Hydrolysis of coconut and rosselle seed oils by using lipase immobilized on hydrotalcite like compounds for production fractions enriched bioactive fatty acids (lauric, linoleic)

Để sản xuất các axít béo có hoạt tính sinh học, các nhà nghiên cứu cũng như các nhà sản xuất quan tâm đặc biệt đến phương pháp thủy phân bằng enzyme.Thủy phân dầu mỡ với xúc tác enzyme c

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sử dụng enzyme lipase làm xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu nhằm thay thế phương pháp dùng xúc tác hóa học do những ưu điểm về công nghệ, tạo ra sản phẩm tinh khiết, dễ dàng kiểm soát chất lượng, mặt khác do không sử dụng nhiều hóa chất, điều kiện phản ứng

êm dịu, có thể thực hiện được ở điều kiện thường nên phương pháp sử dụng enzyme xúc tác cũng thân thiện hơn với môi trường

Các acid béo thu được từ sự thủy phân chất béo được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, chất tẩy rửa, đặc biệt các acid béo không no có giá trị dinh dưỡng cao đang được quan tâm như ω-3, ω-6,…là thành phần quan trọng của nhiều loại thực phẩm chức năng nên đòi hỏi chất lượng cao Phương pháp dùng xúc tác hóa học đang được áp dụng có những nhược điểm như phản ứng phải tiến hành ở điều kiện nhiệt độ, áp suất cao, đòi hỏi trang thiết bị phải có những tính năng đặc biệt như chịu áp, chịu nhiệt, chống ăn mòn,… làm chi phí thiết bị, vận hành cao Ngoài ra bằng phương pháp hóa học sản phẩm thu được có chất lượng không cao, lẫn tạp chất khó tách Trong khi phương pháp sử dụng enzyme lipase làm xúc tác sẽ khắc phục được những hạn chế này

Lipase là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân chất béo tạo ra các acid béo cũng như xúc tác cho phản ứng chuyển este chất béo hay tổng hợp các este

từ acid và rượu Do đó enzyme lipase được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực

sản xuất khác nhau Porcine pancreas (tuyến tụy lợn) là một trong những nguồn thu nhận enzyme lipase quan trọng, enzyme lipase từPorcine pancreas

có tính bền nhiệt cao, có thể xúc tác trong điều kiện khan nước

Axit lauric là axit béo chiếm hàm lượng cao trong dầu dừa Hiện nay, axit lauric ngày càng được quan tâm như một hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học với chức năng kháng khuẩn, hỗ trợ hoạt động tim mạch và có khả năng tăng cường sức đề kháng cho cơ thể

Trong dầu hạt bụp giấm, loại axit béo chiếm tỷ lệ cao nhất là linoleic Các axit α-linoleic và linoleic là tiền chất của nhóm axít béo ω-3 và ω- 6 Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng acid béo ω -3 và ω-6 có thể giúp giảm nguy cơ rối loạn nhịp tim và giảm tỉ lệ hình thành các mảng xơ vữa gây tắc động mạch Axít γ-linoleic được ghi nhận có hiệu quả chống ung thư

Việc thu nhận sản phẩm giàu axit béo có hoạt tính sinh học từ dầu hạt bụp giấm và dầu dừa có ý nghĩa nhất định về hiệu quả kinh tế – xã hội khi góp phần làm tăng giá trị sử dụng của nông sản trên thị trường nước ta

Vì vậy, chúng tôi đề xuất đề tài này với mong muốn góp phần vào hướng nghiên cứu tạo ra sản phẩm có giá trị cao từ nguồn nguyên liệu có sẵn ở nước ta bằng phương pháp sản xuất tiên tiến, phù hợp với mục tiêu phát triển bền vững, thân thiện môi trường, đồng thời tạo tiền đề trong ứng dụng hệ enzyme lipase

Porcine pancrea cố định trên chất mang hydrotalcite – 1 hệ enzyme cố định

mới Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đặt cơ sở cho việc phát triển công nghệ

thủy phân dầu béo với hệ xúc tác sinh học – hướng đến một nền công nghiệp thân thiện môi trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Nguồn thu nhận axít béo có hoạt tính sinh học:

Hình

1.1: Đài hoa và hạt bụp giấm Hạt bụp giấm là phụ phẩm sau khi thu hoạch đài hoa Ở Việt Nam, người dân chỉ giữ lại một lượng hạt đủ để làm giống cho mùa sau, và phần lớn lượng hạt còn lại chỉ đem thải bỏ Điều này tương đương với việc thải bỏ một khối lượng nguyên liệu giàu dinh dưỡng cả về protein, chất béo và chất xơ Hạt bụp giấm chứa khoảng 34% protein; 19-22% chất béo; 39- 42% chất xơ (Amin và cộng sự, 2008) Ở một số nước như Trung quốc, Sudan, Malaysia vàTây Phi, dầu hạt bụp giấm được dùng để làm xà phòng (Malaysia) hoặc sử dụng cho thực phẩm (Sudan) Dầu hạt bụp giấm cũng đang được quan tâm nghiên cứu cho sản xuất biodiesel ở Thailand (Nakpong & Wootthikanokkhan,2010)

Dầu hạt bụp giấm có giá trị dinh dưỡng khá cao với tỷ lệ thành phần của axít béo no và không no là 2:1, trong đó oleic (26%) và linoleic (39-42%) là hai 2 axít béo chiếm hàm lượng cao nhất trong dầu hạt bụp giấm (Akinoso & Suleiman, 2011;Atta & Imaizumi, 2002; Bouanga-Kalou et al., 2011; El-Adawy & Khalil, 1994;Nyam et al., 2009; Nzikou et al., 2011; Zoué et al., 2012) Hạt bụp giấm của Việt Nam chứa khoảng 22.3% dầu trong đó hàm lượng oleic (27.38%) và linoleic (42.49%) là hai thành phần axít béo chủ chốt (Matthaus và cộng sự, 2003) Tài liệu tham khảo cũng

cho thấy các axít béo được tồn trữ trong dầu hạt bụp giấm chủ yếu ở dạng triglyceride (69.2%) (Atta & Imaizumi, 2002)

Ngoài ra, dầu hạt bụp giấm cũng được có hàm lượng axít béo không no khá cao (khoảng 70%) (Mohamed, 2007) Chính vì thế nó được đánh giá là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho công nghệ thực phẩm và mỹ phẩm

Bảng 1.1 Thành phần axit béo của dầu hạt bụp giấm theo các tác giả công bố

Abu-và ctv (1997)

Atta và Imaizumi (2002)

Matthau

s

và ctv (2003)

Mohamed

và ctv (2007)

Nyam

và ctv (2009)

Nzikou

và ctv (2011)

Elneairy (2014)

C16:1n-7

0,2 0,26±0,07 0,64±0,04 0,47 0,44±0,02 0,3±0,0 2,00 Stearic

C18:0

2,4 5,80±0.49 3,63±0,12 2,77 5,28±0,14 5,0±0,2

5,79±0,35

4,09 Oleic

C18:3n-3

1,69±0,19

2,09 Arachidic

Dầu hạt bụp giấm ở nhiệt độ phòng có dạng lỏng, màu vàng xanh với chỉ số khúc xạ và độ ẩm tương ứng là 1,46% và 0,065% (Adepoju và Okunola, 2013), những quan sát về màu sắc và chỉ số khúc xạ phù hợp với báo cáo được công bố trước đó (Mohamed và ctv, 2007; Mahmoud và ctv, 2008; Nakpong và Wootthikanokkhan, 2010) Dầu có nhiệt độ kết tinh -9,52oC và điểm nóng chảy -5,65oC do hàm lượng axit béo không no khá cao (Nyam và ctv, 2009) Trọng lượng phân tử trung bình của dầu thô được xác định là 283,3 (Betiku và Adepoju, 2013)

Dầu hạt bụp giấm có chỉ số xà phòng hóa cao (Abu-Tarboush và ctv, 1997) so với các loại dầu thực vật phổ biến, cho thấy sự có mặt của hàm lượng cao của triacylglycerol trọng lượng phân tử thấp (Nzikou và ctv, 2011)

Chỉ số peroxit(mức độ ổn định oxy hóa chất béo trong quá trình lưu trữ) của dầu bụp giấm tinh chế (6 - 9,3) hơi cao hơn so với dầu thô (5,9 - 9) (Bamgboye và Adejumo, 2010) Chỉ số iốt của dầu bụp giấm thuộc trong phạm vi của dầu bán khô85

- 130 chỉ ra dầu có hàm lượng cao axit béo không no và ít cholesterol tương tự như dầu thực vật như dầu cọ, dầu hạt xoài và dầu cám gạo (Bamgboye và Adejumo, 2010)

Bảng 1.2 Tính chất hóa lý của dầu hạt bụp giấm

Tính chất Mahmoud

và ctv (2008)

Bamgboye

và Adejumo (2010)

Nzikou

và ctv (2011)

Betiku và Adepoju (2013)

Elneairy (2014) Chỉ số axit

(g I 2 /100 g dầu)

97,62 111,2 97,78±0,25 97,77±0,02 115±2,57 Chỉ số peroxit

Cây dừa (Cocos nucifera) phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (G Parfene và

cộng sự, 2013) Dầu dừa được sử dụng từ rất lâu và được minh chứng là một trong những loại dầu đa dụng, có lợi cho sức khỏe, có khả năng hạ chỉ số lipid máu, tăng cường sức khỏe và ngăn ngừa một số bệnh (A.M Marina, 2009; Manisha DebMandal

và cộng sự, 2011; K.G Nevin and T Rajamohan, 2006) Trên thực tế, dầu dừa đã

được sử dụng từ nhiều năm qua để làm thực phẩm cho trẻ sinh thiếu tháng, điều trị cho người có vấn đề về miễn dịch và sử dụng trong các thức uống tăng lực Thành phần hóa học của dầu dừa bao gồm một lượng lớn các chất béo no, có chiều dài mạch cacbon từ 28C đến 52C (J Bezard và cộng sự, 1971; G Parfene và cộng sự 2013) Dầu dừa giàu chất béo có mạch axít béo trung bình (chiếm khoảng 70%) (J Bezard và cộng sự, 1971), các chất béo này có khả năng tiêu hóa tốt và có khả năng kháng khuẩn (G Parfene và cộng sự, 2013) Trong đó ba axít béo có giá trị là axít lauric (C12:0), axít capric (C10:0) và axít caprylic (C8:0) chiếm tỷ lệ khối lượng cao Thành phần axít lauric được chứng minh là có tỷ lệ các nhóm ưa nước và kỵ nước cân bằng (Branen, A L., 1980, G Parfene và cộng sự, 2013) Thành phần axit béo của dầu dừa được trình bày trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Thành phần axít béo trong dầu dừa (J Bezard và cs, 1971)

Công thức cấu tạo: (Sigma-Aldrich, 2015)

- Tên IUPAC: cis,cis-9,12-Octadecadienoic acid

- Công thức phân tử : C18H32O2

- Khối lượng phân tử: 280,45 g/mol

- Tỉ khối: 0,9 g/cm-3

- Điểm nóng chảy: -5oC

- Điểm sôi: 229oC

- Tên khác: Omega 6

Các nghiên cứu về axit linoleic

Axit linoleic (LA, 18:2, n-6) là một axit béo thiết yếu, chiếm ưu thế trong các loại thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc (Wu và cs, 2008) và cũng có mặt rộng rãi trong hầu hết các loại dầu thực vật đặc biệt là dầu bắp, dầu hạt hướng dương, dầu hạt rum và dầu hạt đậu nành Trong công nghiệp, LA có thể sử dụng làm lớp màng bảo vệ, chất bề mặt, chất bôi trơn, cấu thành các hợp chất chuỗi dài và sử dụng trong mỹ phẩm (Abdullah

và Salimon, 2010)

Ở người, LA được chuyển thành axit gammalinolenic (18:3, n-6) để bắt đầu cho con đường chuyển hóa thành các axit béo thiết yếu n-6 như axit dihomogammalinolenic (20:3, n-6), axit arachidonic (20:4, n-6) và axit adrenic (22:4, n-6) là tiền chất prostaglandin (Horrobin và Huang, 1987) có hiệu quả điều trị chống các rối loạn tự miễn dịch tế bào liên quan đến bệnh vẩy nến, viêm thấp khớp, xơ cứng, bệnh đái tháo đường phụ thuộc insulin (Namazi, 2004)

LA liên quan đến lợi ích sức khỏe: Được đề xuất có vai trò tiềm năng trong việc kiểm soát cân nặng và trị bệnh béo phì (Pérez-Matute và ctv, 2007), duy trì sức khỏe tim mạch và tuần hoàn máu bằng cách giảm LDL (Low density lipoprotein)-cholesterol trong máu và gia tăng HDL (High density lipoprotein)-cholesterol (Horrobin và Huang, 1989; EFSA Panel, 2011), bảo vệ và chống lại cơn đột quỵ qua các cơ chế tiềm năng trong việc giảm huyết áp, giảm kết tập tiểu cầu và tăng cường biến dạng của tế bào hồng cầu (Iso và cs, 2002) và cũng đã sử dụng trực tiếp y học vì đặc tính có lợi cho da như bảo vệ da từ tác động của tia UV (EFSA Panel, 2011), chống viêm, khử mụn trứng cá và tính giữ ẩm (Letawe và cs, 1998)

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng LA có thể kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư ở chuột (Ohmori và ctv, 2008), giúp phát triển và duy trì chức năng của thần kinh vì vậy có vai trò tiềm năng cho việc điều trị bệnh Alzheimer (FSA Panel, 2010) và tăng cường nội tiết tố estrogen từ đó có lợi cho việc điều trị các triệu chứng mãn kinh (Parhizkar và Latiff, 2013)

LA chiếm 85 - 90% trong chế độ ăn có chứa PUFA (Meyer và cs, 2003) và

chiếm khoảng 2% năng lượng/ngày đủ để ngăn chặn thiếu hụt Việc tiêu thụ thực phẩm có LA vàaxit gammalinolenic làm giảm các triệu chứng triệu chứng khô mắt và tăng cường sản xuất nước mắt (Macrìvà cs, 2003) Tuy nhiên, chế độ ăn với hàm lượng cao axit linoleic làm tăng nguy cơ phát triển viêm loét đại tràng (Tjonneland và

cs, 2009)và thiếu hụt LA sẽ dẫn đến khô da và rụng tóc, lâu lành vết thương (Wu và

cs, 2008)

b/ Axít lauric:

Axít lauric là thành phần axít béo có hàm lượng cao trong dầu dừa và dầu cọ Khác với các axit béo bão hòa mạch dài, axít lauric có chuỗi mạch carbon trung bình với 12C Các axít béo no mạch trung bình được kiểm định khả năng kháng khuẩn và

chứng tỏ có khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh Gram âm (E coli và S enteritidis) và Gram dương (B cereus và L monocytogenes) (G Parfene và cs, 2013) Acid lauric và acid caprylic có khả năng ức chế một số vi khuẩn như L monocytogenes và E coli O157:H7, Streptococcus spp., E coli ATCC 25922 và P fluorescens, đặc biệt acid lauric có khả năng ức chế tốt đối với cả vi khuẩn gram âm

và gram dương (Patricia Nobmann và cs, 2009) Các acid béo capric acid (decanoic acid, C10:0), lauric acid và α-linolenic acid (c-9,c-12,c-15-octadecatrienoic acid,

C18:3 n-3) được chứng minh có khả năng ức chế sự phát triển của S aureus Các acid

béo mạch trung bình (C:10, C:12) có khả năng liên kết với màng tế bào, tạo pKa cao

và phá vỡ tổ chức glycerophospholipids của tế bào, do đó ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn gây bệnh (Bergsson G và cs, 2001; Sado Kamdema và cs, 2008) Acid

lauric C12:0 (1 mM) có khả năng tiêu diệt 90% tế bào Helicobacter pylori, trong khi

đó các acid béo mạch trung bình khác (C4:0 - C16:0) ở nồng độ 1 mM và pH 7 làm

giảm khả năng sống sót của tế bào H pylori đến 4 log (Cynthia Q Sun, 2003) Trong

cơ thể người, axit lauric chuyển hóa thành hợp chất monolaurin với tác dụng chống các loại virus có lớp vỏ lipid (như SARS và HIV) Monolaurin cũng có khả năng phá hủy các loại vi khuẩn và nấm gây hại nhất định như virus gây bệnh mụn rộp, cảm cúm, viêm gan

1.2 Sản xuất axít béo bằng phương pháp thủy phân với xúc tác enzyme

Sản xuất axít béo bằng cách thủy phân dầu mỡ tự nhiên đóng một vai trò quan trọng trong nền công nghiệp khai thác nguồn năng lượng tự nhiên tái tạo được Các axít béo được dùng làm nguyên liệu chính cho hàng loạt các ngành sản xuất sản phẩm chăm sóc sức khỏe, thực phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp hóa chất như sơn, dầu bôi trơn, chất tẩy rửa… Hằng năm, trên thế giới có khoảng 1,6 triệu tấn axít béo được sản xuất bằng cách thủy phân dầu mỡ Các acid béo được thu nhận từ nhiều nguồn, thường là

từ chất béo từ thực vật và động vật, bằng phương pháp vật lý và hóa học, vận hành ở nhiệt độ cao và áp suất cao (Bahruddin S., 2007) Phương pháp thu nhận bằng hơi nước áp lực cao và thủy phân bằng kiềm có tốc độ phản ứng nhanh, có quy mô sản xuất lớn nhưng sản phẩm có chất lượng không cao Các phương pháp này đòi hỏi điều

kiện nhiệt độ và áp suất cao (khoảng 250oC, 70bar), ở điều kiện này, các axít béo tạo thành, nhất là các axít béo có hoạt tính sinh học có thể bị phân hủy hoặc bị oxy hóa, đồng thời, về mặt kinh tế, phản ứng ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao khiến chi phí năng lượng và đầu tư thiết bị tăng cao

Để sản xuất các axít béo có hoạt tính sinh học, các nhà nghiên cứu cũng như các nhà sản xuất quan tâm đặc biệt đến phương pháp thủy phân bằng enzyme.Thủy phân dầu mỡ với xúc tác enzyme có thể diễn ra ở điều kiện tương đối “mềm” so với 2 phương pháp trên (thường ở nhiệt độ khoảng 35oC và áp suất khí quyển), vì vậy, sản phẩm thu được không bị ảnh hưởng của nhiệt độ, chi phí năng lượng và đầu tư thiết bị phản ứng cũng được giảm đi đáng kể Hiện nay, ở Nhật bản đã có 1 số nhà máy sản xuất axít béo không bão hòa có độ tinh khiết cao bằng cách thủy phân với enzyme

G Parfene và cs (2013) thu nhận chất béo thủy phân và acid béo từ dầu dừa sử

dụng lipase ngoại bào của nấm men Yarrowia lipolytica RO13 trong quá trình lên men

rắn Sau 7 ngày lên men, có thể thu nhận lượng lớn các acid béo no mạch trung bình (C:8, C:10, C:12), trong đó acid lauric (dodecanoic acid, C:12) chiếm 70%

Tuy vậy, việc mở rộng sản xuất theo phương pháp thủy phân với enzyme gặp một số trở ngại: thời gian phản ứng chậm, khó tiến hành sản xuất liên tục, giá thành của enzyme khá cao Enzyme lipase chỉ được hoạt hóa ở bề mặt phân pha, vì vậy, cần phải thêm vào hệ phản ứng chất nhũ hóa, độ bền hệ nhũ tương này giảm theo thời gian

và phụ thuộc nhiều vào phương pháp tạo nhũ Hơn nữa, việc sản xuất axit béo với enzyme tự do còn gặp một khó khăn đáng kể là trong quá trình phản ứng, lượng axít béo được giải phóng làm giảm pH của hệ, khiến cho enzyme bị giảm hoạt tính, nhưng việc điều chỉnh pH bằng dung dịch kiềm lại dẫn tới phản ứng xà phòng hóa, phá vỡ hệ nhũ tương cần thiết để tạo bề mặt phân pha cho enzyme hoạt động

Để khắc phục những trở ngại trên, việc cải thiện độ bền enzyme được quan tâm nghiên cứu Song song với hướng tạo các enzyme mới có hoạt tính, có độ chọn lọc cao và đặc biệt là có độ bền nhiệt, bền pH tốt, việc tạo hệ enzyme cố định trên chất mang ngày càng thu hút sự quan tâm của giới nghiên cứu cũng như các nhà sản xuất

1.3 Các phương pháp phân tách để thu nhận axit béo:

1.3.1 Chưng cất:

Việc tinh sạch axit béo bằng cách chưng cất đã được thực hành trong hơn một trăm năm và đến nay vẫn là phương tiện phổ biến nhất và hiệu quả nhất của sản xuất axít béo có độ tinh khiết cao Việc chưng cất loại bỏ cả các tạp chất sôi thấp và cao cũng như các chất mùi Chưng cất axit béo có thể theo từng mẻ gián đoạn hoặc liên tục, ở áp suất khí quyển hay áp suất thấp Người ta có thể sử dụng phương pháp chưng cất phân đoạn để tách và tinh sạch các axit béo theo chiều dài mạch carbon (Gervajio, 2005; Muckerheide, 1952; Potts, 1956) Do các axit béo khá nhạy cảm với nhiệt độ, các quá trình chưng cất nên được tiến hành ở nhiệt độ thấp, hạn chế thời gian gia nhiệt

ở mức thấp nhất có thể Hiện nay, việc chưng cất đã trở nên rất hiện đại với kỹ thuật tạo chân không cao, truyền nhiệt tốt, nhiệt độ chưng cất đã giảm và thời gian gia nhiệt rút ngắn đáng kể, các axit béo thu được với phương pháp này có độ tinh sạch cao và ít

bị biến tính do nhiệt Chưng cất phân đoạn tách axit béo dựa trên điểm sôi của chúng, các axit béo khác nhau về chiều dài mạch carbon được tách dễ dàng bằng phương

pháp này, sản phẩm thu được có độ tinh khiết đến hơn 90% (Potts & White, 1953; Ruston, 1952) Về cơ bản, chưng cất phân đoạn được thực hiện cùng một cách như chưng cất liên tục Sự khác biệt chính là ở thiết kế của cột cất phân đoạn để loại bỏ các sản phẩm chưng cất dòng phụ của axit béo và trả lại một phần của những dòng trào ngược (Muckerheide, 1952; Stage, 1984) Chưng cất phân đoạn được hãng General Mills áp dụng ở quy mô công nghiệp từ năm 1948 để sản xuất các axit béo và sản phẩm dầu mỡ

1.3.2 Chưng cất phân tử:

Chưng cất phân tử là phương pháp tách hiệu quả đối với các chất béo kém bền nhiệt, dễ bị oxy hóa và các dẫn xuất của chúng Quá trình chưng cất phân tử được tiến hành trong chân không, cho phép giảm nhiệt độ chưng cất, từ đó giảm ảnh hưởng của nhiệt độ lên các axit béo Việc tách các axit béo dựa vào trọng lượng của chúng giúp thu nhận axit béo có hàm lượng tạp chất thấp hơn so với tiêu chuẩn công nghiệp Phương pháp này đã được dùng trong công nghiệp mỹ phẩm, làm giàu axit béo omega-3 (EPA và DHA) và este của chúng trong dầu cá (Rossi và cs, 2011)

1.3.3 Phân tách và tinh sạch axit béo bằng kết tinh

1.3.3.1 Kết tinh phân đoạn dung môi

Điểm nóng chảy của các axit béo thay đổi đáng kể tùy thuộc vào sự khác nhau

về chiều dài mạch carbon và mức độ không bão hòa vì vậy khi nhiệt độ hỗn hợp các axit giảm xuống, các SFA chuỗi dài và MUFA có điểm nóng chảy cao hơn được kết tinh trước trong khi phần PUFA vẫn ở dạng lỏng (Shahidi và Wanasundara, 1998) Nhờ nguyên lý trên mà có thể phân tách các PUFA ra khỏi SFA và MUFA bằng kết tinh phân đoạn ở nhiệt độ thấp Phương pháp này có thể thực hiện bằng cách kết tinh trực tiếp hỗn hợp các axit béo hay khi các axit béo được hòa tan trong dung môi Phương pháp kết tinh nguyên liệu trực tiếp thường cho hiệu quả phân tách và hiệu suất thu hồi không cao do phần lỏng bị kẹt rất nhiều trong phần kết tinh (Lại Mai Hương, 2007) Đối với mục đích làm tăng hàm lượng các axit béo không no thì phân đoạn dung môi cùng với nhiệt độ thấp được cho là phương pháp hiệu quả nhất do dung môi có tác dụng làm giảm độ nhớt của dầu (Timms, 2005), tăng sự khác biệt về nhiệt độ nóng chảy của các axit béo trong phần rắn và phần lỏng (Trần Thị Ngọc Yên, 2004) Một số dung môi sử dụng: acetone, methyl ethyl cetone, methyl alcohol, benzol, paraffin hydrocarbon như là hexane, propane, butane Dựa vào nghiên cứu trước đây acetone là dung môi phù hợp và phổ biến nhất để phân tách hỗn hợp SFA và PUFA (Jala và Guo, 2012)

Kết tinh nhiệt độ thấp các axit béo được thực hiện đầu tiên bởi Brown và cộng

sự, tiến hành làm giàu LA từ dầu hạt cây rum sử dụng dung môi acetone.Ưu điểm chính là kỹ thuật đơn giản, không có thuốc thử ngoại trừ sự tham gia dung môi, không xảy ra quá trình oxy hóa hoặc thay đổi các axit béo (Fontell và cs, 1960), giảm thiểu thiệt hại đến axit béo do tiến hành ở nhiệt độ thấp (Chen và Ju, 2001) và đã được áp dụng để phân tách SFA (palmitic) và PUFA (oleic và linoleic) từ dầu cám gạo (El-Zanati và Khedr, 1991; Yu và cs, 2006) cho hiệu quả phân tách và độ tinh sạch tương ứng PUFA là 88,8%, 91% và SFA 65%, 59% Nghiên cứu gần đây cho thấy quy trình

kết tinh phân đoạn dung môi đã được phát triển để làm giàu PUFA n-3 từ dầu hạt lưu

ly và hạt lanh (Chen và Ju, 2001), dầu cá basa, cá ngừ và cá trích (Trần Thị Ngọc Yên, 2004; Lại Mai Hương, 2007);nội tạng của gà và cá (Patil và Nag, 2011) và loại bỏ các axit béo dạng trans và SFA từ dầu hạt đậu nành (Jala và Guo, 2012)

1.3.3.2 Tạo phức với ure (kết tinh ure)

Phân đoạn tạo phức với ure được thiết lập bởi Bengen vào năm 1940 để phân tách các hợp chất mạch thẳng từ các hợp chất mạch nhánh và mạch vòng.Ngày nay, phương pháp này được biết như kỹ thuật sử dụng để loại bỏ SFA và MUFA SFA và MUFA dễ dàng tạo phức với ure (urea complexed fraction, UCF) và kết tinh khi làm lạnh, sau đó có thể được loại bỏ bằng cách lọc, phần chất lỏng hoặc không tạo phức với urê (non-urea complexed fraction, NUCF) giàu PUFA (Zainuddin và cs, 2011)

Cơ sở khoa học của việc sử dụng ure để phân tách là các tinh thể ure có cấu trúc tứ giác kín với các rãnh có đường kính 5,67 Å Tuy nhiên, khi có mặt các phân tửaxit béo mạch dài, các rãnh phân tử ure được tạo nên đủ lớn để khớp với chuỗi axit béo và kết tinh trong một cấu trúc lục giác với rãnh có đường kính 8 - 12 Å(các phân tửure liên kết với nhau thông qua liên kết hydro trong khi lực Vander Wals mạnh tồn tại giữa các phân tử ure và axit béo, dẫn đến mở các rãnh hình tròn) (Hayes và cs, 1998) Sự có mặt của liên kết đôi trong chuỗi carbon làm tăng kích thước phân tửđồng thời lại làm giảm khả năng tạo phức của nó với ure do đó monoene dễ tạo phức hơn diene và cuối cùng khó tạo phức nhất là triene (Shahidi và Wanasundara, 1998) Xu hướng axit béo kết hợp với ure giảm với sự gia tăng axit béo không no và giảm chiều dài của chuỗi (Zainuddin và cs, 2011) Khả năng liên kết ure và axit béo theo thứ tự như sau: stearic (C18:0) > palmitic (C16:0) > oleic (C18:1) > linoleic (C18:2) > linolenic (C18:3) (Tang và cs, 2002)

Ure tạo phức tốt với các phân tử dài mạch thẳng, ngược lại phân tử phân mạch nhánh, vòng và chứa nối đôi cũng như các nhóm chức năng epoxy hay hydroxy ít có khả năng tạo thành phức hợp với ure (Hayes và cs, 1998) Vì vậy, tạo phức với ure được sử dụng để phân lập PUFA và FFA mạch nhánh thông qua việc loại bỏ các SFA

và MUFA do hình thành UCF Ví dụ như làm giàu EPA và DHA từ dầu cá chép

(Crexi và cs, 2012),axit α-linolenic từ dầu hạt é, Ocinum Basillium L.(Warsito và cs,

2011).UCF rất hiệu quả trong việc loại bỏ SFA từ FFA trong dầu hạt cải nên cải thiện giá trị dinh dưỡng của hỗn hợp FFA (Hayes và cs, 1998) Theo Hình 1.2cho thấy cơ chế hình thành phức hợp của axit béo với ure dựa trên mối liên kết hydro (N-H….N)

tạo nên cấu trúc giống hình ống (Ohlan và cs, 2008)

Hình 1.2: Cơ chế hình thành phức hợp ure với acid béo (Ohlan và cs, 2008) Các nghiên cứu trước đây cũng báo cáo về lợi ích của phương pháp này bao gồm kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng, điều kiện nhiệt độ trung bình, thân thiện môi trường và phức tinh thể cực kỳ ổn định, nguyên liệu không đắt (Wu và cs, 2008) Hơn nữa, nghiên cứu từ những năm 1940 đến những năm 1960 đã chứng minh rằng phức ure bảo vệ các phân tử tránh quá trình oxy hóa như bảo vệ PUFA n-3 từ quá trình tự động oxi hóa (Mendes và cs, 2007)

Nghiên cứu của Abdullah và Salimon (2010) sử dụng phức ure để làm giàu LA

từ dầu hạt Jatropha curcas Dưới điều kiện tối ưu tỷ lệ ure/ FA= 5:1, nhiệt độ kết tinh

-10oC, thời gian 24h thì hiệu suất LA tăng từ 36,71 đến 92,81% và hiệu suất NUCF là 7,8% Tách phân đoạn bằng phức ure là kỹ thuật rẻ và hiệu quả để phân tách LA từ FFA Nghiên cứu đã tiến hành làm giàu LA bằng phức ure từ một số dầu như dầu hạt hướng dương (Zeng và cs, 2007; Wu và cs, 2008), dầu hạt bông (Zheng và cs, 2010)

và dầu Clarias macrocephalus (Zainuddin và cs, 2011) Kết quả thấy rằng % LA từ

pha NUCF tương đối cao thậm chí hơn 80%

1.4 Enzyme lipase Porcine pancreas

Enzyme lipase Porcine pancreas – được tách từ tuyến tụy của lợn

Tuyến tụy của lợnlà nguồn quan trọng để tách enzyme lipase và lipase cũng là enzyme được phân lập lần đầu tiên từ nguồn này

Chuỗi amino acid của enzyme lipase tuyến tụy được duy trì, bảo tồn cao ở động vật bậc cao Enzyme lipase tụy người có 465 amino acid, của lợn là 449 amino acid

Và chuỗi amino acid của enzyme lipase tuyến tụy lợn giống 86% chuỗi enzyme lipase tuyến tụy của người Khối lượng phân tử của enzyme lipase tuyến tụy lợn là 49934,6 Daltons, của colipase là 10322,7 Daltons

Cấu trúc của lipase quyết định chức năng xúc tác của nó Khả năng thủy phân các liên kết este là do ba nhóm có tên là “bộ ba xúc tác (the catalytic triad)”, bộ ba này gồm Ser 153, His 264 và Asp 177

Hình 1.4: Cơ chế xúc tác (bước 1)

Hình 1.3: Mô hình cấu trúc lipase Porcine pancreas

Enzyme lipase Porcine pancreas không chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân chất

béo mà chúng còn xúc tác cho phản ứng chuyển este hay tổng hợp các este từ acid và

rượu Lipase Porcine pancreas là một trong những enzyme có giá thànhthấp nhất

không phải được thu nhận từ vi sinh vật Enzyme này có tính ổn định nhiệt và có thể xúc tác trong nhiều các phản ứng khô (không có nước) Chúng có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất các acid béo quan trọng

1.5 Enzyme cố định

Sử dụng enzyme cố định có một số ưu điểm như sau:

o Một lượng enzyme có thể sử dụng được nhiều lần

o Enzyme không lẫn vào trong sản phẩm, do đó không gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

o Dùng enzyme cố định có thể dừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách

o Các phương pháp cố định enzyme thường được áp dụng là:

o Gắn bằng liên kết đồng hóa trị phân tử enzyme vào chất mang không hòa tan hay gắn các enzyme với nhau để tạo đại phân tử không hòa tan

o Đính enzyme trên bề mặt chất mang hoặc trong lòng khuôn gel có kích thước lỗ khá nhỏ để giữ được enzyme, còn cơ chất có thể qua lại tự do

o Hấp phụ enzyme trên chất mang không tan có hoặc không mang điện tích Trong vài năm gần đây, đã có các nghiên cứu cố định enzyme lipase trên chất mang như chitosan, hạt nano từ tính, hydrotalcite, zeolite, hạt silica, nhựa acrylic macropore , bọt ceramic, thủy tinh xốp, bột nhôm axít hóa, kiềm hóa, kaolin, nhựa Amberlyst, sợi polyester , Nylon

Các nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng rõ rệt của chất mang lên hoạt tính của enzyme: enzyme có thể tăng hoạt tính khi được cố định trên chất mang phù hợp và ngược lại, có thể giảm hoạt tính, thận chí bị mất hoạt tính khi được cố định trên các chất mang gây ức chế enzyme

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác (bước 2)

Trong phản ứng thủy phân dầu thực vật, so với enzyme tự do, enzyme cố định có các đặc điểm vượt trội hơn như: bền với pH, nhiệt độ, ít bị ảnh hưởng bởi nồng độ cơ chất và tốc độ khuấy hơn Việc cố định enzyme lipase sử dụng trong phản ứng thủy phân chất béo thu acid béo được nghiên cứu trên nhiều vật liệu khác nhau nhằm tăng khả năng tái sử dụng enzyme Jinyong Yan và cộng sự (2011) đã cố định lipase từ

Geotrichum candidum trên vật liệu NKA resin làm tăng khả năng tái sử dụng enzyme

trong thủy phân dầu béo thu acid béo

Nghiên cứu của Ting W.J và cộng sự (2006) cố định enzyme lipase từ Candida rugosa lên chitosan để thủy phân dầu nành, pH khảo sát từ 5 – 11 Kết quả cho thấy,

hoạt tính tương đối của enzyme lipase tự do và cố định khi pH nằm trong khoảng từ 6 – 8 là tương đương nhau Tuy nhiên khi pH tăng từ 9 – 11, hoạt tính tương đối của enzyme cố định đạt được cao hơn so với enzyme tự do, đặc biệt, tại pH 11, hoạt tính tương đối của enzyme cố định vẫn đạt được khoảng 90%, trong khi đó, enzyme tự do chỉ còn lại khoảng 30%

Lee Dong-Geun và cộng sự (2008) sử dụng enzyme lipase Porcine pancreas tự do

và enzyme lipase Porcine pancreas cố định lên các hạt nano từ tính kỵ nước để thủy

phân dầu oliu pH khảo sát từ 5.5 – 8.7 Kết quả cho thấy, khi pH tăng lên 8.7, hoạt tính riêng của enzyme cố định đạt được 8.12 U/mg protein, trong khi đó hoạt tính riêng của enzyme tự do chỉ còn 4.75 U/mg protein

Cũng theo Lee Dong-Geun và cộng sự (2008), khi khảo sát về ảnh hưởng của

nhiệt độ đến hoạt tính riêng của enzyme lipase Porcine pancreas tự do và cố định với

nhiệt độ khảo sát từ 20 – 600C, kết quả cho thấy hoạt tính riêng của lipase cố định tại các nhiệt độ khảo sát đều cao hơn so với lipase tự do, đặc biệt, tại nhiệt độ 600C, hoạt tính riêng của lipase cố định đạt khoảng 72 U/mg protein, trong khi đó, enzyme tự do chỉ đạt khoảng 22 U/mg protein Điều này chứng tỏ, lipase cố định bền với nhiệt độ hơn so với lipase tự do.Ting W.J và cộng sự (2006) khảo sát về độ bền nhiệt độ của

lipase từ Candida rugosa trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 550C nhận thấy, enzyme cố định có hoạt tính tương đối cao hơn so với enzyme tự do khi nhiệt độ nằm trong khoảng 40 – 550C

Sheng-Feng L và cộng sự (2009) cố định enzyme lipase từ Candida rugosa lên

màng nano làm bằng chất xơ, dùng để thủy phân dầu nành Nồng độ cơ chất khảo sát

từ 0.5 – 12.5 mM Ở tất cả nồng độ cơ chất khảo sát, tốc độ phản ứng của enzyme cố định đều lớn hơn so với enzyme tự do Điều này có thể là do enzyme cố định ít bị ức chế bởi sản phẩm thủy phân hơn so với enzyme tự do Theo báo cáo của Ting W và cộng sự (2006), mức độ thuỷ phân tối đa đối với dầu đậu nành của enzyme lipase

Candida rugosa cố định trên màng chitosan đạt đến 80% và sau sáu lần sử dụng, hoạt

tính của enzyme còn lại 80%

Các hệ enzyme lipase cố định trên chất mang được quan tâm nghiên cứu và ngày

càng trở nên phong phú Các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật như Candida cylindracea Candida rugosa, Aspergillus niger, Chromobacteriaum viscosum cố định

trên màng polypropylene, màng cellulose, polypropylene vi xốp hoặc các chất mang rắn như thủy tinh xốp, oxit nhôm, hạt PE, Sephadex G50 được sử dụng trong các thiết bị thủy phân dầu oliu, dầu nành, dầu Menhaden, dầu cám, mỡ bò Các công trình công bố cho thấy việc sử dụng hệ enzyme lipase cố định giúp giảm chi phí sản

xuất một cách đáng kể, đồng thời, sản phẩm thu được cũng dễ dàng tinh chế hơn so với khi sử dụng enzyme tự do (theo Murty và cộng sự, 2002) Gần đây, Yagiz F và

cộng sự ( 2007) đã tạo hệ enzyme cố định lipase từ Candida rugosa trên chất mang đa

lớp hydrotalcite, tác giả nhận thấy hydrotalcite có thể là 1 chất mang phù hợp để cố định lipase, hệ enzyme này có hiệu quả xúc tác cao cho phản ứng transester hóa chất thải dầu ăn tạo xăng sinh học Tuy nhiên, chưa có công trình nào cố định lipase

Porcines pancreas trên chất mang hydrotalcite, trong khi đó, theo như nghiên cứu

trước đây của chúng tôi, hydrotalcite với tỷ lệ Mg/Al 2:1 và ion xen cài acetate là chất

mang hoàn toàn phù hợp cho enzyme Porcine pancreas

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị:

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất:

 Chế phẩm enzyme lipasePorcine pancreas:

Chế phẩm dạng bột thu được từ tuyến tụy lợn, Type II hiệu L3126 do hãng Sigma-Aldrich (Mỹ) cung cấp

Theo định nghĩa của nhà cung cấp: Một đơn vị hoạt độ riêng của enzyme (U) được định nghĩa là lượng protein của enzyme giải phóng ra một µmol acid béo từ sự thủy phân cơ chất là dầu oliu trong 1giờ tại pH 7.7, nhiệt độ 370C sẽ cho hoạt độ là

100 – 500unit/mg protein Nếu sử dụng triacetin làm cơ chất tại pH 7.4, nhiệt độ 370C trong 1 giờ sẽ cho hoạt độ 30 – 90 unit/mg protein

Các mẫu chất mang có tỷ lệ kim loại và anion xen cài như trên được nung ở 500oC sau 2 giờ được ký hiệu tương ứng là: HT – ace 0.05M- 500, HT - ace 0.1M-500, HT- ace 0.15M -500, HT –carb 0.05M -500, HT carb 0.1M-500, HT - carb 0.15M-500

2.1.2 Hóa chất sử dụng

- Cloroform CHCl3

- Acid acetic CH3COOH

- Natri thiosulphate Na2S2O3 0.01N

- Mononatri orthophotphate (NaH2PO4.2H2O)

- Dinatri hydrophosphate (Na2HPO4.12H2O)

- Phenolphatalein

- Comasie blue G – 25

- Acid phosphoric H3PO4

- Acid sunfuric H2SO4

- Protein chuẩn bovine serum albumin (BSA)

- Gum arabic AB (Nexira - Pháp)

- Becher 250mL

- Erlen 25, 100, 250, 500 mL

- Ống đong 10, 50 mL

2.2 Bố trí thí nghiệm:

2.2.1 Thu nhận dầu hạt bụp giấm:

Dầu hạt bụp giấm được thu nhận theo 2 phương pháp:

- Lọc thu hỗn hợp dầu và dung môi

- Cất thu hồi dung môi bằng cô quay chân không

Hình 2.1: Quy trình thu dầu hạt bụp giấm bằng cách dùng dung môi trích ly

2.2.2 Khảo sát tính chất ban đầu của dầu dừa và dầu hạt bụp giấm

Xác định chỉ số acid : Dùng dung dịch NaOH 0.1N để trung hòa hết acid béo tự

do có trong mẫu thử được hòa tan trong dung môi ethanol trung tính với chỉ thị màu phenolphatalein

Xác định chỉ số peroxide : Xử lí phần mẫu thử trong môi trường acid acetic và

cloroform bằng dung dịch kali iodua Các peroxide tạo thành trong quá trình ôi hóa chất béo sẽ phản ứng với dung dịch KI tạo ra I2 tự do trong môi trường acid theo phản ứng:

Định phân lượng iod tạo thành bằng dung dịch chuẩn natri thiosulphate Na2S2O3 0.01N với chỉ thị hồ tinh bột Điểm dừng nhận được khi dung dịch chuyển từ màu tím đen sang không màu Chỉ số peroxide tính bằng số mili - đương lượng thiosulphate kết hợp hết với lượng iod giải phóng ra

2Na2S2O3 + I2 → 2NaI + Na2S4O6 + I2

Xác định hàm lượng chất khô: Tiến hành sấy nóng mẫu thử ở nhiệt độ 100ºC cho

đến khi độ ẩm và các chất bay hơi hoàn toàn bay hết, dựa vào khối lượng mẫu trước khi sấy và lượng ẩm xác định hàm lượng chất khô

Xác định độ tro theo tiêu chuẩn TCVN 6531-1998 : Tiến hành hóa tro phần mẫu thử ở nhiệt độ quy định và cân phần còn lại thu được

Xác định hàm lượng lipid tổng - Phương pháp Rose-gottlieb: Mẫu dầu được xử

lý trước với amoniac và ethyl alcohol nhằm hoà tan protein có trong mẫu và giúp protein kết tủa Chất béo được trích ly ra cùng với diethyl ether và petroleum ether Tiến hành sấy để bay hơi phần ether sau trích ly, cân phần còn lại để xác định lượng chất béo trích ly được

Xác định thành phần và hàm lượng acid béo: bằng phương pháp sắc ký khí theo

tiêu chuẩn AOAC 969.33 tại Công ty CP DV KHCN Sắc ký Hải Đăng

Xác định chỉ số iot theoTCVN 6122-2010 tại Công ty CP DV KHCN Sắc ký Hải

Đăng

2.2.4 Cố định enzyme:

Điều kiện cố định enzyme từ Porcine pancreas trên chất mang hydrotalcite:

- Tỷ lệ enzyme/chất mang: 9mg/g (tương ứng 2399,4 UI/g chất mang)

- Nhiệt độ cố định: 30oC

- pH cố định: 7,5

- Tốc độ lắc : 300 vòng /phút

- Thời gian cố định: 6 giờ

Sau khi cố định, dung dịch sẽ được ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút để tách enzyme cố định ra khỏi dung dịch, ly tâm hai lần:

 Lần 1 – 15 phút, sau đó tách dịch ly tâm qua giấy lọc và bổ sungdung dịch đệm mới vào

 Lần 2 – 10 phút, sau đó tách dịch ly tâm qua giấy lọc

Dịch lọc sẽ được xác định hàm lượng protein để tính hiệu suất cố định theo protein, còn enzyme cố định trên chất mang được xác định hoạt tính với phản ứng thủy phân dầu dừa

2.2.5 Thủy phân dầu dừa với enzyme tự do và enzyme cố định

2.2.5.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền nhũ

Nhũ dầu hạt bụp giấm được tạo ra bằng thiết bị đồng hóa cơ với thời gian đồng hóa là 20 phút Sau khi đồng hóa, nhũ được lưu giữ ở 370C trong vòng 5 giờ và tiến hành đo thể tích lượng nhũ tách lớp theo các khoảng thời gian 15, 30, 60,

120, 180, 240, 300 phút

Các yếu tố khảo sát bao gồm: hàm lượng gum arabic, loại đệm và tỷ lệ dầu/nước Khi tiến hành khảo sát yếu tố nào, thì các yếu tố khác sẽ được cố định

 Tạo nhũ bằng thiết bị đồng hóa cơ, thời gian đồng hóa 20 phút

 Lượng gum arabic khảo sát: 2, 4, 6, 8 % khối lượng nhũ

 Tỷ lệ dầu/đệm: 1:1

 Nhiệt độ khảo sát: 370C

 Tiến hành đo sau các khoảng thời gian: 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300 phút

2.2.5.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của loại đệm đến độ bền nhũ

Các thông số thực hiện:

 Đệm Borat, tris – HCl và phosphat pH=7.5

 Tạo nhũ bằng thiết bị đồng hóa cơ, thời gian đồng hóa 20 phút

 Lượng gum arabic khảo sát: kết quả từ thí nghiệm 2.2.4.1.1

 Tỷ lệ dầu/đệm: 1:1

 Nhiệt độ khảo sát: 370C

 Tiến hành đo sau các khoảng thời gian: 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300 phút

2.2.5.3 Khảo sát điều kiện thủy phân dầu dừa và dầu hạt bụp giấm của

enzyme lipase Porcine pancreas tự do

Tiến hành thí nghiệm để tìm điều kiện thích hợp cho phản ứng thủy phân dầu bằng enzyme PPL tự do Tạo nhũ dầu dưới điều kiện khảo sát như trên Tiến hành thủy phân dầu theo các chế độ khác nhau Đo lượng acid béo sinh ra trong các khoảng thời gian: 0, 2, 4, 6 phút; từ đó xây dựng đường biến thiên lượng acid béo sinh ra theo thời gian và tính vận tốc ban đầu của enzyme dựa và đường biểu diễn

Các yếu tố khảo sát: tỷ lệ dầu/đệm, tỷ lệ enzyme/cơ chất, pH, nhiệt độ Khi tiến hành khảo sát yếu tố nào, thì các yếu tố khác sẽ được cố định lại

Tính toán kết quả:

– Tính toán lượng acid béo Y sinh ra như sau:

Y = [ ] , μ (2.2) Trong đó: V0 = số ml NaOH 0,1N được dùng để chuẩn độ mẫu trắng

Vi = số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu tại thời điểm thứ i

– Xác định giá trị vận tốc ban đầu v0: v0 được xác định qua đường biểu diễn biến thiên của lượng acid béo sinh ra theo thời gian, trong khoảng thời gian lượng acid béo tăng tuyến tính theo thời gian, tức là đường biểu diễn lượng acid béo sinh ra theo thời gian là đường thẳng

ú (2.3) Trong đó: Yi = lượng acid béo sinh ra tại thời điểm ti

– Hoạt độ riêng của enzyme được tính theo công thức sau:

HTR =

Trong đó: a là lượng protein trong 1 mg enzyme (mg)

b: tổng dung dịch chứa a mg protein enzyme cho vào phản ứng

V: thể tích nhũ tiến hành phản ứng thủy phân

Hoạt độ của enzyme:

a HTR

HT  * (U) (2.5) [43]

2.2.5.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dầu/đệm đến quá trình thủy phân

Các thông số thực hiện:

 Xác định lượng acid béo sinh ra bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0.1N

2.2.5.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân

 Tỷ lệ dầu/đệm khảo sát là: kết quả từ thí nghiệm2.2.4.2.1

 Xác định lượng acid béo sinh ra bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0.1N

2.2.5.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

Các thông số thực hiện:

 Đệm Borat pH thực hiện là:7, 7.5, 8, 8.5

 Nhiệt độ khảo sát là: 370C

 Hàm lượng gum abrabic : 8%

 Tỷ lệ enzyme/cơ chất thực hiện là: kết quả thí nghiệm 2.2.4.2.2

 Tỷ lệ dầu/đệm khảo sát là: kết quả thí nghiệm 2.2.4.2.1

 Xác định lượng acid béo sinh ra bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0.1N

2.2.5.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Các thông số thực hiện:

 Đệm Borat với pH: kết quả thí nghiệm 2.2.4.2.3

 Nhiệt độ khảo sát là: 320C, 350C, 370C, 400C, 420C

 Hàm lượng gum abrabic : 8%

 Tỷ lệ enzyme/cơ chất thực hiện là: kết quả thí nghiệm 2.2.4.2.2

 Tỷ lệ dầu/đệm khảo sát là: kết quả thí nghiệm 2.2.4.2.1

 Xác định lượng acid béo sinh ra bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0.1N

2.2.6 Thử nghiệmkhả năng thủy phân dầu dừa và dầu bụp giấm của enzyme

lipase Porcine pancreatics cố định

Tiến hành thủy phân dầu bằng các enzyme cố định với những điều kiện thích

hợp được lựa chọn qua các thí nghiệm ở mục 2.2.5 Đo lượng acid béo sinh ra

sau các khoảng thời gian xác định

2.2.7.Tách phân đoạn sản phẩm thủy phân:

2.2.7.1 Tách phân đoạn lần 1: Quá trình tách phân đoạn sản phẩm thủy phân được thực hiện theo quy trình sau:

Hỗn hợp sau thủy phân được trung hòa bằng KOH 0,5N và được chiết bằng 100ml hexan và 50ml nước cất Thu lớp dưới (phân đoạn phân cực

chứa axít béo tự do dạng muối K) và lớp trên (phân đoạn không phân cực tan trong hexan) Phân đoạn phân cực được axít hóa bằng HCl 6N và được chiết bằng diethylether để thu nhận axít béo tự do Các phân đoạn được làm khan bằng Na2SO4 khan, cô quay chân không ở 450C để đuổi dung môi

n-Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận sản phẩm thủy phân và tách lần 1

2.2.7.2 Phân tách để thu phân đoạn giàu axit lauric:

Phân đoạn giàu axit béo tự do thu được sau khi thủy phân và tách lần 1 được tách để thu phân đoạn giàu axit lauric bằng cách thay đổi nhiệt độ theo nguyên lý phương pháp của Schutte Y., 1942

Hỗn hợp axit béo tự do được tách bằng ly tâm ở nhiệt độ phòng, thu phần rắn chứa các axit béo bão hòa có chiều dài mạch từ 12C trở lên Phần rắn này được gia nhiệt từ bên ngoài đến nhiệt độ 70 ± 2 oC và hạ dần nhiệt độ đến 44±2 oC Gạn lấy phần lỏng là thành phần chứa nhiều axit lauric

2.2.7.3 Phân tách để thu phân đoạn giàu axit linoleic:

2.2.7.3.1 Phương

Thí nghiệm được thực hiệ

Hình 2.3 Quy trình làm giàu PUFAb

Khảo sát tỷ lệ ure/FFA

Mục đích:Xác định tỷ lệ ure/FFA

phức ure đạt IV cao nhấttrong NUCF

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệ

Yếu tố cố định:Tỷ lệethanol 95%/ure, th

Salimon (2010) và nhiệt độđư

- Khối lượng FFA: 10g

Tỷ lệ ure/FFA (g/g): 1:1,2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 7:1(Zeng và cs, 2007; Abdullah và Salimon, 2010)

Chỉ tiêu theo dõi:

Hiệu suấtFFA phần lỏng và IV của NUCF (phần lỏng)

Chỉ tiêu theo dõi:

Hiệu suấtFFA phần lỏng và IV của NUCF (phần lỏng)

Khảo sát thời gian

Mục đích: Xác định thời gian thích hợp cho quy trình làm giàu PUFA (LA) bằng tạo phức ure đạt IV cao nhất trong NUCF

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên

và ba lần lặp lại

Yếu tố cố định:

- Khối lượng FFA: 10g

- Tỷ lệ ethanol 95%/ure (ml/g): 5:1

- Tỷ lệ ure/FFA(g/g): Theo kết quả thí nghiệm 2.1

- Nhiệt độ: Theo kết quả thí nghiệm trên 2.2

Yếu tố khảo sát:

Thời gian: 5h, 8h, 16h, 24h, 36h(Abdullah và Salimon, 2010)

Chỉ tiêu theo dõi:

Hiệu suấtFFA phần lỏng và IV của NUCF (phần lỏng)

2.2.7.3.2 Sử dụng phương pháp kết tinh phân đoạn dung môi để thu phân đoạn giàu

LA

aceton/FFA thích hợp cho quy trình làm giàu PUFA

t tinh phân đoạn dung môi đạt IVcao nhấttrong pha l

ệm được bố trí theo kiểu một yếu tố và ba l

ng FFA: 10g

n Thị Ngọc Yên, 2004)

aceton/FFA (ml/g) : 2:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1 (Trần Th

n lỏng và IV của phần lỏng

t tinh phân đoạn dung môi

p cho quy trình làm giàu PUFA

ttrong pha lỏng

và ba lần lặp lại

n Thị Ngọc Yên,

Khảo sát nhiệt độ lạnh đông

Mục đích:Xác định nhiệt độ thích hợp cho quy trình làm giàu PUFA (LA) bằng phương pháp kết tinh phân đoạn dung môi đạtIVcao nhất trong pha lỏng

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu một yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên

và ba lần lặp lại

Yếu tố cố định:

- Khối lượng FFA: 10g

- Tỷ lệ aceton/ FFA: theo kết quả của thí nghiệm 3.1

- Thời gian: 24h

Yếu tố khảo sát:

Nhiệt độ: 5oC, -8oC, -16oC, -25oC, -35oC, (Yu và cs, 2006; Warsito và cs, 2011)

Chỉ tiêu theo dõi:

Hiệu suấtFFA phần lỏng và IV của phần lỏng

2.2.8 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của sản phẩm thủy phân:

Nguyên tắc kiểm tra khả năng bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH

Các chất nghiên cứu có tác dụng kháng oxy hóa theo cơ chế bắt gốc tự do sẽ chuyển gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) từ màu tím sang màu vàng nhạt Xác định khả năng bắt gốc tự do của chất nghiên cứu bằng phương pháp đo độ hấp thu của mẫu tại bước sóng λ = 517 nm Ascorbic acid (Vitamin C) được sử dụng làm chất đối chiếu

Phương pháp tiến hành

a Khảo sát sơ bộ khả năng bắt gốc tự do

- DPPH được hòa tan trong dung môi methanol ở nồng độ 20 μg/mL

- Các mẫu thử nghiệm được giữ nguyên nồng độ ban đầu

Cho 200 μL mẫu thử vào 2800 μL dung dịch DPPH Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong buồng tối với thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm

- Mẫu trắng được thực hiện bằng cách cho 200 μL mẫu thử vào 2800 μL dung dịch DPPH, vortex cho đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm

- Ống không bao gồm 200 μL methanol và 2800 μL dung dịch DPPH, vortex đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm

- Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

- Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH được tính theo công thức

Tỉ lệ bắt gốc DPPH:

Trong đó: Ac: Độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu (ống không)

As: Độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử

Ab: Độ hấp thu của mẫu trắng

- Từ các giá trị của phần trăm bắt gốc DPPH, so sánh và chọn ra mẫu thử có tỉ

lệ bắt gốc cao nhất đem đi xác định giá trị IC50

b Tiến hành xác định giá trị IC50

• Xác định IC50 của mẫu thử nghiệm

- DPPH được hòa tan trong dung môi methanol ở nồng độ 20 μg/mL

- Hòa tan mẫu trong methanol ở các nồng độ khác nhau: 200; 400; 600; 800; và

1000 μg/mL

- Cho 500 μL mẫu vào 2500 μL dung dịch DPPH (thực hiện lần lượt cho từng nồng độ) Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong buồng tối với thời gian 30 phút, rồi đem đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm

- Mẫu trắng được thực hiện bằng cách cho 500 μL mẫu thử vào 2500 μL dung dịch DPPH, vortex cho đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm

- Ống không bao gồm 500 μL methanol và 2500 μL dung dịch DPPH, vortex đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm

- Mỗi thí nghiệm được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình Giá trị IC50 được tính thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế

2.2.9 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm thủy phân:

Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật là xem xét khả năng tăng trưởng của vi sinh vật khi có mặt của chất kháng sinh ở nồng độ nhất định Thông thường MIC, là chỉ số được dùng để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimun inhibitory concentration - MIC) (theo Andrew, 2001) – Nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế được sự tăng trưởng của vi sinh vật sau thời gian ủ nhất định

Các chủng vi khuẩn khảo sát: Escherichia coli (E.coli), Salmonella typhi (S typhi), Staphylococcus aureus (MRSA), Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA), Pseudomonas aeruginosa (Ps aeruginosa) và Enterococcus faecalis (E

faecalis) Khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo phương pháp của Yamac (2006)

So sánh sơ bộ khả năng kháng vi sinh vật giữa các sản phẩm

۷ Nguyên tắc

Vi khuẩn được hoạt hóa và trải lên môi trường (thạch) đã chuẩn bị sẵn Chất thử nghiệm được cho lên trên môi trường ở các vị trí khác nhau sẽ khuếch tán ra và ức chế vi sinh vật tạo thành vùng ức chế, mức độ nhạy cảm của vi sinh vật với chất thử nghiệm được biểu hiện bằng đường kính các vòng ức chế Vòng ức chế càng lớn , chất

có khả năng ức chế càng mạnh

۷ Phương pháp tiến hành

a) Chuẩn độ đục

Sử dụng thang đo độ đục McFarland 0,5 được chuẩn bị như sau:

- Thêm 0,5 mL BaCl2 0,048M (BaCl2.2H2O 1,17% khối lượng/thể tích) vào 99,5 mL dung dịch H2SO4 0,18 M (1% thể tích/thể tích) đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền phù

- Điều chỉnh độ đục của huyền phù sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng

625 nm có OD nằm trong khoảng 0,08 – 0,1 Độ đục này tương đương với mật độ vi sinh vật khoảng 1 – 2x108 CFU/mL (Andrew, 2001)

- Dịch chuẩn độ đục được bảo quản kĩ trong tối ở nhiệt độ phòng, đậy kín để tránh bay hơi, có thể dùng được trong vòng sáu tháng và trước khi sử dụng phải lắc kĩ

để huyền phù phân tán trở lại

b) Chuẩn bị vi sinh vật thử nghiệm

Vi sinh vật thử nghiệm được cấy vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường NB, ủ

ở 370C trong tủ ấm cho đến khi có độ đục bằng hoặc vượt quá McFarland 0,5 Mẫu cấy phải được điều chỉnh độ đục cho bằng với McFarland 0,5 bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý hoặc môi trường NB sạch

Vi sinh vật sau khi điều chỉnh phải sử dụng trong vòng 15 phút

c) Tiến hành

- Hút 20 μL dịch vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên cho vào đĩa petri vô trùng

- Đổ khoảng 20 mL môi trường MHA vào đĩa petri đã chứa vi khuẩn Để nguội

để thạch đông

- Đục các lỗ có đường kính 5 mm trên môi trường thạch

- Nhỏ 30 μL dung dịch mẫu thử nghiệm vào lỗ thạch

- Ủ 370C từ 16 – 18 giờ, riêng đối với chủng vi khuẩn MRSA thì ủ trong 24 giờ

- Đo đường kính vùng ức chế tạo thành (tính theo milimet)

Từ các giá trị của đường kính vùng ức chế tạo, so sánh và chọn ra mẫu thử có đường kính lớn nhất đem đi xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC theo phương pháp pha loãng trong thạch

Xác định giá trị MIC Thực hiện thí nghiệm với 6 chủng vi sinh vật như phần khảo sát sơ bộ tính kháng khuẩn

۷ Nguyên tắc

Chất thử nghiệm được pha loãng thành nhiều nồng độ trong môi trường thử nghiệm, sau đó vi sinh vật được cấy vào với lượng xác định và sau 16 – 18 giờ quan sát sự ức chế bằng mắt thường thông qua độ đục (pha loãng trong môi trường lỏng) hoặc sự tạo thành khóm trên bản thạch (pha loãng trong bản thạch) (Marina và cs, 2009)

Phương pháp này dùng để xác định nồng độ ức chế tổi thiểu MIC và có thể xác định được cả giá trị nồng độ gây chết tối thiểu MBC

۷ Phương pháp tiến hành

a) Chuẩn độ đục

Sử dụng thang đo độ đục chuẩn McFarland 0,5 như đã trình bày ở trên

b) Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Sử dụng dịch cấy vi khuẩn được chuẩn bị như đã trình bày ở trên

c) Chuẩn bị các nồng độ chất thử nghiệm

Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành các nồng độ khác nhau với nước cất đã được hấp tiệt trùng, vortex kĩ để đồng hóa mẫu Khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC dự đoán của chất thử nghiệm Môi trường MHA đã nấu chảy và hấp tiệt trùng được để nguội khoảng 40 – 500C Pha 9 mL môi trường MHA với 1 mL chất thử nghiệm đã pha loãng, vortex kĩ để trộn đều, đổ vào dĩa petri và để nguội cho thạch đông lại Nếu chưa sử dụng, các dĩa thạch có chứa chất thử nghiệm phải được bảo quản lạnh 2 – 8oC trong vòng 2 tuần Tiến hành song song 1 dĩa đối chứng không

có chất thử nghiệm bằng cách thêm 1 mL nước cất vào 9 mL môi trường MHA

d) Tiến hành cấy vi sinh vật

- Dùng micropipette hút 1 μL dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị ở trên cho lên bề mặt môi trường có chứa mẫu thử nghiệm

- Tiến hành song song trên dĩa đối chứng

- Để yên khoảng 15 – 30 phút cho vết chấm khô hoàn toàn, lật ngược dĩa lại

- Ủ các dĩa petri trong tủ ấm 370C trong 16 – 18 giờ

e) Đọc kết quả

Kết quả chỉ có giá trị khi vi sinh vật trong dĩa đối chứng mọc bình thường Lần lượt đọc từ dĩa có nồng độ chất thử nghiệm từ thấp lên cao, quan sát sự tạo thành khóm của vi sinh vật Nồng độ MIC được xác định ở dĩa môi trường mà ở đó có nồng

độ chất thử nghiệm thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo thành khóm của vi sinh vật

2.3 Công thức tính toán:

2.3.1 Hiệu suất cố định enzyme:

 Hiệu suất cố định theo protein:

Hiệu suất cố định enzyme được tính bằng tỉ lệ % giữa lượng protein đượccố định trong chất mang so với lượng protein trong dung dịch enzyme ban đầu trước khi cố định

 Hàm lượng protein trong dung dịch enzyme trước khi cố định :

Với: C0 là nồng độ protein sử dụng cố định, mg/mL

V0 là thể tích dung dịch enzyme sử dụng để thực hiện cố định, mL

 Xác định hàm lượng protein còn lại trong dung dịch sau cố định:

P = C x V (2.7)

Với: C là nồng độ protein của dung dịch lọc được sau cố định, mg/mL

V là thể tích dung dịch lọc thu được sau cố định, mL

 Khối lượng protein enzyme cố định trên LDHs :

Với: A- Hoạt độ enzyme cố định (UI/g)

B- Hoạt độ enzyme tự do có cùng lượng protein trong 1g enzyme cố định (UI)

2.3.2 Xác định tốc độ thủy phân của enzyme cố định:

Tốc độ thủy phân được định nghĩa là số µmol acid béo được tạo ra trong thời gian một phút bởi enzyme thực hiện phản ứng thủy phân trên cơ chất là dầu dừa

Tốc độ thủy phân:

r =( )∗ ∗ , µmol/phút (2.11)

Với: a: Thể tích NaOH dùng chuẩn độ ở mẫu cần khảo sát (có enzyme), mL

b: Thể tích NaOH dùng chuẩn độ ở mẫu trắng, mL

2.3.3 Xác định mức độ thủy phân của enzyme:

Mức độ thủy phân được tính bằng công thức:

DH = ( )∗ ∗

Trong đó, MW được tính theo công thức sau:

MW = G + 3M − 3W ≅ 38.05 + 3M (2.13) Với: G là khối lượng phân tử glycerol (92.0935 g/mol)

m là khối lượng dầu trong nhũ tương (g)

W là khối lượng phân tử nước (18,0125 g/mol)

là khối lượng phân tử trung bình của các acid béo có trong dầu

M = ∑ M ∗ xi (2.14) Với: là tỉ lệ phần trăm theo khối lượng của từng acid thành phần thứ i

là khối lượng phân tử của acid béo thứ i

n là số acid béo có mặt trong dầu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thu nhận dầu hạt bụp giấm:

3.1.1 Xác định một số chỉ tiêu chất lượng của hạt bụp giấm

Kết quả khảo sát này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Hainida và các cộng

sự (2008) từ hạt bụp giấm ở Malaysia, với ẩm 6 – 8%, lipidtổng 19 – 22%, tro 5.4%

Hạt thu hoạch ở Thái lan có hàm lượng dầu khoảng 18% (P Nakpong và S Woothikanokkhan)[32], hay hạt thu hoạch từ Ấn độ chứa hàm lượng chất béo là 19,1 – 22,8%% (N Mahadevan và cs 2007) Một nghiên cứu khác từ hạt bụp giấm Ấn Độ của Rao (1996), kết quả như sau: ẩm 9.9%, lipid 22.1% và tro 7.5% Tuy có sự khác

về độ ẩm và hàm lượng tro, nhưng hàm lượng lipid tổng là khá giống nhau, dao động trong khoảng từ 19-22%

3.1.2 Hiệu suất thu nhận dầu theo phương pháp ép trục vít:

- Khối lượng ban đầu của hạt bụp giấm: 1.496,56g

- Khối lượng dầu thu được: 154,63g

- Hàm lượng dầu= 100%

56,1496

63,154

 = 10,33%

Kết quả ép trục vít thu được hàm lượng dầu trong hạt bụp giấm là 10,33% , kết quả này cho thấy hiệu suất thu hồi dầu thấp, chỉ khoảng 47%

3.1.3 Hiệu suất thu nhận dầu bằng cách trích ly với n-hexan:

Bảng 3.2 Hiệu suất thu nhận dầu bụp giấm với các tỷ lệ dung môi/nguyên liệu khác nhau

Tỷ lệ dung môi/hạt bụp giấm Hiệu suất thu dầu, %

Kết quả hiệu suất trích ly với tỷ lệ dung môi n-hexan khác nhau cho thấy khi tăng lượng dung môi, hiệu suất thu nhận dầu tăng lên Tuy nhiên, so với tỷ lệ dung môi, hiệu suất thu dầu tăng không tương xứng Để giảm hao hụt dung môi do điều kiện ở điều kiện hiện có, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi/hạt bụp giấm là 1:1 cho các thí nghiệm tiếp theo

3.1.4 Hiệu suất thu nhận dầu bụp giấm với thời gian trích ly khác nhau

Bảng 3.3 Hiệu suất thu nhận dầu bụp giấm với thời gian trích ly khác nhau

Bảng 3.4 Chất lượng dầu bụp giấm trích ly với 2 phương pháp

ép trục vít

Dầu trích bằng dung môi

2 Octadecanoic acid C18:0 Stearic % 3.65 3.64

8 Docosadienoic acid C22:1 Erucic % 0.43 0.41

Với các kết quả trong bảng 3.3 và bảng 3.4, có thể thấy phương pháp ép với máy ép trục vít cho hiệu suất thu nhận dầu thấp hơn so với phương pháp trích ly bằng dung môi, chất lượng dầu thu được cũng không bằng so với dầu trích ly bằng dung môi (độ tro và chỉ số axit trong dầu ép cao hơn so với dầu trích ly dung môi) Tuy vậy, thành phần axit béo của dầu bụp giấm thu nhận bằng 2 phương pháp khác nhau khác biệt không đáng kể Vì vậy, phương pháp trích ly dầu bằng dung môi được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo

Kết quả phân tích thành phần acid béo trong dầu so sánh với các nghiên cứu trên thế giới cho thấy hàm lượng các acid béo không no chiếm tỷ lệ lớn, trong đó có những axit béo có giá trị dinh dưỡng cao như acid oleic, acid linoleic, acid erucic Chế độ trích ly dầu bụp giấm cụ thể như sau:

- Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 60oC, sau đó tiến hành nghiền thô Ngâm hạt nghiền trong dung môi hexan vào với tỷ lệ hạt/dung môi là 1:1 (w/w) trong bình đậy kín nắp

- Trích ly trong vòng 48 giờ Lọc thu dịch Dịch thu được gồm chất béo hoà tan trong dung môi, khi đó thực hiện bước thu hồi dung môi và tách lấy dầu bằng thiết bị cô quay chân không

3.2 Khảo sát tính chất ban đầu của dầu dừa:

Bảng 3.6 Chất lượng dầu dừa nguyên liệu

Hàm lượng tạp chất tính theo khối lượng, % 0.00

Bảng 3.7 Thành phần axit béo của dầu dừa (Công ty Sắc ký Hải Đăng)

(%)

Tetradecanoic acid, C14:0 Acid myristic 17.4

Cis-9-Octadecenoic acid, C18:1 Acid oleic 4.38

Cis- 9,12-Octadecadienoic acid, C18:2 Acid linoleic 1.28

Kết quả phân tích thành phần acid béo cho thấy chiếm hàm lượng nhiều nhất trong dầu dừa là acid lauric với 49.2%, thành phần chủ yếu trong dầu dừa vẫn là các chất béo no chiếm 94.34% Các acid béo no trong dầu dừa chủ yếu là mạch ngắn và trung bình (C8-C16)

3.3 Khảo sát quá trình thủy phân dầu dừa:

3.3.1 Tạo nhũ dầu dừa:

3.3.1.1 Khảo sát tìm loại đệm thích hợp

Bảng 3.8: Độ bền nhũ dầu dừa với các loại đệm khác nhau

Loại đệm Thời gian tách

Như vậy qua việc xác định thời gian tách lớp và độ bền nhũ tương ứng thì hệ đệm borat là thích hợp nhất cho quá trình tạo hệ nhũ tương dầu: nước cho các thí nghiệm Việc hệ nhũ được ổn định và đảm bảo độ bền sẽ giúp cho bề mặt liên pha dầu, nước luôn ổn định, tạo điều kiện tốt cho enzyme xúc tác thủy phân đạt hiệu quả Ngoài ra giá trị pH của hệ đệm borat cũng ổn định trong suốt thời gian khảo sát, điều này cũng đảm bảo thông số pH khi thực hiện thí nghiệm được đảm bảo

Căn cứ vào các kết quả khảo sát, hệ đệm borat với các giá trị pH khác nhau được

sử dụng cho những thí nghiệm tiếp sau

3.3.1.2 Khảo sát độ bền nhũ đối với lượng gum arabic sử dụng

Trong thí nghiệm này, thời gian tách pha được khảo sát để tìm ra tỉ lệ gum/ nhũ tương (w/v) thích hợp để chuẩn bị hệ nhũ dầu: nước

Bảng 3.9: Độ bền nhũ theo thời gian khảo sát

Tỷ lệ

gum,

%

Thời gian tách pha

15 phút 30 phút 1 giờ 1.5 giờ 2 giờ 3 giờ 4 giờ 5 giờ

Theo kết quả trình bày trong bảng trên thì khi tăng lượng gum, thời gian tách pha

và độ bền nhũ cũng tăng lên tương ứng Đối với hệ nhũ tương có lượng gum là 4% (w/v) thì tại thời điểm 5h, hệ vẫn chưa tách pha

Ta lựa chọ tỉ lệ gum 4% này cho những thí nghiệm tiếp theo bởi vì:

Lượng gum nhiều hơn (5% và 6%) làm tăng độ nhớt của dung dịch và hệ nhũ, cản trở chuyển động của các enzyme, từ đó giảm khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất Lượng gum 4% (w/v) là vừa đủ đảm bảo hệ nhũ bền mà không làm dung dịch

quá đặc, cản trở sự tiếp xúc của enzyme với cơ chất

3.3.2 Khảo sát quá trình thủy phân dầu dừa của enzyme LPP tự do:

3.3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệdầu/đệm:

Kết quả về ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase được thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu/đệm đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase

Kết quả trên cho ta thấy rằng, khi giảm tỉ lệ dầu/đệm từ 1.5 xuống 1 (v/v) thì tốc độ phản ứng ban đầu của enzyme lipase tăng từ 2.223 lên 8.6 (μmol/phút) Khi tiếp tục giảm tỉ lệ dầu/đệm từ 1 xuống 1/2, 1/3 (v/v) thì tốc độ phản ứng ban đầu cũng giảm dần theo từ 8.6 xuống 6.5 và 1.67 (μmol/phút) Nguyên nhân có thể là do:

Với tỉ lệ dầu/đệm 1/1 (v/v) là tỉ lệ thích hợp cho việc tạo nhũ tương dầu dừa, do đó nhũ tương bền vững, có diện tích bề mặt liên pha dầu nước lớn, do

đó làm tăng diện tích bề mặt diện tích tiếp xúc của enzyme và cơ chất, dẫn đến hoạt độ tương đối của enzyme cao, vì vậy tốc độ phản ứng ban đầu là cao nhất

Ở tỉ lệ 1.5 (v/v), lượng dầu quá lớn làm tăng độ nhớt của nhũ, khiến cho enzyme khó khuếch tán để gặp được cơ chất hơn, làm giảm tốc độ của phản ứng

Ở tỉ lệ dầu/đệm 1/2, 1/3 (v/v), lượng nước tạo nhũ dầu dư làm cho hệ nhũ không bền, bề mặt liên pha dầu nước nhỏ, do đó làm giảm diện tích tiếp xúc

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

giữa enzyme và cơ chất, dẫn đến hoạt tính enzyme giảm đi, do đó tốc độ thủy phân ban đầu giảm đi

Theo W.J.Ting và cộng sự (2006) trong nghiên cứu ứng dụng của LCR lên dầu đậu nành đã khảo sát tỉ lệ dầu/đệm lần lượt là 10:1; 10:3; 10:5; 10:7, 10:9 (w/w) và đạt mức độ thủy phân cao nhất là 41.40 % tại tỉ lệ 10:7 với tỉ lệ enzyme/cơ chất sử dụng cho thí nghiệm là 0.5% (w/v)

Kriti Bhandari và cộng sự (2013) nghiên cứu thủy phân dầu cá ngừ thu nhận acid béo chứa DHA bằng LCR đã tiến hành thí nghiệm tại pH=7.0, nhiệt độ 35oC thu được kết quả tối ưu cho tỉ lệ dầu/nước là 1:10 (w/v) và tỉ lệ dầu/dung môi là 1:1(w/v)

Yuji Shimada và cộng sự (1998) khi các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân của LCR đối với dầu cây lưu ly đã chọn tỉ lệ dầu/nước là 2:1 (v/v)

So sánh kết quả thu được của chúng tôi với các nghiên cứu trên, ta nhận thấy với mỗi hệ cơ chất và enzyme, có 1 tỷ lệ dầu/nước nhất định thích hợp cho tốc độ phản ứng thủy phân là cao nhất

Từ kết quả trên, ta chọn tỉ lệ dầu/đệm là 1/1(v/v) cho thí nghiệm tiếp theo

3.3.2.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/cơ chất:

Kết quả về ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/cơ chất đến tốc độ thủy phân dầu dừa của enzyme lipase được thể hiện ở hình 3.2

Hình 3.2: Ảnh hưởng củatỉ lệ enzyme/cơ chất đến tốc độ thủy phân của enzyme lipase

Theo hình 3.3, khi giảm tỉ lệ enzyme/cơ chất từ 0.33 xuống 0.22(%w/w), tốc

độ thủy phân của enzyme lipase tăng từ 1.25 lên đến 5 (µmol/phút); tuy nhiên, khi tiếp tục giảm lệ enzyme/cơ chất từ 0.165 xuống 0.066 (%w/w), tốc độ thủy phân giảm từ 3.61 đến 2.084(µmol/phút) Nguyên nhân là do:

Khi tỉ lệ enzyme/cơ chất quá cao, có nghĩa là lượng cơ chất để enzyme thủy phân ít, lúc này, cơ chất trong hỗn hợp thủy phân loãng, do đó, khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất bị hạn chế, dẫn đến tốc độ thủy phân của enzyme giảm

Ngược lại, khi tỉ lệ enzyme/cơ chất quá thấp, có nghĩa là lượng cơ chất để enzyme thủy phân tăng cao, lúc này tốc độ thủy phân của enzyme ở thời điểm đầu của quá trình thủy phân tăng, sản phẩm do enzyme thủy phân tạo ra nhiều, chính sản phẩm này đã ức chế hoạt động của enzyme lipase, do đó hoạt độ enzyme giảm, dẫn đến tốc

độ thủy phân của enzyme giảm

Với tỉ lệ enzyme/cơ chất phù hợp, tạo điều kiện tốt cho khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất, enzyme không bị ức chế bởi sản phẩm do enzyme tạo ra, do đó tốc độ phản ứng đạt được là cao nhất

Yuji Shimada và cộng sự (1998) về sản xuất γ -linolenic acid (GLA) bằng cách

thủy phân dầu cây lưu ly bởi enzyme lipase Candida rugose trên 2 yếu tố ảnh hưởng

là thời gian và nồng độ enzyme/cơ chất cho kết quả: Mức độ thủy phân tăng từ 45% lến đến cực đại là 80% khi tăng nồng độ enzyme từ 20U/g mẫu lên 100U/g mẫu, mức độthủy phân không tăng thêm khi tiếp tục tăng nồng độ enzyme lên trên 100U/g mẫu

Noor I.M và cộng sự (2002) sử dụng lipase từ Rhizopus arrhizus thủy phân

dầu cọ Nồng độ cơ chất khảo sát từ 3 – 50 g/l Tốc độ thủy phân đạt được cao nhất là 3.2 µmol/phút tại nồng độ cơ chất 25g/l, dưới 25g/l, tốc độ thủy phân thấp hơn, trên

25 g/l, tốc độ thủy phân không tăng hơn nữa Các kết quả này cũng được các tác giả giải thích tương tự như trên

Như vậy, mỗi enzyme đều có một nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của

nó Nồng độ cơ chất cao hay thấp hơn so với giá trị thích hợp đều không tốt cho hoạt động của enzyme

Từ kết quả trên, ta chọn tỉ lệ enzyme/cơ chất là 0.22(%w/w) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo