Cô lập và xác định cấu trúc, hoạt tính các hoạt chất có khả năng chống ung thư từ cây hà thủ ô trắng, streptocaulon juventas merr , họ thiên lý (asclepiadaceae)

Phổ 1H-NMR của H1 trong khoảng H từ 1,20 đến 2,20 ppm cho thấy các tín hiệu proton của các nhóm metylen chập nhau, nhưng độ chuyển dịch hóa học của các proton metylen vẫn có thể xác địn

Trang 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ:

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa nên có nguồn dược liệu dồi dào và phong phú Y học cổ truyền Việt Nam từ lâu đã dùng cây cỏ để trị nhiều chứng bệnh khác nhau Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào việc tìm hiểu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây thuốc ở Việt Nam, trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các chất tinh khiết cô lập được từ rễ cây hà thủ ô trắng, là cây thuốc đã được các nhà khoa học Việt Nam và Nhật Bản khảo sát, đã cho thấy là có độc tính mạnh đối với các dòng tế bào ung thư phổi, ung thư cổ tử cung…

2 TỔNG QUAN VỀ HÀ THỦ Ô TRẮNG

Cây hà thủ ô trắng có tên khoa học là Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., thuộc

họ Thiên lý (Asclepiadaceae), còn được gọi là cây hà thủ ô nam, dây sữa bò, củ vú

bò, cây sừng bò.[1], [2], [4], [6] Hà thủ ô trắng là loại cây có thân dây leo, dài từ 2 đến 5

m, thân và cành có màu hơi đỏ hay nâu đỏ, có rất nhiều lông Lá hà thủ ô mọc đối nhau, có hình trứng ngược, gốc tròn hoặc hơi hình nón cụt, mặt trên có màu xanh sẫm, ít lông, mặt dưới trắng nhạt, có phủ lông rất mịn Phiến lá dài khoảng 8 đến 14

cm, rộng khoảng 4 đến 9 cm, cuống lá ngắn, có nhiều lông.[1], [6] Hoa có màu nâu nhạt hoặc vàng tía, mọc thành xim Quả hà thủ ô lớn, tách đôi ngang ra trông như sừng bò, có dạng hình thoi, màu xám, dài khoảng 7 đến 11 cm, rộng khoảng 8 mm Hạt quả hà thủ ô dẹt, phồng ở lưng, dài khoảng 5 đến 7 mm, rộng khoảng 2 mm, có chùm lông mịn, dài khoảng 2 cm.[1], [4], [6]

Ở Việt Nam, hà thủ ô trắng mọc hoang ở các vùng đất cao, đồi núi, rừng thứ sinh, mọc nhiều ở các tỉnh miền núi và trung du như Bắc Giang, Hòa Bình, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Nghệ An, An Giang, Lâm Đồng.[1], [2], [6] Ở vùng Tịnh Biên tỉnh An Giang, cây mọc hoang trên các đồi núi và nương rẫy

Trang 2

Hình 1. Rễ cây hà thủ ô trắng thu hái tại ấp Phú Hòa, xã An Phú,

huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2007

Các cây thuộc chi Streptocaulon ít được nghiên cứu mặc dù từ lâu chúng đã được

dùng làm thuốc trong y học cổ truyền Cho đến nay, chỉ thấy có ba loài là

Streptocaulon juventas (Lour.) Merr., Streptocaulon tomentosum và Streptocaulon griffithii Hook f đã được nghiên cứu về thành phần hóa học.[24], [41], [42], [60],[68]

Năm 2002, Tam và các cộng sự đã cô lập từ rễ cây hà thủ ô trắng các hợp chất

Trang 3

Theo Đỗ Tất Lợi,[2] Võ Văn Chi,[6] y học cổ truyền Việt Nam dùng rễ cây hà thủ ô trắng để chữa trị nhiều chứng bệnh khác nhau như cảm mạo, sốt, viêm ruột, tiêu chảy, viêm thận mạn tính; chữa các bệnh thận, gan yếu, chứng thiếu máu, thần kinh suy nhược, ăn ngủ kém, sốt rét kinh niên, phong thấp, tê bại, đau nhức gân xương, phụ nữ kinh nguyệt không đều, tiêu trừ nọc rắn, bệnh tóc bạc sớm

Rễ hà thủ ô trắng còn được sắc để uống, chữa cảm sốt, làm thuốc lợi sữa Lá cây hà thủ ô đun với nước dùng để tắm trị các chứng lở ngứa Ngoài ra, rễ hà thủ ô trắng còn làm thuốc bổ máu, dùng phối hợp với hà thủ ô đỏ.[2], [6]

Năm 2002, tác giả Phạm Thanh Tâm [5] đã thử nghiệm hoạt tính hạ lipid huyết của cao chiết etanol rễ cây hà thủ ô trắng trên chuột nhắt trắng Kết quả nghiên cứu cho

Trang 4

thấy dịch chiết etanol 70% của rễ cây hà thủ ô trắng có tác dụng làm giảm cholesterol xấu

Năm 2002, Ueda và các cộng sự,[58] đã sàng lọc hoạt tính kháng ung thư của các cây thuốc Việt Nam Kết quả sàng lọc sơ bộ cho thấy dịch chiết metanol của rễ củ hà thủ ô trắng có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào khối u ác tính dạng sợi sarcoma HT-1080 ở người, tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư phổi A549 ở người, ung thư ruột kết 26-L5, ung thư phổi ở chuột

Năm 2003, Ueda và cộng sự [59], [60] đã thử nghiệm độc tính tế bào của mười sáu hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết cô lập được từ dịch chiết metanol của rễ cây hà thủ ô trắng, trên các dòng tế bào ung thư, như tế bào khối u ác tính dạng sợi sarcoma HT-1080, ung thư phổi A549, ung thư cổ tử cung HeLa ở người, tế bào ung thư biểu mô 26-L5, ung thư phổi Lewis, tế bào khối u ác tính B16-BL6 ở chuột

Thử nghiệm của Ueda cho thấy các hợp chất dẫn xuất cardenolid 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 cô lập được từ rễ củ hà thủ ô trắng, có hoạt tính ức

chế mạnh sự tăng sinh của tế bào khối u ác tính dạng sợi sarcoma HT-1080 (IC50

của mười sáu hợp chất cardenolid trên có giá trị trong khoảng từ 0,054 đến 1,60 µM) Đối với tế bào ung thư phổi A549, giá trị IC50 của các hợp chất này có giá trị trong khoảng từ 0,016 đến 1,65 µM).[60]

Năm 2010, Na Han và cộng sự [13] đã khảo sát độc tính tế bào của dịch chiết cao etanol 75%, đượcđiều chế từ rễ cây Streptocaulon juventas, thu hái ở tỉnh Vân Nam

của Trung Quốc, tác giả cũng khảo sát độc tính của các phân đoạn thu được từ quá trình sắc ký cao này trong cả hai thử nghiệm in vitro (đối với dòng tế bào ung thư phổi A549), và in vivo (trên chuột đã được tiêm tế bào ung thư phổi A549) Thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết cao etanol 75% có giá trị IC50 là 7,82 g/ml; còn phân đoạn có độc tính tế bào mạnh nhất điều chế được từ cao etanol 75% (phân đoạn thu được với hệ dung môi giải ly diclorometan : metanol, tỷ lệ 3 : 1), có giá trị

IC50 là 0,89 g/ml Kết quả thử nghiệm in vivo trên chuột đã được tiêm tế bào ung thư phổi A549 của Na Han cho thấy sau thời gian 10 ngày, kể từ lúc bắt đầu điều trị bằng cách tiêm dịch chiết của phân đoạn có độc tính tế bào mạnh nhất vào chuột, khi soi dưới kính hiển vi, cho thấy hầu hết các tế bào ung thư phổi A549 đã bị tiêu diệt bởi các thực bào Bằng phương pháp sắc ký trên phân đoạn có độc tính tế bào mạnh nhất, Na Han đã cô lập được ba hợp chất dẫn xuất cardenolid, là thành chính

Trang 5

có trong phân đoạn này, gồm digitoxigenin, periplogenin và periplogenin glucosid

Từ đó tác giả kết luận rằng, các hợp chất này đóng vai trò chủ yếu trong việc ức chế

sự phát triển tế bào ung thư phổi A549 ở chuột

3 NGHIÊN CỨU

3.1 LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT

Quy trình tách chiết và cô lập các hợp chất đã được trình bày cụ thể trong các sơ đồ 3.1, 3.2 Việc lựa chọn hệ dung môi giải ly thích hợp cho quá trình sắc ký cột dựa trên kết quả của sắc ký lớp mỏng Hệ dung môi giải ly nào tách tốt trên sắc ký lớp mỏng thì cũng có khả năng tách tốt trên sắc ký cột

Đối với các hợp chất khó tách ra khỏi nhau (giá trị Rf không khác nhau nhiều), trong thực nghiệm đã dùng kết hợp sắc ký cột silica gel pha thường, sắc ký cột pha đảo, sắc ký bản mỏng điều chế silica gel pha thường, sắc ký bản mỏng điều chế pha đảo, dùng kỹ thuật khai triển nhiều lần Từ dịch chiết metanol của rễ củ hà thủ ô

trắng, đã cô lập được mười sáu hợp chất dẫn xuất cardenolid tinh khiết (từ H1 đến H16)

Sơ đồ 3.1

Đun hoàn lưu với MeOH (25 lít, 3 giờ x 3 lần), lọc nóng,

cô quay ở áp suất thấp

Chiết bằng hỗn hợp CHCl 3 :H 2 O=1:1 (5 lần1,5 lít)

Bột thô rễ cây hà thủ ô trắng

(8 kg)

Dịch sệt nước (720 g)

Trang 6

Sơ đồ 3.2

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT

3.2.1 Hợp chất H1

Hợp chất H1 được cô lập từ phân đoạn C-II (sơ đồ 2.1), kết tinh ở dạng tinh thể

hình kim, không màu (MeOH : H2O = 1 : 1), tan hoàn toàn trong metanol

Nhiệt độ nóng chảy: 251-253oC

H1 có các phổ nghiệm như sau:

- Phổ MS (phụ lục 1a) cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 375,2 [M+H]+

- Phổ 1H-NMR (CD3OD) (phụ lục 1b và bảng 3.1)

- Phổ 13C và phổ DEPT-NMR (CD3OD) (phụ lục 1c, 1d và bảng 3.1)

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (CD3OD) (phụ lục 1e, 1f, 1g và bảng 3.1)

Biện luận cấu trúc

Khối phổ của H1 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 375,2 [M+H]+; phù hợp với công thức phân tử C23H34O4

Dịch sệt nước (720 g)

IV-1 (10,3 g)

H2 (5,4 mg) H8 (5,2 mg) H11 (6,5 mg)

MeOH : H2O = 3:1

SKC Silica gel 28 g H-III, CHCl3: MeOH : H2O (8:2:0,2  14:6:1)

H5 (12,5 mg) H6 (3,5 mg) H12 (3,8 mg)

III-4 (1,1 g) III-3 (9,9 g)

H13 (5,5 mg) H14 (6,5 mg)

III-2 (9,8 g)

H9 (3,5 mg)

H4 (4,5 mg)

H3 (7,3 mg)

Trang 7

Phổ 1H-NMR của H1 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl tại

0,91 (3H, s, H-18) và 1,00 (3H, s, H-19), mũi đơn bầu của proton carbinol tại 4,07 (1H, brs, H-3), một proton olefin cộng hưởng dạng mũi đơn tại H 5,92 (1H, s, H-

22), proton metin cộng hưởng dạng mũi đôi đôi tại H 2,85 (1H, dd, J 9,0; 5,5 Hz,

H-17) Tín hiệu proton metylen cộng hưởng dạng mũi đôi đôi tại H 5,06 (1H, dd, J 18,5 Hz; 1,5 Hz, H-21) và 4,94 (1H, dd, J 18,5 Hz; 1,5 Hz, H-21) thuộc vùng

trường thấp, cho thấy hai proton metylen gắn với nhóm rút điện tử mạnh Các giá trị

H tại H-17, H-21, H-22 và hằng số ghép J tại H-17, H-21, cùng với tín hiệu của hai

nhóm metyl tại H-18 và H-19 cho phép dự đoán H1 có thể là một dẫn xuất

cardenolid vì các giá trị hằng số ghép J và H này là đặc trưng cho hợp chất có khung cardenolid.[62] Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR, các proton có H trong khoảng từ 1,26 đến 2,21 là tín hiệu cộng hưởng của các proton CH và CH2 còn lại

Phổ 13C–NMR, DEPT 90 và DEPT 135 của hợp chất H1 cho thấy các tín hiệu cộng

hưởng ứng với sự hiện diện của 23 carbon, gồm hai carbon metyl cộng hưởng tại C24,3 (C-19) và 16,4 (C-18); mười carbon metylen có giá trị C trong khoảng từ 22,3 đến 75,5; sáu carbon metin có C trong khoảng từ 36,0 đến 120,0; trong đó có một carbon metin cộng hưởng tại C 67,7 (C-3), cho thấy carbon tại C-3 gắn với nhóm rút điện tử, một carbon metin olefin cộng hưởng tại C 117,8 (C-22); năm carbon tứ cấp, trong đó có một carbon tứ cấp gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại C86,5 Các tín hiệu cộng hưởng tại C 177,3 (C-23), 117,8 (C-22) và 178,5 (C-20) là đặc trưng cho vòng -lacton bất bão hòa.[57]

Phổ HMBC của hợp chất H1 được trình bày trong bảng 3.1, cho thấy tín hiệu tại H

1,00 (1H, s, H-19) tương quan đến các tín hiệu cộng hưởng tại C 30,8 (C-1), 37,4 (C-5), 36,7 (C-9); tín hiệu tại H 0,91 (1H, s, H-18) tương quan đến các tín hiệu tại

C 41,0 (C-12), 86,5 (C-14), 52,1 (C-17); tín hiệu tại H 2,85 (1H, dd, J 9,0; 5,5 Hz,

H-17) tương quan đến các tín hiệu tại C 86,5 (C-14), 33,4 (C-15), 178,5 (C-20), 75,4 (C-21), 117,8 (C-22) Việc phân tích tương quan HMBC nói trên, kết hợp so sánh độ chuyển dịch C của H1 với digitoxigenin,[17], [62] cho phép xác định chính xác giá trị C của từng carbon

Trang 8

Phổ 1H-NMR của H1 trong khoảng H từ 1,20 đến 2,20 ppm cho thấy các tín hiệu proton của các nhóm metylen chập nhau, nhưng độ chuyển dịch hóa học của các proton metylen vẫn có thể xác định được dựa vào tương quan HSQC và tương quan

H-H trong phổ COSY Phổ COSY của H1 cho thấy tương quan của proton carbinol

tại H 4,07 (1H, br, H-3) đến tín hiệu cộng hưởng tại H 1,51 (H-2) và 2,00 (H-4); tương quan của tín hiệu cộng hưởng tại H 2,85 (1H, dd, J 9,0; 5,5 Hz, H-17) đến tín

hiệu cộng hưởng tại H 1,93 (1H, m, H-16) và 2,21 (1H, m, H-16) Tương quan

COSY giữa các proton kế cận nhau được thể hiện trong hình 3.1

Hóa học lập thể của vòng A và B trong hợp chất H1 được xác định bằng cách so

sánh với kết quả nghiên cứu của các tác giả trước đây Theo Rikako Hannada,[45] Sarah Kohls,[48] Wolfgang Robien,[62] độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H1 là

24,3 nên sự liên hợp của vòng A và B của H1 ở dạng cis; mũi đơn bầu của proton

carbinol tại H 4,07 (1H, brs, H-3) cho thấy proton H-3 ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Mặt khác, theo Tsutomu Furuya và cộng sự,[57] tín hiệu cộng hưởng proton tại H-17 là 2,85 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Như vậy, hóa học lập thể của

H1 được xác định như sau:

Từ các phân tích dữ liệu phổ một chiều và hai chiều của H1 như trên, có so sánh với

số liệu phổ của digitoxigenin, được trình bày trong bảng 3.1, cho thấy hoàn toàn

trùng khớp Vậy hợp chất H1 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 3,14dihydroxycard-20(22)-enolid (hay digitoxigenin), đã được Myint Myint Khine cô

-lập từ cây Streptocaulon tomentosum vào năm 2006,[42] và Ueda cô lập từ cây

Streptocaulon juventas vào năm 2003.[60]

Trang 9

Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR của H1 và digitoxigenin

Trang 10

Hợp chất H2 được cô lập được từ phân đoạn IV-2 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định

hình, không màu, tan hoàn toàn trong metanol

- Phổ LC-HRMS (phụ lục 2a) cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 559,2879

[M+Na]+

- Phổ 1H-NMR (C5D5N) (phụ lục 2b và bảng 3.2)

- Phổ 13C và phổ DEPT-NMR (C5D5N) (phụ lục 2c, 2d và bảng 3.2)

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (C5D5N) (phụ lục 2e, 2f, 2g và bảng 3.2)

Phổ LC-HRMS của H2 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 559,2879 [M+Na]+; phù hợp với công thức phân tử C29H44O9Na

Phổ 1H-NMR của H2 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl cộng

hưởng tại δH 0,81 (3H, s, H-18) và 0,98 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng

tại δH 4,24 (1H, s, H-3); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH5,02 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz; H-21) và 4,93 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz; H-21); proton

olefin metin cộng hưởng tại δH 6,10 (1H, brs, H-22), proton metin cộng hưởng ở

dạng mũi triplet bầu tại δH 2,77 (1H, brt, J 5,5 Hz; H-17) So sánh với phổ của H1

nhận thấy phổ 1H-NMR của H2 tương tự như của H1 Điểm khác biệt là ở phổ của H2 cho thấy tín hiệu của một đơn vị đường glucose với proton anomer cộng hưởng

tại δH 4,93 (1H, d, J 7,5, H-1) và hai proton metylen của đường này gắn với nhóm

rút điện tử cộng hưởng tại δH 4,55 (1H, d, J 11,5; H-6) và 4,38 (1H, brs, H-6) Các

số liệu phổ như trên cho phép dự đoán H2 là một glucosid có aglycon là

digitoxigenin

Phổ 13C-NMR DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của H2 gồm

29 carbon, trong đó có hai nhóm metyl, mười một nhóm metylen, mười một nhóm

metin; một vòng γ-lacton bất bão hòa, có các tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin

tại δC 117,7 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton cộng hưởng tại δC 174,5 (C-23); tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC 84,7 (C-14) Ngoài ra, phổ 13C-NMR của H2 còn cho thấy tín hiệu carbon anomer của đơn vị

đường glucose cộng hưởng tại δC 103,0 (C-1), carbon metylen của đường này cộng hưởng tại δC 63,0 (C-6)

Trang 11

Phổ HMBC của H2 cho thấy proton anomer tại 4,93 (1H, d, J 7,5 Hz, H-1) tương

quan đến carbon tại δC 71,9 (C-3) nên carbon anomer của đơn vị đường glucose gắn với oxygen tại C-3 Các proton của đơn vị đường được xác định chính xác nhờ tương quan H-H trong phổ COSY và tương quan trong phổ HSQC, có so sánh với tài liệu tham khảo.[20], [62] Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR của H2 được trình bày

trong bảng 3.2, cho thấy hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ của hợp chất

digitoxigenin 3-O--glucopyranosid.[20], [62]

Tương tự hợp chất H1, hóa học lập thể của vòng A và B trong hợp chất H2 được

xác định bằng cách so sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây Theo Rikako Hannada,[45] Sarah Kohls,[48] Wolfgang Robien,[62] độ chuyển dịch hóa học C tại C-

19 của H2 là 23,8 nên sự liên hợp của vòng A và B của H2 ở dạng cis Theo

Tsutomu Furuya và cộng sự,[57] tín hiệu cộng hưởng của proton H-17 là 2,77 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Mặt khác, mũi đơn bầu tại δH 4,24 (H-3) chứng

tỏ proton H-3 ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Như vậy, hóa học lập thể của H2 được

xác định như sau:

Vậy H2 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 14-hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-

-glucopyranosid (hay digitoxigenin 3-O--glucopyranosid), là hợp chất lần đầu tiên

được cô lập từ dịch chiết metanol của bột rễ củ hà thủ ô trắng

Trang 12

Hình 3.2 Tương quan H-H COSY và

HMBC quan trọng của H2

Trang 13

Bảng 3.2 So sánh số liệu phổ NMR của H2 và digitoxigenin 3-O-

Trang 14

Hợp chất H3 được cô lập từ phân đoạn III-2 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định hình,

không màu, tan hoàn toàn trong metanol

[M+Na]+

Phổ 1H-NMR của H3 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl tại δH

0,97 (3H, s, H-18) và 0,80 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,41

(1H, s, H-3); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,02 (1H,

dd, J 18,0; 1,5 Hz; H-21) và 5,28 (1H, d, J 17,0 Hz; H-21); proton olefin metin cộng

hưởng tại δH 6,11 (1H, brs, H-22), một mũi triplet bầu cộng hưởng tại δH 2,77 (1H,

brt, J 9,5, Hz; H-17)

So sánh phổ của H3 với H1, nhận thấy các tín hiệu cộng hưởng ở phổ 1H-NMR của

H3 tương tự như H1, nhưng khác H1 là trên phổ 1H-NMR của H3 cho thấy tín hiệu

hai proton anomer của hai đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 4,85 (1H, d, J 8,0, H-1) và 5,11 (1H, d, J 7,5, H-1); tín hiệu proton metylen của đơn vị đường

thứ nhất cộng hưởng tại δH 4,33 (1H, dd, J 10,5; 5,5, H-6) và 4,82 (1H, d, J 10,5,

H-6); của đơn vị đường thứ hai cộng hưởng tại δH 4,33 (1H, dd, J 11,0; 5,5, H-6)

và 4,50 (1H, brd, J 11,0, H-6) Dựa vào các phân tích về số liệu phổ trên, cho phép

dự đoán H3 là một glycosid có aglycon là digitoxigenin gắn với hai đơn vị đường

glucose Hằng số ghép J tại H-1 và H-1 lần lượt bằng 8,0 và 7,5 Hz cho thấy hai

đơn vị đường đều có cấu hình -D-glucopyranose

Phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng của H3 gồm

35 carbon, trong đó có hai nhóm metyl, mười hai nhóm metylen, mười sáu nhóm metin, tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC 84,7 (C-14);

một vòng γ-lacton bất bão hòa, gồm có tín hiệu của carbon olefin cộng hưởng tại δC

Trang 15

117,8 (C-22), một carbon carbonyl lacton cộng hưởng tại δC 174,5 (C-23) Ngoài ra, phổ 13C-NMR của H3 còn cho thấy tín hiệu carbon anomer của hai đơn vị đường

glucose cộng hưởng tại δC 103,1 (C-1) và 105,4 (C-1)

Phổ HMBC cho thấy proton anomer tại δH 4,85 (1H, d, J 8,0, H-1) của đơn vị

đường thứ nhất tương quan đến carbon tại δC 74,5 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen tại

C-3 Proton anomer tại 5,11 (1H, d, J 7,5, H-1) tương quan đến carbon tại δC 70,3 (C-6) và proton metylen tại δH 4,33 (1H, dd, J 10,5; 5,5, H-6) và 4,82 (1H, d, J

10,5, H-6) tương quan đến tín hiệu δC 105,4 (C-1); cho thấy C-1 của đơn vị đường thứ hai gắn với oxygen tại C-6

Các tín hiệu proton của hai đơn vị đường được xác định chính xác dựa vào tương quan H-H của các proton kế cận nhau trong phổ COSY, có so sánh với tài liệu tham khảo;[60] tín hiệu cộng hưởng carbon trong hai đơn vị đường được xác định dựa vào tương quan HSQC, tương quan HMBC (được trình bày trong bảng 3.3), có so sánh

với độ chuyển dịch carbon của hợp chất digitoxigenin (16)-O-β-D-glucopyranosid.[60]

3-O-β-D-glucopyranosyl-Tương tự hợp chất H1, hóa học lập thể của vòng A và B trong hợp chất H3 được

xác định bằng cách so sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây Theo Rikako Hannada,[45] Sarah Kohls,[48] Wolfgang Robien,[62] độ chuyển dịch hóa học carbon

tại C-19 của H3 là 23,8 nên sự liên hợp của vòng A và B của H3 ở dạng cis.Theo Tsutomu Furuya và cộng sự,[57] tín hiệu cộng hưởng của proton H-17 của hợp chất

H3 là 2,76 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Mặt khác, mũi đơn bầu tại δH4,41 (1H, s, H-3) cho thấy proton H-3 ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Như vậy, hóa

học lập thể của H3 được xác định như sau:

Trang 16

Trang 17

5 4,10 (m) 77,3 77,9

6 4,33 (dd,11,0; 5,5)

Các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H3 được trình bày trong bảng

3.3, cho thấy hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ của hợp chất digitoxigenin D-glucopyranosyl-(16)-O-β-D-glucopyranosid đã được Ueda công bố trước

3-O-β-đây.[60] Vậy H3 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 14-hydroxycard-20(22)-enolid

3-O-[-glucopyranosyl-(16)--glucopyranosid] (hay digitoxigenin glucopyranosyl-(16)-O-β-D-glucopyranosid; digitoxigenin 3-O--gentiobiosid)

3-O-β-D-3.2.4 Hợp chất H4

Hợp chất H4 được cô lập từ phân đoạn III-2 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định hình,

Trang 18

Tương tự như H1, phổ 1H-NMR của H4 cũng cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai

mũi đơn metyl tại δH 0,97 (3H, s, H-18) và 0,93 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng

hưởng tại δH 4,33 (1H, s, H-3); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử, cộng

hưởng tại δH 5,02 (1H, d, J 17,5 Hz; H-21) và 5,29 (1H, d, J 17,5 Hz; H-21); proton

olefin metin cộng hưởng tại δH 6,10 (1H, brs, H-22); proton metin hiện diện ở dạng

mũi triplet bầu cộng hưởng tại δH 2,76 (1H, brt, J 9,0 Hz; H-17) Ngoài ra, phổ 1

H-NMR của H4 cũng cho thấy tín hiệu của hai proton anomer trong hai đơn vị đường

glucose cộng hưởng tại δH 4,92 (1H, d, J 7,5, H-1) và 5,36 (1H, d, J 7,5, H-1); tín

hiệu proton metylen của đơn vị đường thứ nhất cộng hưởng tại δH 4,41 (1H, m, 6) và 4,50 (1H, m, H-6); của đơn vị đường thứ hai cộng hưởng tại 4,23 (1H, m, H-

H-6) và 4,50 (1H, m, H-H-6) Như vậy, giống như H3, hợp chất H4 cũng là một

glycosid có aglycon là digitoxigenin gắn với hai đơn vị đường glucose Hằng số

ghép J tại H-1 và H-1 lần lượt bằng 7,5 và 7,5 Hz cho thấy hai đơn vị đường đều

có cấu hình -glucopyranose

35 carbon, trong đó có hai nhóm metyl, mười hai nhóm metylen, mười sáu nhóm

metin; một vòng γ-lacton bất bão hòa có các tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin

tại δC 117,5 (C-22), một carbon carbonyl lacton cộng hưởng tại δC 174,6 (C-23); tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC 84,6 (C-14) Ngoài ra, phổ 13C-NMR của H4 còn cho thấy tín hiệu carbon anomer của hai đơn vị đường

glucose cộng hưởng tại δC 101,6 (C-1) và 105,7 (C-1)

Phổ HMBC cho thấy proton anomer của đơn vị đường thứ nhất tại δH 4,92 (1H, d,

7,5 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại δC 75,0 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen tại

C-3 Proton anomer tại 5,36 (1H, d, J 7,5, H-1) tương quan đến carbon tại δC 82,9 (C-2) cho thấy carbon anomer (C-1) của đơn vị đường thứ hai gắn với oxygen tại

C-2 Tương tự H3, tín hiệu proton của các đơn vị đường và của khung digitoxigenin trong H4 được xác định chính xác nhờ tương quan H-H giữa các proton kế cận nhau trong phổ COSY Phổ HSQC của H4 cho phép xác định chính

Trang 19

xác độ chuyển dịch hóa học của carbon trong các đơn vị đường, nhờ tương quan

H-C (được trình bày trong bảng 3.4), có so sánh với tài liệu tham khảo.[20]

xác định bằng cách so sánh với tài liệu tham khảo.Theo Rikako Hannada,[45] Sarah Kohls,[48] Wolfgang Robien,[62] độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H4 là 23,8

nên sự liên hợp của vòng A và B của H4 ở dạng cis.Theo Tsutomu Furuya và cộng

sự,[57] tín hiệu cộng hưởng proton tại H-17 của H4 là 2,75 nên hydrogen gắn tại

C-17 là (C-17)-H Mặt khác, mũi đơn bầu tại δH 4,33 (1H, s, H-3) chứng tỏ proton H-3

phải ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Như vậy, hóa học lập thể của hợp chất H4 được

3.4, cho thấy phù hợp với số liệu phổ của hợp chất digitoxigenin -D-sophorosid

Vậy H4 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 14-hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[D-glucopyranosyl-(12)--D-glucopyranosid] (hay digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(12)--D-glucopyranosid]; digitoxigenin -D-sophorosid)

Trang 20

-Bảng 3.4 So sánh số liệu phổ NMR của H4 và digitoxigenin -D-sophorosid.[20]

Vị trí

Hợp chất H4 (C5D5N)

Digitoxigenin  sophorosid (CD3OD)

Trang 21

(*) Sự khác biệt C so với tài liệu tham khảo, C tại C-1 và C-1 được xác định bằng tương quan HSQC giữa H-1 và C-1; giữa H-1 và C-1; và dựa vào tương quan HMBC của H-1 đến C-3

3.2.5 Hợp chất H5

Hợp chất H5 cô lập được từ phân đoạn III-3 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định hình,

[M+Na]+

Phổ LC-HRMS của H5 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 865,4191 [M+Na]+, phù hợp với công thức phân tử C42H66O17Na

Trang 22

Tương tự như H1, phổ 1H-NMR của H5 cũng cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai

mũi đơn metyl tại δH 1,00 (3H, s, H-18) và 0,87 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng

hưởng tại δH 4,17 (1H, s, H-3); proton metylen, gắn với nhóm rút điện tử cộng

hưởng tại δH 5,01 (1H, s, H-21) và 5,28 (1H, d, J 16,5 Hz, H-21); proton olefin

metin cộng hưởng tại δH 6,12 (1H, brs, H-22), proton metin cộng hưởng dạng mũi

đôi đôi tại δH 2,77 (1H, dd, J 9,0; 5,0 Hz, H-17) Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của

H5 còn cho thấy tín hiệu của ba proton anomer, trong đó proton anomer của đơn vị

đường cymarose cộng hưởng tại δH 5,19 (1H, dd, J 9,5; 1,5 Hz, H-1), proton metyl

của đơn vị đường cymarose xuất hiện dạng mũi đôi tại δH 1,56 (d, 6,0 Hz, H-6), proton nhóm metoxy của đường này cộng hưởng dạng mũi đơn tại 3,62 (1H, s,

3-OCH3); proton anomer trong hai đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 4,83

(1H, d, J 8,0 Hz, H-1′) và 5,11 (1H, d, J 7,5 Hz, H-1′); các tín hiệu proton metylen

của một đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 4,92 (1H, m, H-6) và 4,23 (1H,

m, H-6); của đơn vị đường glucose còn lại cộng hưởng tại 4,56 (1H, dd, J 12,5; 2,5, H-6) và 4,37 (1H, dd, J 12,0; 5,5, H-6) Dựa vào các phân tích về số liệu

phổ của H5, có so sánh với tài liệu tham khảo,[11], [56] cho phép dự đoán H5 là một

glycosid có aglycon là digitoxigenin gắn với ba đơn vị đường, trong đó có một đơn

vị đường là cymarose và hai đơn vị đường còn lại là glucose Hằng số ghép J tại

H-1, H-1 và H-1 lần lượt bằng 9,5; 8,0 và 7,5 Hz cho cả ba đơn vị đường đều có cấu hình 

42 carbon, trong đó có ba nhóm metyl, một nhóm metoxy, mười ba nhóm metylen,

hai mươi nhóm metin; một vòng γ-lacton bất bão hòa có các tín hiệu cộng hưởng

của carbon olefin tại δC 117,7 (C-22), một carbon của nhóm carbonyl lacton cộng hưởng tại δC 174,5 (C-23); tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC 84,7 (C-14) Ngoài ra, phổ của H5 còn cho thấy các tín hiệu đặc trưng của

đơn vị đường cymarose với carbon anomer cộng hưởng tại δC 96,8 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng tại δC 58,8 (3-OCH3), tín hiệu của nhóm metyl cộng hưởng tại δC 18,8 (C-6) Tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường glucose với carbon anomer cộng hưởng tại δC 106,6 (C-1), tín hiệu của nhóm metylen cộng hưởng tại

δC 70,9 (C-6); tín hiệu của đơn vị đường glucose còn lại với carbon anomer cộng

Trang 23

hưởng tại δC 105,7 (C-1), tín hiệu của nhóm metylen cộng hưởng tại δC 62,9 6)

(C-Phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton anomer của đường cymarose tương quan đến carbon tại δC 73,3 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen tại C-3 Tín hiệu proton anomer của một đơn vị đường glucose tại δH 4,83 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′) tương quan đến

carbon tại δC 83,7 (C-4) cho thấy C-1 của đơn vị đường này gắn với oxygen tại

C-4 Tín hiệu proton anomer của đơn vị đường glucose còn lại tại 5,11 (1H, d, 7,5

Hz, H-1′) tương quan đến carbon tại δC 70,9 (C-6) cho thấy C-1 của đơn vị đường này gắn với oxygen tại C-6

Phổ COSY cho phép xác định chính xác các proton của đơn vị đường thứ nhất nhờ tương quan COSY của chuỗi H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6 Tín hiệu cộng hưởng tại 3,67 (H-4) xuất hiện dạng mũi đôi đôi với hằng số ghép 9,5 và 2,5 Hz xác nhận H-4 ở vị trí trục nên oxygen tại C-4 ở vị trí xích đạo; tín hiệu tại 4,47 (H-

3) xuất hiện dạng mũi đôi với hằng số ghép nhỏ J 2,5 Hz cho thấy H-3 ở vị trí

xích đạo nên oxygen tại C-3 ở vị trí trục

Tín hiệu cộng hưởng của các proton trong hai đơn vị đường glucose còn lại được xác định tương tự như đơn vị đường thứ nhất, nhờ vào tương quan H-H trong phổ COSY; tín hiệu cộng hưởng carbon trong hai đơn vị đường glucose được xác định nhờ tương quan HSQC, có so sánh với tài liệu tham khảo.[11], [56]

Tương tự hợp chất H1, hóa học lập thể của vòng A và B trong hợp chất H5 cũng

được xác định bằng cách so sánh với tài liệu tham khảo.Theo Rikako Hannada,[45] Sarah Kohls,[48] Wolfgang Robien,[62] độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H5 là

24,0 nên sự liên hợp của vòng A và B của H5 ở dạng cis.Theo Tsutomu Furuya và cộng sự,[57] tín hiệu cộng hưởng của proton H-17 là 2,77 nên hydrogen gắn tại C-17

là (17)-H Mặt khác, mũi đơn bầu tại δH 4,17 (1H, s, H-3) chứng tỏ proton H-3

phải ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Như vậy, hóa học lập thể của hợp chất H5 được

Trang 24

β-gentiobiosyl- H (ppm)

J (Hz) C (ppm)

HMBC (1H13C)

Trang 25

Giá trị có thể hoán vị trong mỗi cột

(*) Tài liệu tham khảo không ghi

(**) Sự khác biệt C so với tài liệu tham khảo, C tại C-1 và C-1 được xác định bằng tương quan HSQC giữa H-1 và C-1; giữa H-1 và C-1; và dựa vào tương quan HMBC của H-1 đến C-3

Việc phân tích phổ NMR như trên, cũng như sự trùng khớp các số liệu phổ của H5

với tài liệu tham khảo,[11], [56] cho thấy H5 có cấu trúc phù hợp với hợp chất 14hydroxycard-20(22)-enolid 3-O--D-glucopyranosyl-(16)--D-glucopyranosyl-(14)--D-cymaropyranosid (hay digitoxigenin β-gentiobiosyl-β-D-cymarosid), đã

-được Ueda và cộng sự công bố vào năm 2003.[60]

3.2.6 Hợp chất H6

Hình 3.5 Tương quan H-H COSY và

HMBC quan trọng của H5

Trang 26

Hợp chất H6 cô lập được từ phân đoạn III-4 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định hình

Phổ LC-HRMS của H6 cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 899,4238 [M-H]¯, phù

hợp với công thức phân tử C44H67O19

1,01 (3H, s, H-18) và 0,90 (3H, s, H-19), proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,25

(1H, s, H-3); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 5,30 (1H,

dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) và 5,02 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21); proton olefin

metin, gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại δH 6,14 (1H, brs, H-22), mũi triplet

của proton metin cộng hưởng tại δH 2,78 (1H, brt, J 5,5 Hz, H-17) Các tín hiệu

cộng hưởng trên phổ 1H-NMR của H6 tương tự như của H1, cho phép dự đoán H6

là một dẫn xuất của digitoxigenin Phổ 1H-NMR của H6 còn cho thấy tín hiệu của

ba proton anomer, tương ứng với ba đơn vị đường Tín hiệu đặc trưng của proton anomer trong đơn vị đường digitalose cộng hưởng tại δH 4,85 (1H, d J 8,0 Hz, H-

1), proton metyl của đường này cộng hưởng ở dạng mũi đôi tại δH 1,65 (3H, d, 6,0

Hz, H-6), proton của nhóm metoxy cộng hưởng tại δH 3,44 (3H, s, 3-OCH3) Ngoài

ra, phổ 1H-NMR của H6 còn cho thấy tín hiệu cộng hưởng dạng mũi đôi tại 4,60

(H-4) có hằng số ghép nhỏ, J 2,5 Hz, cho thấy H-4 ở vị trí xích đạo nên oxygen tại

C-4 ở vị trí trục (hình 3.6) Ở hai đơn vị đường glucose còn lại, tín hiệu cộng hưởng của hai proton anomer cộng hưởng tại δH 5,10 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′) và 5,18 (1H, d, 8,0 Hz, H-1′); tín hiệu proton metylen của một đơn vị đường glucose

cộng hưởng tại δH 4,82 (1H, d, H-6) và 4,30 (1H, dd, J 12,0; 7,5 Hz, H-6); của đơn vị đường glucose còn lại cộng hưởng tại 4,40 (1H, dd, J 11,0; 1,0, H-6) và

Trang 27

4,60 (1H, dd, J 11,0; 2,5, H-6) Dựa vào các phân tích về phổ 1H-NMR của H6

như trên, có so sánh với tài liệu tham khảo,[11], [41], [60] cho thấy H6 là một glycosid

có aglycon là digitoxigenin gắn với ba đơn vị đường, trong đó có một đơn vị đường

là digitalose và hai đơn vị đường còn lại là glucose Hằng số ghép J tại H-1, H-1

và H-1 lần lượt bằng 8,0; 8,0 và 8,0 Hz cho thấy cả ba đơn vị đường đều có cấu hình 

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các mũi cộng hưởng

của H6 gồm 44 carbon, trong đó có ba nhóm metyl, một nhóm metoxy, một nhóm

acetyl (CH3CO-), mười một nhóm metylen, hai mươi ba nhóm metin; một vòng

γ-lacton bất bão hòa có các tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC 117,7 22), một carbon của nhóm carbonyl lacton tại δC 174,5 (C-23); tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 84,7 (C-14) Ngoài ra, phổ của H6 còn cho thấy các

(C-tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường digitalose với carbon anomer của đường này cộng hưởng tại δC 99,7 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng tại δC 58,2 (3-OCH3), tín hiệu của nhóm metyl cộng hưởng tại δC 17,8 (C-6) Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC 106,6 (C-1), nhóm metylen của đường này cộng hưởng tại δC 70,9 (C-6) Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose còn lại cộng hưởng tại δC 105,7 (C-1), của nhóm metylen cộng hưởng tại δC 62,9 (C-6)

Phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton anomer của đường digitalose tương quan đến carbon tại δC 73,5 (C-3) nên C-1 gắn với oxygen tại C-3 Ngoài ra, trong đơn vị

đường digitalose còn cho thấy proton metyl của nhóm acetyl tại 2,07 (3H, s,

CH3CO-) tương quan đến C-2 và proton metin tại 3,96 (1H, m, H-2) tương quan

đến tín hiệu tại δC 169,4 (-COO-), nên nhóm acetyl gắn vào oxygen tại C-2 Phổ HMBC còn cho thấy tín hiệu proton anomer của một đơn vị đường glucose tại δH

5,10 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại δC 74,5 (C-4), cho thấy carbon anomer C-1 của đơn vị đường glucose thứ hai gắn với oxygen tại C-4 của đơn vị đường digitalose Tín hiệu proton anomer của đơn vị đường glucose còn lại

tại 5,18 (1H, d, 8,0 Hz, H-1′) tương quan đến carbon tại δC 70,5 (C-6), cho thấy carbon anomer C-1 của đơn vị đường glucose còn lại gắn với oxygen tại C-6 của đơn vị đường glucose thứ hai

Trang 28

Phổ HSQC cho thấy tương quan một nối của proton và carbon, nên cho phép xác định được độ chuyển dịch hóa học của các proton và carbon tương ứng trong hợp

chất H6, có so sánh với độ dịch chuyển hóa học của proton và carbon của hợp chất

(17)-H-periplogenin

3-O-β-glucopyranosyl(14)-2-O-acetyl-3-O-metyl-β-fucopyranosid.[41]

Tương tự như hợp chất H5, phổ COSY của hợp chất H6 cho phép xác định chính

xác tín hiệu cộng hưởng các proton của đơn vị đường thứ nhất, nhờ tương quan COSY của chuỗi H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6 Tín hiệu cộng hưởng tại H

4,60 (4) xuất hiện dạng mũi đôi đôi với hằng số ghép nhỏ, J 2,5 Hz, xác nhận

H-4 ở vị trí xích đạo nên oxygen tại C-H-4 ở vị trí trục (hình 3.6); tín hiệu tại H 3,52

(H-3) xuất hiện dạng mũi đôi đôi với hằng số ghép J 11,5; 3,0 Hz cho thấy H-3 ở

vị trí trục, nên oxygen gắn tại C-3 ở vị trí xích đạo Tín hiệu cộng hưởng tại H 4,65

(H-1) xuất hiện dạng mũi đôi với J 8,0 Hz, cho thấy H-1 và H-2 đều ở vị trí trục

Tương tự như đơn vị đường thứ nhất, giá trị H của các proton trong hai đơn vị đường còn lại được xác định dựa vào tương quan H-H trong phổ COSY.Hai đơn vị đường này được xác định là glucopyranose, dựa vào các phân tích về dữ liệu phổ (được thể hiện trong bảng 3.6), có so sánh với phần đường của hợp chất (17)-H-

ROESY(***) (1H1H)

1,87 (m)

1,62 (m) 1,90 (m) 30,1

Trang 29

mũi đôi chập một phần mũi đơn bầu của H-3

(-) Không xác định được proton

(*) Các tín hiệu chập nhau

(**) Phổ 1H-NMR đo tại Phòng Phân tích Trung tâm Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Tp HCM

Trang 30

(***) Phổ 1H-NMR và phổ ROESY đo tại Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tương tác của các proton gần nhau trong không gian cho phép xác định cấu trúc lập

thể của H6 Phổ ROESY của hợp chất H6 cho thấy H-19 tương tác với H-1 và H-5,

tương quan này xác nhận cấu trạng cis của vòng A và vòng B; H-8 tương tác với H-18 và H-19, tương quan này xác nhận cấu trạng trans của vòng B và C, đồng thời

tương quan giữa H-8 và H-18 cũng cho thấy nhóm OH gắn tại C-14 phải ở vị trí xích đạo Ngoài ra, phổ ROESY còn cho thấy tương tác của H-12 với H-17, tương

quan này xác nhận hydrogen gắn tại C-17 là (17α)-H, H-3 tương tác với H-1,

tương quan này xác nhận H-3 ở vị trí trục (cấu hình α) Như vậy, cấu trúc lập thể

của khung aglycon trong H6 đã được xác định như sau:

Hình 3.6a Tương quan H-H COSY và HMBC quan trọng của H6

Trang 31

Phổ ROESY của H6 còn cho thấy tương quan của các proton trong các đơn vị

đường Tín hiệu tại H-1 tương quan đến H-3, H-3 và H-5; tín hiệu tại H-1 tương quan đến H-3 xác định H-3 ở vị trí trục; H-2 tương quan đến H-4 nên H-4 ở vị trí trục

Các phân tích về số liệu phổ như trên đã xác định được H6 có cấu trúc phù hợp với

hợp chất 14-hydroxycard-20(22)-enolid 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid], có công thức phân tử C44H68O19 Đây là hợp chất mới đã được kiểm tra bằng phần mềm Scifinder vào tháng 3 năm

-D-2012 Hợp chất được đặt tên là digitoxigenin 3-O-[-D-glucopyranosyl-(16)-glucopyranosyl-(14)--D-2-O-acetyldigitalosid]

-D-3.2.7 Hợp chất H7

Hợp chất H7 được cô lập từ phân đoạn C-II (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định hình

[M+Na]+

Hình 3.6b Tương quan H-H ROESY

quan trọng của H6

Trang 32

Phổ 1H-NMR của H7 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của hai mũi đơn metyl tại H

1,03 (3H, s, H-18) và 1,28 (3H, s, H-19), hai mũi đơn bầu của hai proton carbinol cộng hưởng tại 4,43 (1H, br, H-3) và 4,03 (1H, br, H-1); một mũi đơn olefin cộng hưởng tại 6,12 (1H, s, H-22), mũi đôi đôi cộng hưởng tại 2,79 (1H, dd, J 5,5; 8,5

Hz, H-17); mũi đôi đôi cộng hưởng tại 5,30 (1H, dd, J 18,0 Hz; 1,5 Hz, H-21) và 5,02 (1H, dd, J 18,0 Hz; 2,0 Hz, H-21) Các tín hiệu cộng hưởng trên cho phép dự

đoán H7 cũng là một dẫn xuất cardenolid tương tự như H1 Ngoài ra, trên phổ 1NMR, các mũi có H trong khoảng từ 1,34 đến 2,14 là tín hiệu của các proton CH2 còn lại

H-Phổ 13C–NMR, DEPT 90 và DEPT 135 của hợp chất H7 cho thấy tín hiệu cộng

hưởng ứng với sự hiện diện của 23 carbon, trong đó có hai nhóm metyl cộng hưởng tại C 19,4 (C-19) và 16,2 (C-18) Khác với H1, H7 có chín nhóm metylen, có độ

chuyển dịch hóa học C có giá trị trong khoảng từ 21,6 đến 73,7; bảy nhóm metin có giá trị C trong khoảng từ 38,0 đến 120,0 Carbon metin gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại C 68,1 (C-3) và 73,2 (C-1); một carbon olefin metin cộng hưởng tại

C 117,7 (C-22); bốn carbon tứ cấp, gồm một carbon tứ cấp gắn với nhóm rút điện

tử cộng hưởng tại 84,6 Các tín hiệu cộng hưởng của vòng -lacton bất bão hòa cộng hưởng tại C 174,5 (C-23), 117,7 (C-22) và 175,9 (C-20)

Phổ HMBC của hợp chất H7 được trình bày trong bảng 3.7, qua đó cho thấy tín

hiệu cộng hưởng tại H 1,28 (3H, s, H-19) tương quan đến các tín hiệu tại C 73,2

(C-1), 31,1 (C-5), 40,7 (C-10) Như vậy, khác với H1, trong hợp chất H7, proton

gắn tại C-1 là proton carbinol

Tương tự hợp chất H1, tín hiệu cộng hưởng của các proton và carbon trong hợp chất H7 được xác định chính xác nhờ tương quan H-H trong phổ COSY, tương

quan H-C trong phổ HMBC kết hợp với phổ 1H, 13C và DEPT-NMR

Cũng như H1, hóa học lập thể của vòng A và B trong hợp chất H7 được xác định

bằng cách so sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây Theo Tsutomu,[57] Ueda,[60]

và Rodrigo M Pádua,[47] độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H7 là 19,4 (đo

trong C5D5N) nên sự liên hợp của vòng A và B của H1 ở dạng cis Theo Tsutomu

Trang 33

Furuya,[57] tín hiệu cộng hưởng proton tại H-17 là 2,79 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Mặt khác, phổ 1H-NMR của H7 cho thấy proton H-2 có hằng số ghép nhỏ,

J 3,0 nên proton H-1 phải ở vị trí xích đạo, vậy nhóm OH gắn tại C-1 phải ở vị trí trục Mũi đơn bầu của proton carbinol tại 4,43 (1H, br, H-3) chứng tỏ proton H-3

phải ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Như vậy, cấu trúc lập thể của H7 được xác định

C (ppm) (CD3OD)

HMBC (1H13C)

Trang 34

(*) Tài liệu tham khảo không ghi

3.7, cho thấy hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ của hợp chất 1,3,14trihydroxycard-20(22)-enolid (hay acovenosigenin A) đã được Rodrigo M Pádua công bố vào năm 2007 [47] và Ueda cô lập từ cây hà thủ ô trắng vào năm 2003.[60]

-3.2.8 Hợp chất H8

Hợp chất H8 được cô lập được từ phân đoạn IV-2 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định

hình không màu, tan hoàn toàn trong metanol

Hình 3.7 Tương quan HMBC quan trọng của H7

Trang 35

- Phổ LC-MS (phụ lục 8a) cho mũi ion của phân tử giả, với m/z 553,1 [M+H]+

- Phổ 1H-NMR (CD3OD) (phụ lục 8b và bảng 3.8)

- Phổ 13C và phổ DEPT-NMR (CD3OD) (phụ lục 8c, 8d và bảng 3.8)

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (CD3OD) (phụ lục 8e, 8f, 8g và bảng 3.8)

Phổ LC-MS của H8 cho mũi ion của phân tử giả,với m/z 553,1 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử C29H44O10

0,91 (3H, s, H-18) và 1,11 (3H, s, H-19), hai proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,29

(1H, s, H-3) và 3,74 (1H, s, H-1); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng

hưởng tại δH 4,93 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz; 21) và 5,05 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz;

H-21); proton olefin metin cộng hưởng tại δH 5,92 (1H, brs, H-22); proton metin cộng

hưởng dạng mũi triplet tại δH 2,85 (1H, brt, J 6,0 Hz; H-17) So sánh với phổ của

H7 nhận thấy phổ 1H-NMR của H8 tương tự Điểm khác biệt là trên phổ của H8

cho thấy tín hiệu của một đơn vị đường -D-glucose, với proton anomer cộng

hưởng tại 4,36 (1H, d, J 8,0, H-1), hai proton metylen gắn với nhóm rút điện tử cộng hưởng tại 3,68 (1H, dd, J 12,0; 5,5 Hz, H-6) và 3,89 (1H, dd, J 12,0; 5,5 Hz,

H-6)

Phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của H8

gồm 29 carbon, trong đó có hai nhóm metyl, mười nhóm metylen, mười hai nhóm metin; tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC 86,5 (C-14);

một vòng γ-lacton bất bão hòa, gồm có tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin tại δC

117,8 (C-22), một carbon carbonyl lacton cộng hưởng tại δC 177,2 (C-23) Ngoài ra,

phổ của H8 còn cho thấy tín hiệu carbon anomer của đơn vị đường glucose cộng

hưởng tại δC 102,2 (C-1)

Phổ HMBC của H8 cho thấy proton tại δH 1,11 (3H, s, H-19) tương quan đến tín

hiệu carbon carbinol tại δC 73,8 (C-1), cho thấy sự hiện diện của nhóm chức hydroxyl tại C-1 Phổ COSY cho thấy tương quan của proton H-2 đến H-1 và H-3 nên carbon metin còn lại gắn oxygen là C-3 Tương quan HMBC của proton tại δH

0,91 (3H, s, H-18) đến carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC 86,3 chứng

minh có sự hiện diện của nhóm hydroxyl tại C-14 Vị trí của vòng γ-lacton bất bão

Trang 36

hòa được xác định là ở C-17 bằng tương quan HMBC của H-17 tại δH 2,84 đến carbon tại δC 178,4 (C-20), 75,4 (C-21) và 117,8 (C-22) Đơn vị đường của H8

được xác định là D-glucose dựa vào độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu proton

và carbon Tương quan HMBC của H-1 đến C-3 cho thấy đường D-glucose gắn vào C-3 Hằng số ghép 3JHH của H-1 là 8,0 Hz cho thấy cấu hình của đường là β-

D-glucopyranose Các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất H8 được

Trang 37

Ghi chú:

a, b, c

giá trị có thể hoán vị trong mỗi cột

(*) aglycon của H8 được so sánh với acovenosigenin A và acovenosigenin A 3-O-digitalosid

Tương tự H7, hóa học lập thể của vòng A và B trong hợp chất H8 được xác định

bằng cách so sánh với tài liệu tham khảo.Theo Rikako Hannada,[45] Rodrigo M Pádua,[47] Sarah Kohls,[48] Wolfgang Robien,[62] Tsutomu,[57] Ueda,[60] độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H8 là 19,2 (đo trong CD3OD) nên sự liên hợp của

vòng A và B của H8 ở dạng cis.Theo Tsutomu Furuya và cộng sự,[57] tín hiệu cộng hưởng của proton H-17 là 2,85 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Mặt khác,

phổ 1H-NMR và COSY của H8 cho thấy proton H-2 cộng hưởng dạng mũi đôi đôi

với hằng số ghép nhỏ, J 2,0 nên proton H-1 và H-3 đều phải ở vị trí xích đạo, vì vậy

nhóm hydroxyl gắn tại C-1 và C-3 đều phải ở vị trí trục; mũi đơn bầu tại δH 4,29

(1H, s, H-3) cũng chứng tỏ proton H-3 ở vị trí xích đạo (cấu hình α) Như vậy, hóa

học lập thể của hợp chất H8 được xác định như sau:

Từ các phân tích phổ trên, có so sánh với tài liệu tham khảo,[47], [60] cho thấy H8 có

cấu trúc phù hợp với hợp chất 1,14-dihydroxycard-20(22)-enolid

3-O-β-D-glucopyranosid (hay acovenosigenin A 3-O-β-D-3-O-β-D-glucopyranosid) H8 là hợp chất

Trang 38

lần đầu tiên được cô lập từ dịch chiết metanol của bột rễ củ hà thủ ô trắng, đã được Xiao-Hui Zhang [64] lần đầu tiên công bố cô lập từ rễ cây Streptocaulon griffithii

vào năm 2007

3.2.9 Hợp chất H9

Hợp chất H9 cô lập được từ phân đoạn III-2 (sơ đồ 2.1), là chất bột vô định hình,

[M+Na]+

1,00 (3H, s, H-18) và 1,21 (3H, s, H-19), hai proton carbinol cộng hưởng tại δH 4,53

(1H, brs, H-3) và tại 3,87 (1H, brs, H-1); proton metylen gắn với nhóm rút điện tử

Hình 3.8 Tương quan HMBC

và COSY quan trọng của H8

Trang 39

cộng hưởng tại δH 5,30 (1H, dd, J 18,0; 1,5 Hz, H-21) và 5,00 (1H, dd, J 18,0; 1,5

Hz, H-21); proton olefin metin cộng hưởng tại δH 6,12 (1H, brs, H-22), mũi triplet

bầu của proton metin cộng hưởng tại δH 2,77 (1H, brt, J 5,0 Hz; H-17) So sánh với

phổ 1H-NMR của H7, nhận thấy phổ của H9 có các tín hiệu cộng hưởng của khung aglycon tương tự như của H7, điểm khác biệt là trên phổ của H9 cho thấy các tín

hiệu đặc trưng của hai đơn vị đường là digitalose và glucose Tín hiệu đặc trưng của proton anomer trong đơn vị đường digitalose cộng hưởng tại δH 4,75 (1H, d J 8,0

Hz, H-1), proton metyl của đường này cộng hưởng dạng mũi đôi tại δH 1,58 (3H, d,

J 6,5 Hz, H-6) và proton của nhóm metoxy cộng hưởng dạng mũi đơn tại δH 3,64

(3H, s, 3-OCH3) Tín hiệu cộng hưởng của proton anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δH 5,13 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1′), hai proton metylen của đường này cộng hưởng tại 4,53 (1H, m, H-6′) và 4,35 (1H, m, H-6′)

36 carbon, trong đó có ba nhóm metyl, mười nhóm metylen, mười bảy nhóm metin, một nhóm metoxy, tín hiệu của một carbon tứ cấp gắn oxygen cộng hưởng tại δC

84,6 (C-14); một vòng γ-lacton bất bão hòa, gồm có tín hiệu cộng hưởng của carbon

olefin tại δC 117,7 (C-22), một carbon carbonyl cộng hưởng tại δC 174,5 (C-23)

Ngoài ra, phổ của H9 còn cho thấy các tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường

digitalose với carbon anomer cộng hưởng tại δC 101,3 (C-1), tín hiệu nhóm metoxy cộng hưởng tại δC 58,9 (3-OCH3), tín hiệu của nhóm metyl cộng hưởng tại δC 17,6 (C-6) Tín hiệu của carbon anomer trong đơn vị đường glucose cộng hưởng tại δC

105,4 (C-1), nhóm metylen của đường này cộng hưởng tại δC 63,1 (C-6)

Tương tự H7, phổ HMBC của H9 cho thấy proton tại δH 1,21 (3H, s, H-19) tương

quan đến tín hiệu carbon carbinol tại δC 72,1 (C-1), nên nhóm chức hydroxyl gắn tại C-1 Tương quan của proton H-2 với H-1 và H-3 trên phổ COSY cho thấy carbon metin gắn oxygen còn lại là C-3 Tương quan HMBC của proton tại δH 1,00 (3H, s,

H-18) đến carbon tứ cấp gắn oxygen tại δC 86,3 chứng minh có sự hiện diện của nhóm hydroxyl tại C-14

Ngoài ra, phổ HMBC của H9 còn cho thấy tín hiệu proton anomer của đường

digitalose tại δH 4,75 (1H, d, J 8,0 Hz, H-1) tương quan đến carbon tại δC 74,4 3) nên carbon anomer của đường này gắn với oxygen tại C-3 Hằng số ghép 3JHH

Trang 40

(C-của H-1 (J 8,0 Hz) cho thấy cấu hình β (C-của đường digitalose Mặt khác, tín hiệu

cộng hưởng tại H 4,33 (H-4) xuất hiện dạng mũi đôi với hằng số ghép nhỏ, J 2,5

nên H-4 ở vị trí xích đạo, vậy oxygen gắn tại C-4 ở vị trí trục.Đơn vị đường còn

lại của H9 được xác định là β-D-glucopyranose dựa vào độ dịch chuyển hóa học

của các tín hiệu proton và carbon, có so sánh với tài liệu tham khảo.[11], [60] Trong đơn vị đường glucose, tín hiệu proton cộng hưởng tại H 5,13 (H-1) hiện diện ở

dạng mũi đôi có hằng số ghép J 8,0 Hz; tín hiệu cộng hưởng tại H 4,23 (H-3) hiện

diện ở dạng triplet, có hằng số ghép J 9,0 Hz; tín hiệu cộng hưởng tại H 4,18 (H-4)

hiện diện ở dạng mũi triplet, có hằng số ghép J 9,0 Hz, từ đó cho thấy các proton trong đơn vị đường thứ hai đều ở vị trí trục, phù hợp với cấu trúc của đường β-D-

glucopyranose Phổ HMBC của hợp chất H9 còn cho thấy tín hiệu proton anomer

của đơn vị đường glucose tại H 5,13 (H-1) tương quan đến carbon tại δC 76,0 4), đồng thời tín hiệu cộng hưởng tại H 4,33 (brd, 2,5 Hz, H-4) tương quan đến

(C-carbon tại δC 105,4 (C-1) cho thấy carbon C-1 của đơn vị đường này gắn với oxygen tại C-4 của đơn vị đường thứ nhất

Phổ COSY cho thấy tương quan H-H của chuỗi H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6/ H-7/

H-8/ H-9/ H-11/ H-12 và H-15/ H-16/ H-17 trong khung aglycon của hợp chất H9,

cũng như tương quan của các proton kế cận nhau trong hai đơn vị đường (tương

quan COSY được trình bày trong hình 3.9)

xác định dựa trên các kết quả nghiên cứu trước đây Theo Rikako Hannada,[45]Rodrigo M Pádua,[47] Sarah Kohls,[48] Tsutomu,[57] Ueda,[60] Wolfgang Robien,[62] độ chuyển dịch hóa học C tại C-19 của H9 là 19,1 (đo trong pyridin-d 5) nên sự liên

hợp của vòng A và B của H9 ở dạng cis.Theo Tsutomu Furuya,[57] tín hiệu cộng hưởng của proton H-17 là 2,77 nên hydrogen gắn tại C-17 là (17)-H Ngoài ra,

phổ 1H-NMR của H9 cho thấy proton H-2 cộng hưởng dạng mũi đôi đôi với hằng số

ghép J 15,0; 2,5 Hz cho thấy proton H-1 và H-3 đều phải ở vị trí xích đạo, vì vậy

nhóm hydroxyl gắn tại C-1 và C-3 đều ở vị trí trục; proton metin hiện diện ở dạng mũi đơn bầu tại δH 4,53 (1H, brs, H-3) chứng tỏ proton H-3 ở vị trí xích đạo (cấu hình α); mũi đôi bầu tại δH 2,34 (1H, brd, J 11,5 Hz, H-5) cho thấy H-5 ở vị trí trục

Như vậy, hóa học lập thể của hợp chất H9 được xác định như sau:

Định dạng
Số trang	81
Dung lượng	1,66 MB