Isolation and selection of bacillus spp producing fibrinolytic enzymes from vietnamese fermented foods and extraction of fibrinolytic enzymes for functional food application

Đề tài nghiên cứu này tập trung nghiên cứu hàm lượng các fibrinolytic enzyme có trong các sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam, phân lập và tuyển chọn nguồn vi sinh vật sản sinh r

1

Chương 1 MỞ ĐẦU

Fibrin là một loại protein không hòa tan xuất hiện ở những vết thương trên cơ thể Chúng tạo thành màng quanh vết thương và đông đặc lại để ngăn chặn sự chảy máu từ vết thương Fibrin được tạo ra từ finbrinogen bởi tác động của enzyme thrombin mà loại enzyme này được tạo thành bởi sự tương tác giữa các plateles, một loại tế bào tìm thấy trong máu, với các mô bị thương Fibrin rất cần thiết để làm lành các vết thương và là cơ

sở để tạo nên các mô mới Tuy nhiên khi quá nhiều các fibrin được tạo ra chúng sẽ hình thành các cục máu đông làm ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của các cơ quan trong

cơ thể Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết bởi các bệnh tim mạch, trong đó ở Việt Nam số người chết vì bệnh tim mạch khoảng 300,000 người Nguyên nhân chính của bệnh đột quỵ và nhồi máu cơ tim là sự hình thành các cục máu đông bám vào các vách vỡ của mạch máu Sự tích tụ của fibrin trong mạch máu làm cản trở sự lưu thông máu gây tổn hại nghiêm trọng đến

mô tim, dẫn đến rối loạn nhịp đập, ngừng tim và gây tử vong Sự phân hủy các cục máu đông phụ thuộc vào sự hoạt động của các plasmin nội sinh, đây là một loại protease được kích hoạt bởi các tissue plasminogen activator Có ba loại thuốc đang được sử dụng hiện nay trong điều trị bệnh nghẽn mạch đó là urokinase, streptokinase và tissue plasminogen activator (t-PA) Tuy nhiên những enzyme này rất đắt và các bệnh nhân có thể phải chịu những phản ứng phụ không mong muốn như chảy máu dạ dày hay các dị ứng

Hiện nay các sản phẩm lên men truyền thống được phát hiện ra có chứa một lượng lớn các fibrinolytic enzyme có chức năng phá hủy cục máu đông có thể sử dụng như một loại thuốc an toàn và rẻ tiền trong điều trị bệnh nghẽn mạch Do đó có nhiều nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu về nguồn gốc, cấu trúc và tính chất chức năng của các loại fibrinolytic enzyme này Các nghiên cứu cho thấy các fibrinolytic enzymes giữ vai trò quan trọng trong đời sống con người, tuy nhiên khả năng cơ thể tự sản xuất fibrinolytic enzymes tỉ lệ nghịch với tuổi tác Ở trạng thái rối loạn hay cơ thể không thể tự sản xuất fibrinolytic enzymes sẽ dẫn đến các bệnh tim mạch như đột quỵ, nhồi máu cơ tim, đó

là lý do tại sao cần duy trì hàm lượng fibrinolytic enzymes trong cơ thể ở trạng thái cân bằng Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống như Natto của Nhật Bản, Douchi của Trung Quốc, nước tương Chungkook-Jang của Hàn Quốc, mắm tôm Đài Loan đều có chứa một lượng lớn các fibrinolytic enzyme Từ các nghiên cứu trên thế giới có thể kết luận rằng các fibrinolytic enzyme được sản sinh ra trong quá trình lên men

tự nhiên của các vi khuẩn trong không khí từ nguồn cơ chất là protein Do đó đã có một số nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện việc phân lập và định danh các vi khuẩn có mặt

trong các sản phẩm lên men như Kim et al (1996) đã phân lập được chủng Bacillus sp từ nước tương Chunkook-Jang, một loại nước tương truyền thống của Hàn Quốc, Bacillus

về việc tách chiết enzyme natokinase từ các sản phẩm đậu tương lên men sử dụng

chủng vi khuẩn Bacillus nato đã được tiến hành nhưng việc ứng dụng còn hạn chế do

phải mua chế phẩm vi khuẩn của nước ngoài với giá thành cao do đo không có hiệu quả kinh tế Với những ý nghĩa trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus spp có khả năng sản sinh fibrinolytic

enzymes từ các loại thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam và khả năng thu hồi các fibrinolytic enzymes dùng trong thực phẩm chức năng” Đề tài nghiên

cứu này tập trung nghiên cứu hàm lượng các fibrinolytic enzyme có trong các sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam, phân lập và tuyển chọn nguồn vi sinh vật sản sinh ra fibrinolytic enzyme hàm lượng cao từ các sản phẩm lên men truyền thống

và khả năng tách chiết các fibrinolytic enzyme dung trong sản xuất các loại thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng phòng và chữa các bệnh tim mạch và đột quỵ Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế của các sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam, tìm ra được hệ vi sinh vật có trong các sản phẩm lên men này và tối ưu hóa điều kiện sống của chúng để có thể sản xuất ra hàm lượng các fibrinolytic enzyme cao, cũng như tìm ra phương pháp tách chiết các fibrinolytic enzyme sử dụng như là nguồn thuốc và thực phẩm chức năng tự nhiên có lợi cho cơ thể con người

Các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Xác định hàm lượng các fibrinolytic enzyme có trong các sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam để tìm ra hệ vi sinh vật có thể sản sinh ra các fibrinolytic enzymes có hàm lượng cao nhất;

- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh fibrinolytic enzyme cao;

- Tối ưu hóa điều kiện lên men của các chủng vi khuân phân lập được để sản xuất các fibrinolytic enzymes;

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất các enzyme này ứng dụng trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng nhằm điều trị các bệnh về tim mạch

sở để tạo nên các mô mới Tuy nhiên khi quá nhiều các fibrin được tạo ra chúng sẽ hình thành các cục máu đông làm ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của các cơ quan trong

cơ thể Hình 2.1 cho thấy hình ảnh cục máu đông được hình thành trong động-tĩnh mạch

bị thương tổn do xơ vữa

Hình 2.1 Hình ảnh sự hình thành huyết khối trong động mạch bị thương

Bệnh huyết khối là sự hình thành cục máu đông bên trong lòng mạch, gây tắc nghẽn mạch (tĩnh mạch hoặc động mạch), ngăn mạch máu đưa chất dinh dưỡng và oxy

về nuôi các cơ quan trọng yếu trong cơ thể Bệnh lý huyết khối động - tĩnh mạch là nguyên nhân của một số bệnh lý nghiêm trọng đe dọa tính mạng như thuyên tắc phổi (PE), đột quỵ, nhồi máu cơ tim hay đau thắt ngực, để lại hậu quả nghiêm trọng hoặc gây tử vong nhanh chóng Sự tích tụ của fibrin trong mạch máu làm cản trở sự lưu thông máu gây tổn hại nghiêm trọng đến mô tim, dẫn đến rối loạn nhịp đập, ngừng tim

và gây tử vong Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng

17 triệu người chết bởi các bệnh tim mạch (WHO, 2014), trong đó ở Việt Nam số người chết vì bệnh tim mạch khoảng 300,000 người (MOH, 2009) Sự phân hủy các cục máu đông phụ thuộc vào sự hoạt động của các plasmin nội sinh, đây là một loại protease được kích hoạt bởi các tissue plasminogen activator (Rouf et al., 1996)

Các tác nhân làm tan huyết khối phân hủy fibrin bằng cách tạo các chuỗi phản ứng phân hủy fibrin trong cơ thể người hoặc mô phỏng theo các phân tử làm tan huyết khối

có giá thành cao và có thể là trở ngại cho những bệnh nhân phải theo liệu trình chữa trị lâu dài Vì vậy, nghiên cứu và phát hiện ra tác nhân mới an toàn và giá thành thấp

trong điều trị huyết khối là rất cần thiết

2.2 Các loại fibrinolytic enzymes và khả năng phá cục máu đông

Fibrinolytic enzymes giữ vai trò quan trọng trong đời sống con người, tuy nhiên khả năng cơ thể tự sản xuất fibrinolytic enzymes tỉ lệ nghịch với tuổi tác Ở trạng thái rối loạn hay cơ thể không thể tự sản xuất fibrinolytic enzymes sẽ dẫn đến các bệnh tim mạch như đột quỵ, nhồi máu cơ tim, đó là lý do tại sao cần duy trì hàm lượng fibrinolytic enzymes trong cơ thể ở trạng thái cân bằng

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tìm ra các fibrinolytic enzyme trong các sản phẩm thực phẩm lên men như natto của Nhật Bản (Sumi et al., 1987), nước tương Chungkook-Jang của Hàn Quốc (Kim et al., 1996) và edible honey mushroom (Kim & Kim, 1999) Các loại mắm tôm của các nước châu Á như Đài Loan cũng được tìm thấy có chứa hàm lượng lớn các fibrinolytic enzyme (Wong & Mine, 2004)

Natto là một loại thực phẩm truyền thống của Nhật Bản được làm từ đậu nành lên men Trong nhiều thế kỷ, natto được sử dụng như một loại lương thực và là phương thuốc dân gian chữa bệnh tim và mạch máu, mệt mỏi và bệnh tê phù (beriberi) Tuy nhiên, mãi đến đầu những năm 1980, một trong những đặc tính quan trọng của natto mới được TS Hiroyuki Sumi phát hiện Khi cho natto vào một khối huyết nhân tạo trong đĩa petri và đặt ở 37oC (tương đương nhiệt độ cơ thể người), sau 18 giờ, khối huyết quanh natto được hòa tan hoàn toàn Vì thế TS Sumi đã đặt tên cho enzyme mới được phát hiện là nattokinase

Nattokinase là một fibrinolytic enzyme có hoạt tính mạnh, có khả năng phân giải các cục máu đông, ngăn chặn sự kết tụ các tế bào hồng cầu, làm tăng khả năng sản

5

xuất plasmin và các tác nhân tan huyết khác trong cơ thể người Nattokinase là protein

có cấu trúc là các chuỗi đơn polypeptide gồm có 275 amino acids và có trọng lượng phân tử là 27 kDa Nattokinase có thể dùng để chữa trị và ngăn ngừa bệnh huyết khối tĩnh mạch sâu (DVT – Deep vein thrombosis) có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe Thực tế cho thấy, nattokinase có hoạt tính fibrinolytic cao hơn 4 lần so với plasmin

Streptokinase là enzyme thu nhận được từ các chủng vi khuẩn thuộc loài

Streptococci và được phát hiện như là một loại thuốc dùng để chữa trị bệnh nghẽn

mạch một cách hiệu quả Streptokinase là một protein ngoại bào, có phân tử lượng 47 kDa được tổ hợp từ 414 amino acids (Kim et al., 2000) Streptokinase hoạt động trong

cơ thể bằng cách chuyển hóa plasminogen thành plasmin

2.3 Nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme fibrinolytic

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh fibrinolytic enzymes

Quá trình lên men là do các vi khuẩn trong không khí nhiễm vào nguyên liệu trong quá trình chế biến một cách tự nhiên Từ các nghiên cứu trên thế giới có thể kết luận rằng các fibrinolytic enzyme được sản sinh ra trong quá trình lên men tự nhiên của các vi

6

khuẩn trong không khí từ nguồn cơ chất là protein của hạt đậu tương hoặc của tôm, cá

Bảng 2.1 tổng hợp các kết quả của các nghiên cứu đã tìm ra được các chủng vi sinh vật có

thể sản sinh fibrinolytic enzyme thuộc các loài Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Alteromonas, Coryneform, Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Tritotecium, Actinomyces, Streptomyces, Escheria coli, phổ biến nhất là chủng Bacillus subtilis từ thực phẩm lên men

Như vậy, các fibrinolytic enzyme được nghiên cứu sản xuất rộng rãi từ các thực phẩm lên men truyền thống như Natto của Nhật Bản, Douchi của Trung Quốc, nước tương Chungkook-Jang của Hàn Quốc, mắm tôm Đài Loan Các fibrinolytic enzymes này được sử dụng trong sản xuất thuốc và các thực phẩm chức năng chữa các bệnh về tim mạch một cách hiệu quả Trong khi đó ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về hàm lượng các fibrinolytic enzyme trong các sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam như các loại tương lên men, các loại mắm tôm, mắm tép lên men, mặc dù các sản phẩm này được sử dụng phổ biến ở Việt Nam Ngoài ra, nguồn vi sinh vật để sản sinh

ra các fibrinolytic enzyme và khả năng tách chiết các enzymes này từ các thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam cũng chưa được nghiên cứu Từ ý tưởng trên nhóm nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng

Bacillus spp có khả năng sản sinh fibrinolytic enzymes từ các loại thực phẩm lên men

truyền thống của Việt Nam và khả năng thu hồi các fibrinolytic enzymes dùng trong thực phẩm chức năng” Đề tài nghiên cứu này tập trung nghiên cứu hàm lượng các fibrinolytic enzyme có trong các sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam, phân lập và tuyển chọn nguồn vi sinh vật sản sinh ra fibrinolytic enzyme hàm lượng cao từ các sản phẩm lên men truyền thống và khả năng tách chiết các fibrinolytic enzyme dung trong sản xuất các loại thuốc và các sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng phòng và chữa các bệnh tim mạch và đột quỵ

7

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các mẫu mắm tôm thương mại được thu thập trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam

gồm 11 mẫu Độ ẩm, màu sắc và xuất xứ được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Độ ẩm, màu sắc và khu vực lấy mẫu các loại mắm tôm

62,2 74,0

Xám Xám

64,6 56,0

Xam Hồng

65,0 56,0 46,5 60,0 52,0 58,0 42,0

Xám Xám Hồng Đen Hồng Đen Cam

Các mẫu tương lên men cũng được thu thập trên cả 3 miền gồm 15 mẫu Độ ẩm,

màu sắc và xuất xứ được trình bày trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Độ ẩm, màu sắc và khu vực lấy mẫu các loại tương lên men

34,0 33,0 35,2 36,6 37,2 30,2

Nâu Nâu Nâu Nâu đậm Nâu Nâu nhạt

21,8 11,4

Nâu Nâu đậm

31,6 29,6 31,8 31,0 65,0

Nâu Nâu đậm Nâu Nâu nhạt Nâu đậm

49,8 36,8

Nâu đậm Nâu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị mẫu

Sau khi xác định hàm lượng chất khô của từng mẫu, mẫu được pha loãng với dung dịch đệm phosphate để đảm bảo tất cả các mẫu đều có cùng nồng độ dựa vào phần trăm hàm lượng chất khô Lắc đều mẫu trong 10 phút và lọc bằng giấy lọc Whatman Dung dịch sau lọc được đo hoạt tính tan huyết khối bằng phương pháp phân hủy fibrin

để tìm ra mẫu có khả năng phân giải huyết khối nhiều nhất

3.2.2 Phương pháp đo hoạt tính fibrinolytic enzyme

Hoạt tính của enzyme làm tan huyết khối được đánh giá theo phương pháp phân giải fibrin của Công ty Trách nhiệm hữu hạn Phòng thí nghiệm Khoa học Sinh học Nhật Bản (Japan Bio Science Laboratory Co., Ltd (JBSL)) Trước hết, cho 0.4 mL fibrinogen và 0.1 mL dung dịch đệm phosphate 245mM (pH 7) vào ống nghiệm và ủ ở điều kiện 37oC Sau 5 phút, thêm 0.1 mL thrombin vào và ủ ở điều kiện 37oC trong 10 phút để hình thành huyết khối Sau đó, 0.1 mL dung dịch enzyme được thêm, ủ ở điều kiện 37oC và khuấy đều sau 20, 40, 60 phút, thêm 2.0 mL axit trichloroacetic (TCA)

và trộn đều để kết thúc phản ứng enzyme Hỗn hợp enzyme sau đó được ủ ở điều kiện

37oC trong 20 phút, ly tâm ở 6,500 g trong 5 phút và loại bỏ cặn Sau đó, lấy 1 mL dịch nổi đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 275 nm Đối với mẫu chứng, tất cả các bước được thực hiện đúng với quy trình như trên trừ bước thêm enzyme Khi đó enzyme được thêm vào sau khi kết thúc phản ứng bằng TCA Trong thí nghiệm này, một đơn vị (đơn vị phân giải fibrin, FU) của hoạt tính enzyme được định nghĩa là sự tăng lên 0.01 trong mỗi giây khi đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 275 nm của dung dịch phản ứng

Hoạt tính enzyme được tính theo công thức

Hoạt tính enzyme (FU/mL) = (ODs – ODc)/(0.01 x 60 x 0.1)

Trong đó, ODs: giá trị OD của mẫu; ODc: giá trị OD của mẫu chứng

3.2.3 Phân lập và định danh vi khuẩn sản sinh fibrinolytic enzymes

Các mẫu có hoạt tính tan huyết cao nhất được pha loãng ở các mức nồng độ 10-3,

10-4 và 10-5 Trải đều 100 µl dung dịch pha loãng lên bề mặt đĩa thạch LB chứa (g/L) peptone, 10; chiết xuất nấm men, 5; NaCl, 10; thạch, 20, pH 7.0 và ủ ở điều kiện 37oC

9

trong 24 giờ Quan sát đĩa thạch LB và cấy chuyền cho đến khi trên mỗi đĩa thạch

đồng nhất về khuẩn lạc

Tất cả vi khuẩn phân lập từ các mẫu được xác định khả năng tiết enzyme nhằm tìm

ra những vi khuẩn có khả năng phân giải fibrin nhiều nhất sử dụng cho các khảo sát sau này Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong bình erlen 250 mL Vi khuẩn được nuôi cấy trong 30 mL canh trường giống chứa (g/L) K2HPO4, 1; MgSO4.7H2O, 0.5 ở điều kiện 37oC trong 24 giờ Sau đó 1 mL canh trường được chuyển sang bình erlen chứa 100 mL môi trường nuôi cấy lỏng chứa (g/L) SSP, 10; K2HPO4, 1; MgSO4.7H2O ở điều kiện 37oC trong 24 giờ hoặc canh trường rắn chứa cơ chất là bột

bã đậu tương Sau 24 giờ nuôi cấy lắc, thu hoạch enzyme bằng cách ly tâm môi trường nuôi cấy ở 10,000g trong 15 phút Dịch nổi thu được sau ly tâm là fibrinolytic enzyme thô được sử dụng để đo hoạt tính enzyme

Tất cả các mẫu vi khuẩn được nhuộm Gram để dễ quan sát và chụp ảnh bằng máy ảnh Canon độ phân giải 12.1 megapixels phóng to quang học 4 lần Các vi khuẩn sản xuất enzyme có hoạt tính cao nhất được chọn và gửi đến công ty NK Biotek để định danh bằng phương pháp 16S rRNA

3.2.4 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy thu nhận fibrinolytic enzyme cao nhất bằng phương pháp tối ưu cổ điển

Sự ảnh hưởng của 4 tác nhân đến khả năng sản xuất enzyme làm tan huyết khối, bao gồm cơ chất (SSP), thời gian lên men, nhiệt độ và muối ăn (NaCl), được khảo sát bằng cách sử dụng phương pháp tối ưu hóa cổ điển Phương pháp này được tiến hành bằng cách thay đổi từng tác nhân trong khi các tác nhân còn lại vẫn được giữ cố định Khi giá trị tối ưu của mỗi tác nhân được tìm thấy sẽ được dùng cho các khảo sát của những tác nhân còn lại Mỗi tác nhân được khảo sát ở 4 cấp độ, trong đó nồng độ SSP, thời gian lên men, nhiệt độ và muối ăn được thay đổi lần lượt từ 0.5% đến 2.0%, từ 16 giờ đến 72 giờ, từ 30oC đến 45oC, từ 0.5% đến 2.0%

3.2.4.1 Ảnh hưởng của cơ chất đến sự sản xuất enzyme làm tan huyết khối

Để tìm ra điều kiện tối ưu của nồng độ cơ chất, vi khuẩn được nuôi cấy trong canh trường giống chứa các nồng độ cơ chất khác nhau gồm 0.5%, 1.0%, 1.5%, và 2.0%,

pH của môi trường được điều chỉnh ở 7.0 Sau 24 tiếng nuôi cấy lắc ở điều kiện 37oC, dịch nuôi cấy lỏng được ly tâm ở 10,000 vòng, điều kiện 4oC trong 20 min để thu dịch nổi Enzyme thu được sau đó được đo hoạt tính tan huyết

3.2.4.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự sản xuất enzyme làm tan huyết khối

10

Sau khi tìm ra giá trị tối ưu của nồng độ cơ chất, ảnh hưởng của thời gian lên men được khảo sát bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường chứa nồng độ cơ chất tối tưu ở 16 giờ, 24 giờ, 48 giờ, và 72 giờ Bước ly tâm và xác định hoạt tính tan huyết của enzyme được tiến hành như các bước nêu trên

3.2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sự sản xuất enzyme làm tan huyết khối

Thí nghiệm được tiến hành liên tục ở các nhiệt độ khác nhau gồm 30oC, 37oC,

40oC, và 45oC Các điều kiện khác của sự tăng trưởng vi khuẩn được thiết lập ở nồng

độ SSP tối ưu, thời gian lên men tối ưu và pH 7.0 Bước ly tâm và xác định hoạt tính tan huyết của enzyme được tiến hành như các bước nêu trên

3.2.4 Ảnh hưởng của muối ăn đến sự sản xuất enzyme làm tan huyết khối

Môi trường chứa nồng độ SSP tối ưu được bổ sung thêm muối ăn ở 4 nồng độ khác nhau (0.5%, 1.0%, 1.5% và 2.0%), và được thiết lập ở điều kiện nhiệt độ và thời gian tối ưu Bước ly tâm và xác định hoạt tính tan huyết của enzyme được tiến hành như các bước nêu trên

3.2.5 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy thu nhận fibrinolytic enzyme cao nhất phương pháp tối ưu bề mặt đáp ứng

Mô hình Box Behnken là một mô hình bậc hai 3 cấp độ được sử dụng trong phương pháp bề mặt đáp ứng (Box và Behnken 1960) Mô hình xây dựng tập hợp con chi tiết của tổ hợp thừa số từ thiết kế lũy thừa bậc 3 Trong thiết kế Box Behnken, mỗi biến được thay đổi ở 3 cấp độ được mã hóa là -1, 0, 1 (Andre và Mukhopadhyay 2010) Mô hình Box Behnken sử dụng trong nghiên cứu này được thiết lập cho 4 tác nhân độc lập biến đổi ở 3 cấp độ Mối quan hệ giữa các biến độc lập và kết quả phụ thuôc được thiết lập bởi mô hình bậc hai như phương trình dưới đây (1)

Trong đó Y là kết quả đo được, βo, βi, βii, βịj lần lượt là các hệ số bậc một của Xi,

hệ số bậc hai của Xi, và sự tương tác giữa 2 tác nhân Xi và Xj Xi và Xj là các ký hiệu của các biến độc lập thứ i và j Sự ý nghĩa của mô hình được đánh giá dựa vào hệ số ước lượng và giá trị p nhận được từ F-test Hệ số xác định, ký hiệu R2, cho thấy khả năng các điểm giá trị có thể nằm trên đường thẳng hoặc đường cong Mối quan hệ giữa các biến và kết quả trong phương pháp bề mặt đáp ứng được thể hiện trong bề mặt không gian 3 chiều

3.2.5.1 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy dạng lỏng

( 1 )

X X X

i n

1 1



11

Theo phương pháp của Prafulla và cs (2010), vi khuẩn được nuôi cấy trong bình erlen chứa 25 mL dịch lỏng gồm (g/L) D-glucose, 10; yeast extract, 10; , K2HPO4 3H2O, 1; MgSO4.7H2O, 0.5 và pH từ 7.0 – 7.5, ủ trong 37oC trong máy lắc ở 180 vòng trong 24 giờ Đối với quy trình tối ưu hóa, lấy 5% (thể tích/thể tích) dịch nuôi cấy cho vào bình erlen chứa 25 mL môi trường chưa tối ưu gồm D-glucose, 20; peptone,10; chiết xuất nấm men, 10; K2HPO4 3H2O, 1; MgSO4.7H2O, 0.5, CaCl2.2H2O, 0.5 Nhiệt

độ, nồng độ cơ chất và muối ăn, thời gian lên men được biến đổi liên tục lần lượt từ

30oC đến 40oC, từ 0.5% đến 1.5%, từ 0.5% đến 1.5%, và từ 24 giờ đến 72 giờ, và pH của môi trường được chỉnh ở giá trị từ 7.0 đến 7.5 Sau khoảng thời gian và nhiệt độ ủ thích hợp ở 180 vòng, mẫu được ly tâm ở 10,000 vòng trong 30 phút để thu dịch nổi Bước ly tâm được tiến hành ở 4oC Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Bốn thông số ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn và khả năng sản sinh ra enzyme fibrinolytic bao gồm: nhiệt độ (X1), bột vỏ tôm (X2), muối ăn (X3) và thời gian lên men (X4) được chọn làm 4 biến độc lập và hoạt tính tan huyết của enzyme (Y) là kết qủa phụ thuộc Bảng 3.3 thể hiện 3 cấp độ của mỗi thông số và các giá trị tương ứng Mô hình 25 thí nghiệm được xây dựng bằng thiết kế Box Behnken dựa trên phần

mềm Design Expert phiên bản thử nghiệm 7.0.0 (Stat Ease, USA)

Bảng 3.3 Cấp độ và ký hiệu của các tác nhân trong thiết kế Box

Behnken cho môi trường lên men lỏng

3.2.5.2 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy dạng rắn

Vi sinh vật được nuôi cấy trong bình tam giác Erlen có chứa 30 ml canh trường giống (0.1% K2HPO4 and 0.05% MgSO4.7H2O, w/w), sau đó được lên men ở nhiệt độ 37oC trong 24h Sau khi lên men, 0,1 ml canh trường giống được chuyển sang bình

Erlen có chứa canh trường dạng rắn (Ramakrishna et al., 2011) và lên men ở nhiệt độ

37oC trong 24h Dung dịch enzyme được thu hồi sau khi pha loãng canh trường trong dung dịch phosphate và được đem đi thử hoạt tính enzyme fibrinolytic

12

Bảng 3.4 Cấp độ và ký hiệu của các tác nhân trong thiết kế Box Behnken

cho môi trường lên men rắn

(Stat Ease, USA)

13

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phần I Xác định hoạt tính fibrinolytic enzymes trong các sản phẩm lên

men truyền thống của Việt Nam

4.1 Hoạt tính fibrinolytic enzymes trong các sản phẩm mắm tôm

Hoạt tính fibrinolytic enzyme có trong các sản phẩm mắm tôm thu thập trên 3

miền Bắc, Trung, Nam Việt Nam được trình bày trong Hình 4.1 Kết quả cho thấy

rằng tất cả 11 mẫu mắm tôm đều có chứa hàm lượng fibrinolytic enzyme với hoạt độ trong khoảng từ 0,23 đến 3,72 FU/g mẫu khô Trong đó có 03 mẫu mắm tôm có hoạt tính fibrinolytic enzyme cao nhất là Sông Hương 1, Trí Hải 1 và Thanh Hóa với các hoạt độ enzyme tương ứng là 3,72; 3,56 và 3,20 FU/g mẫu khô Fibrinolytic enzyme

có trong các sản phẩm mắm là do sự có mặt của các vi khuẩn trong không khí lẫn vào nguyên liệu trong quá trình chuẩn bị và lên men tự nhiên Do đó hoạt tính enzyme khác nhau trong các mẫu có thể do sự có mặt của các chủng vi khuẩn khác nhau hoặc

do nồng độ vi khuẩn có trong các mẫu là khác nhau Trong nghiên cứu tiếp theo, 2 mẫu mắm có hoạt tính fibrinolytic enzyme cao nhất được lựa chọn để phân lập và định danh các chủng có khả năng sản sinh fibrinolytic enzyme gồm mẫu Sông Hương 1 và mẫu Thanh Hóa

Hình 4.1 Hoạt tính fibrinolytic enzyme trong các sản phẩm mắm tôm

4.2 Hoạt tính fibrinolytic enzymes trong các sản phẩm tương lên men

Hoạt tính fibrinolytic enzyme có trong các mẫu đậu tương lên men được trình bày

trong Hình 4.2 Trong 15 mẫu tương lên men được thu thập từ 3 miền Bắc, Trung,

14

Nam Việt Nam thì chỉ có 07 mẫu có chứa fibrinolytic enzyme với các hoạt độ khác nhau trong khoảng 0,32 – 1,81 FU/g Có 8 mẫu không có hoạt tính enzyme bao gồm Huu Ai, Toan Thu, Hau Sanh, Trung Nguyen, Nam Dan, Hang Hai, Tam Duc and Thuy San KV1 Trong nghiên cứu tiếp theo, 02 mẫu tương Miso và Green Chili có hoạt độ enzyme cao nhất tương ứng 1,81 và 0,77 FU/g được lựa chọn để phân lập các

vi khuẩn có khả năng sản sinh fibrinolytic enzyme

Hình 4.2 Hoạt tính fibrinolytic enzyme trong các sản phẩm tương lên men

Phần II Phân lập và định danh các vi khuẩn có khả năng sản sinh

fibrinolytic enzymes cao từ các sản phẩm lên men

4.3 Phân lập các vi khuẩn có trong mắm tôm

Hình 4.3 Hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu mắm tôm Sông

Hương 1

15

Sau khi cấy chuyền nhiều lần để thu được các bào tử đồng nhất trong đĩa agar, có

03 mẫu vi khuẩn có hình thái khác nhau đã được phân lập từ mẫu mắm tôm Sông

Hương 1 và được ký hiệu là A1, A2 và A3 Hình 4.3 cho thấy các mẫu vi khuẩn phân

lập được có hình thái khác nhau nhưng đều là vi khuẩn gram dương Mẫu vi khuẩn A1

có hình tròn, mẫu A2 có hình oval và mẫu A3 có hình que Các mẫu vi khuẩn phân lập được sẽ được kiểm tra khả năng sản sinh fibrinolytic enzyme trong thí nghiệm tiếp theo

Cũng tương tự thí nghiệm trên, sau khi phân lập các mẫu vi khuẩn có trong sản phẩm mắm tôm Thanh Hóa thu được kết quả là 03 mẫu vi khuẩn có hình thái khác

nhau và được ký hiệu là B1, B2 và B3 như trong Hình 4.4 Cả 03 mẫu vi khuẩn này

cũng làm vi khuẩn gram dương, tuy nhiên B1 có hình tròn, còn B2 và B3 có hình que Khả năng sản sinh ra fibrinolytic enzyme của các vi khuẩn này được kiểm tra bằng phương pháp lên men lỏng trong thí nghiệm tiếp theo

Hình 4.4 Hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu mắm tôm Thanh

Hóa 4.4 Hoạt tính fibrinolytic enzyme sản sinh bởi các vi khuẩn phân lập từ mắm tôm

Hoạt tính fibrinolytic enzyme sản sinh bởi các chủng vi khuẩn A1, A2 và A3 phân lập được từ mẫu mắm tôm Sông Hương 1 trong canh trường lên men lỏng sử dụng vỏ

tôm là cơ chất được trình bày trong Bảng 4.1

Bảng 4.1 Hoạt tính fibrinolytic enzyme trong canh trường lên men từ

các chủng vi khuẩn phân lập từ mắm Sông Hương 1

16

Kết quả cho thấy rằng tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng sản sinh ra fibrinolytic enzyme, trong đó hoạt độ enzyme từ chủng A3 là cao nhất (3,12 FU/ml), tiếp theo là các chủng A2 (2,90 FU/ml) và A1 (2,28 FU/ml) Như vậy, chủng A3 có hình que và có khả năng sản sinh ra fibrinolytic enzyme cao hơn so với các chủng khác có thể thấy đây là chủng vi khuẩn tốt để sản xuất fibrinolytic enzyme

Do đó chủng A3 được đem đi định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 16s

rRNA sequencing

Bảng 4.2 là kết quả hoạt tính fibrinolytic enzyme được sản sinh ra trong canh

trường lên men có sử dụng các chủng vi khuẩn B1, B2 và B3 được phân lập từ mẫu mắm tôm Thanh Hóa Trong 03 chủng phân lập được, chủng B2 có khả năng sản sinh

ra fibrinolytic enzyme có hoạt tính cao nhất Do đó chủng B2 được chọn để đem đi định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 16s rRNA sequencing

Bảng 4.2 Hoạt tính fibrinolytic enzyme trong canh trường lên men từ

các chủng vi khuẩn phân lập từ mắm Thanh Hóa

17

Hình 4.5 trình bày kết quả định danh chủng vi khuẩn A3 phân lập được từ mẫu

mắm tôm Sông Hương 1 và có khả năng sản sinh ra fibrinolytic enzyme hoạt tính cao Kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 16s rRNA sequencing cho thấy chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu mắm tôm Sông Hương 1 thuộc chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis với sự trùng hợp về trật tự gene là 100% Trong nghiên cứu của Wang

et al (2011), chủng vi khuẩn Bacillus subtilis TKU007 đã được sử dụng để sản xuất

fibrinolytic enzyme bằng phương pháp lên men lỏng có sử dụng vỏ tôm làm cơ chất

Trong nghiên cứu này chủng vi khuẩn Bacillus subtilis A3 phân lập được từ mẫu mắm

tôm Sông Hương 1 hoàn toàn có thể sử dụng để sản xuất fibrinolytic enzyme trong công nghiệp Trong nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sẽ tối ưu hóa môi trường lên men

để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất

Kết quả định danh chủng vi khuẩn B2 phân lập từ mẫu mắm tôm Thanh Hóa có

khả năng sản sinh fibrinolytic enzyme cao được trình bày trong Hình 4.6 Từ kết quả

phân tích 16s rRND sequencing có thể khẳng định rằng chủng vi khuẩn này gần giống

chủng Bacillus weihenstephanensis DSM11821 với độ tương đồng là 99% Kết quả này cho thấy rằng có nhiều chủng Bacillus spp có trong tự nhiên có mặt trong các mẫu

mắm tôm trong quá trình sản xuất để lên men tạo ra fibrinolytic enzyme Trong nghiên cứu tiếp theo môi trường nuôi cấy cũng được tối ưu để so sánh khả năng sản sinh

fibrinolytic enzyme của các chủng Bacillus phân lập được

Hình 4.6 Kết quả định danh chủng vi khuẩn B2 phân lập từ mắm tôm Thanh Hóa

4.6 Phân lập các vi khuẩn có trong tương lên men

Hai mẫu tương GreenChili và Miso có chứa fibrinolytic enzyme cao được chọn để phân lập các chủng vi khuẩn có mặt trong các sản phẩm này Dựa vào hình thái của các chủng vi khuẩn, có 02 chủng có hình thái khác nhau ký hiệu là CB1 và CB2 được

18

phân lập từ mẫu tương GreenChili như trong Hình 4.7 Cả 2 chủng CB1 và CB2 đều

là các vi khuẩn gram dương, có hình que, dạng di động, tập hợp thành hình tròn, màu trắng sáng Tuy nhiên các bào tử của chủng CB1 có bề mặt trơn và đục, còn bào tử của chủng CB2 có bên mặt gồ ghề và trong suốt

Hình 4.7 Hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu tương GreenChili

Tương tự như trên, cũng có 02 chủng vi khuẩn có hình thái khác nhau được phân lập từ mẫu tương Miso ký hiệu là MB1 và MB2 MB1 có các bào từ không đồng đều,

bề mặt gồ ghề, màu kem, còn mẫu MB2 có các bào tử hình tròn, bề mặt gồ ghề, có

màu trắng như trong Hình 4.8

Để chứng minh khả năng sản sinh fibrinolytic enzyme của các chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tương lên men Trong thí nghiệm tiếp theo, các chủng vi khuẩn này được sử dụng trong quá trình lên men bã đậu tương bằng phương pháp lên men rắn Hoạt tính của các fibrinolytic enzyme sản sinh ra từ các chủng vi khuẩn này được xác định để lựa chọn các chủng tốt nhất có thể ứng dụng trong sản xuất fibrinolytic enzyme theo quy mô công nghiệp Các nghiên cứu tiếp theo là định danh các chủng vi khuẩn này và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để thu được hàm lượng fibrinolytic enzyme cao nhất

19

Hình 4.8 Hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được từ mẫu tương Miso

4.7 Hoạt tính fibrinolytic enzyme sản sinh bởi các vi khuẩn phân lập từ tương lên men

Hoạt tính fibrinolytic enzyme có trong canh trường lên men từ bã đậu tương có sử dụng các chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu đậu tương GreenChili và Miso

được trình bày trong Bảng 4.3

Bảng 4.3 Hoạt tính fibrinolytic enzyme trong canh trường lên men từ

các chủng vi khuẩn phân lập từ đậu tương lên men