) cao hơn so

với chitosan [63], [67] Goy và cộng sự (2009) cũng cho thấy chitosan có trọng lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chitosan có trọng lượng phân

tử cao [51]

Bảng 1.1 Ảnh hưởng độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử của

chitosan đến hoạt tính kháng khuẩn [24]

Đặc tính hóa lý Ảnh hưởng trên hoạt tính kháng khuẩn

DD tăng Liên kết tĩnh điện trên màng tế bào tăng

Sự thay đổi tính thấm của màng tăng

Mw tăng Sự thẩm thấu vào bên trong nhân tế bào giảm

Tuy nhiên các kết quả về hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được công bố bởi các tác giả đôi khi lại trái ngược nhau Cụ thể, nghiên cứu của Hong Kyoon No (2002) và cộng sự cho thấy chitosan có khối lượng phân tử cao có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan có khối lượng phân tử thấp hơn [42] Park và cộng sự (2004)

đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với mức độ deacetyl hóa khác nhau trên 3 loài vi khuẩn Gram âm, và 5 loài vi khuẩn Gram dương cho thấy chitosan với độ deacetyl hóa 75 % cho khả năng kháng khuẩn cao hơn khi so sánh với chitosan có độ deacetyl hóa 50 % và 90 % [47] Chung YC và cộng sự (2004) khi nghiên cứu mối quan hệ giữa hoạt tính kháng khuẩn của chitosan với đặc điểm

bề mặt tế bào vi khuẩn cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đối với vi khuẩn Gram âm mạnh hơn Gram dương [66] Như vậy, ngoài Mw, DD còn có

nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan do đó mà các kết quả nghiên cứu không hoàn toàn thống nhất với nhau

Hoạt tính kháng oxy hóa

Theo như Hisao Tomida và cộng sự (2009) nghiên cứu đặc tính kháng các gốc tự do của chitosan khác nhau khi khối lượng phân tử và nồng độ chitosan khác nhau Cụ thể, nồng độ chitosan càng cao thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao

Đối với các chitosan có khối lượng phân tử khác nhau thì kết quả cho thấy chitosan có khối lượng phân tử thấp (<30 kDa) thì có đặc tính kháng oxy hóa cao, chitosan có khối lượng phân tử lớn hơn thì có hoạt tính kháng oxy hóa thấp [21]

Xing và cộng sự (2005) cho thấy chitosan với trọng lượng phân tử càng thấp thì tiềm năng “kìm kẹp” ion sắt càng cao [64] Sự kẹp ion kim loại là một trong những lý do tại sao chitosan có thể được xem như là chất kháng oxy hóa tiềm năng cho sự ổn định lipid [49]

Kết quả nghiên cứu của Xie và cộng sự (2001) công bố rằng các nhóm amine

tự do đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan, nhóm này hấp thụ ion H+ trong dung dịch để hình thành nhóm –NH3+, đây là nhóm hóa học có

khả năng kết hợp với các gốc tự do để tạo thành những phân tử ổn định [62] Park

và cộng sự (2004) khi nghiên cứu chitosan với mức DD 50 %, 75 %, 90 % lên khả năng bắt các gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), gốc hydroxyl, gốc superoxide, và gốc alkyl cho kết quả chitosan với độ DD càng cao thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao [48] Như vậy, nhóm amine tự do trong chitosan đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính bắt gốc tự do (bảng 1.2.)

Bảng 1.2 Ảnh hưởng độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử của

chitosan đến hoạt tính kháng oxy hóa [24]

Đặc tính hóa lý Ảnh hưởng trên hoạt tính kháng oxy hóa

Tiềm năng kìm kẹp ion kém

1.3.3 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản trái cây

So với những polysaccharide khác, chitosan có các tính chất ưu việt như phân hủy sinh học, kháng khuẩn, kháng nấm, không độc, vì vậy, chitosan được xem là một trong những polymer có giá trị nhất được dùng trong nhiều lĩnh vực y dược, công nghệ sinh học, môi trường, nông nghiệp, mỹ phẩm, đặc biệt có nhiều ứng dụng trong thực phẩm

Thật vậy, hoạt tính kháng khuẩn và đặc tính tạo màng của chitosan làm cho

nó trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng trong bảo quản thực phẩm, cải thiện chất lượng và thời gian sử dụng của các loại thực phẩm có các nguồn gốc khác nhau như nông nghiệp, gia cầm, thủy sản

Nhiễm nấm, rối loạn sinh lý và trầy dập bên ngoài là những tổn thất chính sau thu hoạch trái cây Một trong những giải pháp tiềm năng để kéo dài thời gian dự trữ các sản phẩm dễ hư hỏng là áp dụng lớp phủ, sau đó là bảo quản lạnh Lớp phủ như là một rào cản bảo vệ để giảm quá trình hô hấp và thoát hơi nước trên bề mặt trái cây, làm chậm sự tăng trưởng của vi sinh vật, sự thay đổi màu sắc và cải thiện chất lượng cấu trúc của các loại trái cây

Trái cây phủ với một lớp màng bán thấm sẽ làm chậm quá trình chín bằng cách thay đổi khí CO2, O2, và mức độ ethylene của trái cây Lớp phủ chitosan có khả năng thay đổi không khí sau màng bao mà không gây ra quá trình hô hấp kỵ khí bởi vì màng chitosan là màng thẩm thấu chọn lọc O2 hơn CO2 Vì vậy, màng bao chitosan khả năng thay đổi không khí trong các mô và có đặc tính kháng nấm nên

có tiềm năng kéo dài thời gian bảo quản và kiểm soát sự phân hủy của các loại trái cây [19]

1.4 ACID FERULIC

1.4.1 Acid Ferulic

Acid Ferulic (FA) có nguồn gốc từ quá trình biến dưỡng phenylalanine và tyrosine bởi con đường Shikimate trong thực vật [34]

Nó có mặt trong hạt và lá ở dạng tự do hay ở dạng liên kết cộng hóa trị với lignin và biopolymer khác Trong lúa mì, FA là ester liên kết với carbohydrate Dạng đồng phân trans- của nó chiếm ưu thế và chiếm 90 % trong tổng số acid phenolic trong bột mì FA cũng được tìm thấy trong các loại trái cây, một số loại rau quả như cam, cà chua, cà rốt, ngô, [34]

1.4.2 Cấu trúc hóa học

Acid ferulic (4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid) là một hợp chất phenolic,

nó có cấu trúc đặc biệt ba motif có thể đóng góp vào khả năng bắt gốc tự do của hợp chất này [34]

Hình 1.4 Cấu trúc của acid ferulic [34]

Sự hiện diện của các nhóm cho điện tử trên vòng benzen (3-methoxy và quan trọng hơn là 4-hydroxyl) của FA có thể làm chấm dứt chuỗi phản ứng gốc tự do Ngoài ra, nhóm acid cacboxylic trong FA với một liên kết đôi không bão hòa C-C

có thể cung cấp những vị trí tấn công cho các gốc tự do và do đó ngăn chặn chúng tấn công màng Ngoài ra, nhóm acid cacboxylic cũng hoạt động như cái neo của

FA, liên kết với màng lipid, cung cấp một sự bảo vệ chống quá trình peroxy hóa lipid Vì vậy, sự hiện diện của những nhóm thế cho điện tử này làm tăng cường hoạt tính kháng oxy hóa của FA [34]

1.4.3 Một số ứng dụng trong thực phẩm

Acid ferulic có nhiều hiệu quả sinh học bao gồm kháng khuẩn, kháng viêm, chống dị ứng, chống huyết khối, kháng virus, kháng ung thư và giãn mạch [34] nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực y học, mỹ phẩm và có cả thực phẩm

FA có độc tính thấp với LD50 (Lethal Dose, 50 %) là 2445 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột đực và 2113 mg/kg trọng lượng cơ thể chuột cái [54]

Tại Nhật Bản, FA được chấp nhận như là một phụ gia thực phẩm và sử dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên trong các loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm Ngoài ra, ở Mỹ và hầu hết các nước châu Âu, các dịch chiết xuất tự nhiên từ rau thơm, cà phê, đậu vani, một số cây gia vị và thực vật khác được đánh giá là có hàm lượng FA cao, và được thêm vào các loại thực phẩm như một chất chống oxy hóa đã được FDA phê duyệt [40] Một số ứng dụng trong thực phẩm chính như sau:

Acid ferulic là một chất bảo quản

Acid ferulic lần đầu tiên được sử dụng tại Nhật Bản vào năm 1975 để bảo quản cam và để ngăn chặn sự tự oxy hóa của dầu lanh, mỡ lợn, dầu đậu nành Hỗn hợp của FA và acid amino hoặc FA và dipeptide (glycylglycine, alanylalanine) đã gây ra một tác dụng đồng ức chế trên quá trình peroxy hóa acid linoleic [15]

So với các chất phenolic khác, FA có hai lợi thế Thứ nhất, FA có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh Heinonen và cộng sự (1998) kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa của acid galic, propyl gallate, acid caffeic, malvidin, delphinidin, catechin, epicatechin, rutin, quercetin và acid ferulic trong hệ thống oxy hóa lecithin-liposome Kết quả FA đạt hiệu quả cao nhất trong sự ức chế quá trình oxy hóa lipid

và protein [20] Một lợi thế nữa là FA ít bị ảnh hưởng nhiều bởi những thay đổi pH hơn các hợp chất phenolic khác (acid chlorogenic, acid caffeic và acid gallic) Điều này là rất quan trọng đối với thực phẩm bị xử lý kiềm (thực phẩm xử lý kiềm để protein ngũ cốc và các loại đậu được bảo vệ hoặc để kích thích sự hình thành sợi thịt cũng như protein thực vật hoặc để chuẩn bị bóc vỏ trái cây và rau quả) [13]

FA có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm và nấm men FA từ dịch chiết của một số loài thực vật cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn [54] Lattanzio và cộng sự (1994) thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của 12 loại các hợp chất phenolic

với năm nấm (Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Alternia sp, Botrytis

cinerea và Penicillium digitatum) thì thấy rằng FA cho kết quả hoạt động cao nhất

[32] Nó đã được báo cáo rằng feruloyl oligosaccharide ester cho thấy tác dụng ức

chế nhiều loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn âm [25] FA ở nồng độ của 500

mg/l cũng có thể ức chế sự tăng trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae,

nhưng hiệu quả thấp hơn potassium sorbate [54]

Acid Ferulic là một tác nhân tạo liên kết ngang

FA được biết đến qua liên kết với polysaccharide, nó được sử dụng để làm tăng độ dẻo và hình thành gel từ một số polysaccharide như pectin và arabinoxylan [43] Sự hình thành gel cũng có thể được thực hiện từ feruloylated arabinoxylan và protein sử dụng các tác nhân liên kết như amonium sulfate [60], hydrogen peroxide hay peroxidase [44] và laccase [36] Ferulic và oxide của nó, acid quinoid ferulic,

có thể phản ứng với một số acid amino trong protein như tyrosine, lysine, cysteine

và những phân tử protein qua liên kết ngang [23], [45] Vì vậy, nó có thể được sử dụng như một tác nhân liên kết ngang để cải thiện các tính chất của màng protein ăn được

Kwok và Ou thấy rằng sự kết hợp của FA vào dung dịch tạo màng làm từ protein isolate đậu nành (soy protein isolate- SPI) thì sẽ tăng độ bền, độ dai, giảm

sự thấm hơi nước và sự thấm khí của màng SPI [54]

1.5 LACCASE

1.5.1 Định nghĩa

Laccase (benzenediol: oxy oxidoreductase, EC 1.10.3.2) thuộc họ enzyme oxidase đa đồng cùng với các enzyme khác như ascorbic oxidase ở thực vật,

ceruloplasmin ở động vật có vú hay Fet3p ferroxidase từ Saccharomyces cerevisiae

Các enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa các cơ chất khác nhau với sự khử cùng lúc phân tử oxy thành nước Yoshida là người đầu tiên phát hiện ra laccase vào năm

1883 sau khi quan sát mủ của cây sơn mài (Rhus vernicifera) Nhật Bản đã đông

cứng lại dưới sự có mặt của không khí [5]

Laccase được tìm thấy nhiều ở thực vật vì nó liên quan đến sự tổng hợp lignin, một thành phần cấu trúc của vách tế bào thực vật, ngoài ra còn có ở một số côn trùng và vi khuẩn Tuy nhiên, hầu như laccase có ích trong công nghệ sinh học

là có nguồn gốc từ nấm Hơn 60 chủng nấm thuộc Ascomycetes, Deuteromycetes và đặc biệt là Basidiomycetes có hoạt tính laccase [5]

1.5.2 Cấu trúc phân tử

Phân tử laccase có dạng holoenzyme cụ thể là một dimer hay tetramer glycoprotein Mỗi monomer chứa 4 nguyên tử đồng gắn vào 3 vị trí khử (T1,T2 và T3 Trọng lượng phân tử mỗi monomer khoảng 50 kDa-100 kDa với điểm đẳng điện khoảng pH 4.0 Laccase có mức độ glycosyl hóa cao, hơn phân nữa liên kết cộng hóa trị với carbohydrate chiếm khoảng từ 10-50 % tổng khối lượng phân tử laccase Các carbohydrate (mannose, N-Acetylglucosamine và galactose) đóng góp vào sự ổn định cao cho laccase [5]

Cho đến gần đây, cấu trúc không gian ba chiều của laccase từ năm loại nấm

đã được báo cáo: Coprinus cinereus (ở dạng thiếu đồng T2), Trametes versicolor,

Pycnoporus cinnabarinus, Melanocarpus albomyces và Rigidoporus lignosus có

laccase với đầy đủ các ion Cu [4]

Hình 1.5 Trung tâm hoạt động của laccase [4]

Nguyên tử đồng T1 liên kết với một đoạn peptide gồm 2 gốc histidine và 1 gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền Nguyên tử đồng T2 liên kết với 2 histidine còn T3 phối hợp với 6 histidine, giữa hai nguyên tử đồng T3 được duy trì bởi cầu nối hydroxyl [4]

Thế khử của đồng loại T1 thay đổi từ 430 mV cho laccase từ cây R

vernicifera lên tới 780 mV cho laccase từ nấm Polyporus lang Hiệu quả xúc tác

(kcat/Km) của laccase đối với một số cơ chất phụ thuộc tuyến tính vào thế khử của đồng loại T1 có nghĩa là thế khử ở vị trí T1 càng cao thì hiệu quả xúc tác sẽ càng cao Đó là lý do tại sao laccase với một thế khử cao ở vị trí T1 được quan tâm đặc biệt trong công nghệ sinh học ví dụ như trong tẩy trắng hay các quá trình xử lý sinh học khác [4]

1.5.3 Cơ chế xúc tác

Những nguyên tử Cu trong phân tử laccase đóng một vai trò quan trọng trong

cơ chế xúc tác Có ba bước chính trong sự xúc tác laccase Cu loại 1 sẽ được khử bởi một cơ chất khử Sau đó điện tử này được chuyển từ Cu loại 1 tới cụm trinuclear được tạo thành từ những nguyên tử Cu loại 2 và Cu loại 3 để khử phân tử

O2 thành nước [4]

Cơ chế xúc tác đơn giản nhất của laccase đó là các phân tử cơ chất tương tác trực tiếp với trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm Laccase sử dụng oxy như chất nhận điện tử để loại bỏ những proton từ nhóm hydroxyl phenolic của lignin hay các hợp chất phenol đơn giản do thế khử của nó thấp Cơ chất bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase thường tạo gốc tự do không bền, tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme như hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa [4]

Tuy nhiên, đối với một số cơ chất phi phenolic không thể bị oxy hóa trực tiếp bởi laccase vì chúng quá lớn để đi vào tâm hoạt động của enzyme hoặc bởi vì chúng

có một thế khử đặc biệt cao Điều này có thể khắc phục được bằng cách bổ sung thêm chất được gọi là “chất trung gian hóa học (chemical mediators)” đó là các hợp chất hoạt động phù hợp như cơ chất trung gian cho laccase, dạng oxy hóa của chúng

có thể tương tác với những cơ chất mục tiêu có cấu trúc cồng kềnh hay thế khử cao [4]

Hình 1.6 Sơ đồ biểu thị quá trình oxy hóa cơ chất bởi laccase khi không có mặt (a)

hay có mặt (b) của chất trung gian hóa học [4]

1.5.4 Tính chất hóa sinh

Laccase từ các nguồn gốc khác nhau thì sẽ có tính đặc hiệu với cơ chất khác nhau Do đó, nhiều cơ chất đã được kiểm tra để đánh giá hoạt tính của laccase Hoạt tính của laccase được xác định bằng hằng số Michaelis (Km) và hằng số xúc tác (Kcat) Giá trị Km của laccase trong khoảng 2-5000 μM Giá trị Km của những laccase khác nhau đối với cùng một cơ chất hay khác cơ chất đều khác nhau Laccase thường có ái lực cao với ABTS và syringaldazine với hằng số xúc tác cao, trong khi đó quá trình oxy hóa của guaiacol và DMP thì chậm hơn và các hằng số

Km tương ứng cao hơn [28]

Ngoài hằng số Michaelis, hằng số đặc hiệu xúc tác của laccase thì hoạt tính

và sự ổn định của laccase còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau

pH tối ưu cho laccase hoạt động là từ 4 – 6, nếu pH quá kiềm hay quá acid có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của laccase Nếu pH quá cao thì có thể làm giảm khả năng oxy hóa khử của cơ chất phenolic, làm cho bề mặt nhạy cảm hơn trong quá trình oxy hóa của laccase Mỗi loại laccase được thu nhận từ các loại vi sinh vật khác

nhau thì nhiệt độ tối ưu đối với laccase khác nhau Laccase hoạt động tối ưu ở nhiệt

độ 30-50oC và nhanh chóng mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 60oC Laccase được

phân lập từ vi sinh vật chịu nhiệt như Streptomyces lavendulae có thời gian bán hủy

100 phút ở 70oC, Bacillus subtilis CotA là 112 phút ở 80oC Còn ở nấm thời gian bán hủy của laccase được 1 giờ ở 70oC và dưới 10 phút ở 80oC [28]

1.5.5 Một số ứng dụng trong thực phẩm

Laccase là một trong các loại enzyme oxy hóa có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện tử cuối cùng là oxy phân tử do đó chúng được ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp như dệt (cải biến, tẩy trắng và nhuộm màu sợi), bột giấy và giấy (khử lignin tẩy trắng giấy), tổng hợp chất hữu cơ, dược phẩm, môi trường (khử độc các chất gây ô nhiễm), công nghệ sinh học nano (cảm biến sinh học) [26] và đặc biệt laccase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Nhiều cơ chất của laccase như carbohydrate, acid béo chưa bão hòa, phenol

và protein chứa thiol- là những thành phần quan trọng của các loại thực phẩm hay

đồ uống Việc biến đổi các thành phần đó bởi laccase có thể hướng tới một chức năng mới, cải thiện được chất lượng và giảm giá thành của sản phẩm [26]

Chất lượng bia sẽ được cải thiện nhờ laccase Trong bia luôn tồn tại một lượng nhỏ proanthocyanidin, polyphenol, chúng sẽ làm cho protein bị kết tủa và hình thành vẩn đục trong quá trình bảo quản bia Do đó, việc sử dụng laccase cho quá trình oxy hóa polyphenol là một phương pháp thay thế cho phương pháp truyền thống để ngăn cản sự hình thành vẩn đục đã được thử nghiệm bởi nhiều tác giả [18] Theo như Mathiasen (1995) laccase có thể được thêm vào cuối của quá trình sản xuất bia để loại bỏ oxy không mong muốn trong bia thành phẩm ngăn chặn sự hình thành các hương vị lạ do oxy phản ứng với acid béo, acid amino, protein và rượu để kéo dài thời gian bảo quản [35]

Ngoài ổn định bia, ổn định rượu vang là một trong những ứng dụng chính của laccase trong ngành công nghiệp thực phẩm thay thế cho các chất hấp phụ vật

lý và hóa học [37] Rượu vang gồm một hỗn hợp phức tạp của các hợp chất hóa học khác nhau như ethanol, các acid hữu cơ (thơm), muối và các hợp chất phenolic

(màu sắc và hương vị) Polyphenol loại bỏ phải được chọn lọc để tránh mất sự thay đổi không mong muốn trong các đặc tính cảm quan của rượu vang Laccase cho thấy một số ưu điểm sử dụng để loại bỏ polyphenol nhờ sự ổn định trong môi trường acid và ức chế đảo ngược với sulphite [57] Ngoài ra, laccase còn được dùng

để xử lý nút chai làm bằng gỗ bần để loại các vết bẩn và các hợp chất phenolic trong nút chai rượu vang [8] Laccase cố định trên vật mang đồng-chelate đã được

sử dụng thành công để loại bỏ phenol từ nho [52] Phenol bị loại bỏ một phần bởi

xúc tác của enzyme đặc biệt là các hợp chất (-)-epicatechin, FA và acid o-coumaric Laccase xúc tác tạo thành hai hợp chất phức tạp từ FA là acid trans-5-((E)-2-vinyl-

carboxylic và acid (Z)-b-(4-((E)-2-carboxyvinyl)-2-methoxyphenoxy)-4-hydroxy-3-methoxy cinnamic [46]

carboxy)-2-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-methoxy-2,3-dihydrobenzofuran-3-Laccase còn được sử dụng trong bảo quản thực phẩm để loại bỏ oxy hòa tan, ngăn chặn quá trình oxy hóa làm hư sản phẩm, kiểm soát mùi hôi làm tăng vị giác

và loại bỏ một số thành phần không mong muốn khác Laccase được dùng để làm giảm vị cay, nóng và các vị khó chịu khác, được ứng dụng trong việc cải thiện hương vị và mùi vị của cacao, dùng trong công nghệ sản xuất trà xanh, trà đen đáp ứng nhu cầu thị trường do loại bỏ một phần các hợp chất phenol làm giảm vị đắng chát và tạo màu sắc cho trà [6] Các loại dầu thực vật có chứa một lượng lớn acid linoleic và acid linolenic có thể phản ứng với oxy hòa tan sinh các hợp chất dễ bay hơi không mong muốn Do đó, chất lượng hương vị của một số loại dầu có thể được cải thiện bằng cách loại bỏ oxy hiện diện trong dầu dưới tác dụng của laccase Laccase được thêm vào bột trong quá trình làm bánh để oxy hóa một số thành phần trong bột và tăng cấu trúc gluten trong bột làm mềm, giảm độ dính và tăng độ đàn hồi cho bột Laccase cũng được sử dụng để tạo các mối liên kết giữa acid ferulic và hợp chất pectin trong củ cải đường thông qua oxy hóa các mối liên kết hình thành dạng gel rất có tiềm năng trong thực phẩm [36]

1.6.1 Phương pháp hóa học

Wanvimol và Suwabun (2008) đã nghiên cứu sự gắn acid gallic lên chitosan nhờ các tác nhân hóa học 1-Ethyl-3(3’-dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC)

và N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sau khi EDC và NHS khởi đầu cho phản ứng ester trên acid gallic, thì các acid gallic đó sẽ phản ứng thế ở C-2 hoặc C-3 hoặc C-6 của chitosan Sự ghép acid gallic lên chitosan ở C-2 thu được liên kết amide, hoặc ở C-3 và C-6 thu được liên kết ester (hình 1.4.) Những nhóm thế này sẽ phá vỡ cấu trúc của chitosan, làm giảm liên kết hydro nội phân tử, vì vậy mà làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa của dẫn xuất chitosan [61]

Hình 1.7 Con đường phản ứng của chitosan gắn với acid gallic thông qua các tác

nhân gắn [61]

Tao Sun và cộng sự (2004) cũng nghiên cứu tạo hai dẫn xuất chitosan carboxymethy chitosan gắn acid maleic sodium (CMCTS-g-MAS) và hydroxypropyl chitosan gắn acid maleic (HPCTS-g-MAS) thông qua tác nhân hóa học gắn là ammonium persulphate [59]

Ưu điểm của phương pháp hóa học là phản ứng nhanh, dễ thực hiện, hiệu suất cao và rẻ tiền Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là sử dụng các chất hóa học độc hại có thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tạo sản phẩm phụ độc hại, ô nhiễm môi trường và hạn chế về mặt ứng dụng

1.6.2 Phương pháp sinh học

Cơ chế của sự ghép nối

Abdulhadi Aljawish và cộng sự (2012) nghiên cứu quá trình oxy hóa FA và

ethyl ferulate được xúc tác bởi laccase từ Myceliophtora thermophyla ghép nối lên

chitosan trong đệm phosphate 50 mM pH 7.5 ở 30oC Cơ chế có thể là Laccase oxy hóa FA và ethyl ferulate thành những gốc phản ứng liên kết cộng hóa trị với nhóm

NH2 ở vị trí C-2 của chitosan Các dẫn xuất chitosan tổng hợp được đều có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với chitosan bình thường [3]

Mojca Bozic và cộng sự (2012, 2013) sử dụng laccase từ Trametes

versicolor cho sự ghép nối giữa chitosan với acid caffeic và acid gallic Tác giả

nhận thấy những phản ứng ghép O-quinone-amino thông qua cơ chế base Schiff, phản ứng cộng gộp Michael, sự hình thành ester hay sự tương tác tĩnh điện giữa những oligomer hay polymer phenolic với chitosan phụ thuộc vào loại acid phenolic

và môi trường pH phản ứng [39], [40] Ở pH 6.5 và pH 5.5, xảy ra phản ứng base có hình thức C=N của imine Thêm vào đó là những phản ứng cộng Michael

Schiff-có sự chuyển những nhóm amin sơ cấp thành những nhóm amine thứ cấp, NH và những NH bẻ xuống trở nên nhiều hơn nhờ vào sự tăng nhóm hydroxyl của acid phenolic dẫn đến sự thay đổi cấu trúc của nó [40] Ở pH 4.5, đối với những acid gallic, acid caffeic chưa phân ly thì sẽ có sự hình thành liên kết ester giữa những nhóm carbonyl của chúng với nhóm hydroxyl ở vị trí C-6 trên chitosan Những acid gallic phân ly một phần, acid caffeic phân ly hoàn toàn và những oligomer/polymer của chúng cũng hình thành tương tác tĩnh điện với những nhóm amino tích điện dương của chitosan và sự thêm những liên kết hydrogen liên và nội phân tử giữa những nhóm cồng kềnh của vòng benzen và chitosan [40]

Hình 1.8 Các cơ chế của chitosan gắn với acid caffeic (phía trên) và acid gallic

(phía dưới) bằng sự xúc tác của laccase ở các pH khác nhau [40]

Có thể đưa ra cơ chế chung như sau:

Laccase có thể oxy hóa phenol và chuyển chúng thành những O-quinone phản ứng Sau đó, những O-quinone này sẽ liên kết với nhau hình thành những oligomer và/hoặc phản ứng phức tạp với những nhóm amine của chitosan không có

sự xúc tác của enzyme

Hình 1.9 Sự biến đổi chitosan với những quinone đã được tạo thành bởi laccase

[12]

Hóa học của phản ứng có thể là những quinone liên kết cộng hóa trị với những nhóm amine thông qua cơ chế phản ứng Schiff-base và/hoặc kiểu Michael [40]

1.6.3 Hoạt tính sinh học của dẫn xuất chitosan

Hoạt tính kháng oxy hóa

Theo như Mojca Bozic và cộng sự (2012) thì màng chitosan- acid gallic và chitosan- acid caffeic có hoạt tính bắt gốc ABTS.+ cao hơn nhiều khi so sánh với màng chitosan tự nhiên Đối với những điều kiện pH phản ứng thì hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất được tìm thấy đó là màng chitosan đã biến đổi ở pH 4.5 Có thể giải thích điều này như sau: Ở pH 4.5, một phần acid gallic được ghép nối thông qua đuôi carboxylic và một phần khác của nhóm carboxylic đã phân ly hình thành liên kết tĩnh điện với nhóm amino tích điện dương của chitosan Điều này tạo nên

sự ổn định cho vòng benzene với những gốc -OH tự do, do đó nó có hoạt tính kháng oxy hóa cao [40] Ngược lại, sự ghép nối hình thành ở pH 5.5 và pH 6.5, acid caffeic và acid gallic được liên kết cộng hóa trị bởi liên kết -NH- trên phân tử chitosan do đó những nhóm OH tự do của acid gallic, acid caffeic bị giảm do sự trở ngại về không gian vì vậy hoạt tính bắt gốc ABTS.+ chậm hơn so với phản ứng ở pH 4.5 [40]

Tuy nhiên, các kết quả công bố của Mojca Bozic và cộng sự (2013) lại cho kết quả trái ngược với kết quả nghiên cứu 2012 Khả năng bắt gốc tự do ABTS.+ của chitosan đã được ghép acid caffeic ở pH 4.5 cao hơn khi so với chitosan đã được ghép acid caffeic ở pH 6.5 Đối với acid gallic thì ngược lại, khả năng bắt gốc tự do ABTS.+ của chitosan đã được ghép acid gallic ở pH 6.5 cao hơn khi so với ở pH 4.5 [39]

Abdulhadi Aljawish và cộng sự (2012) nghiên cứu quá trình oxy hóa FA và ethyl ferulate (EF) được xúc tác bởi laccase ghép nối lên chitosan trong đệm phosphate 50 mM, pH 7.5 ở 30oC Đối với khả năng bắt gốc tự do DPPH, ABTS.+cũng như là phương pháp đo năng lực khử, hoạt tính kháng oxy hóa của dẫn xuất C-

FA đều cao hơn dẫn xuất C-EF Nguyên nhân có thể là do đặc tính kháng oxy hóa của FA tinh cao hơn ethyl ferulate tinh và có thể do số lượng những sản phẩm của quá trình oxy hóa FA bởi laccase gắn lên chitosan cao hơn những sản phẩm của ethyl ferulate gắn lên chitosan [3]

Như vậy, có thể có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxy hóa của chitosan đã biến đổi cụ thể như loại acid phenolic sử dụng, số lượng sản phẩm oxy hóa của acid phenolic gắn lên chitosan, môi trường pH phản ứng gắn hay phương pháp sử dụng để kiểm tra khả năng kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng khuẩn

Nghiên cứu của Mojca Bozic và cộng sự (2012) cho thấy ảnh hưởng của hai loại màng chitosan đã được gắn với acid gallic và màng chitosan gắn với acid caffeic phản ứng ở ba pH 4.5, 5.5 và 6.5 đến khả năng kháng khuẩn trên 3 loại vi

khuẩn và khả năng kháng nấm trên C albicans Kết quả nghiên cứu cho thấy sự ghép chitosan ở pH 5.5 và pH 6.5 hoạt tính kháng khuẩn đối với E coli và L

monocytogenes giảm khi so sánh với chitosan đối chứng Ngược lại, sự ghép

chitosan ở pH 4.5 có hoạt tính kháng E coli và L monocytogenes tăng, đặc biệt những chitosan gắn acid gallic ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng E coli Tuy nhiên đối với chủng vi khuẩn S enteric, màng chitosan gắn acid gallic hay acid caffeic ở

pH 4.5, 5.5, hay 6.5 đều có hoạt tính kháng chủng vi khuẩn này gần như nhau khi so

sánh với chitosan đối chứng Trong trường hợp kháng nấm C albicans, màng

chitosan đã được ghép ở pH 5.5, 6.5 thì hoạt tính kháng nấm cao hơn màng chitosan được ghép ở pH 4.5 nhưng đối với chitosan đối chứng thì hoạt tính kháng nấm không tăng đáng kể [40] Qua đây cho thấy, không phải chỉ có pH phản ứng cho quá trình ghép acid phenolic lên chitosan làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn mà còn có yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật đó

là loại vi sinh vật sử dụng Và không phải chitosan sau khi được biến đổi lúc nào cũng có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chitosan ban đầu

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Nhìn chung tổng hợp dẫn xuất từ chitosan và hợp chất acid phenolic bằng phương pháp sinh học đã được công bố nhiều Tuy nhiên, nghiên cứu tạo dẫn xuất chitosan- acid ferulic và ứng dụng dẫn xuất này vào bảo quản trái cây vẫn còn ít được nghiên cứu Có thể liệt kê một số công trình nghiên cứu sau:

G Elegir và cộng sự (2008) nghiên cứu màng bao cellulose kháng khuẩn thông qua sự ghép nối với những hợp chất phenolic nhờ laccase Laccase xúc tác quá trình polymer hóa acid caffeic và isoeugenol giúp tăng cường hoạt tính kháng

khuẩn như Staphylococcus aureus, E coli trong môi trường lỏng Những giấy

handsheet đã được xử lý bề mặt với laccase và những hợp chất phenol thì có hiệu quả cao trong việc chống lại vi khuẩn Gr- và Gr+ hơn là những giấy handsheet chỉ được xử lý với những dẫn xuất monomer phenol Hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào chức năng của cấu trúc gắn, thời gian gắn và nồng độ của các dẫn xuất hợp chất phenolic [14]

Guillem Rocasalbas và cộng sự (2013) đã nghiên cứu sự hỗ trợ của laccase trong quá trình hình thành hydrogel ổn định giữa chitosan và gelatin với các

polyphenol từ thực vật Hamamelis virginiana Dịch chiết polyphenolic sẽ bị oxy

hóa bởi laccase, sau đó liên kết cộng hóa trị với chitosan và gelatin để thu được hydrogel có hoạt tính sinh học và ổn định dùng làm băng gạc cho việc điều trị những vết thương kinh niên Nguyên liệu này có hiệu quả kháng khuẩn chống lại

Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus và ức chế những enzyme có

hại đến vết thương như myeloperxidase và collagenase Hydrogel ổn định và chống lại sự phân hủy của lysozyme đạt được sau khi phản ứng 2 giờ với laccase Sau khi

ủ 24h, khả năng ức chế của hydrogel đối với myeloperxidase và collagenase tương ứng là 32 % và 79 % [16]

Randal L Shogren và cộng sự (2013) đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của hỗn hợp gồm có sự đồng ghép nối hai polymer đó là tinh bột và lignosufonate

(SLS) nhờ sự xúc tác của laccase từ Trametes versicolor Sự ghép nối giữa tinh bột

và SLS có hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả tạo nền tảng cho việc chuẩn bị những polymer kháng oxy hóa tiềm năng trong việc tạo màng bao trái cây, rau quả, băng gạc vết thương, hoặc dùng trong mỹ phẩm [50]

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việc tạo ra màng bao thực phẩm bằng chitosan bao bọc trái cây, thịt, trứng, cá, đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều tại Việt Nam Cụ thể, Lê Thị Minh Thúy (2008) đã tạo màng bao chitosan có sự phối trộn với gelatin và phụ gia sodium benzoate để bảo quản phi lê cá ngừ đại dương [75] Nguyễn Thị Lan (2009)

đã tạo màng bao chitosan để bảo quản trứng gà [76] Trần Thị Kim Tâm (2010) đã nghiên cứu bảo quản quả dâu tây với màng bán thấm chitosan [2]

Tuy nhiên, việc nghiên cứu gắn acid ferulic lên chitosan dưới sự xúc tác của laccase ứng dụng bảo quản trái cây vẫn chưa được nghiên cứu và quan tâm nhiều trong nước

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu dùng cho tổng hợp dẫn xuất C-FA

Chitosan được phân phối từ công ty ChitoWorld, Khu Công Nghiệp Tân Tạo, Tp HCM với độ deactyl hóa trên 90 %

Laccase từ chủng nấm Pleurotus sp được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm của

Bộ môn Sinh hóa, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Môi trường lỏng để nấm phát triển trong 9 ngày nuôi cấy lắc gồm có KH2PO4 0.3 %, Na2HP04 1.5 %, NaCl 0.5 %, MgSO4 0.02 %, glucose 2.2 %, yeast extract 0.2 %, NH4Cl 0.2 % và 0.5 mM CuSO4

Acid Ferulic từ công ty Sigma (Mỹ)

- Nồi Autoclave Wise Clave

- Tủ cấy an toàn sinh học

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

CMC và chitosan được lựa chọn để khảo sát khả năng tạo màng bảo quản xoài CMC tạo màng ngăn sự thoát hơi nước và sự xâm nhập của vi sinh vật CMC làm chất mang chứa laccase, sự hoạt động của laccase giúp giảm thiểu O2 xâm nhập Chitosan bị oxy hóa bởi hợp chất ferulic acid dưới tác động của laccase được