Tài liệu phương pháp nuôi cấy tế bào động vật

• Có 2 dạng TB ĐV được nuôi cấy: - TB nuôi cấy sơ cấp: tách ra từ mô mới, vòng đời nuôi cấy bị giới hạn, được xử lý bằng trypsin để tách thành những TB đơn như TB biểu bì, nguyên bào sợi[r]

Phương pháp nuôi cấy

Tế bào động vật

Lịch sử phát triển

Năm 1912, Alexis Carrel thử nghiệm nuôi phôi gà

bằng cách bổ sung các chất dinh dưỡng vào môi

trường

Năm 1955, Harry Eagle’s dùng một hỗn hợp các a.a,

vitamin, carbonhydrate và muối, huyết thanh…nuôi

tế bào

Tế bào tuyến thượng thận (Bounasisi và cs, 1962)

Tế bào tuyến yên (Bounasisi và cs, 1962)

Tế bào thần kinh (Augusti – Tocco và sato, 1969)

Tế bào cơ (Yaff, 1968)

Nội dung

3

Đặc điểm tế bào động vật

 Tính cơ học yếu

 Tăng trưởng và phân chia chậm

 Cơ chế kìm hãm ngược

 Cần giá đỡ

 Có thể thay đổi kiểu gen kiểu hình (dung hợp tế bào)

 Có thể bảo quản lâu dài (lạnh sâu)

4

Đặc điểm của tế bào động vật

Tính chất cần giá đỡ

• Có 2 kiểu TB:

- TB phụ thuộc vào chỗ neo để bám dính: Bám vào đáy bình nuôi cấy và tạo thành lớp đơn bao phủ toàn bộ bề mặt vật thể nuôi cấy (confluence)

- TB không phụ thuộc vào chỗ neo (là những TB kết hợp với dịch lỏng trong cơ thể, ví dụ: TB máu)

Đặc điểm của tế bào động vật

Bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu trong nitơ lỏng (-197oC)

Một số khái niệm về dòng tế bào

8

+ Dòng tế bào (cell line):

quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu

Một số khái niệm về dòng tế bào

Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line): là dòng tế bào nuôi cấy qua nhiều thế hệ và duy trì khả năng phân bào trong một thời gian rất dài,

có khi là vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính Tế bào Hela (tế bàoung thư cổ tử cung)

+ Dòng tế bào tạm thời (Temporary cell

line): chỉ có khả năng sống trong điều kiện

nuôi cấy ở một thời gian giới hạn

+ Tế bào sơ cấp (primary cell): Là các tế bào

được nuôi cấy trong điều kiện in vitro lần đầu

tiên sau khi được tách ra từ khối mô

+ Tế bào thứ cấp (secondary cell): là các tế

bào đã qua vài lần cấy truyền sau khi được tách

từ khối mô

• Có 2 dạng TB ĐV được nuôi cấy:

- TB nuôi cấy sơ cấp: tách ra từ mô mới, vòng đời

nuôi cấy bị giới hạn, được xử lý bằng trypsin để tách

thành những TB đơn như TB biểu bì, nguyên bào sợi

- Dòng TB liên tục: được biến nạp làm mất đi tính

nhạy đối với các nhân tố kiểm soát sự phát triển, tạo ra

những dòng TB bất tử, được tạo hình lại; dễ nuôi cấy

hơn TB sơ cấp

Kỹ thuật phân tách tế bào

 Là cách một loại hay nhiều loại tế bào khác nhau từ mô hay cơ quan

 Có nhiều phương pháp tách tế bào : vật lý

và hóa học

 Phương pháp vật lý : phụ thuộc vào kích thước, hình dạng và tỷ trọng

 Phương pháp hóa học: nhờ enzyme protease cắt cầu nối protein liên bào

13

Một số phương pháp vật lý

 Phương pháp lọc

 Phương pháp ly tâm

 Phương pháp gắn với chất nền ái lực: hạt,

bề mặt, lưới….

 Phương pháp tách tế bào bằng hạt huỳnh quang (FACS)

 Phương pháp tách tế bào bằng hạt có từ tính (MACS)

14

15

16

Phương pháp li tâm theo gradient tỉ trọng: Các tế

bào sẽ lắng ở một lớp trong gradient tỉ trọng tương ứng với tỉ trọng của chúng

+ Môi trường ly tâm theo gradient tỉ trọng thường dùng là: percoll, ficoll… Máy li tâm siêu tốc

18

20 TÁCH BẰNG CRYOGEL

21

22

23

24

25

TÁCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

 Enzyme sử dụng thường là Trypsin

 Quy trình tách mô bằng Trypsin ấm

 Quy trình tách mô bằng Trypsin ấm

26

27

QUY TRÌNH

TÁCH MÔ BẰNG

TRYPSIN ẤM

Bước 1: Rửa mẫu mô bằng PBS

Bước 2: Cắt bỏ những phần không

cần thiết như mỡ, mô đã bị chết

Bước 3: Cắt thành những mảnh nhỏ có

kích thước 3mm 2

Bước 4: Chuyển mẫu vào erlen 50ml có

chứa sẵn PBS và rửa từ 2 – 3 lần

Bước 5: Thêm Trypsine 0,25%

(1ml trypsine 0,25% + 100mg mẫu)

Bước 6: Khuấy từ gia nhiệt: 200 vòng/phút,

thời gian 30 phút, nhiệt độ 36,5 o C

Bước 7: Thu dịch nổi, ly tâm 1000rpm

trong 10 phút

Dịch nổi

Tế bào + 1ml môi trường

(bảo quản ở 4 0 C)

Bước 8: Đếm số lượng tế bào (đạt 106tế bào /ml)

Bước 9: Nuôi tế bào ở 36,50C từ 48 – 72h

Bước 10: Quan sát dưới kính hiển vi

QUY TRÌNH TÁCH MÔ BẰNG TRYPSIN LẠNH

Bước 1: Cắt mô thành các mẫu 3 – 4 mm

và rửa mẫu nhiều lần bằng PBS vô trùng

Bước 2: loại bỏ phần PBS rửa mẫu lần cuối

và thay thế bằng trypsin 0,25%

Bước 3: Đặt mẫu ở 4 o C trong vòng 6 – 18 h

Bước 4: loại bỏ trypsin

Bước 5: Ủ ống chứa mô ở 36,5 o C trong 20 – 30 phút

Bước 6: 1ml môi trường cho 100 mg mô (dùng pipette trộn nhẹ nhàng)

Bước 7: tiến hành lọc bằng lọc vô trùng (kích thước lỗ 100 – 200 µm)

Bước 7: Thu dịch lọc, ly tâm 1000rpm trong 10 phút

Dịch chứa tế bào (xác định mật độ tế bào) Đạt 10 6 tế bào/ml

Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào đ.vật

Bảo quản

Mô

Nuôi cấy tế bào sơ cấp

Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục

Phân tách

Cấy chuyền

Hạn định số lượng Không hạn định số lượng

Bảo quản

38

Các kiểu nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)

 Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu

 Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy

 Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)

 Thuận lợi:

 Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của

tế bào in vivo

 Bất lợi:

 Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các

fibroblast

 Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức

 Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

39

Nuôi cấy thứ cấp

Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ

cấp

Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau

khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy

Thường chứa kiểu tế bào đơn

Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ

Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:

Dòng tế bào

Dòng tế bào liên tục

Các kiểu nuôi cấy tế bào

40

1) Dòng tế bào

lần cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia)

mức độ biệt hóa

để duy trì những dòng này trong thời gian dài

Các kiểu nuôi cấy tế bào

41

2) Dòng tế bào liên tục

chuyển dạng từ khối u

lại rất ít các đặc tính in vivo.

43

Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection) trong nuôi cấy

Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu phụ thuộc vào

Tốc độ phát triển

Kiểu phát triển

Hình thành sản phẩm chuyên biệt

Tuổi thọ

Khả năng bám dính

Đưa DNA vào trong tế bào

44

Hình dạng tế bào khi nuôi

Phát triển huyền phù(như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)

Dòng tế bào thu từ máu

Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi

Tế bào thu từ các mô rắn

SHSY5Y-Neuronal

45

Yêu cầu cần thiết cho nuôi cấy Tế

bào Động vật

46

47

Các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng

sinh tế bào

48

Nhân tố ảnh hưởng đến sự biệt hóa

 Sự biệt hóa tế bào rất quan trọng cho các

chức năng tế bào bình thường

 Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào:

Mật độ tế bào cao

Tương tác tế tế bào và tương tác tế

bào-chất nền

49

Các nhân tố ảnh hưởng đến tính

bám dính

và biệt hóa

Tương tác tế bào-tế bào

Tương tác tế bào-chất nền:

tác tế bào-tế bào

50

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công

của nuôi cấy tế bào

 Tế bào thích hợp

 Điều kiện thích hợp

Pha rắn

Pha lỏng

Pha khí

Nhiệt độ

51

Pha rắn

một giá thể để sinh trưởng

và di chuyển

polystyrene plastic

glass, filter wells

Bề mặt có thể được xử lí với:

Collagen, poly-l-lysine, matrigel

Lớp đơn tế bào

52

Pha lỏng

 Thành phần của môi trường

Cân bằng áp suất thẩm thấu

Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions

Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor

Hầu hết chứa 4-20 mM glucose

Nguồn năng lượng: glycolysis

53

Pha lỏng

Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh

Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa

Glutamine có thể đi vào chu trình Kreb

Cần thiết cho các tế bào đặc biệt

54

Pha lỏng

Vitamin

vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh

Tiền chất cho các co-factors

Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin

Hệ đệm

Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4

Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu:

Hệ thống đệm bicarbonate/CO2

Hệ đệm hóa chất: HEPES

Môi trường nuôi cấy thương mại như pH vàng (acid) hay hồng (alkali)

Áp suất thẩm thấu

Tương tự áp suất thẩm thấu 290 mOsm

Pha lỏng

Huyết thanh

tăng trưởng

độc

hay khi nuôi mật độ thấp

56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro

nhiễm

• Số thế hệ TB: số lần TB được tách chuyển

(“split”) từ đĩa và nuôi cấy sang đĩa khác

Các điều kiện nuôi cấy TB ĐV

• Đệm phosphate không có Ca2+ Mg2+ (PBS) được dùng

để rửa và loại bỏ huyết thanh trong môi trường

tránh ức chế chức năng của Trypsin-EDTA

- Calcium cũng ức chế chức năng của Trypsin-EDTA

- Phải làm ấm trước khi sử dụng để TB không bị sốc bởi

dung dịch lạnh

• Enzym dùng để tách TB khỏi đĩa nuôi cấy là trypsin:

- Trypsin cắt nối peptid (LYS hoặc ARG) trong fibronectin của chất nền ngoại bào

- EDTA nối với ion calcium trong môi trường

- Trypsin sẽ tự phân hủy và mất hoạt tính nếu trong bể nước hơn 20 phút

- Trypsin hóa TB quá lâu sẽ làm giảm khả năng sống của TB

• Chất tẩy: dùng để loại bỏ TB còn lại trong đĩa hoặc ống nuôi cấy

• Bể nước: dùng để làm ấm môi trường, PBS,

Basal medium Eagle (BME) Nuôi cấy tế bào với huyết

thanh Mininal essential media (MEM)

Nuôi cấy tế bào với huyết thanh thẩm tách Dulbecco’s modified Eagle

(DMEM)

Nuôi cấy nhiều tế bào nhiễm virus, phát triển với huyết thanh, tăng trưởng nồng độ cao

Ham’s F12 nutrient mixture (F12)

Nuôi cấy tế bào CHO, mật

độ thấp, huyết thanh thấp F12 – DMEM (1:1) Nuôi cấy các kiểu tế bào có

và không có huyết thanh

61

Pha khí

Carbondioxide

5-10% CO2

Sản xuất sản phẩm: pyruvate

Oxy

Hầu hết tế bào cần thiết phân áp oxy thấp

62

Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài

Thiết bị

64

66

• Chất nhuộm TB trypan blue

• Duy trì mức độ CO2 (5-10%), độ ẩm và nhiệt độ (37oC) giống như điều kiện

in vivo

69

Kính hiển vi đảo pha

KHV đảo pha

Có thể dùng quan sát TB sống

KHV thường quan sát TB đã dược nhuộm (TB đã chết)

72

Kĩ thuật vô trùng

Vi sinh vật là vấn đề nguy hại chính trong nuôi cấy tế bào

Kháng sinh

Cải thiện điều kiện PTN

Kĩ thuật vô trùng

Bề mặt sạch và gọn gàng

Người “sạch”

Hóa chất và môi trường

Dụng cụ nuôi cấy

Khảo sát các yếu tố gây nhiễm

• Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc (làm thay đổi độ dục

và pH của môi trường)

• Mycoplasma (nhuộm DNA trực tiếp, thử nghiệm

miễn dịch enzyme bằng kháng huyết thanh đặc

hiệu, kháng thể đơn dòng, khuếch đại PCR RNA

của mycoplasma)

Nuôi cấy tế bào quy

mô lớn

74

75

Bioreactors

Thiết bị nhân giống Spinner Flash Thiết bị lên men tự động Bio-Flo

78

79

80

81

83

84

85

86

Kỹ thuật tạo dòng tế bào

87

88

89

90

92

93

94

95

96

97

99

101

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy

tế bào động vật

•Sản xuất protein cho mục đích thương mại

•Nghiên cứu TBG, TB ung thư

•Sản xuất vaccine, kháng thể, hormone

•Nuôi cấy TB người và ĐV sơ cấp

•Nuôi cấy phôi

•Liệu pháp gen

•Liệu pháp TB

•Sản xuất mô, cơ quan nhân tạo

103

HYBRIDOMA

Dung hợp TB u tủy với TB lá lách và chọn lọc

TB lai Hybridoma

FUSION (by making the cell membranes more permeable)

PEG (polyethylene glycol)

MYELOMA CELLS SPLEEN CELLS

HYBRIDOMA CELLS HAT Medium

1.Plating of Ce lls in HAT selective Medium 2.Scanning of Viable Hybridomas

-Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase – là 1 enzyme trong quá trình chuyển hóa purine

107

Kỹ thuật bảo quản tế bào động vật

108

(1) Giảm thiểu sự biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền

(2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào

(3) Ngăn cản quá trình biệt hoá tế bào

(4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào

(5) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong in vitro

(6) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái

(7) Giảm chi phí nuôi cấy

(8) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng

(9) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen

(10) Thuận lợi cho vận chuyển

(11) Thuận lợi cho việc thương mại hoá

(12) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy

không cần thiết

110

111

112

113

114

115

116