Investigation of chemical constituents of vietnamese medicinal plants and synthesis of their derivatives inhibit DPPH, tyrosinase, and human cancer cell lines

TÓM TẮTTừ 12 mẫu cây thuốc Việt Nam, bao gồm: trái Sa kê, Artocarpus altilis; cây An điền hoa nhỏ, Hedyotis tenelliflora; cây An điền nhám, Hedyotis rudis; cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthe

MỤC LỤC

TÓM TẮT 4

ABSTRACT 5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 8

LỜI CẢM ƠN 9

BÁO CÁO TÓM TẮT 10

CHƯƠNG 1: MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 21

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Phương pháp cô lập các hợp chất tinh khiết 23

3.1.1 Phương pháp cô lập các hợp chất từ trái Sa kê, Artocarpus altilis 23

3.1.2 Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây An điền hoa nhỏ, Hedyotis tenelliflora 23

3.1.3.Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây An điền nhám, Hedyotis rudis 24

3.1.4 Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá và rễ cây Xuân hoa đỏ, Pseuderanthemumcarruthersii 24

3.1.5.Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá và rễ cây Xuân hoa mạng, Pseuderanthemum reticulatum 26

3.1.6.Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá và rễ câyBông cẩm, Pseuderanthemum andersonii 26

3.1.7.Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây Sơn cúc Ba Thùy, Wedelia trilobata 26

3.1.8 Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây Sơn cúc hai hoa, Wedelia biflora 27

3.1.9 Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá cây Neem, Azadirachta indica 27

3.1.10 Phương pháp cô lập các hợp chất từ hạt và vỏ quả cây Tô mộc, Caesalpinia sappan 28

3.1.11 Phương pháp cô lập các hợp chất từ vỏ và trái cây Còng mù u, Calophyllum

thorelii………

… 28

3.1.12 Phương pháp cô lập các chất từ lá cây Còng núi, Calophyllum dryobalanoides…29 3.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 29

3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa 29

3.4.Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 30

3.5.Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzymeα-glucosidase 30

3.6 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzymeacetylcholinesterase 30

3.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 31

3.8.Phương pháp điều chế các dẫn xuất 31

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

4.1 NỘI DUNG 1, 2, 3: Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ một số cây thuốc nghiên cứu 33

4.1.1 Trái Sa kê, Artocarpus altilis 33

4.1.2 Cây An điền hoa nhỏ, Hedyotis tenelliflora 33

4.1.3.Cây An điền nhám, Hedyotis rudis 34

4.1.4 Cây Xuân hoa đỏ,Pseuderanthemumcarruthersii 35

4.1.5 Cây Xuân hoa mạng,Pseuderanthemum reticulatum 37

4.1.6 Cây Bông cẩm, Pseuderanthemum andersonii 38

4.1.7 Cây Sơn cúc ba thuỳ, Wedelia trilobata 39

4.1.8 Cây Sơn cúc hai hoa,Wedelia biflora 40

4.1.9 Lá cây Neem,Azadirachta indica 42

4.1.10 Hạt và vỏ hạt Tô mộc,Caesalpinia sappan 44

4.1.11 Cây Còng mù u,Calophyllum thorelii 45

4.1.11 Cây Còng mù núi,Calophyllum dryobalanoides 47

4.2 NỘI DUNG 4: Điều chế dẫn xuất 48

4.2.1 Tổng hợp các sản phẩm ester hóa tại chức acid C-28 của acid betulinic với các alkyl halide 49

4.2.2 Tổng hợp các sản phẩm ester hóa tại chức rượu C-3 của acid betulinic với các dẫn

xuất acid chloride 49

4.2.3 Tổng hợp các sản phẩm ester hóa tại chức acid C-28 của acid ursolic với các alkyl halide 50

4.2.4.Tổng hợp các sản phẩm ester hóa tại chức rượu C-3 của acid ursolic với các dẫn xuất acid chloride 50

4.2.5 Tổng hợp các sản phẩm gồm oxy hóa chức rượu C-3 của acid ursolic, sau đó alkyl hóa với các dẫn xuất alkyl bromide 51

4.2.6 Oxy hóa tại vị trí C-11 51

4.3 NỘI DUNG 5: Thử hoạt tính sinh học 52

4.3.1 Hoạt tính kháng oxi hóa (ức chế gốc tự do DPPH) 52

4.3.2 Hoạt tính ức chế enzym tyrosinase 52

4.3.3 Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 53

4.3.4 Hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase 54

4.3.5 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 55

4.4 NỘI DUNG 6: Công bố kết quả 58

4.4.1 Tạp chí chuyên ngành quốc tế 58

4.4.2 Tạp chí chuyên ngành trong nước 59

4.4.3 Tham dự hội nghị khoa học quốc tế 61

4.4.3 Tham dự hội nghị khoa học trong nước 61

4.5 Kết quả tham gia đào tạo sau đại học 63

4.5.1 Thạc sĩ 63

4.5.2 Tiến sĩ 64

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

TÓM TẮT

Từ 12 mẫu cây thuốc Việt Nam, bao gồm: trái Sa kê, Artocarpus altilis; cây An điền hoa nhỏ, Hedyotis tenelliflora; cây An điền nhám, Hedyotis rudis; cây Xuân hoa đỏ,

Pseuderanthemumcarruthersii; cây Xuân hoa mạng, Pseuderanthemum reticulatum;

câyBông cẩm, Pseuderanthemum andersonii; cây Sơn cúc Ba Thùy, Wedelia trilobata;cây Sơn cúc hai hoa, Wedelia biflora;lá cây Neem, Azadirachta indica; hạt và vỏ hạt cây Tô mộc,

Caesalpinia sappan; vỏ và trái cây Còng mù u, Calophyllum thorelii; lá cây Còng núi, Calophyllum dryobalanoides; đã cô lập và xác định được cấu trúc của 155 hợp chất, trong

đó có 38 hợp chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới Từ hai acid chiếm hàm lượng lớn, acid ursolic và acid betulinic, đã điều chế được 8 dẫn xuất của acid betulinic và 17 dẫn xuất của acid ursolic Tiến hành nghiên cứu các hoạt tính sinh học của các hợp chất cho thấy

có 2 hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do DPPH với giá trị IC50< 100M từ trái Sa kê; 3 hợp chất có khả năng ức chế enzym tyrosinase với giá trị IC50< 100M từ vỏ hạt Tô mộc; 16 hợp chất có khả năng ức chế enzym α-glucosidase với giá trị IC50< 100M từ lá cây Neem;

20 hợp chất có khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase dưới 50% ở nồng độ 100g/mL

từ cây Xuân hoa đỏ; có 5 hợp chất có khả năng ức chế MCF-7 và một hợp chất ức chế HeLa dưới 81% ở nồng độ 100g/mL từ cây Xuân hoa đỏ; 4 hợp chất có hoạt tính trung bình trên các dòng tế bào HeLa, MCF-7 và NCI-H460 với giá trị IC50< 100g/mL từ cây Còng mù u;

3 hợp chất có hoạt tính mạnh trên dòng tế bàoPANC-1 với giá trị IC50< 100M từ hạt Tô mộc; 1 hợp chất dẫn xuất của acid ursolic có hoạt tính mạnh hơn acid ursolic trên các dòng

tế bào HeLa, MCF-7, HEP G2 và NCI-H460 Từ các kết quả trên, đề tài đã đăng được 7 bài báo quốc tế và 18 bài báo trong nước; tham gia 3 hội nghị quốc tế và 6 hội nghị trong nước; đào tạo 10thạc sĩ và 3tiến sĩ

From 12 Vietnamese medicinal plants, including: Artocarpus altilis, Hedyotis

tenelliflora, Hedyotis rudis, Pseuderanthemumcarruthersii, Pseuderanthemum reticulatum, Pseuderanthemum andersonii, Wedelia trilobata,Wedelia biflora,Azadirachta indica, Caesalpinia sappan,Calophyllum thorelii, Calophyllum dryobalanoides, 155 natural

compounds have been isolated, among them, 38 were new compounds From ursolic and betulinicacids, 8 betulinicacid and 17 ursolic acid derivatives have been synthesized Studies

on biological activities indicated that 2 compounds show DPPH scavenging inhibitory activity with IC50values < 100M fromA altilis, 3compounds possessed tyrosinase

inhibitory activity with IC50values< 100M from C sappan; 16compounds showed

α-glucosidase inhibitory activity with IC50values< 100M from A indica; 20 compounds displayed acetylcholinesterase inhibitory activity <50% at 100g/mLfromP carruthersii;5

compounds possessed anti-cytotoxicity activity against MCF-7 and 1 against HeLa cancer

cell line < 81% at 100g/mLfromP carruthersii;4compounds showed moderate activity

against HeLa, MCF-7 and NCI-H460cancer cell lines with IC50values < 100g/mL from C

thorelii; 3 compounds displayed strong activity against PANC-1cancer cell line with

IC50values < 100Mfrom the seed of C.sappan; 1 ursolic acid derivative possessed stronger

activity than ursolic acid against HeLa, MCF-7, HEP G2 và NCI-H460 cancer cell lines From these results, we published 7 international and 18 national papers, took part in 3 international and 6 national conferences, trained 10 master and 3 PhD students

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EtOAc: Ethyl acetate

C-NMR: 13C- Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

COSY: COrrelation SpectroscopY

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation spectroscopy HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation spectroscopy NOESY: Nuclear Overhause Effect Spectroscopy

LC-MS: Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy

HR-ESI-MS: HighResolution ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry

DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH (IC50) của các mẫu cao chiết và hợp chất cô lập từ trái Sa kê

Bảng 2: Phần trăm ức chế và IC50 trên thử nghiệm hoạt tính ức chế enzymeα-glucosidasecủa

các hợp chất phân lập từ lá cây Neem

Bảng 3: Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase trên các hợp chất

cô lập từ cây Pseuderanthemum carruthersii

Bảng 4: Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên dòng ung thư vú MCF–7 và ung

thư cổ tử cung HeLa trên các hợp chất cô lập từ cây Pseuderanthemum carruthersii

Bảng 5: Nồng độ gây độc tế bào IC50 (µg/ml) của các benzophenon thu được từ cây còng

mù u trên các dòng tế bào HeLa, MCF-7, NCI-H460

Bảng 6:Giá trị IC50 (µM) của các cleistantan diterpencô lập được từ hạt Tô mộc trên dòng tế

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1: Cấu trúc các hợp chất cô lập từ trái Sa kê

Hình 2: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây An điền hoa nhỏ

Hình 3: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây An điền nhám

Hình 4: Cấu trúc các hợp chất terpenoid được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 5: Cấu trúc các hợp chất lignan được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 6: Cấu trúc các hợp chất có chứa nitrogen được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 7: Cấu trúc các hợp chất flavonoid được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 8: Cấu trúc các hợp chất phenylethanoid được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 9: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây Xuân hoa mạng

Hình 10: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây Bông cẩm

Hình 11: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây Sơn cúc ba thuỳ

Hình 12: Cấu trúc các hợp chất cô lập từ cao ether petroleum và cao chloroform của cây Sơn cúc hai hoa

Hình 13: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cao ethyl acetate của cây Sơn cúc hai hoa Hình 14: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ lá cây Neem, Azadirachta indica

Hình 15: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cao dichloromethane của hạt Tô mộc

Hình 16: Cấu trúc các hợp chất cô lập từ vỏ quả Tô mộc

Hình 17: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cao ether petroleum của trái cây Còng mù Hình 18: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cao EtOAc của trái cây Còng mù u

Hình 19: Cấu trúc các hợp chất cô lập từ cao EtOAc của vỏ cây còng mù u

Hình 20: Cấu trúc các hợp chất cô lập từ cao eter dầu hỏa của vỏ cây còng mù u

Hình 21: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cao ethyl acetate của vỏ cây Còng núi

Hình 22:Sơ đồ tổng hợp các sản phẩm ester hóa tại chức acid C-28 của acid betulinic với các alkyl halide

Hình 23:Sơ đồ tổng hợpcác sản phẩm ester hóa tại chức rượu C-3 của acid betulinic với các dẫn xuất acid chloride

Hình 24:Sơ đồ tổng hợpcác sản phẩm ester hóa tại chức acid C-28 của acid ursolic với các alkyl halide

Hình 25:Sơ đồ tổng hợpcác sản phẩm ester hóa tại chức rượu C-3 của acid ursolic với các các dẫn xuất acid chloride

Hình 26:Sơ đồ tổng hợp các sản phẩm gồm oxy hóa chức rượu C-3 của acid ursolic, sau đó alkyl hóa với các dẫn xuất alkyl bromide

Hình 27:Sơ đồ Oxy hóa tại vị trí C-11

2 Vo Thi Nga, Nguyen Phi Linh, Tuong Lam Truong, Vo Phung Nguyen, Nguyen Kim

Phi Phung, Nguyen Ngoc Suong, Constituents of the leaves of Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb.,Phytochemistry Letters,

5, 673-676, 2012

3 Nguyen Thi Ha Thu, Le Thi Thu Ha, Vo Thi Nga, Pham Nguyen Kim Tuyen, Ton That Quang, Forde–Riddick Danielle, Lawrence Michael Pratt, Nguyen Kim Phi

Phung, Six new phenolic glycosides and a new ceramide from the flowers of Wedelia

biflora and their cytotoxicity against some cancer cell lines, Natural Products

Calophyllum thorelii, Tetrahedron Letters,53, 4487-4493, 2012

6 Hai Xuan Nguyen, Mai Thanh Thi Nguyen, Thy Anh Nguyen, Nhi Y Thi Nguyen, Dao Anh Thi Phan, Phuoc Ho Thi, Trong Huu Phan Nguyen, Phu Hoang Dang, Nhan Trung Nguyen, Jun-ya Ueda, Suresh Awale, Cleistanthane diterpenes from the seed

of Caesalpinia sappan and their antiausterity activity against PANC-1 human

pancreatic cancer cell line, Fitoterapia, 91, 148-153, 2013

7 Y Nhi Thi Nguyen, Qui Kim Tran, Mai Thanh Thi Nguyen, Quan Le Tran,

Limonoids from the leaves of Azadirachta indica, Phytochemistry, submitted,

PHYTOCHEM-D-13-00647

4.4.2 Tạp chí chuyên ngành trong nước

1 Võ Thị Ngà, Nguyễn Phi Linh, Trần Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Kim Phi Phụng,

Nguyễn Ngọc Sương, Some phenylethanoids from roots of Pseuderanthemum

carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb Tạp Chí Hoá

Học,48(4B), 325-331, 2010

2 Nguyễn Phúc Đảm, Từ Đức Dũng, Lưu Huỳnh Vạn Long, Nguyễn Kim Phi Phụng,

Four triterpenoids from Hedyotis tenelliflora Blume (Rubiaceae) growing in Viet

Nam,Tạp Chí Hoá Học,48(4B), 250 – 254, 2010

3 Nguyễn Thị Hoài Thu, Tôn Thất Quang, Nguyễn Kim Phi Phụng, A new triterpenoid

from the flowers of Wedelia biflora (L.) DC (Asteraceae), Tạp Chí Hoá Học,48(4B),

350-354, 2010 (Hội nghị Hoá học toàn quốc lần thứ V, Hà Nội 16-17/11/2010)

4 Võ Thị Ngà, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Sương, Four phenylethanoids

from leaves of Pseuderanthemum carruthersii (Seem.) Guill var atropurpureum

(Bull.) Fosb (Acanthaceae),Tạp Chí Hoá Học,48(5), 539-545, 2010

5 Nguyễn Thị Lệ Thu, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Thorexanthon, một

xanthon mới từ trái cây Còng mù u (Calophyllum thorelii), Tạp chí Hóa học,48(4B),

360-364, 2010

6 Nguyễn Thị Lệ Thu, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Hợp chất phenol từ

cao etyl acetat của trái cây Còng mù u (Calophyllum thorelii), Tạp chí Dược liệu,

15(4), 234-237, 2010

7 Nguyễn Thị Lệ Thu, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Phân lập và nhận

danh hợp chất phenol từ vỏ cây Còng mù u (Calophyllum thorelii), Tạp chí Phân tích

Hóa, Lý và Sinh học,15(3), 26-31, 2010

8 Nguyễn Trung Nhân, Nguyễn Thị Thanh Mai., Cassane-type diterpenes from the

CH2Cl2 extract of the seed of Caesalpinia sappan L., Tạp chí Hóa học,48(4B),

393−397, 2010

9 Võ Thị Ngà, Nguyễn Phi Linh, Nguyễn Hoàng Minh Nhựt, Nguyễn Kim Phi Phụng,

Nguyễn Ngọc Sương, Four lignans from roots of Pseuderanthemum carruthersii

(Seem) Guill var atropurpureum (Bull.) Fosb, Tạp chí Phát Triển Khoa học và

Công Nghệ, 14 (2), 12-19, 2011

10 Trương Thị Hồng Nguyệt, Nguyễn Thị Hoài Thu, Tôn Thất Quang, Nguyễn Kim Phi

Phụng, Some compounds from flower of Wedelia trilobata (L.) Hitch (Asteraceae),Tạp

chí Phát Triển Khoa học và Công Nghệ,14(2), 20-27, 2011

11 Mai Anh Hùng, Nguyễn Phúc Đảm, Từ Đức Dũng, Ngo6 Thị Thùy Dương, Tôn Thất

Quang, Nguyễn Kim Phi Phụng, Iridoid glycosides from Hedyotis rudis and Hedyotis

tenelliflora growing in Viet Nam,Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 49(5B),

436-442,2011

12 Nguyễn Phi Linh, Võ Thị Ngà, Trần Thị Thanh Nhàn, Tôn Thất Quang, Nguyễn Kim

Phi Phụng, Contribution to the chemical constituents of Pseuderanthemum reticulatum

Radlk family of Acanthaceae, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ,49(5B), 728-734,2011

13 Nguyễn Trung Nhân, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Thị Thanh Mai, Nghiên cứu thành

phần hóa học cao n-hexan của trái cây sa kê Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg, họ

dâu tằm (Moraceae), Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, 14 (5), 43-49, 2011

14 Nguyễn Như Tâm, Nguyễn Kim Phi Phụng, Trần Thượng Quảng, Tống Thanh Danh,

Bán tổng hợp một số dẫn xuất của axít betulinic, Tạp chí Hóa học, 49 (2ABC),

546-550, 2011

15 Trần Thanh Phương, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Thành Quân, Tống Thanh Danh,

Tổng hợp các dẫn xuất mới của axít ursolic, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công

nghệ, 14 (K3), 49-53, 2011

16 Nguyễn Thị Ý Nhi, Trần Lê Quan, Trần Kim Qui, -glucosidase inhibitory limonoids

from the leaves ofAzadirachta indica Juss grown in Ninh Thuan province, Tạp chí

17 Đặng Hoàng Phú, Phan Nguyễn Hữu Trọng, Nguyễn Thành Đức, Nguyễn Trung Nhân,

Khảo sát thành phần hóa học của vỏ quả tô mộc (Caesalpinia sappan L.), họ

Caesalpiniaceae, Tạp chí Hóa học, 50 (4A), 242-245, 2012

18 Nguyễn Thị Trang, Hà Diệu Ly, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Khảo sát thành phần hóa

học cao ethyl acetate của vỏ cây còng núi (Calophyllum dryobalanoides), Tạp chí

Khoa học và Công nghệ,50(3A), 145-150, 2012

CHƯƠNG 1: MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Khảo sát thành phần hóa học của một số cây thuốc Việt Nam và điều chế một số dẫn xuất theo những định hướng thử nghiệm sinh học như tác dụng kháng oxy hóa, ức chế enzyme, kháng một số dòng tế bào ung thư người, góp phần làm giàu danh mục hợp chất tự nhiên trên thế giới đồng thời cung cấp những thông tin để phát triển lĩnh vực hóa dược của Việt Nam

Các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài bao gồm:

nghiên cứu

1 Sa kê Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg Dâu (Moraceae) Trái

2 An điền hoa nhỏ Hedyotis tenellifloraBl

Cà phê (Rubiaceae) Toàn thân

3 An điền nhám Hedyotis rudis Pierre ex Pit Toàn thân

5 Xuân hoa mạng Pseuderanthemum reticulatum Radlk Lá, rễ

6 Bông cẩm Pseuderanthemum andersonii Lindau Lá, rễ

7 Sơn cúc ba thùy Wedelia trilobata (L.) Hitch

Cúc (Asteraceae) Toàn thân

8 Sơn cúc hai hoa Wedelia biflora(L.) DC Toàn thân

9 Neem Azadirachta indica Xoan (Meliaceae) Lá

10 Tô mộc Caesalpinia sappan L Vang (Caesalpiniaceae) Hạt, vỏ hạt

11 Còng mù u Calophyllum thorelii Pierre

Bứa (Guttiferea) Vỏ cây, trái

12 Còng núi Calophyllum dryobalanoides Pierre Lá

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxi hóa của trái Sa kê, Artocarpus

altilis.

2 Khảo sát thành phần hóa học của cây An điền hoa nhỏ, Hedyotis tenelliflora

3 Khảo sát thành phần hóa học của cây An điền nhám, Hedyotis rudis

4 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase, hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của lá và rễ cây Xuân hoa đỏ,

7 Khảo sát thành phần hóa học của cây Sơn cúc Ba Thùy, Wedelia trilobata

8 Khảo sát thành phần hóa học của cây Sơn cúc hai hoa, Wedelia biflora

9 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của lá cây

Neem, Azadirachta indica

10 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, gây độc tế bào

ung thư tụy PANC-1 của hạt và vỏ hạt cây Tô mộc, Caesalpinia sappan

11 Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư HeLa,

MCF-7, NCI-H460 của vỏ và trái cây Còng mù u, Calophyllum thorelii

12 Khảo sát thành phần hóa học của lá cây Còng núi,Calophyllum dryobalanoides

13 Điều chế các dẫn xuất của acid ursolic và acid betulinic

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương pháp cô lập các hợp chất tinh khiết

Mỗi cây thuốc nghiên cứu sẽ được trích ly với một dung môi phù hợp, cô quay đuổi dung môi để thu được cao thô tương ứng Tiến hành điều chế các mẫu cao có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn Các mẫu cao sẽ được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi phù hợp thu được các phân đoạn cao Từ mỗi phân đoạn, tiến hành sắc ký cột nhiều lần, sắc ký bản mỏng điều chế để cô lập các hợp chất tinh khiết

3.1.1 Phương pháp cô lập các hợp chất từ trái Sa kê, Artocarpus altilis

Trái Sa kê Artocarpus altilis, được thu hái vào tháng 11 năm 2008 tại huyện Hóc

Môn-TP.HCM, được định danh bởi dược sĩ Phan Đức Bình - Phó tổng biên tập Bán nguyệt san

“Thuốc và Sức khỏe” TP Hồ Chí Minh Trái Sakê được cắt lát rồi sấy khô ở 50C

Trái Sakê khô (3,5kg) được nghiền nát rồi trích nóng với MeOH,lọc, thu hồi dung môi, thu được 810g cao MeOH thô Lấy cao này hòa tan trong nước và lần lượt chiết lỏng-lỏng

với các dung môi: n-hexane, chloroform và ethyl acetatethu được các cao tương ứng là: cao

n-hexane(650 g), cao chloroform(3,4 g), cao ethyl acetate(3,5 g)và dịch nước còn lại sau khi

chiết

Thực hiện sắc ký cột với 120g cao n-hexane trên silica gel với hệ dung môi

etherpetroleum –ethyl acetate, độ phân cực tăng dần, chia thành 18 phân đoạn Tiến hành khảo sát phân đoạn thứ 6, 12, và 18, sử dụng sắc ký cột silica gel nhiều lần kết hợp sắc ký điều chế cô lập được 4 hợp chất

3.1.2 Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây An điền hoa nhỏ, Hedyotis

tenelliflora

Cây An điền hoa nhỏ được thu hái tại khu du lịch rừng Ma Đa Gui, huyện Đạ Huoai,

tỉnh Lâm Đồng Tên khoa học của cây là Hedyotis tenelliflora Bl được nhận danh bởi dược

sĩ Phan Đức Bình - Phó tổng biên tập Bán nguyệt san “Thuốc và Sức khỏe” TP Hồ Chí Minh Một mẫu cây ép khô được lưu trong quyển sách lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu số US-C015, tại bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM

Từ 2,1 kg bột cây khô đã điều chế thành cao methanol (120 g) bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng Sau đó sử dụng phương pháp trích pha rắn silica gel để phân chia cao methanol thành các loại cao có độ phân cực khác nhau là cao etherpetroleum1 (8,5 g) và etherpetroleum2 (11,0 g); cao chloroform 1 (4,7 g) và cao chloroform 2 ( 7,6 g), cao ethyl acetate (13,8 g) và cao methanol (50,5 g).Từ cao chloroform 2, tiến hành sắc ký cột nhiều lần với các hệ dung môi khác nhau đã cô lập được 8 hợp chất

3.1.3 Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây An điền nhám, Hedyotis rudis

Cây An điền nhám được thu hái tại khu du lịch rừng Ma Đa Gui, huyện Đạ Huoai, tỉnh

Lâm Đồng Tên khoa học của cây là Hedyotis tenelliflora Bl được nhận danh bởi dược sĩ

Phan Đức Bình - Phó tổng biên tập Bán nguyệt san “Thuốc và Sức khỏe” TP Hồ Chí Minh Một mẫu cây ép khô được lưu trong quyển sách lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫuUS–C016, tại bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Tp.HCM

Bột cây được trích kiệt bằng ethanol theo phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, dịch lọc được gom lại, cô quay thu hồi dung môi, thu được cao thô ethanol.Điều chế các loại cao bằng phương pháp sắc kí cột silica gel trên cao ethanol, giải li lần lượt bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần như:etherpetroleum 60-90C,benzene, chloroform, ethyl acetate và methanol Dung dịch giải li được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, kết quả thu được là 5 loại cao tương ứng Tiến hành sắc ký cột nhiều lần các mẫu cao, từ cao etherpetroleum (10 g) cô lập được 1 hợp chất, RUDI-1 (32 mg);từ cao benzene (10 g)cô lập được 1 hợp chất, RUDI-3 (19 mg), từ cao chloroform (14,7 g), cô lập 1 hợp chất, RUDI-4 (27 mg); từ cao ethyl acetate (10 g) cô lập được 3 hợp chất,RUDI-5 (12 mg), RUDI-6 (9 mg), RUDI-7 (30 mg)

3.1.4 Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá và rễ cây Xuân hoa đỏ,

Pseuderanthemumcarruthersii

Cây Xuân hoa đỏ được nhận danh bởi nhà Thực vật học TS Võ Văn Chi và TS.Hoàng Việt, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN Tp Hồ Chí Minh Mẫu khô của hai cây được lưu giữ trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu USA007 cho cây Xuân hoa đỏ lá đỏ

và ký hiệu mẫu USA008 cho cây Xuân hoa đỏ lá xanh, lưu tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Trường ĐHKHTN Tp Hồ Chí Minh Lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ được thu hái

tại xã Tân Phước, huyện Đồng Phú, tỉnh Bình Phước Rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh được thu hái tại quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh

Bột khô lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với methanol ở nhiệt độ phòng Dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích thô methanol (ĐL, 800 g) Phần cao thô methanol được hòa tan với một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt Phần dịch sệt này khi để qua đêm trong tủ lạnh có kết tủa lắng xuống Phần kết tủa được lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ có dạng tinh thể hình phiến (50 g) Phần dịch lọc được loại béo bằng cách trích với etherpetroleum rồi đến ethyl acetate bằng phương pháp trích lỏnglỏng Các phần dịch trích này được thu hồi dung môi ở

áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng, cao etherpetroleum(ĐL.P, 170 g) và cao ethyl acetate (ĐL.E, 17 g) Dịch nước được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng cách cho qua cột Diaion HP20, với các dung môi giải ly lần lượt là nước, hỗn hợp methanol : nước (1:1) và methanol Các phân đoạn này được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được các loại cao tương ứng, cao nước (ĐL.N, 350 g), cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g) và cao methanol (ĐL.M, 6 g)

Bột khô rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm với ethanol ở nhiệt độ phòng (2 ngày/lần x 10 lần) Dịch trích được thu hồi dung môi ở

áp suất kém để thu được cao trích thô etanol (XR, 400 g) Phần cao thô ethanol được hòa tan với một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt Phần dịch sệt này khi để qua đêm trong tủ lạnh có kết tủa lắng xuống Phần kết tủa được lọc và rửa bằng methanol, thu được muối vô cơ có dạng tinh thể hình phiến (40 g) Phần dịch lọc được trích lỏnglỏng với chloroform rồi đến ethyl acetate Các phần dịch trích này được thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các loại cao tương ứng, cao chloroform (XR.C, 120 g) và cao ethyl acetate (XR.E, 20 g) Lớp nước được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng cách cho qua cột Diaion HP20, với các dung môi giải ly lần lượt là nước, hỗn hợp methanol : nước (1:1) và methanol Các phân đoạn này được thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các loại cao tương ứng, cao nước (XR.N, 60 g), cao methanolnước (XR.MN, 20 g) và cao methanol (XR.M, 12 g)

Từ cao ethyl acetate (ĐL.E, 17 g) và cao methanolnước (ĐL.MN, 30 g) của lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ đã cô lập được 16 hợp chất

Từ cao chloroform (XR.C, 120 g), cao ethyl acetate (XR.E, 20 g) và cao methanolnước (XR.MN, 20 g) của rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh đã cô lập được 18 hợp chất

Từ cao dichloromethane (XL.D, 22 g), cao ethyl acetate (XL.E, 7 g) và cao methanol (XL.M, 100 g) của lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh đã cô lập được 4 hợp chất

Từ lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ, rễ và lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh là đã cô lập được 38 hợp chất Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại, đã xác định được cấu trúc hóa học của 35 hợp chất vì có 3 hợp chất cùng hiện diện ở cả hai nguyên liệu nghiên cứu khác nhau

3.1.5 Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá và rễ cây Xuân hoa mạng,

3.1.7 Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây Sơn cúc Ba Thùy, Wedelia trilobata

Cây Sơn cúc ba thùy - Wedelia trilobata (L.) Hitch thu hái tại quận 2, 9 và Thủ Đức,

TPHCM, được nhận danh bởi dược sĩ Phan Đức Bình - Phó tổng biên tập Bán nguyệt san

“Thuốc và Sức khỏe” TP Hồ Chí Minh Một mẫu cây ép khô được lưu trong quyển sách lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu US–B002, lưu tại bộ môn Hóa hữu cơ, Trường ĐHKHTN, Tp.HCM

Từ bộ phận hoa (950g bột hoa khô) của đã được điều chế thành cao methanol hoa (302,6g) bằng phương pháp ngâm dầm trong methanol ở nhiệt độ phòng Thực hiện sự trích

rắn – lỏng trên cao methanol với etherpetroleum, thu được cao etherpetroleum(70g) và từ

cao này đã cô lập được 10 hợp chất

3.1.8 Phương pháp cô lập các hợp chất từ cây Sơn cúc hai hoa, Wedelia biflora

Hoa cây Sơn Cúc hai hoa - Wedelia biflora (L.) DC được thu hái ở công viên Gia Định,

quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 11 năm 2007 Cây được nhận danh tên khoa học bởi dược sĩ Phan Đức Bình, phó tổng biên tập Bán nguyệt san “Thuốc và Sức khỏe”, hội Dược học Việt Nam Cây được lưu mẫu trong quyển lưu trữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu US–B001, tại Bộ môn Hóa Hữu Cơ, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên TP HCM

Từ 8 kg hoa tươi Wedelia biflora (L.) DC (1,2 kg bột hoa khô), tiến hành điều chế cao

ethanol hoa bằng phương pháp ngâm dầm trong ethanol tại nhiệt độ phòng Từ cao ethanol hoa

đã điều chế các cao có độ phân cực khác nhau với thu suất (%) so với cao ethanol hoa ban đầu lần lượt là: cao etherpetroleum1 (13,4%), cao etherpetroleum2 (10,1%), tủa etherpetroleum (0,7%), cao chloroform 1 (7,5%), cao chloroform 2 (4,0%), cao chloroform 3 (3,9%), cao chloroform 4 (3,7%), cao ethyl acetate 1 (6,5%), cao ethyl acetate 2 (9,2%), tủa ethyl acetate (0,9%) và cao methanol (28,1%)

Từ tủa etherpetroleum, cao etherpetroleum, cao chloroform đã sắc ký cột nhiều lần để thu được 9 hợp chất

Thực hiện tương tự trên cao ethyl acetate đã thu được 8 hợp chất

3.1.9 Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá cây Neem, Azadirachta indica

Lá Neem được thu hái tại vườn cây Neem của Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Ninh Thuận, thuộc xã Phước Dinh, huyện Ninh Phước, Tỉnh Ninh Thuận, vào tháng 03/2006 Sau

đó loại bỏ những lá vàng úa, sâu bệnh, rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ, thu được bột lá khô (7,5 kg)

Bột khô của lá cây Neem được ngâm với dung môi methanol trong bình thủy tinh có nắp đậy trong vòng 24 giờ Sau đó lọc lấy phần dịch trích, cô quay và thu hồi dung môi Tiếp tục thực hiện lặp lại nhiều lần như trên để trích kiệt, thu được cao thô methanol (1,3kg) Phần cao thô methanol tiếp tục được hòa tan bằng nước sau đó lần lượt trích lỏng–lỏng với

các dung môi etherpetroleum, ethyl acetate và n-butanol Dịch trích etherpetroleum, ethyl

acetate và n-butanol được làm khan, cô quay dưới áp suất kém, thu hồi dung môi, thu được

các cao tương ứng với khối lượng lần lượt là 470 g, 125 g và 138 g

Một phần cao ethyl acetate (110 g) được thực hiện sắc ký cột trên silica gel pha thường với hệ dung môi CHCl3-MeOH với độ phân cực tăng dần từ 0% đến30%, thu được 16 phân đoạn chính Các phân đoạn này tiếp tục được thực hiện sắc ký cột (sắc ký cột silica gel pha thường, silica gel pha đảo RP-18) nhiều lần, sắc ký điều chế và sắc ký lỏng hiệu năng cao,

cô lập được 20 hợp chất limonoid

3.1.10 Phương pháp cô lập các hợp chất từ hạt và vỏ quả cây Tô mộc,

Caesalpinia sappan

Quả khô được thu hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang, vào tháng 11 năm 2009 và được định danh bởi Thạc sĩ Hoàng Việt, khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Sau đó, quả được tách thành 2 phần: hạt và vỏ hạt

Hạt được xay nhỏ thành bột (2,8 kg), tiến hành trích nóng với dichloromethane bằng phương pháp đun hoàn lưu Toàn bộ dịch trích thu được đem cô quay áp suất kém, thu được cao dichloromethane (260 g).Thực hiện sắc ký cột cao diclhoromethane (260 g) trên silica gel pha thường với hệ giải ly ethyl acetate : etherpetroleumcó độ phân cực tăng dần (0% ÷ 100%); sau đó chuyển sang hệ MeOH:CHCl3 với độ phân cực tăng dần từ 0% đến 30%; gom thành 5 phân đoạn chính Tiến hành sắc ký cột nhiều lần và sắc ký bản mỏng điều chế các phân đoạn, cô lập được 9 hợp chất

Vỏ quả được sấy khô, xay nhỏ rồi trích với methanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao methanol thô Hòa tan cao methanol thô vào nước rồi trích lần lượt với các dung môi etherpetroleum, chloroform, ethyl acetate thu được các cao tương ứng Lần lượt thực hiện sắc ký cột silica gel trên cao chloroform và cao ethyl acetate với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau, đồng thời kết hợp sắc ký bản mỏng trên silica gel pha thường, pha đảo RP18 và sắc ký điều chế cô lập được 8 hợp chất

3.1.11 Phương pháp cô lập các hợp chất từ vỏ và trái cây Còng mù u,

Calophyllum thorelii

Trái xanh của cây còng mù u (Calophyllum thorelii Pierre) được thu hái ở Lâm

trường Sông Kôn, tỉnh Bình Định và được GVC Nguyễn Thiện Tịch, Khoa Sinh, Trường

ĐHKHTN Tp HCM định danh Mẫu sau khi thu hái được phơi khô, xay nhỏ rồi chiết Soxhlet (4 kg) lần lượt với etherpetroleumrồi ethyl acetate Thu hồi dung môi bằng máy cô quay thu được cao etherpetroleum(764,3 g) và cao ethyl acetate (162,8 g) Lấy 145 g cao etherpetroleumđem sắc ký cột nhiều lần thu được 4 hợp chất Sắc ký cột cao ethyl acetate trên silica gel thu được 5 hợp chất

Vỏ cây Còng mù u được thu hái trên cùng một cây ở Lâm trường Sông Kôn Mẫu khô xay nhỏ (4,5 kg) sau khi trích kiệt bằng Soxhlet với etherpetroleumrồi được trích tiếp với ethyl acetate, thu hồi dung môi thu được cao etherpetroleum(96 g) và cao ethyl acetate (958 g) Lấy 163,5 g cao ethyl acetate đem sắc ký cột trên silica gel thu được 6 hợp chất Thực hiện tương tự sắc ký cột silica gel trên cao etherpetroleumthu được 9 hợp chất

3.1.12 Phương pháp cô lập các hợp chất từ lá cây Còng núi, Calophyllum

dryobalanoides

Vỏ cây còng núi (Calophyllum dryobalanoides Pierre) thu hái tại Lâm trường Tân Phú,

tỉnh Đồng Nai và được chuyên viên thực vật của Lâm trường định danh Mẫu phơi khô, xay

nhỏ rồi trích (4,9 kg) bằng bộ chiết Soxhlet với n-hexane và sau đó là ethyl acetate Thu hồi dung môi thu được cao n-hexane và cao ethyl acetate Sắc ký cột cao ethyl acetate (40 g) thu

được 6 hợp chất

3.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Việc xác định cấu trúc được thực hiện bằng các phương pháp phổ nghiệm như 1NMR, 13C-NMR, COSY,HSQC, HMBC, NOESY, LC-MS, HR-ESI-MS Để nhận danh các hợp chất cô lập được là mới hay cũ, tiến hành tra cứu bằng phần mềm SciFinder, các hợp chất cũ sẽ được tra cứu và so sánh với số liệu phổ từ tài liệu tham khảo

H-3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa

Có nhiều phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa, trong đó phổ biến nhất là hoạt tính

ức chế gốc tự do DPPH DPPH• là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH• bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt Dựa vào cường độ màu của dung dịch khi có

và không có mẫu thử ở 517 nm ta sẽ tính được hoạt tính ức chế DPPH của mẫu thử Chất đối

chứng dương là trolox

3.4 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase

Enzyme tyrosinase xúc tác quá trình sinh tổng hợp melanin ở người, ảnh hưởng đến màu sắc của da, mắt, và tóc Melanin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ làn da khỏi ảnh hưởng của tia UV, tuy nhiên nếu lượng melanin được tích lũy quá nhiều sẽ làm thay đổi màu sắc lớp biểu bì, gây ra các rối loạn về da như tàn nhang, nám da… Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế tyrosinase đã và đang được ngành mỹ phẩm quan tâm rất nhiều

Để nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, người ta thực hiện qui trình dựa trên nguyên tắc sau:

Enzyme tyrosinase xúc tác quá trình oxi hóa 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) tạo hợp chất dopachrome màu cam đỏ, có bước sóng hấp thu cực đại tại 475nm Khi có mặt chất

ức chế, cường độ hấp thu của dung dịch tại bước sóng 475nm sẽ giảm Dựa vào cường độ màu của dung dịch khi có và không có mẫu thử, sẽ tính được hoạt tính ức chế enzyme

tyrosinase của mẫu Chất đối chứng dương là acid kojic

3.5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzymeα-glucosidase

Enzymeα-glucosidase trong ruột non đóng vai trò xúc tác cho quá trình phân hủy các

oligosaccharid và disaccharid thành các phân tử glucose trước khi thấm vào mạch máu Như

vậy, bằng cách ức chế hoạt động của α-glucosidase, ta có thể làm giảm sự hấp thụ đường

cũng như ngăn ngừa hiện tượng lượng đường tăng cao, và đây là một trong các khuynh hướng điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 hiện nay

Để nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme-glucosidase, người ta thực hiện qui trình dựa trên nguyên tắc sau:

Enzyme-glucosidase xúc tác quá trình chuyển hoá p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNP-G) màu cam đỏ, có bước sóng hấp thu cực đại tại 401nm, thành đường glucose Khi có mặt chất ức chế, cường độ hấp thu của dung dịch tại bước sóng 401nm sẽ giảm Dựa vào cường độ màu của dung dịch khi có và không có mẫu thử sẽ tính được hoạt tính ức chế enzyme-glucosidase của mẫu Chất đối chứng dương là acarbose

3.6 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase

Enzyme acetylcholinesterase là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine, sinh ra choline và acetate, thường được tìm thấy ở các khớp thần kinh hay các điểm nối thần kinh cơ trong hệ thần kinh.Bằng cách ức chế enzyme acetylcholinesterase, quá trình thủy phân acetylcholine cũng giảm và làm tăng khả năng lưu trữ acetylcholine ở các khớp thần kinh người bệnh Alzheimer làm cải thiện tình trạng của bệnh nhân

Để nghiên cứu hoạt tính ức chế enzymeacetylcholinesterase, thực hiện qui trình dựa trên nguyên tắc sau:

Trong môi trường đệm pH = 8,0, enzyme acetylcholinesterase sẽ xúc tác quá trình thủy phân acetylthiocholine tạo thành acetyl và thiocholine Sau đó, thiocholine sinh ra sẽ phản ứng với acid 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) để tạo ra 5-thio-2-nitrobenzoate có màu vàng với bước sóng hấp phụ cực đại tại 412 nm Khi có mặt chất ức chế, cường độ hấp thu của dung dịch tại bước sóng 412 nm sẽ giảm Dựa vào cường độ màu của dung dịch khi có

và không có mẫu thử sẽ tính được hoạt tính ức chế enzymeacetylcholinesterase của mẫu Chất đối chứng dương là galantamine

3.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử nghiệm được tiến hành bằng phương pháp MTT trên các dòng tế bào ung thư như Hela, MCF-7, NCI-H460, PANC-1 Dùng đĩa 96 giếng nuôi tế bào ở 37,50C trong môi trường 5% CO2 trong 24 giờ Sau khi nuôi ổn định tế bào, thay môi trường chứa các mẫu thử hòa tan, ủ nuôi tiếp tế bào ở 37,50C trong môi trường 5% CO2 trong 72 giờ Đo mật độ quang của dịch huyền phù tế bào có tinh thể formazan (tạo ra bằng phản ứng MTT) ở các giếng thời điểm ban đầu Từ đó tính toán khả năng kháng phân bào của các mẫu thử.Chất đối chứng dương là arctigenin đối với dòng tế bào PANC-1, campothecin 5-FU đối với các dòng tế bào Hela, MCF-7, NCI-H460

Các thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, enzyme tyrosinase, enzyme glucosidaseđược tiến hành tại Bộ môn Hóa Phân tích và Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Trường ĐHKHTN; thử nghiệm độc tính tế bào ung thư các dòng Hela, MCF-7, NCI-H460được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Trường ĐHKHTN, dòng

-PANC-1 được gửi thực hiện tại Viện nghiên cứu thuốc thiên nhiên, Trường Đại học Y Dược Toyama, Nhật Bản

3.8 Phương pháp điều chế các dẫn xuất

Tác chất phản ứng được hòa tan trong dung môi hữu cơ thích hợp, được cho vào bình phản ứng cùng với xúc tác (nếu cần) Phản ứng được thực hiện trong điều kiện khuấy, gia nhiệt hoặc làm lạnh, đồng thời được theo dõi bởi sắc ký bản mỏng với hệ dung môi thích hợp Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được lọc, chiết bằng nước, rửa nhiều lần bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetate hoặc dichloromethane), và làm khan bằng Na2SO4 (muối sodium sulfate khan) Sau đó cô quay tách loại dung môi và tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột

silicagel với hệ dung môi n-hexane - ethyl acetate Sản phẩm được xác định cấu trúc qua phổ

1

H-NMR, MS

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 NỘI DUNG 1, 2, 3: Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ một số cây

thuốc nghiên cứu

4.1.1 Trái Sa kê,Artocarpus altilis

Từ cao n-hexanetrái Sa kê đã cô lập và xác định cấu trúc 4 hợp chất:

2-formyl-5-hydroxymetylfural (1), epifriedelanol (2), 5-hydroxy-7,4’-dimetoxyflavon (3) và acid gallic (4).Các hợp chất này lần đầu tiên tìm thấy có trong trái Sa kê (Hình 1)

Hình 1 – Cấu trúc các hợp chất cô lập từ tráiSa kê

4.1.2 Cây An điền hoa nhỏ,Hedyotis tenelliflora

Từ cao chloroform 2, đã cô lập được 8 hợp chất là: squalen (AH-1), acid ursolic (AH-2), acid corosolic(AH-3), acid maslinic(AH-4), daphyllosid(AH-5), 6-hydroxygeniposid(AH-6),

tenelliosid A(AH-7), deacetyltenelliosid A (hay tenelliosid B)(AH-8) (Hình 2)

Các hợp chất cô lập được trong cây tuy đã biết có sự hiện diện trong các loài cây khác,

nhưng đây là lần đầu tiên được biết chúng có hiện diện trong cây Hedyotis tenelliflora Trong

số các hợp chất cô lập được, các hợp chất daphyllosid, acid maslinic, acid corosolic lần đầu

tiên biết đến trong chi Hedyotis.Hai hợp chất tenelliosid A (AH-7) và tenelliosid B (AH-8) là hai hợp chất mới

Hình 2: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây An điền hoa nhỏ

4.1.3.Cây An điền nhám, Hedyotis rudis

Từ phần cây mọc trên mặt đấtđã cô lập được 6 hợp chất là: acid ursolic(AN-1), acid

3β-acetylursolic(AN-2), acid 3β-acetylbetulinic(AN-3), và 3 hợp chất mới đặt tên là: rudioside

A(AN-4) , B (AN-5)và C(AN-6) (Hình 3)

Hình 3: Cấu trúc các hợp chất được cô lập từ cây An điền nhám

6 78 9 10 11 12 13 14

151617 18 19 20 21 22

23 24

25 26

27 28

29 30

COOH

HO

3

1 2 4 5

6 78 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 22

23 24

25 26

27 28

29 30

HO

3

1 2

4 5 6 78 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

23 24

Acid ursolic (AH-2)

1 3 4 5 6 7 8 9

10

O OGlc H H

HO

O

OCH3O

H

11

1 3 4 5 6 7 8 9

10

O

OGlc H

H O

OCH3O

H

H

HO

1 3 4 5 6 7 8 9

10

C11O

O CH3

O C O

H3C H

Daphyllosid (AH-5)

Acid corosolic (AH-3) Acid maslinic (AH-4)

Tenelliosid A (AH-7) Tenelliosid B (AH-8)

HOH2C

CH2OH HO O

HOH2C HOH2C

O

Rudioside C (AN-6)

Hợp chất mới Hợp chất mới Hợp chất mới

4.1.4 Cây Xuân hoa đỏ,Pseuderanthemumcarruthersii

Từ lá cây Xuân hoa đỏ lá đỏ: đã cô lập và xác định cấu trúc 16 hợp chất, bao gồm:

osmanthuside B (X-1), isomartynoside (X-2), luteolin 7–O–β–D–glucopyranoside (X-3),

antirrhinoside (X-4), 5β,6β–dihydroxyantirrhide (X-5), linarioside (X-6), salidroside (X-7),

echipuroside A (X-8), darendoside B (X-9), verbascoside (X-10), isoverbascoside (X-11), luteolin

7–O–rutinoside (X-12), apigenin 7–O–rutinosid (X-13), apigenin 6–C––L–arabinopyranosyl–8–

C––L–arabinopyranoside (X-14), apigenin 6,8–di–C––L–arabinopyranoside (X-15) và apigenin

6–C– β–D–xylopyranosyl–8–C––L–arabinopyranoside (X-16)

Từ rễ cây Xuân hoa đỏ lá xanh: đã cô lập và xác định cấu trúc 18 hợp chất, bao gồm:

darendoside B (X-9), verbascoside (X-10) và isoverbascoside (X-11), acid oleanolic (X-17), betulin (X-18), (+)–eudesmin (X-19), lupeol (X-20), acid betulinic (X-21), (+)–magnolin (X-22), acid pseuderanic (X-23), (+)–syringaresinol (X-24), (+)–episyringaresinol (X-25), (+)–1– hydroxysyringaresinol (X-26), pseuderesinol (X-27), pseuderanoside (X-28), martynoside (X-29), leucosceptoside A (X-30), squalen (X-31)

Từ lá cây Xuân hoa đỏ lá xanh: đã cô lập và xác định cấu trúc4 hợp chất, bao gồm:

indol 3–carboxaldehyde (X-32), uracil (X-33), adenin (X-34) và betain (X-35)

Các hợp chất được phân loại thành 5 nhóm hợp chất: terpenoid (Hình 4), lignan (Hình 5), hợp chất có chứa nitrogen (Hình 6), flavonoid (Hình 7)và phenylethanoid (Hình 8)

Hình 4: Cấu trúc các hợp chất terpenoid được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hợp chất mới

O

OH HO

H3C

O

O HO

HO CH3O HO

H2C O HO

CH3HOH2C

HO

HO HO

Hình 5: Cấu trúc các hợp chất lignan được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 6: Cấu trúc các hợp chất có chứa nitrogen được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hình 7: Cấu trúc các hợp chất flavonoid được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

Hợp chất mới Hợp chất mới

O

O OH

HO OCH 3

H HO

H 3 CO OCH 3

H H

H3CO

O

O

OCH 3 OH

HO OCH 3

H H

HO OCH 3

H H

HO OCH3

H H

OCH 3

H 3 CO

O HO

HO OH

HO

HO O

H O

O

OCH 3 OH

HO

OCH 3

H HO

OCH 3

H 3 CO

OCH 3 O

O OCH 3

H 3 CO

OCH 3

H H

HN

H

H N

CHO

H3C N

H3C

H3C CH2 COO N

H N

NH2

Indole

3-carboxaldehyde (X-32) Uracil (X-33) Adenine (X-34) Betaine (X-35)

O H

HO OH

O HO

H OH

OH

H OH

OH O OH OH

HO

OH

HO O

O

OH

OH

HO O HO OH

OH

O OH

O OH OH OH

Luteolin 7-O--D-glucopyranoside (X-3)

Hình8: Cấu trúc các hợp chất phenylethanoid được cô lập từ cây Xuân hoa đỏ

4.1.5 Cây xuân hoa mạng,Pseuderanthemum reticulatum

Từ cao ethanol, đã cô lập được 10 hợp chất: tyrosol (XM-1), uracil (XM-2), vomifoliol (XM-3), (6S,9R)-vomifoliol (XM-4), vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside (XM-

(6S,9S)-5), salidroside (XM-6), uridin (XM-7), apigenin 7-O-β-D-rutinoside (XM-8), 1-O-(9Z, 12Z,

15Z-octadecatrienoyl-2-O-hexadecanoyl-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol (XM-9),

1-O-hexadecanoyl-3-O--D-galactopyranosyl-(16)-β-D-galactopyranosylglycerol

(XM-10)(Hình 9)

Các hợp chất này lần đầu tiên được xác định có trong cây Xuân hoa mạng Trong số

này, uracil, apigenin 7-O-β-D-rutinoside cũng thấy hiện diện trong cây Xuân hoa đỏ, và các

hợp chất còn lại lần đầu tiên biết hiện diện trong chi Pseuderanthemum

O O O OH OH

O OH HO

O OH HO

HOH3C

O HO

O OH HO

OH

O HO

O OH HO

HOH3C

OH

Darendoside B(X-9)

O O O OH OH

O HO

OH

HO

O HO

OH HO

O HO OH

O

O HO

O HO O OH O

O OH HO

O OH HO