Nghiên cứu tạo mạch máu nhân tạo từ giá thể động mạch vô bào và tế bào tiền thân nội mô người hướng tới ứng dụng điều trị bệnh tim mạch

Một phương pháp đang được nghiên cứu nhiều hiện nay để tạo giá thể mạch máu nhân tạo là khừ tế bào động mạch tự nhiên để tạo giá thể mạch máu vô bào.. Phương pháp này có những ưu điểm nh

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

TÓM TẮT i

ABSTRACT ii

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH viii

LỜI CẢM ƠN vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cấu tạo mạch máu 3

1.2 Căn bệnh xơ vữa mạch máu 4

1.3 Các phương pháp chữa trị hiện nay 6

1.4 Giá thể mạch máu 8

1.5 Các phương pháp tạo giá thể mạch máu vô bào 9

1.6 Tế bào tiền thân nội mô (EPC) 11

1.6.1 Đặc điểm hình thái tế bào EPC được nuôi cấy 11

1.6.2 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của tế bào EPC 14

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Động mạch vành heo 17

2.1.2 Máu cuống rốn người 17

2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô 18

2.3.2 Phương pháp tách tế bào EPC khỏi đĩa nuôi cấy và cấy chuyền 19

2.3.3 Phương pháp đánh giá tế bào EPC 19

2.3.4 Phương pháp xử lý động mạch vành heo 22

2.3.5 Phương pháp đánh giá hiệu quả khử tế bào 25

2.3.6 Phương pháp khử trùng mạch máu vô bào 27

2.3.7 Phương pháp đánh giá độc tính của giá thể mạch máu vô bào 28

2.3.8 Phương pháp cấy tế bào EPC lên giá thể mạch máu vô bào 28

2.3.9 Phương pháp đánh giá sự bám dính của tế bào EPC trên khung nâng đỡ 29

2.3.10 Phương pháp đánh giá sự tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ 29

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 31

3.1 Kết quả nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô (EPC) 31

3.2 Kết quả đánh giá tế bào tiền thân nội mô (EPC) 33

3.2.1 Kết quả nhuộm Giemsa 33

3.2.2 Kết quả kiểm tra marker bề mặt bằng phương pháp flow cytometry 34

3.2.3 Kết quả kiểm tra marker bằng phương pháp RT-PCR 34

3.2.4 Kết quả đánh giá sự tăng sinh tế bào 35

3.3 Kết quả tạo giá thể mạch máu vô bào 39

3.3.1 Kết quả thu nhận động mạch vành 39

3.3.2 Kết quả đánh giá mô mạch máu bình thường 39

3.3.3 Kết quả khử tế bào mạch máu bằng NaOH 0,5M 41

3.3.4 Kết quả khử tế bào mạch máu bằng Triton X100 0,1% 43

3.3.5 Kết quả khử tế bào mạch máu bằng nước cất 44

3.3.6 Kết quả khử tế bào mạch máu bằng SDS 0,5% 45

3.3.7 Kết quả khử tế bào mạch máu bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% 24 giờ và nước cất 18 giờ 46

3.3.8 Kết quả khử tế bào mạch máu bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% 24 giờ và nước cất 24 giờ 48

3.4 Kết quả khử trùng khung nâng đỡ 50

3.5 Kết quả đánh giá độc tính của giá thể mạch máu vô bào 52

Bàn luận: 53

3.6 Kết quả đánh giá sự tăng sinh EPC lên giá thể mạch máu vô bào 59

KẾT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

TÓM TẮT

Giá thể mạch máu vô bào (dVG) được tạo từ mạch máu tự nhiên bằng phương pháp khử

tế bào Giá thể mạch máu vô bào có cấu trúc, thành phần tương tự như mạch máu tự nhiên Tế bào tiền thân nội mô (EPC) là nguồn tế bào có thể được thu nhận từ máu cuống rốn hoặc tự thân, EPC mang nhiều tính chất của tế bào nội mô: biểu hiện các marker đặc trưng của tế bào nội mô, khả năng chống đông máu Sự kết hợp giá thể mạch máu khử tế bào và tế bào EPC có thể tạo ra mạch máu kỹ nghệ hướng tới thay thế hoàn toàn hoặc bắc cầu qua đoạn mạch tự nhiên Trong đề tài này, tế bào EPC được thu nhận từ máu cuống rốn, giá thể động mạch được thu từ động mạch vành tim heo Động mạch vành tim heo được khử tế bào bằng NaOH 0.5 M trong 6 giờ hoặc nước cất 24 giờ hoặc Triton X100 0,1% trong 24 giờ hoặc SDS 0,5% trong 24 giờ Hiệu quả khử tế bào được đánh giá bằng phương pháp nhuộm HE, Trichrome, Verhoeff – Van Gieson dVG được khử trùng với cồn 70o trong 12 giờ/18 giờ/24 giờ hoặc với hỗn hợp kháng sinh/kháng nấm (penicillin, streptomycin, amphotericin B) Tiếp theo, độc tính giá thể vô bào được đánh giá theo tiêu chuẩn ISO 10993-5 Máu cuống rốn được ly tâm đẳng tỷ trọng với Histopaque để thu tế bào đơn nhân Lớp tế bào đơn nhân được nuôi trong môi trường EGM-2 bổ sung 10% FBS, nuôi ở 37oC, 5% CO2 Tế bào thế hệ P3 được đánh giá marker CD14, CD45, CD105 bằng flow cytometry và KDR, Ve-cadherin, Thrombomodulin, vWF, CD146 bằng RT-PCR Tế bào EPC được đưa lên lòng giá thể mạch máu vô bào bằng phương pháp tiêm trực tiếp và nuôi cấy tĩnh 11 ngày Sự tăng trưởng được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét, nhuộm HE và MTT Kết quả cho thấy: phương pháp khử tế bào tốt

là kết hợp SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất 18 giờ Phương pháp khử trùng tốt nhất là

sử dụng cồn 70o Giá thể mạch máu không gây độc tế bào Tế bào EPC được thu nhận thành công, biểu hiện các marker CD 105, KDR, Ve-cadherin, Thrombomodulin, vWF, CD146 và không biểu hiện CD14, CD45 Tế bào EPC bám dính và tăng sinh trên lòng mạch máu từ ngày 1 đến ngày 7

12 hours aVGs are not toxic to fibroblast Umbilical blood derived EPCs were successfully isolated EPCs express marker CD105, KDR, Ve-cadherin, Thrombomodulin, vWF, CD146 and don’t express CD14, CD45 EPCs were adhered and growth on lumen of acellular vascular grafts from day 1 to day 7

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

Bảng 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 18 Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi được sử dụng trong phương pháp RT-PCR 21 Bảng 3.1 Tổng kết hiệu quả loại tế bào của các chất thí nghiệm 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

dVG: Giá thể mạch máu khử tế bào

ddVG: Giá thể mạch máu khử tế bào đã khử trùng

EPC: Tế bào tiền thân nội mô

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc ba lớp của mạch máu 3

Hình 1.2 Động mạch xơ vữa 4

Hình 1.3 Cấu tạo mảng xơ vữa 5

Hình 1.4 Xơ vữa động mạch vành 6

Hình 1.5 Các phương pháp chữa trị xơ vữa động mạch 7

Hình 1.6 Mảnh ghép Dacron (giá thể mạch máu không phân hủy) 8

Hình 1.7 Phương pháp loại tế bào (A: Cấu trúc bình thường của mô, B: Mô loại tế bào) 10

Hình 1.8 Mảnh ghép SIS 11

Hình 1.9 Các phương pháp nuôi cấy EPC từ tế bào đơn nhân trong máu người 13

Hình 1.10 Con đường phát triển của tế bào máu – nội mô và sự biểu hiện CD45 15

Hình 3.1 Kêt quả ly tâm thu tế bào đơn nhân bằng Histopaque 31

Hình 3.2 Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào EPC trên bề mặt nuôi cấy (x100) 32

Hình 3.3 Kết quả nuôi cấy tế bào EPC thế hệ P3 (x100) 33

Hình 3.4 Kết quả nhuộm Giemsa tế bào EPC thế hệ P3 (x100) 33

Hình 3.5 Kết quả đánh giá các marker bề mặt bằng phương pháp flow cytometry 34

Hình 3.6 Kết quả đánh giá các marker bằng phương pháp RT-PCR 34

Hình 3.7 Biểu đồ biểu thị đường cong tăng trưởng tế bào EPC ở thế hệ P3 35

Hình 3.8 Động mạch vành 39

Hình 3.9 Kết quả nhuộm HE mẫu chứng 40

Hình 3.10 Kết quả nhuộm collagen và elastin mẫu chứng 41

Hình 3.11 Kết quả nhuộm mô học mạch máu xử lý với NaOH 0,5M trong 6 giờ 42

Hình 3.12 Kết quả nhuộm mô học mạch máu xử lý với Triton X100 trong 24 giờ 43

Hình 3.13 Kết quả nhuộm mô học mẫu xử lý với nước cất 2 lần trong 24 giờ 44

Hình 3.14 Kết quả nhuộm mô học mẫu mạch máu xử lý với SDS trong 24 giờ 46

Hình 3.15 Kết quả nhuộm mô học mẫu xử lý với SDS 24 giờ và nước cất 18 giờ 47

Hình 3.16 Kết quả nhuộm mô học mẫu xử lý với SDS 24 giờ và nước cất 24 giờ 48

Hình 3.17 Kết quả quan sát mẫu dVG chưa khử trùng trên đĩa agar sau 7 ngày 50 Hình 3.18 Kết quả khử trùng dVG với chất kháng khuẩn và kháng nấm 51 Hình 3.19 Kết quả khử trùng mạch máu vô bào với cồn 70 o ở các mốc thời gian 51

Hình 3.20 Giá thể mạch máu vô bào đặt trực tiếp lên lớp tế bào nguyên bào sợi (x100)

gian 60

Hình 3.28 Biểu đồ biểu thị sự tăng sinh tế bào EPC trên giá thể mạch máu vô bào 61 Hình 3.29 Kết quả chụp SEM tế bào EPC trên bề mặt giá thể mạch máu (x800) 64

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia Cám ơn Đại học Quốc gia đã giúp tôi hoàn thành đề tài này

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hằng năm, các căn bệnh mạch máu như xơ vữa hoặc phình mạch đang gây ra hàng triệu cái chết tại các quốc gia trên toàn thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2004, hơn bảy triệu người qua đời do bệnh xơ vữa mạch vành (chiếm 9,6%

số ca tử vong trên toàn thế giới) Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm

2011, trung bình, trong bảy người Mỹ qua đời sẽ có một người qua đời do bệnh động mạch vành Năm 2011, khoảng 375295 người Mỹ qua đời vì bệnh động mạch vành Mỗi năm, thêm khoảng 635000 người Mỹ bị bệnh mạch vành Nguy hiểm hơn, những căn bệnh này xuất hiện ngày càng phổ biến với triệu chứng ngày càng nặng và độ tuổi mắc bệnh ngày càng trẻ Tại Việt Nam, mặc dù chưa có nghiên cứu chính thức thống kê số lượng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu nhưng theo ghi nhận của nhiều bệnh viện, lượng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu đang ngày càng gia tăng Theo thống kê của Viện Tim Mạch Trung Ương, năm 2003 tỉ lệ bệnh nhân nhập viện do bệnh động mạch vành chiếm 11,2%, đến năm 2008 tỉ lệ này đã tăng lên 24%

Một số phương pháp chữa trị bệnh mạch máu được áp dụng như: sử dụng một mạch máu khác làm cầu nối qua đoạn bị tổn thương hoặc đặt một khung kim loại (stent) để nong lòng mạch bị hẹp do xơ vữa Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn chưa chữa trị được hoàn toàn căn bệnh mạch máu, khoảng 1/3 bệnh nhân không có mạch máu phù hợp, chi phí phẫu thuật cao, hiện tượng tái hẹp vẫn có khả năng xảy ra Do đó, kỹ nghệ mạch máu

ra đời nhằm tạo ra giá thể mạch máu nhân tạo phù hợp được sử dụng làm đoạn mạch bắc cầu qua vị trí bị tổn thương hoặc được sử dụng để thay thế mạch máu bị tổn thương Một phương pháp đang được nghiên cứu nhiều hiện nay để tạo giá thể mạch máu nhân tạo là khừ tế bào động mạch tự nhiên để tạo giá thể mạch máu vô bào Phương pháp này có những ưu điểm như cấu trúc, hình dạng, thành phần của giá thể mạch máu vô bào tương

tự với mạch máu tự nhiên, nguồn thu nhận mẫu dồi dào và chi phí sản xuất tương đối thấp hơn Do đó, giá thể mạch máu vô bào hứa hẹn đem đến nhiều hy vọng cho các nghiên cứu trong kỹ nghệ mạch máu

Tuy nhiên, hạn chế chung của các loại giá thể mạch máu là hiện tượng đông máu trong lòng mạch sau khi ghép Hiện tượng đông máu trong lòng mạch có thể diễn ra ngay lập tức khi dVG tiếp xúc với dòng máu Giải pháp đang được sử dụng hiện nay để khắc phục tình trạng này là sử dụng chất chống đông (như heparin) để hạn chế tình trạng trên Tuy nhiên, để giải quyết triệt để khó khăn này, hỗ trợ nhanh chóng quá trình tái cấu trúc của

mô và hạn chế sự xâm nhập của tế bào viêm của cơ thể chủ, dòng tế bào nội mô thường được cấy trên lòng mạch máu để tạo thành một lớp nội mô chống đông tự nhiên Dòng tế bào nội mô thường được sử dụng là tế bào nội mô và tế bào tiền thân nội mô Tế bào nội

mô là thành phần quan trọng của lớp trong mạch máu, chức năng của tế bào nội mô là chống đông máu Tuy nhiên, nguồn thu nhận tế bào nội mô tự thân bị giới hạn (do phải thu nhận mạch máu mới thu nhận được tế bào nộ mô) nên tiềm năng ứng dụng của tế bào này bị hạn chế Hiện nay, tế bào tiền thân nội mô là một ứng viên quan trọng trong lĩnh vực này Dòng tế bào này có thể được thu nhận tự thân từ trong máu người bệnh

Trên thế giới, kỹ nghệ mạch máu đã phát triển mạnh trong nhiều thập kỷ nhưng tại Việt Nam, chưa có bất kỳ nghiên cứu nào trong lĩnh vực kỹ nghệ mạch máu được công bố trong nhiều năm qua Nhận thấy rõ tầm quan trọng của tế bào nội mô, giá thể mạch máu

vô bào và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tạo mạch máu nhân tạo từ giá thể động mạch vô bào và tế bào tiền thân nội

mô người hướng tới ứng dụng điều trị bệnh tim mạch”

MỤC TIÊU

- Tạo được giá thể mạch máu vô bào từ động mạch vành heo

- Nuôi cấy thành công tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người

- Đánh giá được sự tăng trưởng tế bào tiền thân nội mô đối với giá thể mạch máu vô bào

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu tạo mạch máu

Phần lớn các động mạch, tĩnh mạch trong cơ thể được được cấu tạo bởi 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong

- Lớp ngoài là lớp mô liên kết được cấu thành từ các nguyên bào sợi, dây thần kinh và những mạch máu nhỏ Thành phần ECM (ExtraCellular Matrix) chủ yếu lớp ngoài

là sợi collagen và elastin Những sợi collagen lớp ngoài được định hướng theo chiều dọc Nhờ đó, động mạch có độ bền cần thiết để ngăn chặn hiện tượng giãn mạch máu quá mức khi cơ thể vận động [52]

- Lớp giữa bao gồm các tế bào cơ trơn và những sợi protein như collagen, elastin Tế bào cơ trơn và các sợi protein được tổ chức thành những vòng tròn đồng tâm xoay quanh trục mạch máu Ranh giới giữa lớp giữa và lớp ngoài là phiến đàn hồi ngoài được cấu tạo từ các sợi elastin [15, 36]

- Lớp trong (còn gọi là lớp nội mô hay lớp nội mạc) bao gồm một lớp tế bào nội mô

Tế bào nội mô bao phủ hoàn toàn lòng trong của tất cả mạch máu trong cơ thể Ranh giới giữa lớp trong và lớp giữa là phiến đàn hồi trong được cấu tạo từ các phân tử elastin [15, 36]

Hình 1.1 Cấu trúc ba lớp của mạch máu (http://iupucbio2.iupui.edu)

Lớp ngoài

hồi trong

Phiến đàn

Tế bào cơ trơn

1.2 Căn bệnh xơ vữa mạch máu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) năm 2012, khoảng 17,5 triệu người qua đời vì bệnh tim mạch trên toàn thế giới (chiếm 31% số ca tử vong trên toàn thế giới) Trong số những bệnh nhân qua đời vì bệnh tim mạch, hơn 7,4 triệu người qua đời do bệnh mạch vành Theo dự đoán, đến năm 2030, hai mươi ba triệu người qua đời vì bệnh tim mạch Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm 2011, số ca tử vong do bệnh mạch vành chiếm 1/7 tổng số ca tử vong trên toàn nước Mỹ Nguy hiểm hơn, những căn bệnh này xuất hiện ngày càng phổ biến với triệu chứng ngày càng nặng và độ tuổi mắc bệnh ngày càng trẻ Hiện nay, số lượng người mắc bệnh tim mạch đang gia tăng mạnh trong những nước có thu nhập thấp và trung bình do sự thay đổi lối sống và sự thiếu thốn về điều kiện kinh tế

Nhiều căn bệnh liên quan đến mạch máu được biết đến trong xã hội hiện tại như xơ vữa mạch máu, phình mạch và những trường hợp mạch máu bị tổn thương do tai nạn, bệnh lý Trong đó, căn bệnh thường xãy ra nhất và đưa đến những hậu quả thảm khốc là xơ vữa mạch máu Xơ vữa mạch máu là hiện tượng các phân tử lipid lắng đọng vào thành mạch dẫn đến thành mạch trở nên xơ và cứng hơn

Hình 1.2 Động mạch xơ vữa (http://www.pic2fly.com)

cản sự lắng tụ LDL vào thành mạch Tuy nhiên, khi tế bào nội mô bị suy chức năng, khe

hở được hình thành giữa các tế bào nội mô Các phân tử LDL xâm nhập vào lớp cận nội

mô thông qua những khe hở giữa các tế bào Đồng thời, các tế bào bạch cầu như monocyte, lympho T cũng xâm nhập vào lớp cận nội mô theo con đường tương tự LDL Nguyên nhân thường gặp đối với hiện tượng suy chức năng nội mô bao gồm bệnh cao huyết áp, bệnh tiểu đường, chứng nghiện thuốc lá, nồng độ các phân tử LDL bị oxi hóa cao, nhiễm vi sinh vật như virus herpes [26]

Trong lớp cận nội mô, các hạt LDL bị oxi hóa (LDLox) bởi các sản phẩm được sản xuất bởi tế bào nội mô và tế bào cơ trơn và bị hấp thu bởi các đại thực bào Đại thực bào dung hợp một lượng lớn các phân tử LDLox tạo thành tế bào foam Các tế bào foam tích lũy theo thời gian tạo thành những mảng mỡ lấn vào lòng mạch máu Ngoài ra, LDLox tác động mạnh lên tế bào nội mô, gây suy giảm chức năng tế bào nội mô trên diện rộng [2, 16]

Hình 1.3 Cấu tạo mảng xơ vữa [26]

Sau đó, tế bào nội mô tiết ra các chất cảm ứng quá trình hoạt hóa và di cư tế bào cơ trơn Tiếp theo, tế bào cơ trơn trải qua quá trình hoạt hóa, di cư, tăng sinh và tổng hợp ECM (chủ yếu là collagen, proteoglycan) trong lớp cận nội mô Sau đó, tế bào cơ trơn, nguyên bào sợi tạo nên lớp vỏ xơ bao bọc bên ngoài mãng xơ vữa và các tế bào, các phân tử lipid bên trong mãng mỡ bị phân hủy hình thành phần lõi vữa bên trong mãng xơ vữa [16]

Màng bao xơ Lõi vữa

Tế bào foam

Tác hại của xơ vữa mạch máu

Khi tiếp xúc với LDLox, tế bào nội mô chuyển sang khả năng cảm ứng đông máu thay vì chống đông máu Những khối máu đông có thể hình thành trên bề mặt mảng xơ vữa gây tắc mạch máu

Nguy hiểm nhất, màng bao ngoài mãng xơ vữa có thể bị phá vỡ bởi các enzyme do tế bào bạch cầu sản xuất hoặc do áp lực dòng máu Ngay tức thời, khối máu đông sẽ được hình thành tại vị trí mảng xơ vữa dẫn đến tắc một phần hoặc tắc hoàn toàn mạch máu Mảng

xơ vữa bị bong khỏi mạch sẽ di chuyển theo dòng máu và có thể gây tắc những mạch nhỏ hơn

Sự nguy hiểm của xơ vữa mạch máu phụ thuộc nhiều vào vị trí mạch máu Xơ vữa động mạch vành có thể dẫn tới bị nhồi máu cơ tim, xỡ vữa động mạch não có thể dẫn tới tai biến mạch máu não, xơ vữa tại động mạch chi có thể dẫn tới liệt chi Tóm lại, bệnh xơ vữa mạch máu có thể gây ra những tổn thương nghiêm trọng đến bệnh nhân như bị bại liệt, sống đời sống thực vật… và thường xuyên dẫn đến tử vong

Hình 1.4 Xơ vữa động mạch vành (http://www.professays.com)

1.3 Các phương pháp chữa trị hiện nay

Hiện nay, các phương pháp lâm sàng được áp dụng chữa trị xơ vữa mạch máu bao gồm: phương pháp chữa trị bằng thuốc, phương pháp bắc cầu động mạch, phương pháp tạo hình động mạch

Vùng cơ tim tổn thương Mạch vành xơ vữa

- Phương pháp bắc cầu động mạch: Phương pháp này sử dụng một mạch máu làm cầu nối ngang qua đoạn mạch bị xơ vữa Cầu nối mạch máu giúp phục hồi dòng máu đến các mô, cơ quan nằm phía sau đoạn xơ vữa

- Phương pháp tạo hình động mạch: Phương pháp này sử dụng một khung kim loại được gọi là stent Stent được đưa vào cơ thể bằng phương pháp nội soi và di chuyển theo tĩnh mạch đùi đến vị trí xơ vữa Tại vị trí xơ vữa, stent được căng ra để nén mãng xơ vữa vào thành mạch và cố định tại vị trí xơ vữa Qua đó, mãng xơ vữa bị hẹp lại, sự lưu thông của dòng máu qua vị trí xơ vữa được phục hồi

Hình 1.5 Các phương pháp chữa trị xơ vữa động mạch vành

(http://my.clevelandclinic.org)

Các phương pháp chữa trị xơ vữa mạch máu hiện nay đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng Nhược điểm chung của các phương pháp này là vẫn chưa chữa trị hoàn toàn căn bệnh xơ vữa (mãng xơ vữa vẫn tồn tại trong mạch máu và có khả năng bong ra khỏi

vị trí ban đầu), chi phí cho mỗi ca chữa trị cao, số lượng mạch máu tự thân phù hợp cho phẫu thuật bắc cầu mạch máu không nhiều và vẫn có khả năng bị tái hiẹp

Trong bối cảnh đó, kỹ nghệ mạch máu ra đời nhằm giải quyết những vấn đề vẫn tồn đọng đến hiện tại của các phương pháp chữa trị truyền thống Mạch máu nhân tạo được thiết kế nhằm thay thế những mạch máu tổn thương hoặc dùng để làm cầu nối bắc qua đoạn mạch

xơ vữa Mạch máu nhân tạo có thể được sản xuất ở quy mô công nghiệp với chi phí sản

Mạch máu bắc cầu

mạch

xuất thấp Do đó, mạch máu nhân tạo hoàn toàn có khả năng đáp ứng được nhu cầu của các bệnh nhân trên toàn thế giới [32]

1.4 Giá thể mạch máu

Giá thể mạch máu là một cấu trúc hình ống được tạo bởi vật liệu tự nhiên hoặc tổng hợp

có hoạt tính sinh học Nhiều loại giá thể mạch máu sử dụng tạo mạch máu nhân tạo được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ trước Về thành phần, giá thể mạch máu được chia thành các nhóm sau: polymer tổng hợp không phân hủy, polymer tổng hợp có khả năng phân hủy, protein và giá thể mạch máu vô bào

Hình 1.6 Mảnh ghép Dacron (giá thể mạch máu không phân hủy) [33]

Các loại giá thể mạch máu tổng hợp và protein được xem là những giá thể mạch máu truyền thống trong kỹ nghệ mạch máu lẫn trong kỹ nghệ mô bởi vì chúng xuất hiện khá sớm và được nghiên cứu cặn kẽ từ nhiều thập kỷ trước đây Hầu hết những mạch máu kỹ nghệ hóa được tạo từ những polymer tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học hoặc polymer sinh học như collagen, fibrin… Bất lợi rõ ràng của 2 loại giá thể mạch máu trên

là thành phần và cấu trúc của giá thể mạch máu nhân tạo không giống với thành phần và cấu trúc của mạch máu tự nhiên và khả năng hỗ trợ quá trình tái cấu trúc mạch máu không tốt Thông thường, các loại giá thể mạch máu trên nhanh chóng bị phân hủy trong

cơ thể [25]

1.5 Các phương pháp tạo giá thể mạch máu vô bào

Các phương pháp tạo giá thể mạch máu truyền thống đều dựa trên một ý tưởng chung là tạo ống ghép có cấu trúc tương tự cấu trúc mô cần thay thế Hình dạng, cấu trúc và thành phần ống ghép càng giống với mô tự nhiên càng tốt Sau đó, một ý tưởng khác hình thành: nếu các loại ống ghép được tạo ra bằng cách mô phỏng cấu trúc, tính chất của cơ quan tự nhiên cần thay thế, vậy tại sao chúng ta không sử dụng chính cơ quan tự nhiên để làm ống ghép bởi vì bản thân mô, cơ quan đã mang cấu trúc, tính chất của chính nó Từ

đó, ý tưởng tạo ống ghép từ mô tự nhiên bằng phương pháp loại tế bào đã ra đời trong những năm gần đây

Tất cả các mô, cơ quan trong cơ thể đều được cấu thành từ hai thành phần chính là tế bào

và khung nâng đỡ ngoại bào (ECM) Giữa các mô và các cơ quan khác nhau, thành phần

tế bào và ECM sẽ không giống nhau ECM là khung nâng đỡ protein của mô và cơ quan

do tế bào tổng hợp và tiết ra ngoài Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của mô và cơ quan Đồng thời, tế bào còn là mục tiêu tấn công của hệ miễn dịch cơ thể chủ đối với các mảnh ghép đồng loại hoặc khác loại Phương pháp loại tế bào được tiến hành với mục đích loại bỏ hoàn toàn các tế bào trong mô, cơ quan và thu nhận một cách toàn vẹn ECM của mô, cơ quan ban đầu Sản phẩm của quá trình loại tế bào là một khung nâng đỡ protein có thành phần, cấu trúc và hình dạng tương tự với mô tự nhiên và khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch cơ thể chủ trở nên yếu đi Khung nâng đỡ protein sau xử lý được gọi là giá thể vô bào (trong kỹ nghệ mạch máu, giá thể vô bào còn được gọi là ống ghép mạch máu vô bào) Khung nâng đỡ protein có thể được sử dụng trực tiếp cấy ghép thay thế mô, cơ quan hoặc được cố định tế bào trước khi cấy ghép [8]

Hình 1.7 Phương pháp loại tế bào (A: Cấu trúc bình thường của mô, B: Mô loại tế bào)

Phương pháp loại tế bào thường được tiến hành với mô, cơ quan dị loại Trong cấy ghép mạch máu, mạch tự thân luôn là “tiêu chuẩn vàng” để cấy ghép nhưng không phải mạch

tự nhân nào cũng thích hợp, số lượng mạch tự thân phù hợp rất ít Mạch máu đồng loại có

số lượng nhiều hơn nhưng vẫn không đáp ứng đầy đủ nhu cầu của bệnh nhân và có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch Mạch máu dị loại hiếm được sử dụng vì chúng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh mặc dù số lượng mẫu rất dồi dào Phương pháp loại tế bào được nghiên cứu đối với các mạch dị loại bởi vì phương pháp loại tế bào có thể tận dụng ưu điểm về số lượng dồi dào và hạn chế nhược điểm về tính kháng nguyên mạnh của các mạch dị loại Trong hai thành phần tế bào và ECM, tế bào là thành phần kháng nguyên chính gây đáp ứng kích thích đáp ứng miễn dịch vật chủ [28] Sau khi loại tế bào, khả năng kích thích miễn dịch của mạch máu dị loại giảm mạnh Sản phẩm quá trình khử

tế bào mạch máu là giá thể mạch máu vô bào [8]

Phương pháp khử tế bào mạch máu có những ưu điểm sau đây

- Giá thể mạch máu vô bào có cấu trúc, hình dạng và thành phần giống mạch máu tự nhiên

- Đáp ứng miễn dịch của giá thể mạch máu vô bào yếu

- Số lượng mẫu dồi dào

- Quy trình xử lý đơn giản, chi phí sản xuất thấp

Tế bào

Các ion Các ion

Tế bào

Nhiều nghiên cứu ghép giá thể mạch máu vô bào vào cơ thể động vật đã được tiến hành Giá thể mạch máu vô bào được sử dụng trực tiếp (Hiles và đồng nghiệp 1995, Martin và đồng nghiệp 2005) hoặc được cố định tế bào mạch máu cơ thể chủ trước khi cấy ghép (Hodde và đồng nghiệp 2002, Amiel và đồng nghiệp 2006) Sau 4 tuần, tỉ lệ thông máu của những động mạch chuột được cấy tế bào với tế bào nội mô là 89%, trong khi đó, những mảnh ghép không được cấy tế bào nội mô có tỉ lệ thông máu là 29% [1]

Ngoài ra, giá thể mạch máu vô bào có thể được thu nhận từ những mô khác đã trải qua quá trình xử lý tế bào như SIS (Small Intestial Submucosa), Alloderm SIS là SIS và Alloderm là những sản phẩm loại tế bào được thương mại hóa trên thị trường SIS có bản chất là lớp dưới niêm mạc ruột non SIS được thu nhận bằng cách loại bỏ lớp niêm mạc, lớp thanh mạc và lớp cơ ruột non và sau đó được cắt thành những tấm nhỏ Sau đó, SIS trải qua quá trình loại tế bào, khử trùng để trở thành sản phẩm được thương mại hóa trên thị trường SIS được ứng dụng nhiều trong y học từ năm 1989 Trong kỹ nghệ mạch máu, SIS được cuộn tròn quanh một lõi kim loại, sau đó được khâu lại để tạo dạng ống [32]

Hình 1.8 Mảnh ghép SIS ( http://www.rcsed.ac.uk)

1.6 Tế bào tiền thân nội mô (EPC)

1.6.1 Đặc điểm hình thái tế bào EPC được nuôi cấy

Tế bào nội mô bao phủ toàn bộ mặt trong của mạch máu vai trò giúp chống kết dính tiểu cầu, bạch cầu, và sản sinh các yếu tố điều tiết quan trọng Những tổn thương và rối loạn chức năng tế bào nội mô làm cho thành mạch mất khả năng chống đông máu, tạo điều kiện hình thành các mảng xơ vữa gây ra nhiều bệnh lý nguy hiểm Quá trình tái tạo lớp

nội mô có thể do sự di chuyển và tăng sinh của những tế bào nội mô xung quanh Tuy nhiên, tế bào nội mô là tế bào đã trưởng thành và tăng sinh thấp nên khả năng thay thế lớp nội mô hư hỏng bị hạn chế Trong tuỷ xương và máu ngoại vi người có một loại tế bào có khả năng tăng sinh cao, mang đặc điểm của tế bào nội mô và được gọi là tế bào tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cell - EPC)

Năm 1997, Asahara và cộng sự thu nhận và nuôi tế bào đơn nhân CD34+ từ máu của người trưởng thành trên đĩa có tráng fibronectin [45] Sau năm ngày, thấy xuất hiện các cụm tế bào với tế bào hình tròn ở giữa và xung quanh là tế bào dạng thon dài Trong đó, các tế bào hình thon dài biểu hiện kháng nguyên của tế bào nội mô như: CD31, TIE2, VEGFR2, E-selectin Khi được tiêm vào chuột suy giảm miễn dịch thiếu máu chi, các tế bào này tập trung tại những vùng tạo mạch máu mới Do đó, Asahara cho rằng những tế bào hình thoi CD34+ là tế bào EPC

Năm 2003, Hill và cộng sự nuôi cấy tế bào đơn nhân từ máu người trên đĩa tráng với fibronectin Sau 48 giờ, tiến hành thu các tế bào không bám dính và cấy lại trên đĩa tráng fibronectin Năm ngày sau, thấy xuất hiện các cụm tế bào tương tự như nghiên cứu của Asahara, cụm tế bào này được Hill gọi là CFU-Hill [9] Theo quy trình nuôi cấy của Hill, các tế bào này xuất hiện sớm, khả năng tăng sinh thấp và được gọi là tế bào EPC sớm (Early-Endothelial Progenitor Cell: e-EPC)

Hình 1.9 Các phương pháp nuôi cấy EPC từ tế bào đơn nhân trong máu người [10] A: cụm tế bào CFU-Hill hình thành sau 5 ngày từ các tế bào không bám dính; B: tế bào CAC là các tế bào bám dính sau 4-7 ngày nuôi cấy, CAC không hình thành cụm tế bào;

C: cụm tế bào EPC xuất hiện sau 6-21 ngày từ các tế bào bám dính

Tuy nhiên, cụm tế bào phân lập theo phương pháp của Asahara và Hill được chứng minh không phải là EPC thực sự mà là các tế bào có nguồn gốc từ dòng tạo máu Trong đó, tế bào hình thon dài là các đại thực bào, biểu hiện marker của tế bào nội mô nhưng không

có khả năng hình thành cấu trúc mạch máu khi được cấy in vivo, còn tế bào hình tròn là

những tế bào tiền thân dòng tuỷ, tế bào đơn nhân và tế bào lympho T Ngoài ra, còn có một quần thể tế bào có khả năng tăng sinh sớm khác gọi là tế bào tạo mạch tuần hoàn (circulating angiogenic cells – CAC) Các tế bào CAC tham gia vào sự hình thành mạch máu mới bằng cách tiết ra các cytokine tạo mạch, có vai trò điều hoà mạch máu ở trạng thái cân bằng, kích thích tạo mạch mới ở vị trí có vết thương và mô thiếu máu cục bộ

Khác với quy trình của Hill, năm 2004, Ingram và cộng sự nuôi cấy tế bào đơn nhân trên giếng có tráng collagen Sau 24 giờ, tiến hành loại bỏ các tế bào không bám dính Sau 2-3 tuần nuôi cấy, thấy xuất hiện một lớp tế bào có dạng viên sỏi (cobblestone) Các tế bào này biểu hiện các marker của tế bào nội mô như: vascular endothelial grow factor receptor-2 (VEGFR-2), von-Willebrand Factor (vWF), endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS), Vascular Endothelial-cadherin (VE-cadherin), khả năng tạo thành cấu trúc dạng

mạch máu in vitro và không biểu hiện kháng nguyên của tế bào dòng tạo máu là CD45

(kháng nguyên đặc trưng của tế bào bạch cầu), CD14 (kháng nguyên đặc trưng của tế bào đơn nhân, đại thực bào) Những tế bào dạng sỏi được gọi là tế bào hình thành nội mô (endothelial colony forming cell - ECFC) Một số nghiên cứu cho thấy ECFC có nguồn gốc từ tuỷ xương, tuần hoàn trong máu ngoại vi và có khả năng sinh trưởng thành tế bào nội mô [13]

Như vậy, quá trình nuôi cấy hình thành các loại tế bào có thời điểm xuất hiện và kiểu hình khác nhau Trong đó, ECFC là tế bào hình thành nội mô xuất hiện muộn sau khi nuôi cấy từ 1 – 3 tuần, mang đặc điểm hình thái và đặc tính của EPC và được coi là EPC thực sự

1.6.2 Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của tế bào EPC

Tế bào EPC mang những kháng nguyên của tế bào nội mô như: VEGFR-2, CD31, CD146, VE-caherin, vWF, eNOS, E-selectin Trong đó, CD34 là kháng nguyên của tế bào có nguồn gốc trung bì như máu, nội mô, nguyên bào sợi, tế bào biểu mô và được coi

là kháng nguyên chính để phân lập tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic Stem Cell - HSC); VEGFR-2 là thụ thể cho yếu tố phát triển nội mô có trên tế bào có nguồn gốc từ lớp trung

bì như máu, nội mô và mô cơ tim Hai kháng nguyên này được Asahara dùng để xác định

tế bào EPC khi nuôi cấy tế bào đơn nhân CD34+VEGFR-2+ trên đĩa tráng fibronectin và thấy xuất hiện các tế bào có đặc điểm của tế bào nội mô

Hình 1.10 Con đường phát triển của tế bào máu – nội mô và sự biểu hiện CD45

Trong phôi thai, tế bào tiền thân trung phôi bì CD45 - hình thành nên tế bào tiền thân nội

mô CD45 - , nguyên bào mạch máu và tế bào nội mô tạo máu (hemogenic endothelial cell: HEC) Nguyên bào mạch máu CD45 - có thể biệt hoá thành tế bào nội mô CD45 - hoặc tế bào gốc và tiền thân tạo máu (HSC/HPC) CD45 + HSC/HPC có thể phát triển thành tế

bào giống nội mô (like-endothelial) CD45 + CD133 -

Năm 2000, Peichev và cộng sự phân lập EPC dựa trên CD133 CD133 là một polypeptide xuyên màng có trên tế bào gốc tạo máu và các tế bào tiền thân trong tuỷ xương và máu ngoại vi Những tế bào CD34+CD133+ sẽ mang kiểu hình chưa trưởng thành và sự biểu hiện CD133 giảm khi tế bào trưởng thành Nghiên cứu cũng cho thấy các tế bào nội mô tĩnh mạch cuống rốn (đại diện của tế bào nội mô trưởng thành) biểu hiện CD34 và VEGFR-2 nhưng âm tính với CD133 Do đó, Peichev cho rằng, kiểu hình của EPC là CD34+CD133+VEGFR-2+ Tuy nhiên, các tế bào biểu hiện ba loại kháng nguyên trên đều đồng biểu hiện CD45 (là marker của tế bào máu) Do đó, Hirschi cho rằng các tế bào CD133+ là tế bào có nguồn gốc từ tế bào dòng tạo máu và không có khả năng hình thành

tế bào nội mô

Năm 2007, Timmermans và cộng sự khảo sát quần thể tế bào CD133+ và nhận thấy rằng hầu hết các tế bào CD133+ đều biểu hiện CD45 Điều này giống với nghiên cứu của Hirschi Do đó, Timmermans khẳng định tế bào EPC có kiểu hình âm tính với CD133 và CD45 [37]

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Động mạch vành heo

Tim heo được thu trực tiếp từ lò mổ, bảo quản trong PBS lạnh và vận chuyển ngay lập tức về phòng thí nghiệm Trong điều kiện phòng thí nghiệm, tiến hành thu nhận động mạch vành

Tiêu chuẩn chọn mẫu:

- Heo thu mạch máu là heo khỏe mạnh, có trọng lượng 80 – 100 kg

- Tim heo phải được thu trực tế từ cơ thể sống và bảo quản ngay trong PBS lạnh Không thu tim heo đã cắt sẵn từ trước

2.1.2 Máu cuống rốn người

Máu cuống rốn được lấy từ cuống rốn trẻ mới sinh tại bệnh viện Máu được thu vào túi máu có chất chống đông citrate phosphate destrose (CPD), bảo quản 4oC và vận chuyển ngay lập tức về phòng thí nghiệm

Tiêu chuẩn chọn mẫu:

- Trẻ sinh ra không dị tật bẩm sinh, được mang thai đủ tháng và cuống rốn bình thường

- Mẫu máu phải không có cục máu đông, âm tính với các xét nghiệm HIV, HbsAg, HCV, giang mai

- Máu sau khi lấy được chuyển về phòng thí nghiệm và thao tác trong vòng 2 giờ

2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Bảng 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô

Nguyên tắc: EPC là một quần thể nhỏ của tế bào đơn nhân trong máu Phương pháp ly

tâm đẳng tỷ trọng bằng Histopaque (tỷ trọng 1,077 g/ml) sẽ giúp phân lập quần thể tế bào đơn nhân (có chứa EPC) Sau khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp (môi trường EGM-2 bổ sung 10% FBS), tế bào EPC sẽ phát triển

Phương pháp: Thực hiện theo quy trình sau:

- Hút 5 ml máu cuống rốn cho vào ống ly tâm chứa 5ml Histopaque và ly tâm 3000 vòng/phút trong 25 phút

Xác định tế bào EPC

Cấy tế bào EPC lên giá thể mạch máu vô bào

Tạo giá thể mạch máu vô bào

Xây dựng đường cong tăng trưởng

Đánh giá sự tăng trưởng của tế bào trên giá thể mạch máu vô bào Máu cuống rốn

Thu nhận và nuôi cấy tế bào EPC từ máu

- Sau khi ly tâm, dùng pipette pasteur vô trùng hút lớp tế bào đơn nhân cho vào ống ly tâm 15ml Bổ sung đủ 10ml dung dịch HBSS, trộn đều nhẹ và đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó, đổ bỏ dịch nổi ở trên một cách nhẹ nhàng Lặp lại bước này 2 lần

- Bổ sung môi trường EGM-2 và tạo huyền phù tế bào

- Cho huyền phù tế bào vào đĩa nuôi cấy 6 giếng đã phủ với collagen, mỗi giếng 2ml Mật độ tế bào khoảng 106 tế bào/giếng

- Đặt đĩa trong tủ nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2

- Thay môi trường hằng ngày trong tuần đầu tiên Sau đó thay cách 2 ngày/lần

2.3.2 Phương pháp tách tế bào EPC khỏi đĩa nuôi cấy và cấy chuyền

Nguyên tắc: Trypsin là một enzyme thủy phân protein Khi tiếp xúc với tế bào bám dính,

trypsin sẽ phá vỡ protein liên kết giữa tế bào với bề mặt đĩa, làm cho tế bào bị tách khỏi

bề mặt Tế bào tách ra được cấy sang đĩa nuôi cấy mới giúp gia tăng số lượng tế bào hiện

có

Phương pháp:

- Hút bỏ môi trường trong đĩa nuôi cấy

- Tráng lại đĩa bằng PBS vô trùng

- Bổ sung trypsin/EDTA 0,25% và đặt đĩa trong tủ nuôi tế bào trong 5 phút

- Tế bào tách ra được hút cho vào ống và ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút

- Hút bỏ dịch nổi, bổ sung môi trường nuôi cấy mới và tạo huyền phù

- Hút huyền phù tế bào cho vào đĩa nuôi cấy mới

2.3.3 Phương pháp đánh giá tế bào EPC

2.3.3.1 Phương pháp nhuộm Giemsa

Nguyên tắc: Đối với tế bào, thuốc nhuộm Giemsa giúp nhận biết hình dạng tế bào, nhân

và tế bào chất Trong thí nghiệm này, tế bào nuôi cấy từ tĩnh mạch cuống rốn được nhuộm với Giemsa để xác định hình dạng và độ đồng nhất tế bào

Phương pháp:

- Bề mặt đĩa nuôi tế bào được rửa bằng PBS 2 lần trước khi cố định bằng formalin trong 10 phút

- Loại bỏ formalin khỏi đĩa nuôi và thay thế bằng 1ml dung dịch Giemsa trong 5 phút

- Bổ sung 4 ml nước cất vào đĩa và để yên 10 phút

- Thuốc nhuộm bị đổ bỏ và được rửa bằng nước cất 3 lần trước khi quan sát với kính hiển vi

2.3.3.2 Phương pháp flow cytometry

Nguyên tắc: Flow cytometry là kỹ thuật dùng trong việc đếm tế bào, phân loại và phát

hiện marker đặc trưng Tế bào đánh dấu huỳnh quang được chảy qua một cảm biến ánh sáng Khi đi qua chùm tia laser, tuỳ theo đặc điểm kích thước và thành phần của tế bào

mà ánh sáng bị tán xạ hoặc bị hấp thụ và phát ra một ánh sáng huỳnh quang, hiện tượng này sẽ được ghi nhận bởi đầu dò ánh sáng Trong thí nghiệm này, tế bào EPC được đánh giá sự biểu hiện của các marker: CD14, CD45, CD105

2.3.3.3 Phương pháp RT-PCR

Nguyên tắc: Phương pháp RT-PCR được sử dụng để đánh giá sự biểu hiện mRNA của

các gen mục tiêu Trong thí nghiệm này, sự biểu hiện mRNA của các gen CD146,

Ve-cadherin, Thrombomodulin, von-Willebrand Factor, KDR được xác định bằng phương pháp RT-PCR

Phương pháp: Gởi mẫu thực hiện thí nghiệm tại công ty Nam Khoa

Thu nhận RNA:

- Cặn tế bào được thu và hoà tan trong 0,75ml trizol Sau đó bổ sung thêm 0,2ml chloroform và cho vào effendorf, đem vortex mạnh

- Ly tâm effendorf 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

- Tiếp theo, hút 400 µl dịch nổi cho vào effendorf sạch và thêm vào 400 µl isopropanol

- Sau 10 phút, tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC để thu nhận RNA

- Loại bỏ dịch nổi và bổ sung thêm 1ml ethanol 75%, vortex, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC

- Đổ bỏ ethanol và để cặn khô tự nhiên trong 5-10 phút

- Bổ sung nước DEPC trong 10-15 phút rồi cho vào đá lạnh

Phản ứng RT-PCR:

Bảng2.2 Thông tin các cặp mồi được sử dụng trong phương pháp RT-PCR

Các thành phần phản ứng RT-PCR được trộn theo công thức sau:

Nguyên tắc: Hai thành phần cơ bản của mô là tế bào và khung nâng đỡ ngoại bào

(ECM) Phương pháp tạo giá thể mạch máu vô bào từ mô tự nhiên là phương pháp loại

bỏ thành phần tế bào của mô ban đầu Hiện nay, nhiều phương pháp khử tế bào được sử dụng bởi các nhà khoa học trên thế giới Trong đó, phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất là phương pháp hóa học Trong nghiên cứu này, hiệu quả loại tế bào của các chất SDS, NaOH, nước cất, Triton X100 được khảo sát riêng lẻ nhằm xác định phương pháp nhằm hướng tới tạo phương pháp loại tế bào kết hợp hiệu quả

- Trong điều kiện vô trùng, động mạch vành được tách khỏi tim heo bằng kéo, dao mổ

và được những mảng mỡ, cơ tim bao xung quanh

- Sau đó, thu nhận toàn bộ động mạch vành và bảo quản trong PBS ở 4oC cho tới khi thí nghiệm

2.3.4.2 Phương pháp xử lý mạch vành với NaOH 0,5M trong 6 giờ

- Mạch vành sau khi tách thành công được tiến hành xử lý bằng NaOH 0,5M trong 6 giờ

- Mạch sau khi xử lý được cố định trong dung dịch formalin 4% có chứa đệm phosphate

- Sau đó, mẫu được đánh giá mô học HE, Trichrome, Van Giesion để đánh giá hiệu quả khử tế bào

2.3.4.3 Phương pháp xử lý mạch vành với H 2 O trong 24 giờ

- Mạch vành sau khi tách thành công được tiến hành xử lý bằng nước cất trong 24 giờ

- Mạch sau khi xử lý được cố định trong dung dịch formalin 4% có chứa đệm phosphate

- Sau đó, mẫu được đánh giá mô học HE, Trichrome, Van Giesion để đánh giá hiệu quả khử tế bào

2.3.4.4 Phương pháp xử lý mạch vành với Triton X100 0,1% trong 24

2.3.4.5 Phương pháp xử lý mạch vành với SDS 0,5% trong 24 giờ

- Mạch vành sau khi tách thành công được tiến hành xử lý bằng SDS 0,5% trong 24 giờ

- Mạch sau khi xử lý được cố định trong dung dịch formalin 4% có chứa đệm phosphate

- Sau đó, mẫu được đánh giá mô học HE, Trichrome, Van Giesion để đánh giá hiệu quả khử tế bào

2.3.4.6 Phương pháp xử lý mạch vành với SDS 0,5% 24 giờ và nước cất

2.3.4.7 Phương pháp xử lý mạch vành với SDS 0,5% 24 giờ và nước cất

2.3.5 Phương pháp đánh giá hiệu quả khử tế bào

2.3.5.1 Phương pháp nhuộm Hemtoxylin và Eosin (HE)

Nguyên tắc: Hiệu quả loại tế bào được đánh giá bằng phương pháp nhuộm mô học

Hematoxylin và Eosin Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào có màu đỏ đậm và khung nâng đỡ ngoại bào có màu hồng nhạt Thông qua hình dạng và sự biểu hiện màu sắc, lượng tế bào trong khung nâng đỡ được xử lý có thể xác định rõ ràng

- Ngâm mẫu trong thuốc nhuộm Hematoxylin trong 5 phút Rửa mẫu nhuộm dưới vòi nước cho đến khi nước chảy ra không màu Nhúng mẫu vào dung dịch acid alcohol 2-

3 lần cho đến khi lát cắt có màu hồng Rửa mẫu bằng nước vòi khoảng 3-5 phút Nhúng mẫu 3-5 lần trong dung dịch NH4OH Rửa mẫu bằng nước vòi 3-5 lần Nhuộm với thuốc nhuộm Eosin Y trong 1 phút

2.3.5.2 Phương pháp nhuộm Trichrome

Nguyên tắc: Collagen là thành phần protein chính trong ECM mạch máu Do đó, hiệu

quả bảo tồn ECM thường được đánh giá thông qua hiệu quả bảo tồn collagen Lượng collagen còn lại trong khung nâng đỡ ngoại bào có thể được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trichrome Khi nhuộm bằng phương pháp này, collagen có màu xanh đặc trưng

Phương pháp:

- Mẫu được loại nước trong cồn 100o, 95o và 70o

- Ngâm mẫu trong dung dịch Bouin 1 giờ tại 56oC Rửa mẫu bằng nước vòi cho đến khi hết màu vàng

- Nhuộm mẫu trong dung dịch hematoxylin trong 10 phút

- Nhuộm mẫu trong dung dịch acid fuchsin 10-15 phút

- Chuyển mẫu vào dung dịch aniline blue trong 5-10 phút

2.3.5.3 Phương pháp nhuộm Verhoeff-Van Gieson (nhuộm elastin) Nguyên tắc: Elastin có ái lực mạnh với phức hợp sắt - hematoxylin có trong thuốc

nhuộm Sau khi nhuộm, sợi elastin và nhân được nhuộm màu đen hoặc nâu, các yếu tố

- Sau đó mẫu được nhuộm với thuốc nhuộm Verhoeff-Van Gieson tại phòng xét

nghiệm giải phẫu bệnh của Bệnh viện Nhi Đồng I

2.3.6 Phương pháp khử trùng mạch máu vô bào

- Mẫu sau thời gian ngâm được rửa với PBS vô trùng và kiểm tra mức độ nhiễm

2.3.6.3 Phương pháp đánh giá hiệu quả khử trùng

Nguyên tắc:

Thạch LB là môi trường giàu dinh dưỡng cho sự phát triển của vi khuẩn, nấm

Phương pháp:

- Mẫu sau khi khử trùng được rửa với PBS vô trùng 3 lần

- Cắt mỗi đoạn mạch máu thành 10 mảnh nhỏ 0,5 x 0,5 cm2 Đặt các mảnh lên đĩa agar với mặt ngoài (5 mảnh) hoặc mặt trong (5 mảnh) áp lên bề mặt đĩa

- Quan sát sự hình thành khuẩn lạc

2.3.7 Phương pháp đánh giá độc tính của giá thể mạch máu vô bào

Nguyên tắc:

Độc tính tế bào của mạch máu vô bào được đánh giá theo tiêu chuẩn ISO 10993-5

Phương pháp:

- Mạch máu vô bào đã khử trùng được cắt thành những mảnh nhỏ 3x3 mm2

- Nguyên bào sợi được cấy lên đĩa 4 giếng với mật độ 4x104 tế bào/giếng

- Sau 1 ngày, hút hết môi trường cũ, thay môi trường mới

- Đặt mảnh giá thể mạch máu lên bề mặt tế bào

- Sau 1 ngày, gắp bỏ mảnh mạch máu vô bào

- Tiến hành quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược, nhuộm Giemsa để xác định hình dạng tế bào, đánh giá MTT để xác định mức độ độc tính tế bào

2.3.8 Phương pháp cấy tế bào EPC lên giá thể mạch máu vô bào

Nguyên tắc:

Tế bào EPC được cấy lên ddVG bằng phương pháp tiêm trực tiếp và nuôi trên giá thể mạch máu vô bào bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh Huyền phù tế bào được đưa trực tiếp lên giá thể mạch máu vô bào bằng pipette Sau đó, đưa toàn bộ cấu trúc này vào đĩa nuôi cấy, bổ sung môi trường và đặt trong tủ nuôi tế bào ở 37oC, 5% CO2

- Dùng pipette hút 20 µl huyền phù tế bào cho vào lòng mạch của ddVG Sau năm phút

bổ sung thêm 200 µl môi trường Sau 30 phút, bổ sung thêm 1ml môi trường vào giếng và đưa đĩa vào tủ nuôi tế bào Phương pháp thực hiện nhẹ nhàng để không ảnh hưởng đến tế bào trên khung nâng đỡ

- Thay môi trường sau ngày đầu tiên Sau đó, thay 2 ngày/lần