Establishment of protocol and development of PCR kit for detection of y chromosomal microdeletions in men with azoospermia

Những sai hỏng trên các vùng này, phổ biến là các đột biến vi mất đoạn, có thể dẫn đến tình trạng ít tinh trùng hoặc không có tinh trùng trong tinh dịch [7].. Việc chẩn đoán di truyền là

TÓM TẮT i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ v

LỜI CẢM ƠN vi

BÁO CÁO TÓM TẮT TÌNH HÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN vii

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Azoospermia 1

1.1.1 Khái niệm Azoospemia 1

1.1.2 Phân loại 1

1.1.3 Nguyên nhân di truyền gây bệnh Azoospermia 2

1.1.4 Nhân tố azoospermia và các kiểu đột biến vi mất đoạn phổ biến 3

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán phát hiện 4

1.1.6 Phương pháp điều trị 6

1.2 Multiplex polymerase chain reaction 7

1.2.1 Polymerase chain reaction (PCR) 7

1.2.2 Multiplex-PCR 8

1.2.3 Ứng dụng 8

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 9

2.1.1 Dụng cụ - Thiết bị 9

2.1.2 Vật liệu sinh học 9

2.1.3 Môi trường và hóa chất 11

2.2 Phương pháp 11

2.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962, pHT1963, pHT1964, pHT1965. 11

2.2.1.1Thu nhận các trình tự sY84, sY86, sY134, sY127, sY254 v.v 11

2.2.1.2Thực hiện phản ứng cắt mở vòng plasmid pBluescript II KS (+) 13

2.2.1.3Thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp 13

2.2.1.4Biến nạp sản phẩm nối vào E coli OmniMAX 13

2.2.2.1Khảo sát khả năng hoạt động và tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế mới 17

2.2.2.2 Khảo sát nồng độ phức hợp mồi A và B 17

2.2.2.3Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi 17

2.2.2.4Khảo sát sơ bộ nồng độ Mg2+ 17

2.2.2.5Khảo sát nồng độ khuôn DNA 18

2.2.2.6Khảo sát nồng độ phức hợp plasmid làm đối chứng 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 Tạo dòng các vector tái tổ hợp mang trình tự DNA marker của NST Y 19

3.1.1 PCR thu nhận các trình tự DNA marker của NST Y 19

3.1.2 Sàng lọc sơ bộ các khuẩn lạc E coli OmniMAX mang các vector tái tổ hợp bằng kháng sinh và X-gal 19

3.1.3 Sàng lọc các khuẩn lạc E coli OmniMAX mang các vector tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc 20

3.1.4 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR đặc hiệu 21

3.1.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn 22

3.2 Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng Multiplex-PCR phát hiện vi mất đoạn trên NST Y với mồi được thiết kế mới 23

3.2.1. Kết quả khảo sát khả năng hoạt động và tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế mới 24

3.2.2 Kết quả khảo sát nồng độ từng mồi trong trong phức hợp mồi A và B 24

3.2.3 Kết quả khảo sát sơ bộ nồng độ Mg2+ 25

3.2.4 Kết quả khảo sát dãy nhiệt độ bắt cặp mồi 26

3.2.5 Kết quả khảo sát nồng độ khuôn DNA 26

3.2.6 Kết quả khảo sát nồng độ phức hợp plasmid làm đối chứng 27

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 28

4.2 Đề nghị 28

i

nam giới, chiếm tỉ lệ từ 2-10% và xảy ra thường xuyên tại 3 vùng AZFa, AZFb, AZFc

(nhân tố azoospermia) thuộc cánh dài nhiễm sắc thể (NST) Y Hiện nay việc chẩn đoán vi mất đoạn trên NST Y hầu như là bắt buộc trước khi tiến hành lựa chọn các phương pháp điều trị hay hỗ trợ sinh sản tiếp theo tại các bệnh viện và trung tâm điều trị vô sinh hiếm

muộn Để phát hiện vi mất đoạn trên 3 vùng AZF, SRY, ZFY của NST Y hiện nay phải sử

dụng kỹ thuật Multiplex – PCR do European Academy of Andrology/European Molecular Genetics Quality Network (EAA/EMQN) đưa ra Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là sản phẩm Multiplex – PCR có kích thước tương đương nhau nên vạch điện di rất gần nhau, gây khó khăn cho thao tác chẩn đoán Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã thiết kế lại các cặp mồi cũng bắt cặp trên vùng gene được EAA/EMQN khuyến cáo nhưng sản phẩm PCR có kích thước khác biệt rõ rệt, vạch DNA điện di phân tách xa nhau nhằm tạo thuận lợi cho công tác chẩn đoán Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã tạo được những plasmid tái tổ hợp có mang các gene cần kiểm tra để làm mẫu đối chứng cho bộ kit

ii

accounting for 2-10% of all infertility cases, and occurs frequently at 3 regions of the chromosome long arm namely AZFa, AZFb and AZFc (azoospermia factor) Currently, the diagnosis of microdeletions on the Y chromosome is almost mandatory in institutes and centers for infertility diseases before selecting treatment or assisting methods To

Y-detect microdeletions in AZF, SRY and ZFY regions, the current approach is a Multiplex –

PCR assays offering by European Academy of Andrology/European Molecular Genetics Quality Network (EAA/EMQN) However, the drawback of this method is the PCR products were similar in size and then the DNA electrophoresis bands ran very closely on gels that makes it difficult to manipulate the diagnosis Therefore, in this study, we have redesigned primer pairs matching with genes also be recommended by EAA/EMQN but the PCR products are distinctly different in sizes, making the DNA electrophoresis bands take apart further to facilitate the diagnosis Besides, we also have created recombinant

plasmids carrying the marker genes for the control sample in kits

iii

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

TEX 101 Testis Expressed 101

ECM1 Extracellular Matrix Protein 1

TESE Testicular Sperm Extraction

IVF In Vitro Fertilisation

dNTP deoxy Nucleotide Triphosphate

ICSI Intra-Cytoplasmic Sperm Injection

iv

Bảng 2.2 Kích thước sản phẩm dự kiến và mồi dùng cho PCR thu các trình tự marker… 12

Bảng 3.1 Kích thước sản phẩm cắt giới hạn kiểm tra các plasmid tái tổ hợp…… …22

Bảng 3.2 Nồng độ từng cặp mồi sử dụng trong phức hợp mồi A và B………24

v

Hình 1.2 Kết quả chẩn đoán phát hiện vi mất đoạn AZF trên NST Y theo phương

pháp multiplex-PCR do EAA/EMQN khuyến cáo 6

Hình 1.3 Cơ chế của một phản ứng PCR điển hình 8

Hình 2.1 Thang DNA (ZipRulerTM Express DNA Ladder Set – Fermentas) 11

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR thu DNA marker dành cho tạo dòng 12

Hình 2.3 Sơ đồ vị trí tương ứng của mồi ON1267 và ON1268 trên các vector mục tiêu 15

Hình 2.4 Tóm tắt qui trình tạo dòng vector pHT1959 16

Hình 3.1 Kết quả điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR thu các trình tự DNA marker trên NST Y 19

Hình 3.2 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào E coli OmniMAX và sàng lọc trắng xanh trên môi trường LB-agar-Amp-Xgal 20

Hình 3.3 Kết quả điện di các sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962, pHT1964 21

Hình 3.4 Kết quả điện di các sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc pHT1963, pHT1965. 21

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR đặc hiệu kiểm tra từng plasmid tái tổ hợp 22

Hình 3.6: Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI 23

Hình 3.7 Kết quả điện di các sản phẩm PCR với từng cặp mồi riêng lẻ 24

Hình 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 25

Hình 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp mồi 26

Hình 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khuôn DNA 27

Hình 3.11 Kết quả khảo sát nồng độ phức hợp plasmid làm đối chứng 28

vi

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn Cơ quan chủ quản Đại học Quốc Gia TP HCM và Cơ quan chủ trì Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM đã tài trợ kinh phí, cung cấp cơ sở vật chất cho chúng tôi thực hiện đề tài này Chân thành cảm ơn Phòng Khoa học Công nghệ, Phòng Tài vụ, Phòng Quản trị thiết bị, Ban Chủ Nhiệm khoa Sinh Học đã giúp đỡ chúng tôi trong công tác giấy tờ và hậu cần

Chân thành cảm ơn các thầy cô và các bạn sinh viên của Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian qua

Chân thành cảm ơn các thành viên trong nhóm nghiên cứu đã luôn đồng hành và hỗ trợ lẫn nhau trong suốt quá trình thực hiện đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1

1.1 Bệnh Azoospermia

1.1.1 Khái niệm Azoospemia

Azoospermia là một thuật ngữ dùng để chỉ tình trạng y học của một người đàn ông không có hoặc

có rất ít tinh trùng trong tinh dịch Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh sản, thậm chí

có thể dẫn đến vô sinh Tuy nhiên, nhiều dạng azoospermia, nhất là các dạng không do yếu tố di truyền, hiện nay đã có thể được điều trị y tế thành công Ở người, azoospermia ảnh hưởng đến khoảng 1% tổng số nam giới [11] và chiếm 20% tổng số nguyên nhân gây vô sinh nam [10]

Testicular azoospermia

Trong trường hợp này, tình trạng tinh hoàn không bình thường, teo hoặc không có tinh hoàn, dẫn đến việc sản xuất tinh trùng bị ảnh hưởng nghiêm trọng và khiến cho hoạt động của FSH có xu hướng tăng cao (hypergonadotropic) do cơ chế điều hòa bị gián đoạn Testicular azoospermia chiếm khoảng 49% - 93% tổng số trường hợp mắc azoospermia trên toàn thế giới [10] với nguyên nhân chủ yếu do các rối loạn di truyền bẩm sinh như hội chứng Klinefelter, đột biến vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể (NST) Y [8] hoặc các nguyên nhân khách quan như nhiễm trùng, phẫu thuật hay xạ trị Nhìn chung, đối với các bệnh nhân azoospermia thuộc nhóm này, việc điều trị khá phức tạp do một số trường hợp có thể không thu nhận được tế bào mầm [12] Ngoài

ra, các phân tích sai hỏng di truyền cũng là điều kiện chẩn đoán bắt buộc trước khi đưa ra phác đồ điều trị thích hợp

Posttesticular azoospermia

2

Bệnh nhân thuộc nhóm này vẫn có cơ chế sinh tinh bình thường nhưng không được xuất ra ngoài trong quá trình xuất tinh Hiện tượng này ảnh hưởng khoảng 7% - 51% tổng số đàn ông mắc bệnh azoospermia [10] Nguyên nhân chủ yếu bởi các chướng ngại vật lý ở vùng sinh dục nằm ngoài tinh hoàn (posttesticular) như tắc nghẽn ống dẫn tinh do nhiễm trùng hay phẫu thuật, hoặc bởi các rối loạn như hiện tượng bất sản ống dẫn tinh bẩm sinh Ngoài ra, xuất tinh ngược cũng được xếp vào nhóm bệnh posttesticular azoospermia Việc điều trị đối với nhóm bệnh nhân này khá đơn giản do dễ dàng thu được tinh trùng đã trưởng thành từ người bệnh

Idiopathic azoospermia

Idiopathic azoospermia bao gồm các trường hợp không có tinh trùng trong tinh dịch nhưng chưa biết rõ nguyên nhân Nó có thể là kết quả tổng hợp của nhiều yếu tố nguy cơ như tuổi tác và trọng lượng cơ thể Một nghiên cứu năm 2013 đã quan sát thấy có một mối liên hệ mật thiết giữa tình trạng thừa cân ở người và tình trạng ít tinh trùng trong tinh dịch, tuy nhiên cơ chế gây bệnh hiện vẫn chưa được giải thích rõ ràng [13]

1.1.3 Nguyên nhân di truyền gây bệnh Azoospermia

Hầu hết các dạng azoospermia bao gồm pretesticular, testicular và posttesticular đều có thể liên quan đến các sai hỏng di truyền Tần suất xuất hiện các đột biến trên DNA bộ gene tỷ lệ nghịch với số lượng tinh trùng được sản xuất Do đó, nam giới mắc azoospermia được coi là có nguy cơ cao nếu có từ 10% - 20% sai hỏng di truyền so với dưới 1% đối với nam giới bình thường [10]

Các sai hỏng dẫn đến sự suy giảm hoạt động của hormone GnRH hoặc gornadotropin là nguyên nhân di truyền phổ biến nhất dẫn đến pretesticular azoospermia Trong khi đó, testicular azoospermia lại chắc chắn xảy ra ở những bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter (XXY) và XX male, là những hội chứng liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính Ngoài ra, một nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng 13% đàn ông mắc bệnh azoospermia có nguyên nhân liên quan đến các vi đột biến trên nhiễm sắc thể giới tính Y [8] Một vùng trên cánh dài NST Y được gọi là Azoospermia factor (AZF) được chia thành các vùng nhỏ hơn là AZFa, AZFb và AZFc [16] Những sai hỏng trên các vùng này, phổ biến là các đột biến vi mất đoạn, có thể dẫn đến tình trạng ít tinh trùng hoặc không

có tinh trùng trong tinh dịch [7] Đối với posttesticular azoospermia, nguyên nhân di truyền được

xác định chủ yếu là một số đột biến điểm trên gene cystic fibrosis transmembrane conductance

3

regulator (CFTR), dẫn đến các bất thường trong quá trình hình thành và biệt hóa ống dẫn tinh, gây

ra hiện tượng bất sản ống dẫn tinh bẩm sinh [6]

Việc chẩn đoán di truyền là một trong những điều kiện bắt buộc trước khi tiến hành điều trị đối với những bệnh nhân mắc bệnh azoospermia nhằm tầm soát kịp thời các sai hỏng, từ đó đưa ra phương pháp điều trị thích hợp như sinh con gái theo ý muốn hoặc xin tinh trùng từ ngân hàng, tránh tình trạng các sai hỏng đó có thể được phát tán sang thế hệ tiếp theo

1.1.4 Nhân tố azoospermia và các kiểu đột biến vi mất đoạn phổ biến

Azoospermia factor (AZF) được đưa ra bởi HUGO Gene Nomenclature Committee (HGGNC) nhằm chỉ chung một tập hợp các gene nằm trên NST Y, chịu trách nhiệm mã hóa những protein chức năng quan trọng trong quá trình sinh tinh Những đột biến trên vùng này có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự hình thành tinh trùng và dẫn đến vô sinh AZF được chia

thành các vùng nhỏ hơn bao gồm AZFa, AZFb, AZFc (Hình 1.1) [16]

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa vị trí của 3 vùng gene AZF trên cánh dài nhiễm sắc thể Y [5]

Vi mất đoạn trên 3 vùng gene này được biết đến lần đầu tiên trong nghiên cứu của Vogt và cộng sự (1992) [15] Theo đó, mỗi vùng gene bị mất đoạn có thể có kiểu hình với các mức độ thiếu hụt tinh trùng khác nhau Mất đoạn AZFa chỉ hình thành đến tế bào Sertoli, mất đoạn AZFb tinh trùng chỉ phát triển đến giai đoạn thứ ba của sự phân bào (pachytene) và mất đoạn AZFc tinh trùng chỉ phát triển đến giai đoạn tinh tử (spermatid) [16] Phần lớn các công trình nghiên cứu liên quan đều cho thấy vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam xảy ra ở một trong

ba vùng gene này, trong đó AZFc là vùng phổ biến nhất Tuy nhiên, mối liên hệ giữa kiểu vi mất đoạn trên vùng AZF và kiểu hình cụ thể vẫn chưa được chứng minh một cách thống nhất trong các nghiên cứu khác nhau

4

1.1.5 Các phương pháp chẩn đoán phát hiện

Azoospermia được xem là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây vô sinh nam và do

đó thường được tiến hành chẩn đoán trước tiên

Phương pháp sơ khởi nhất là đếm tinh trùng dưới kính hiển vi nhằm đánh giá số lượng tinh trùng trong tinh dịch thu ở hai thời điểm xuất tinh khác nhau Việc đánh giá này được thực hiện kèm theo các khảo sát về lịch sử gia đình; tình trạng sức khỏe và thể chất; các yếu tố tâm lý như stress, trầm cảm; các thói quen không lành mạnh như hút thuốc, uống rượu; lịch sử sử dụng thuốc hay các can thiệp y tế trước đây, đặc biệt là phẫu thuật đường sinh dục hoặc các liệu pháp sử dụng hormone sinh dục nếu có Việc đánh giá này về cơ bản sẽ tìm ra nguyên nhân gây vô sinh có phải

do azoospermia hay không Tuy nhiên, đây chỉ là những kết luận ban đầu mang tính sàng lọc và tham khảo, cần phải tiến hành thêm các chẩn đoán sâu hơn cơ chế gây azoospermia, nhất là các sai hỏng trên cơ quan sinh dục, hoạt động của các hormone cũng như có sự tham gia của các yếu tố di truyền hay không

Đối với các sai hỏng trên cơ quan sinh dục, sự vắng mặt bẩm sinh của các ống dẫn tinh có thể được phát hiện bằng siêu âm qua trực tràng, sau đó được kiểm chứng di truyền có phải do đột biến gene CFTR hay không [17] Phương pháp siêu âm còn cho phép phát hiện các bất thường về mặt giải phẫu học của các ống dẫn tinh cũng như các tắc nghẽn nếu có Hiện tượng xuất tinh ngược có thể được phát hiện bằng cách khảo sát sự hiện diện của tinh trùng trong nước tiểu

Về mặt nội tiết, nồng độ thấp của các hormone LH và FSH đi kèm với nồng độ thấp hoặc bình thường của testosterone là chỉ thị cho pretesticular azoospermia, trong khi đó nồng độ cao của gonadotropin là chỉ thị cho testicular azoospermia Tuy nhiên, sự khác biệt này thường không

rõ ràng và khó khăn trong chẩn đoán Ngoài ra, các protein trong tinh dịch như TEX101 và ECM1 gần đây cũng được chứng minh cho phép chẩn đoán và phân loại các dạng azoospermia, đồng thời cũng cho phép dự đoán có tinh trùng trong tinh hoàn hay không [2], từ đó có thể áp dụng phương pháp TESE trong việc điều trị

Đặc biệt, những bệnh nhân azoospermia do suy tuyến yên hoặc phát hiện thấy sự phát triển bất thường của tinh hoàn (testicular azoospermia) thường liên quan đến các sai hỏng di truyền, do

đó được khuyến cáo tiến hành ngay các xét nghiệm như karyotype và chẩn đoán vi mất đoạn trên NST Y [17]

5

Chẩn đoán các đột biến vi mất đoạn trên NST Y được thực hiện thông qua việc tách chiết DNA bộ gene từ các tế bào bạch cầu trong máu người bệnh, sau đó trộn với một số cặp mồi đặc hiệu tương ứng với một số marker trong khoảng hơn 300 marker di truyền đã biết trên NST Y liên quan đến azoospermia và tiến hành phản ứng polymerase chain reaction (PCR) và điện di trên gel agarose nhằm phát hiện sự khuếch đại các đoạn DNA marker mục tiêu, từ đó kết luận có sự mất đoạn trên các vùng trình tự của NST Y tương ứng với các marker đó hay không [18] Tuy nhiên, phương pháp này chỉ được thực hiện trên một vùng rất nhỏ trong tổng số 20 triệu cặp base của NST Y Do đó, độ nhạy và độ chính xác phụ thuộc rất lớn vào việc lựa chọn marker cũng như số lượng các marker trong một thử nghiệm

Năm 1999, EAA/EMQN (European Academy of Andrology (EAA) và European Molecular Genetics Quality Network) đã công bố một danh sách chi tiết các quy trình cũng như hướng dẫn và khuyến nghị nhằm nâng cao chất lượng các xét nghiệm chẩn đoán vi mất đoạn Trong đó, quy trình cơ bản phát hiện vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y ở vùng AZF được chứng minh cho độ chính xác và độ nhạy cao [14] Ngày nay, tuy sự hiểu biết cũng như các thành tựu trong nghiên cứu về trình tự và cơ chế gây đột biến vi mất đoạn trên NST Y đã gia tăng đáng kể nhưng quy trình chẩn đoán năm 1999, dựa trên 2 phản ứng Multiplex-PCR khuếch đại các marker

trên cả 3 vùng AZF (Hình 1.2), vẫn còn nguyên giá trị trong công tác chẩn đoán bệnh

azoospermia do yếu tố di truyền Tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán đột biến gene, trong đó có đột biến vi mất đoạn trên NST Y gây bệnh azoospermia, là giải trình tự DNA Tuy nhiên, phương pháp này hiện tại vẫn tốn khá nhiều chi phí và vẫn chưa được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm lâm sàng

6

Hình 1.2 Kết quả chẩn đoán phát hiện vi mất đoạn AZF trên NST Y theo phương pháp

multiplex-PCR dưa trên hai bộ mồi multiplex A và multiplex B do EAA/EMQN khuyến cáo (1): thang phi X-Healll; (2): nước, (3): DNA nữ; (4): DNA nam giới bình thường; (5): DNA

nam giới mất đoạn AZFb; (6): DNA nam giới mất đoạn AZFc [14]

1.1.6 Phương pháp điều trị

Pretesticular và posttesticular azoospermia có thể được điều trị tương đối đơn giản Trong khi đó testicular azoospermia phải điều trị phức tạp hơn, một số trường hợp chưa có phương pháp can thiệp hiệu quả

Đối với pretesticular, các nguyên nhân trực tiếp gây ra azoospermia như thừa prolactin hay tăng hấp thu testosterone ngoại sinh được phát hiện và can thiệp trực tiếp bằng thuốc, protein trị liệu hoặc thay đổi thói quen ăn uống Trong những trường hợp này, nếu tinh hoàn vẫn phát triển bình thường, việc sử dụng liệu pháp hormone có thể được xem xét sử dụng nhằm kích hoạt lại quá trình sinh tinh

Ngoài ra, sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ trong những năm gần đây đã phổ biến rộng rãi phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) với kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) cho phép thụ tinh thành công ngay cả với những tinh trùng chưa được phát triển hoàn chỉnh Điều này đã mở ra hy vọng cho hàng triệu cặp vợ chồng vô sinh trên toàn thế giới mà nguyên nhân do người nam mắc bệnh testicular azoospermia Việc thu nhận tinh trùng, trưởng thành hoặc chưa trưởng thành, có thể được thực hiện theo nhiều cách tiếp cận khác nhau tùy từng trường hợp cụ thể Tuy nhiên, việc không có tinh trùng ở mức độ nặng do tinh hoàn

1.2 Multiplex polymerase chain reaction

1.2.1 Polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm

nhân bản in vitro một đoạn DNA đã biết trình tự từ một hoặc một vài bản sao lên hàng triệu bản sao mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR được sử dụng nhiều

trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như nhận dạng, phát hiện các bệnh di truyền, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tạo dòng gene hay xác định huyết thống …

Phương pháp này dựa trên một chu trình luân nhiệt và hoạt động tổng hợp DNA của một

enzyme DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt như Taq hay Pfu Phản ứng PCR diễn ra khi hỗn

hợp chứa DNA mạch khuôn, mồi, dNTP tự do và enzyme DNA polymerase được đun nóng và làm nguội lặp lại nhiều lần một cách liên tục theo ba giai đoạn Giai đoạn thứ nhất, khi nhiệt độ tăng cao, toàn bộ các đoạn DNA mạch đôi tách ra thành mạch đơn Giai đoạn thứ hai, khi giảm nhiệt độ, các mạch đơn bắt cặp bổ sung với nhau Tuy nhiên, do mồi chỉ là các đoạn DNA mạch đơn ngắn nên dễ dàng bắt cặp bổ sung với mạch khuôn hơn so với mạch khuôn còn lại Giai đoạn thứ ba, ở nhiệt độ thích hợp, DNA polymerase gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi và sử dụng dNTP tự

đo để tổng hợp mạch mới theo chiều 5’- 3’, từ đó tạo ra nhiều bản sao cho đoạn DNA mục tiêu Sơ

đồ mô tả quá trình xảy ra trong một phản ứng PCR được minh họa trong Hình 1.3

di truyền

Hiện nay, các kit thương mại cho multiplex-PCR với nhiều mục đích khác nhau đã được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, trong đó có cả chẩn đoán phát hiện đột biến vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y liên quan đến bệnh azoospermia

1.2.3 Ứng dụng

Multiplex-PCR được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1988 trong một nghiên cứu phát hiện đột biến mất đoạn trên gene mã hóa dystrophin ở người [4] Sau đó, nó cũng được sử dụng đối với

9

gene steroid sulfatase [1] Đến năm 2008, multiplex-PCR đã được ứng dụng khá rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt trong hoạt động phân tích các microsatellite và SNPs trên DNA

bộ gene của nhiều sinh vật với hiệu suất cao và dung lượng phân tích rất lớn [9]

Ngoài ra, một số ứng dụng khác của multiplex-PCR bao gồm: xác định cùng lúc nhiều tác nhân gây bệnh, phân tích nhiều loại đột biến trong cùng một mẫu DNA, định lượng sự biểu hiện đồng thời của nhiều gene, xác định huyết thống

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

 Nồi hấp Autoclave (SS325 – TOMY)

 Máy vortex (Biocote)

 Máy ly tâm (Eppendorf)

 Máy đo quang phổ (Boeco)

 Máy đo quang phổ chuyên dụng vi thể tích (GE Healthcare)

 Máy đo pH (TRANS instruments)

 Máy PCR (Eppendorf)

 Tủ lạnh sâu -80°C (Telstar)

 Tủ mát 4°C (Lucland Fukusima)

 Bộ điện di protein (BioRad)

 Bộ điện di agarose (Cleaver)

 Bộ nguồn (Cleaver)

 Máy khuấy từ gia nhiệt (Benchmark)

 Máy heat nhiệt (Benchmark)

 Máy đọc Elisa (BioTek-Thermo)

10

 E coli OmniMAX TM (F´ {proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR) Δ(ccdAB)} mcrA hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1recA1 supE44 thi-

Δ(mrr-1 gyrA96 relAΔ(mrr-1 tonA panD) (Invitrogen)

 Plasmid pBluescript II KS+ (Invitrogen)

 Mồi cho phản ứng PCR (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Trình tự các mồi oligonucleotide cho các phản ứng PCR dùng trong đề tài

Mồi Trình tự mồi Gene/DNA bắt cặp

11

2.1.3 Môi trường và hóa chất

- Môi trường: LB (5 g/l Yeast extract; 10 g/l Trypton; 5 g/l NaCl), LB – Agar (5 g/l Yeast extract; 10 g/l Trypton; 5 g/l NaCl; 20 g/l agar)

- Enzyme: Pfu DNA polymerase 5 U/µl (Fermentas), Taq DNA polymerase 5 U/µl

(Fermentas), EcoRV 10 U/µl (Fermentas), BamHI 10 U/µl (Fermentas), EcoRI 10 U/µl

(Fermentas), T4 DNA ligase 5 U/µl (Fermentas)

- Hóa chất điện di agarose: UltraPure Agarose (Invitrogen), SYBR® Safe DNA Gel Stain (Invitrogen), dung dịch TAE 50X pH 8,0 (Tris-acetate 40mM; EDTA 0,1 M pH 8,0), dung dịch nạp mẫu 6X (Bromophenol blue 0,25%; xylene cyanol 0,25%; glycerol 40%)

- Kháng sinh: Ampicillin 200 mg/ml

- Thang chuẩn DNA (Fermentas) (Hình 2.2)

2.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962, pHT1963, pHT1964, pHT1965

2.2.1.1 Thu nhận các trình tự sY84, sY86, sY134, sY127, sY254 sY255, SRY, ZFY

12

Các trình tự marker trên NST Y lần lượt được nhân bản bằng phản ứng PCR với các cặp mồi

đặc hiệu và khuôn là DNA bộ gene của nam giới bình thường Thành phần phản ứng gồm: Pfu

buffer 1X; dNTP 200 µM mỗi loại; mồi xuôi 0,25 pmol/µl; mồi ngược 0,25 pmol/µl; DNA bộ

gene 250 ng; enzyme Pfu 2 U; H2O vừa đủ 100 µl Chương trình chạy PCR như được mô tả trong

sơ đồ bên dưới, mồi và kích thước các sản phẩm PCR được thể hiện trong Bảng 2.2

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR thu DNA marker dành cho tạo dòng

Bảng 2.2 Kích thước sản phẩm dự kiến và mồi dùng cho PCR thu các trình tự marker:

STS marker Mồi Kích thước sản phẩm PCR (bp)

13

2.2.1.2 Thực hiện phản ứng cắt mở vòng plasmid pBluescript II KS (+)

Plasmid pBluescript II KS (+) được xử lý mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV để tạo

đầu bằng Vị trí nhận biết của enzyme này là duy nhất và nằm trong vùng MCS Với thành phần

phản ứng bao gồm: Red buffer 1X; plasmid pBluescript II KS (+) 1 µg; enzyme EcoRV 10 U;

H2O vừa đủ 100 µl Ủ 2 giờ ở 37oC sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả cắt mở vòng plasmid và tinh sạch sản phẩm cắt bằng kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN)

2.2.1.3 Thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp

Marker sY84, sY86, sY134, sY127, sY254 sY255, SRY, ZFY được nối vào plasmid pBluescript

II KS+ đã mở vòng nhằm tạo vector tái tổ hợp pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962,

pHT1963, pHT1964, pHT1965 Phản ứng nối được thực hiện bằng T4 DNA ligase (Fermentas) với các thành phần như sau: T4 DNA ligase buffer 1X; gene marker 150 ng; pBluescript II KS (+)

150 ng; enzyme T4 DNA ligase 2 U; PEG 5%; H2O vừa đủ 20 µl và ủ ở 25oC trong 1 giờ

2.2.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli OmniMAX

Chuẩn bị tế bào E coli OmniMAX khả nạp

 Nuôi E.coli OmniMAX trên môi trường LB agar ở 37oC, qua đêm

 Cấy chuyền 1 khuẩn lạc đơn vào 20 ml môi trường LB, lắc 37oC, qua đêm

 Cấy chuyền sang 300 ml môi trường LB, lắc ở 37oC

 Khi OD600 đạt 0,6 tiến hành thu sinh khối (ly tâm 6000 rpm, 2 phút)

 Tiến hành các bước tiếp theo trong bồn đá lạnh

 Huyền phù sinh khối thu được trong 20 ml CaCl2 100 mM lạnh

 Ly tâm 6000 rpm, thu lấy tủa

 Thêm 6 ml CaCl2 100 mM lạnh và 600 µl glycerol 100%, huyền phù nhẹ

 Chia nhỏ mẫu với thể tích 300 µl vào các epp 1,5 ml Bảo quản ở -80oC

Quy trình biến nạp

Sản phẩm nối được biến nạp vào E coli theo phương pháp hóa biến nạp và nuôi cấy trên môi

trường đĩa thạch chọn lọc bằng kháng sinh và X-gal với quy trình như sau: