Nghiên cứu đa dạng di truyền liên quan đến một số tính trạng chọn lọc một số giống khoai mỳ manihot esculenta crantz ở đông nam bộ việt nam dựa vào chỉ thị SSR và một số gen đích qui định tính t

Trong nghiên cứu này, 44 giống đại diện trong tập đoàn khoai mỳ của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng lộc được chọn lọc để đánh giá đa di truyền về tính trạng năng suất củ tươi và tỷ

1

BÁO CÁO TỔNG KẾT

Tên đề tài

- Tên tiếng Việt: Nghiên cứu đa dạng di truyền liên quan đến một số tính trạng chọn lọc

một số giống khoai mỳ Manihot esculenta Crantz ở Đông Nam Bộ Việt Nam dựa vào chỉ

thị SSR và một số gen đích qui định tính trạng trên

- Tên tiếng Anh: Research on genetic diversity related to some interest characters of

cassava (Manihot esculenta Crantz) in South-eatern Vietnam based on DNA markers of

SSR and targeted genes

1

MỤC LỤC

TÓM TẮT 3

ABSTRACT 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 7

LỜI CẢM ƠN 8

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai mỳ ở việt nam 8

1.1.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống khoai mỳ theo phương pháp truyền thống 9

1.1.2.1 Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất tinh bột cao, khả năng thích ứng rộng 9

1.1.2.2 Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất tinh bột cao, đa dụng và thời gian sinh trưởng ngắn, thích ứng rộng với các vùng sinh thái 10

1.1.2.3 Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất cao, sạch bệnh phục vụ cho chế biến nhiên liệu sinh học (nlsh) 10

1.1.3 Hướng chính cải tiến giống khoai mỳ việt nam hiện nay 10

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống khoai mỳ trên thế giới 11

1.3 Hạn chế về trình độ khoa học, công nghệ và tính cấp thiết của đề tài 13

1.4 Tiếp cận hướng giải quyết để thực hiện mục tiêu của đề tài 13

1.4.1 Ứng dụng công nghệ sinh học 13

1.4.2 Sử dụng nguồn vật liệu có sẵn trong nước 14

1.5 Tính mới của đề tài 14

1.6 Kết luận tổng quan 14

Chương 2 - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Nội dung 15

2.1.1 Tác định các cặp mồi SSR và thiết kế các cặp mồi trên gen đích 15

2.1.2 Tiến hành các phản ứng PCR dựa trên các cặp mồi đã thiết kế và DNA tổng số của các giống khoai mỳ đã tuyển chọn 15

2.1.3 Phân tích đa dạng di truyền các giống khoai mỳ 15

2.2 Nguyên liệu 15

2.3 Phương pháp 16

2.3.1 Xác định các cặp mồi SSR và thiết kết các cặp mồi trên gen đích 16

2.3.2 Tách dna tổng số 16

2.3.3 Tiến hành phản ứng PCR sử dụng DNA tổng số và các cặp mồi đã thiết kế 16

2.3.4 Giải trình tự các sản phẩm 16

2.3.5 Phân tích đa dạng di truyền 16

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Xác định các cặp mồi SSR và thiết các cặp mồi trên gen đích 17

3.1.1 Xác định các cặp mồi SSR 17

3.1.2 Thiết kế các cặp mồi trên gen đích 18

3.2 Thực hiện phản ứng PCR giữa các cặp mồi đã thiết kế với DNA tổng số 19

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số của đại diện 44 dòng khoai mỳ 19

3.2.2 Phản ứng PCR 19

3.2.2.1 Phản ứng PCR với các cặp mồi SSR 19

3.2.2.2 Nhân bản bằng PCR với các cặp mồi trên gen đích 23

3.3 Phân tích đa dạng di truyền 23

3.3.1 Phân tích đa đạng di truyền dựa vào chỉ thị SSR 23

2

3.3.1.1 Phân tích dựa vào mức tương đồng di truyền 23

3.3.1.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào các chỉ số đa dạng di truyền trong quần thể 25

3.3.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đa hình trình tự dna của gen qui định tỷ lệ tinh bột của khoai mỳ 28

3.3.2.1 Giải trình tự các sản phẩm PCR của đại diện 14 giống khoai mỳ 28

3.3.2.2 Phân tích dựa vào mức tương đồng di truyền 29

3.3.2.2 Phân tích dựa vào các hệ số di truyền 29

3.3.2.3 Phân tích dựa vào các đột biến điểm 30

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 35

3

TÓM TẮT (Tối đa một trang A4)

Ở Việt Nam, khoai mỳ là một trong số những cây lương thực quan trọng sau lúa và ngô Để nâng cao năng suất và chất lượng của khoai mỳ, đánh giá đa dạng di truyền về các tính trạng chọn lọc của các quần thể làm nguyên liệu lai tạo phải được ưu tiên hàng đầu Trong nghiên cứu này, 44 giống đại diện trong tập đoàn khoai mỳ của Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng lộc được chọn lọc để đánh giá đa di truyền về tính trạng năng suất củ tươi và tỷ lệ tinh bột sử dụng 19 chỉ thị SSR trên 5 loci liên quan đến 2 tính trạng trên Kết quả phân tích tương đồng di truyền và các hệ số

di truyền cho thấy quần thể khoai mỳ nghiên cứu có đa dạng di truyền cao 44 đại diện khoai mỳ phân thành 3 nhóm trên biểu đồ UPGMA với mức tương đồng di truyền thấp (30-38%) và khoảng cách di truyền tin cậy (0,11-0,38) Mỗi locus có trung bình từ 3 đến 4 allen; các allen có tần suất

xuất hiện cao (fa = 0,17-0,53) để hình thành 6-9 kiểu gen/locus Đa dạng di truyền cao trong quần thể còn được phản ánh từ giá trị tin cậy về thống kê của các hệ số di truyền khác như Shannon (I = 1,03-1,35), mức độ dị hợp tử (Ho = 0,27-0,93) Hàm lượng thông tin đa hình cao (PIC = 0,63-0,73)

cho thấy 5 cặp mồi SSR trong nghiên cứu này có thể sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền liên quan đến tính trạng chọn lọc của khoai mỳ Kết quả phân tích bằng cây chủng loại Neighbor

Joining, dựa vào hệ số di truyền và dựa vào đột biến điểm dọc đoạn đích 612bp trên gen GBSS1qui

định tỷ lệ tinh bột và năng suất tinh bột của các giống khoai mỳ nghiên cứu đều phản ánh đa dạng

di truyền cao và phù hợp với kết quả đánh giá bằng chỉ thị SSR 14 giống khoai mỳ được phân thành 3 nhánh tách biệt trên cây chủng loại theo tỷ lệ tinh bột và năng suất củ tươi trung bình đặc trưng của từng nhóm Các nhóm có khoảng cách di truyền tin cậy (53-99%) và khác biệt di truyền

tin cậy (K st= 0,74, χ2=28; P = 0,036) với số lượng alen (A = 9) và đa dạng alen cao (A d = 0,91) Mỗi nhóm khoai mỳ có 2-5 alen đặc trưng.Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để đánh giá đa dạng di truyền về tính trạng trạng năng suất củ tươi và tỷ lệ tinh bột của các quần thể trong tập đoàn lưu giữ nguồn gen khoai mỳ cho bảo tốn và lai tạo

4

ABSTRACT (Tối đa một trang A4)

In Vietnam, cassava is in the third importance crop after rice and maize To improve productivity, evaluation of genetic diversity on selection characters of cassava population for materials of hybridization should be one of priorities In this research, 44 varieties in a cassava germplasm were selectively collected for evaluation of genetic diversity on fresh root yield and starch content traits using 19 SSR markers on 5 loci Analyses of similarity and genetic indice revealed a high diversity

in the studied population 44 varieties clustered into 3 main groups based on UPGMA dendrogram with the low genetic similarity (30-38%) and the significantly genetic distance (0,11-0,38) On

average, there were 3-4 allens/locus High frequency of the allens (fa = 0,17-0,53) resulted in

genotypic diversity (6-9 genotypes/locus) High genetic diversity of the population was also

indicated with statistical significances of Shannon index (I = 1,03-1,35) and observed heterozygosity level (Ho = 0,27-0,93) High polymorphic information content (PIC = 0,63-0,73)

indicated that 5 SSR primer pairs in this study were applicable for study on genetic diversity of selective characters of cassava populations Results from analyses of Neighbor Joining tree, genetic

indice and typical mutated points of 612bp-fragments on GBSS1 gene, which codes for starch

content and fresh root yield of the studied varieties all revealed high genetic diversity and were in agreement to previous analyses with SSR markers All 14 varieties were separated into 3 clusters

on Neighbor Joining tree, in accordance with the variation in tube-starch percentage and fresh root yield between groups All three groups were divergent with significance of genetic distance (53-

99% of bootstrap values) and genetic differentiation (K st= 0,74, χ2=28; P = 0.036) with high number of allen (A=9) and high allenic diversity (A d=0,91) The varieties of each group had 2-5 specific allens The results in this study may provide fundamental scientific evidence for a regular evaluation on genetic diversity of fresh root yield and starch content characters in cassava germplasm for conservation and breeding

5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

DMC Hàm lượng chất khô (Dry Matter Content)

fa Tần suất xuất hiện (Frequency of the Allens)

FRY Năng suất củ tươi (Fresh Root Yield)

FAO TC lương nông liên hợp quốc(Food and Agriculture Organization)

I Hệ số Shannon (Shannon index)

IAS Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

Kg kilo gram

GBSS Granule Bound Starch Synthase

Gst Khác biệt di truyền giữa các nhóm

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphic Information Content

QTL Quantitative Trait Locus

RAPD Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA RiboNucleic Acid

SSR Simple Sequence Repeats

StC Tỷ lệ tinh bột (Starch Sontent)

Taq Thermus aquaticus

Ta Nhiệt độ bắt cặp mồi

UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic average

6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2: Diễn biến tăng sản lượng khoai mỳ Việt Nam (1000 tấn) phân theo vùng từ năm 2000

đến năm 2010 9

Bảng 1.3 Tổng hợp các chỉ thị phân tử đã được công bố liên quan đến di truyền cây khoai mỳ 11 Bảng 2.1 Bốn mươi bốn dòng khoai mỳ sử dụng cho nghiên cứu 15

Bảng 3.1 Kết quả xác định 11 cặp mồi SSR liên quan đến năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột của khoai mỳ 17

Bảng 3.2 Kết quả thiết kế 2 cặp mồi trên gen GBSSI và II liên quan đến năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột của khoai mỳ 18

Bảng 3.3 Thông tin về 5 loci của đại diện 44 dòng khoai mỳ 23

Bảng 3.4 12 giống khoai mỳ được chọn trong 44 giống (Bảng 1) để tách DNA tổng số và nhân bản bằng PCR với cặp mồi GBSS1 thiết kế trên gen GBSSI Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Giá trị trung bình về năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột của các nhóm khoai mỳ .24

Bảng 3.6 Mức tương đồng di truyền và khoảng các di truyền giữa các nhóm khoai mỳ 25

Bảng 3.7a: Tần suất xuất hiện các alen và mức thông tin đa hình của các loci 26

Bảng 3.7b Tần suất xuất hiện kiểu gen ở mỗi locus 26

Bảng 3.8 Giá trị một số hệ số di truyền của các loci trong quần thể khoai mỳ 27

7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng sắn thí nghiệm 1µl/giếng 1-44 thứ tự các dòng sắn như ghi ở Bảng 1 M: thang chuẩn DNA (100bp-GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas) 19 Hình 3.2 Kết quả nhân bản bằng PCR giữa DNA tổng số của 44 dòng khoai mỳ và 5 cặp mồi SSR 1-44 thứ tự các mẫu khoai mỳ (Bảng 3.1) SSRY32, NS80, SSRY41, SSRY45 và SSRY161: tên các cặp mồi SSR (Bảng 3.2) 22 Hình 3.3 Kết quả nhân bản đoạn trên gen GBSSI bằng PCR giữa cặp mồi GBSS1 và DNA tổng

số của 12 mẫu khoai mỳ 1- 12 đoạn trên gen GBSS1 của các mẫu khoai mỳ theo thứ tự ở Bảng 3.3 M: DNA ladder 23 Hình 3.4 Biểu đồ hình cây về mức tương đồng di truyền của 44 giống khoai mỳ phân tích dựa vào đa hình chiều dài các sản phẩm SSR-PCR 24 Hình 3.5 Kiểm tra kết quả dòng hóa bằng PCR các đoạn 600bp trên gen GBSSI của đại diện 12 giống khoai mỳ 1- 12 các sản phẩm PCR theo thứ tự ở Hình 3.3 được dòng hóa trong plasmid N: đối chứng âm M: DNA ladder……… 29

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí bởi Đại học Quốc gia TP HCM trong đề tài mã số

C2074-28-07

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai mỳ ở Việt Nam

Khoai mỳ được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới từ 30 độ vĩ Bắc đến 30 độ vĩ Nam với độ cao giới hạn trong khoảng 2.000 m Tinh bột khoai mỳ là một thành phần quan trọng trong chế độ ăn của hơn một tỷ người trên thế giới (http://www.ttta-tapioca.org/web2/index.php) Ngoài

ra khoai mỳ còn là nguyên liệu để chế biến ra nhiều loại sản phẩm phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp như: dược, dệt, hoá dầu thực phẩm, chăn nuôi… Giá trị của cây khoai mỳ đang được nâng cao nhờ những ứng dụng ngày càng rộng rãi của chúng Trong ngành dược, tinh bột khoai mỳ được

sử dụng làm tá dược trong sản xuất thuốc, biến tính tinh bột khoai mỳ cho nhiều sản phẩm có giá trị như đường gluccose, fructose… để làm dịch truyền hoặc các phụ gia tá dược cho các sản phẩm khác Tinh bột khoai mỳ còn được dùng để làm hồ vải, đặc biệt là thành phần không thể thiếu được trong ngành công nghiệp do nguyên liệu này có độ dẻo cao và không bị tan trong nước Từ tinh bột trong khoai mỳ mà cây trồng này có thể được sử dụng để chế biến khoảng 300 loại sản phẩm khác nhau Lá khoai mỳ dùng để chế biến thức ăn gia súc hoặc dùng để nuôi tằm Thân khoai mỳ dùng

để chế biến cồn, làm giấy, ván ép, chất đốt hoặc làm giá thể trồng nấm… Một trong những ứng dụng nổi bật nhất hiện nay và trong tương lai của khoai mỳ là sản xuất xăng sinh học để dùng cho các động cơ đốt trong, không gây ô nhiễm môi trường Ở nước ta những năm gần đây, cây khoai

mỳ thực sự đã trở thành cây hàng hoá góp phần rất lớn trong chương trình xoá đói giảm nghèo cho nông dân ở vùng cao, vùng sâu, vùng xa

Diện tích trồng khoai mỳ ở nước ta đã tăng từ 237.600 ha (năm 2000) lên 496.200 ha (năm 2010) Đạt được thành tựu trên là nhờ tác động của nhiều yếu tố, trong đó nhập nội, chọn lọc và nhân giống khoai mỳ mới cho sản suất là những yếu tố chính Các giống khoai mỳ mới chủ yếu là KM94, KM140, KM98-5, KM98-7, SM937-26, đã được công nhận giống quốc gia Các giống này hiện đang được trồng trên 420.000 ha mỗi năm và thực sự đã mang lại bội thu năng suất cho nhiều vùng trồng khoai mỳ, tăng hiệu quả kinh tế và tăng sức cạnh tranh trong chế biến khoai mỳ xuất khẩu (Nguyễn Hữu Hỷ và Trần Công Khanh, 2010) Đông Nam Bộ, Tây Nguyên và Duyên hải Nam Trung Bộ là các vùng trồng khoai mỳ chính với trên 73,79% tổng sản lượng khoai mỳ và 65,44 % tổng diện tích khoai mỳ của cả nước (Bảng 1.1 và 1.2)

Bảng 1.1 Diễn biến diện tích khoai mỳ Việt Nam (1000 ha) phân theo vùng từ năm 2000 đến năm

2010

Vùng sinh thái 2000 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Đồng bằng Sông Hồng 9,9 8,5 8,4 8,8 7,9 7,5 7,3 Vùng núi trung du phía

Bắc 82,1 89,4 93,7 96,5 110,0 101,4 104,6 Vùng ven biển Trung Bộ 83,8 133,0 140,3 151,2 168,3 157,2 105,0 Tây Nguyên 38,0 89,4 125,9 129,9 149,1 137,7 133,2 Đông Nam Bộ 16,1 98,8 100,9 102,9 111,4 97,7 90,1 Đồng bằng Sông Cửu

Nguồn: http://www.gso.gov.vn/default.aspx

Bảng 1.2: Diễn biến tăng sản lượng khoai mỳ Việt Nam (1000 tấn) phân theo vùng từ năm 2000

đến năm 2010

Vùng sinh thái 2000 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Đồng bằng Sông Hồng 87,9 92,4 93,7 102,9 101,3 112,4 108,8 Vùng núi trung du phía Bắc 678,5 986,8 1070,8 1132,3 1309,9 1220,1 1260,1 Vùng ven biển Trung Bộ 645,9 1855,9 2167,6 2359,9 2736,3 2561,0 2607,6 Tây Nguyên 351,5 1446,6 2058,8 2090,4 2371,7 2148,8 2179,5 Đông Nam Bộ 154,3 2270,5 2327,4 2434,4 2684,8 2401,4 2283,3 Đồng bằng Sông Cửu Long 68,2 64,0 64,2 72,9 105,9 86,8 82,3

Tổng cộng 1986,3 6716,2 7782,5 8192,8 9309,9 8530,5 8521,6

Khoai mỳ Việt Nam đã trở thành cây nguyên nhiên liệu sinh học có lợi thế cạnh tranh cao và

là một mặt hàng xuất khẩu có khối lượng và kim ngạch xuất khẩu lớn Khoai mỳ là cây tinh bột quang hợp theo chu trình C4 có hiệu suất thu hồi cồn cao Trung bình 6 kg khoai mỳ củ tươi chế biến được một lít cồn 99,6% để làm xăng pha cồn E5 hoặc E10 hiệu quả kinh tế lớn và có lợi cho môi trường Khoai mỳ dễ trồng, đầu tư thấp có khối lượng lớn, làm được nhiều sản phẩm có giá trị Thị trường xuất khẩu sản phẩm khoai mỳ thuận lợi, có nhu cầu lớn và ổn định Chính phủ Việt Nam đã phê duyệt “Chương trình phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn đến năm 2025” Ba nhà máy chế biến cồn sinh học hiện đang xây dựng tại Phú Thọ, Quảng Ngãi và Bình Phước với công suất mỗi nhà máy 100 triệu lít /năm, đã đưa vào hoạt động từ năm 2012 Từ đó đã tạo thêm những cơ hội mới để phát triển sản xuất khoai mỳ, thu hút đầu tư, tăng việc làm và thu nhập cho hộ nông dân và góp phần hiện đại hóa nông nghiệp nông thôn Đối với sản xuất tinh bột khoai mỳ, hiện nay toàn quốc đã có trên 60 nhà máy đã đi vào hoạt động với tổng công suất khoảng 3,2-4,8 triệu tấn củ tươi/năm, sản xuất 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột khoai mỳ/năm Trong đó trên 70% cho xuất khẩu và gần 30% cho tiêu thụ trong nước (Nguyen Van Bo và Hoang Kim, 2008) Nhờ thành tựu trên, Việt Nam là nước đứng thứ hai sau Thái Lan về xuất khẩu sản phẩm khoai mỳ sang thị trường chính là Trung Quốc Tổng khối lượng xuất khẩu năm 2009 của nước ta đạt khoảng 3-4 triệu tấn khoai mỳ lát khô và 300-350 nghìn tấn tinh bột khoai mỳ Giá khoai mỳ ngày càng tăng, năm 2008 mỳ lát khô là 135 USD/ tấn và cuối 2009 là 180 – 195 USD/ tấn

1.1.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống khoai mỳ theo phương pháp truyền thống

1.1.2.1 Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất tinh bột cao, khả năng thích ứng rộng

Tại Việt Nam những nghiên cứu đối với cây khoai mỳ tập trung chủ yếu vào việc chọn tạo các giống có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn thông qua các phương pháp lai tạo truyền thống Một trong những yếu tố chính góp phần hiệu quả trong việc nâng cao năng suất và sản lượng khoai mỳ là sự tăng cường nghiên cứu, nhập nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ mới, trong việc chọn tạo và nhân giống lai (Hoàng Kim, 2003) Về cơ sở nghiên cứu chọn tạo giống khoai mỳ, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam (IAS) đóng vai trò chính, các cơ sơ khác như Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Nông- Lâm nghiệp Thủ Đức, Đại học Nông- Lâm Huế và các sở Nông nghiệp của các tỉnh trồng nhiều khoai mỳ phối hợp nghiên cứu phát triển Trong chiến lược hợp tác, từ năm 1991, IAS đã hợp tác chặt chẽ với CIAT và Mạng lưới Nghiên cứu khoai mỳ châu Á để đẩy mạnh hoạt động nghiên cứu và phát triển khoai mỳ Mục tiêu của công tác cải thiện giống khoai mỳ là tập trung chọn tạo những giống có năng suất củ tươi và hàm lương tinh bột cao, phục vụ cho chế biến công nghiệp Kết qủa đã chọn tạo và giới thiệu cho sản xuất được bộ giống khoai mỳ mới gồm: KM60; KM94; KM95; SM937 - 26; KM98-1, KM140 và KM98- 5 Những giống mới có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, khả năng thích ứng rộng đã thực sự mang lại năng suất và lợi nhuận cao cho nông dân trên diện rộng, góp phần xóa đói giảm nghèo, tăng sức cạnh tranh của tinh bột khoai mỳ xuất khẩu và các sản phẩm khác chế biến từ khoai mỳ

Tuy KM94 là giống điển hình cho năng suất cao có rất nhiều ưu điểm, nhưng vẫn còn bộc lộ một

số nhược điểm sau:

1 Thuộc nhóm khoai mỳ đắng, không thích hợp tiêu thụ tươi cho người và chăn nuôi

2 Thời gian sinh trưởng hơi dài, phải thu hoạch sau 10 tháng sau trồng mới đạt được năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao

3 Cây cao, thân cong ở phần gốc, gây khó khăn trong việc canh tác, thu gom và bảo quản giống

4 Giống khoai mỳ KM94 hiện nay đang nhiễm bệnh chổi rồng (Phytoplasma) tại một số tỉnh như: Đồng Nai, Quảng Ngãi, Kon Tum và Quảng Trị

1.1.2.2 Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất tinh bột cao, đa dụng và thời gian sinh trưởng ngắn, thích ứng rộng với các vùng sinh thái

Mục tiêu chính để chọn tạo giống khoai mỳ theo hướng này là: chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, thời gian sinh trưởng ngắn, vừa thích hợp chế biến công nghiệp, vừa có thể làm thức ăn cho người và thức ăn gia súc và nhằm bổ sung, thay thế cho giống khoai mỳ chủ lực KM94 đang có xu hướng bị thoái hóa Từ đó có thể giúp nông dân và các doanh nghiệp chế biến khoai mỳ rải vụ thu hoạch và chế biến, đáp ứng nhu cầu chế biến tinh bột và

có thể làm lương thực Các giống khoai mỳ mới (KM98- 1, KM98- 5 và KM140) đã được lai tạo

và tuyển chọn trong giai đoạn từ năm 1995 đến nay Công tác chọn tạo giống khoai mỳ ở giai đoạn này thực sự đã có nhiều đóng góp cho sản xuất trong việc nâng cao năng suất, sản lượng khoai mỳ

và đa dạng hóa về cơ cấu giống khoai mỳ trong sản xuất

1.1.2.3 Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất cao, sạch bệnh phục vụ cho chế biến nhiên liệu sinh học (NLSH)

Ðể bảo đảm an ninh năng lượng, bảo vệ môi trường và thúc đẩy phát triển kinh tế nông thôn tại các vùng sâu, vùng xa, ngày 20-11-2007, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt "Ðề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn 2025" Ðề án bao gồm hoạt động của các cơ quan chính phủ và doanh nghiệp nhằm xây dựng lộ trình sử dụng nhiên liệu sinh học (NLSH) của Việt Nam, khung pháp lý, các chính sách khuyến khích sản xuất, xây dựng mô hình thử nghiệm sản xuất

và phân phối NLSH cũng như các dự án đầu tư của Chính phủ để phát triển NLSH đến năm 2025 Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam là đơn vị kinh tế hàng đầu hoạt động trong lĩnh vực năng lượng đã xây dựng "Kế hoạch và Chương trình triển khai các dự án NLSH của Việt Nam", triển khai Ðề án phát triển NLSH của Chính phủ, thúc đẩy quá trình sản xuất và phân phối NLSH tại thị trường Việt Nam Trong đó, khoai mỳ là nguyên liệu chính cho công nghệ chế biến NLSH Những tiến bộ về công tác chọn tạo giống khoai mỳ ở Việt Nam đã khẳng định ý nghĩa quan trọng của phương pháp tuyển chọn giống khoai mỳ thích hợp theo vùng khí hậu, đất đai và tạo nguồn vật liệu khởi đầu phong phú để tạo nên sự đột phá về năng suất

1.1.3 Hướng chính cải tiến giống khoai mỳ Việt Nam hiện nay

1) Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất củ tươi và tỷ lệ tinh bột cao, khả năng thích ứng rộng, thích hợp với chế biến công nghiệp

2) Chọn tạo giống khoai mỳ có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, đa dụng, thời gian sinh trưởng ngắn, thích hợp các vùng sinh thái

3) Chọn tạo giống khoai mỳ năng suất cao phục vụ cho công nghệ chế biến NLSH

Ba mục tiêu trên đều đặt nền tảng trên vườn lai hữu tính Các giống khoai mỳ được chọn lọc

để luôn có vật liệu mới và khả thi cao cho chọn lọc ra giống ngắn ngày, nhằm rải vụ và tăng vụ mà không tăng diện tích, cải tạo đất dễ dàng, để sản xuất khoai mỳ bền vững trong tương lai Để đạt được các mục tiêu này, việc kết hợp giữa chọn tạo khoai mỳ theo phương pháp truyền thống với ứng dụng công nghệ sinh học (CNSH) được coi là giải pháp đột phá nhằm góp phần xây dựng nền nông nghiệp nước ta phát triển toàn diện theo hướng hiện đại Tuy nhiên, trên thực tế, những nghiên cứu áp dụng CNSH hiện đại đối với việc cải tạo giống khoai mỳ ở Việt Nam còn rất hạn chế Mặc dù các phương pháp lai tạo truyền thống đã đem lại những kết quả khả quan đối với việc phát triển các giống khoai mỳ mới, nhưng các phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế như thời gian chọn lọc kéo dài Năng suất (17tấn/ha/năm) thấp hơn nhiều so với một số nước trên thế giới, như Ấn độ, tới 35-40 tấn/ha/năm Có được thành tựu này là do nhiều nước trên thế giới đã áp dụng

kỹ thuật chọn tạo giống kết hợp giữa phương pháp truyền thống với ứng dụng các chỉ thị phân tử Các dòng có ưu thế về các tính trạng chọn lọc được thu thập, trồng và duy trì ở các vùng thực địa giữ nguồn gen Các chỉ thị phân tử sau đó được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền trong loài, giữa các dòng chọn lọc và giữa các thế hệ Các kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền, nhất là đa dạng di truyền được đánh giá dựa vào các chỉ thị phân tử liên quan đến các tính trạng chọn lọc như năng suất củ tươi, hàm lượng tinh bột, khả năng kháng bệnh… là cơ sở để chọn tạo khoai mỳ thành công theo các tính trạng mong muốn

Ở nước ta đã có một số công trình chọn tạo giống có kết hợp giữa phương pháp truyền thống với nghiên cứu đa dạng di truyền các giống tuyển chọn ứng dụng kỹ thuật phân tử Điển hình là đề tài “Nghiên cứu ứng dụng Công nghệ chọn tạo giống và quy trình canh tác của Hàn Quốc vào phát triển sản xuất sắn bền vững cho vùng trồng sắn trọng điểm các tỉnh phía Nam” trong năm 2012 Một trong những kết quả nổi bật của đề tài là tuyển chọn được 14 giống sắn triển vọng có năng suất

củ tươi từ 35-40 tấn/ha và thành lập được tập đoàn gồm 244 giống Đồng thời đa dạng di truyền của các giống khoai mỳ triển vọng được đánh giá ứng dụng các chỉ thị SSR (Nguyễn Hữu Hỷ và CS., 2013) Tuy nhiên đề tài mới chỉ tập trung nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền các giống có năng suất củ tươi cao Trên thực tế, với khoai mỳ, ngoài chỉ tiêu trên, tỷ lệ tinh bột đóng vai trò tiên quyết Vì vậy, kết hợp cùng nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền cả 2 tính trạng năng suất củ tươi và tỷ lệ tinh bột làm cơ sở để chọn tạo ra các giống khoai mì vừa có năng suất củ tươi và tỷ lệ tinh bột cao đóng vai trò quan trọng và cấp thiết

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống khoai mỳ trên thế giới

Chỉ thị DNA tồn tại trong mọi kiểu gen và biểu hiện độc lập với kiểu hình Vì thế chỉ thị phân tử là một công cụ hữu hiệu nghiên cứu di truyền, cho phép các nhà di truyền học và các nhà tạo giống định vị và theo dõi các tính trạng điều khiển bằng đa gen và đơn gen Các chỉ thị này thường i) ổn định suốt trong quá trình phát triển, ii) có khả năng phát hiện ở tất cả các mô, iii) không bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường

Dựa vào chỉ thị phân tử, việc xác định đa dạng nguồn di truyền của thực vật đã trở nên đơn giản và có độ tin cậy cao Trước khi phát hiện các chỉ thị phân tử, các nhà tạo giống thực vật phải dựa vào các biểu hiện kiểu hình như các chỉ thị để xác định giống mang các tính trạng chọn lọc (Zacarias và CS., 2004) Các phương pháp này vẫn được dùng cho đến nay ở khắp các châu lục, đặc biệt ở những vùng chưa có khả năng dùng chỉ thị phân tử Việc ứng dụng kỹ thuật hiện đại cho phép nghiên cứu đa dạng về DNA trong quần thể các giống có sẵn, xác định cấu trúc đa dạng di truyền trong các bộ giống từ các tập đoàn khác nhau, góp phần bảo tồn số lượng tối đa nguồn gen Chỉ thị phân tử còn được sử dụng để xác định cấu trúc của tập đoàn và đặc điểm phân tử của các tính trạng nông học Kết quả đánh giá có tính quyết định trong phát triển chiến lược quản lý tập đoàn và nâng cao hiểu quả chọn lọc các vật liệu ban đầu cho chọn tạo giống Việc đánh giá đúng góp phần xác định được các tổ hợp mới có khoảng cách di truyền lớn, tạo ra đa dạng quần thể chọn lọc tiếp theo và có thể được dùng để chọn lọc, gắn kết các gen mong muốn có trong quần thể sưu tập vào trong giống sản xuất (Smith, 1995; Mohammadi và Prasanna, 2003) Ngoài ra chỉ thị phân

tử còn đóng góp đáng kể trong xác định mức bội thể và phát triển bản đồ di truyền (Fregene và CS., 1997; Lokko và CS., 2005)

Ứng dụng kỹ thuật phân tử trong chọn lọc đã tạo ra nhiều giống khoai mỳ có năng suất cao, thích nghi nhiều vùng sinh thái Trong đó, việc sử dụng chỉ thị phân tử đã rút ngắn thời gian chọn tạo giống khoai mỳ Bản đồ di truyền đầu tiên ở cây khoai mỳ được thiết lập dựa trên các chỉ thị phân tử RFLP (Fregene và CS., 1997) Bản đồ này đã trở thành một công cụ hữu hiệu để phân tích những tính trạng chọn lọc quan trọng của khoai mỳ (Jorge và CS., 2000; Akano và CS., 2002; Okogbenin và Fregene, 2003) Từ bản đồ di truyền, trên 500 chỉ thị SSR đã được phân tích (Okogbenin và CS., 2006; Sraphet và CS., 2011; Hình 1) Ngoài ra, bản đồ di truyền còn có ý nghĩa quan trọng đối với các nghiên cứu di truyền và xác định các QTL liên kết với những tính trạng chọn lọc quan trọng như năng suất củ tươi, tỷ lệ tinh bột, khả năng kháng bệnh… của cây khoai

mỳ

Bảng 1.3 Tổng hợp một số chỉ thị phân tử đã được công bố liên quan đến di truyền cây khoai mỳ

TT Chỉ thị phân tử Gen quy định tính trạng

5 SSR Cấu trúc cây và năng suất Okogbenin & Fregene, 2003

8 RAPD, RFLP, SSR Các tính trạng ở củ Okogbenin và Fregene, 2003

Hình 1.1 Bản đồ di truyền của cây khoai mỳ dựa trên chỉ thị SSR và EST-SSR, bao gồm 510 ví trị SSR phủ trên 1.420,3 cM của 8/23 nhóm liên kết (theo Okogbenin và CS., 2006)

Các chỉ thị phân tử DNA đã và đang được dùng trong nghiên cứu, chọn tạo giống khoai mỳ bao gồm random amplified polymorphic DNA (RAPDs), restriction fragment length polymorphisms (RFLPs), amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) và simple sequence repeats (SSRs) (Bảng 1.3) Trong số đó, các chỉ thị SSR đang được xem như chỉ thị hàng đầu để đánh giá đa dạng di truyền SSR bao gồm các đoạn lặp lại của các trình tự nucleotide ngắn (1-6 bp) Thường gặp nhất là các đoạn có các nucleotide lăp lại 2, 3 và 4 và những đoạn này được phân bố trong toàn bộ genome SSR là các chỉ thị đồng trội, có mặt ở cả cá thể đồng hợp tử

và di hợp tử SSR thể hiện mức độ đa dạng cao và ổn định ở các tế bào dinh dưỡng và được di

truyền như là tính trạng đồng trội theo quy luật mendel (Fregene và CS., 2003) Hiện nay, các vị trí SSR đã và đang được dùng rộng rãi và hiệu quả trong việc xác định các chỉ thị DNA liên quan đến các tính trạng nông học quan trọng của nhiều cây cho củ như Yam, taro và khoai tây Chỉ thị SSR lần đầu tiên được dùng cho khoai mỳ là nghiên cứu mối quan hệ giữa các dòng chọn lọc và họ hàng hoang dã (Ocampo và CS., 1995) và sau đó là 96 giống địa phương thu thập từ các vùng khác nhau của Tanzania CIAT (International Centre for Tropical Agriculture) đã ứng dụng SSR trong việc phát hiện các dòng lặp lại trong quần thể nguồn giống gốc (Chavarriaga-Aguirre và CS., 1998) và phân tích đa dạng của các quần thể tự nhiên của khoai mỳ (Carvalho và Schaal, 2001)

Từ khi toàn bộ hệ gen của khoai mỳ đã được giải trình tự đến nay, trên 800 cặp mồi SSR đã được phân tích, công bố (International Centre for Tropical Agriculture) và ứng dụng rộng rãi theo nhiều nghiên cứu khác nhau nhằm chọn tạo ra các giống khoai mỳ có ưu thế cao về tính trạng chọn lọc Trong số đó, nhiều chỉ thị SSR và gen đích liên quan đến đa dạng di truyền cũng như các tính trạng kinh tế quan trọng của khoai mỳ đã được nghiên cứu và công bố:

- Các chỉ thị SSR điển hình và được ứng dụng rộng rãi:

+ 161 cặp mồi SSR đã được sử dụng để nghiên cứu thành công đa dạng di truyền của các quần thể khoai mỳ ở Puerto Rio (Montero-Rojas và CS., 2011), ở Ấn Độ (Raghu và CS., 2007), và ở nhiều nước khác trên thế giới (Kizito và CS., 2007; Fregene và CS., 2003)

- Năm cặp mồi mồi SSR liên quan đến khả năng cho năng suất củ tươi của một số tập đoàn khoai

mỳ ở Trung Quốc (Chen và CS., 2012)

- Sáu cặp mồi mồi SSR liên quan đến hàm lượng chất khô (DMC) của một số tập đoàn khoai mỳ ở Châu Phi (Kizito và CS., 2007)

- Một số gen đích liên quan đến năng suất, chất lượng của khoai mỳ: gen GBSS (granule-bound starch synthase) 1 và 2 điều khiển quá trình sinh tổng hợp tinh bột của khoai mỳ (Salehuzzaman và

CS 1993; Munyikwa và CS., 1997; Opabode và CS., 2011; Aiemnaka và CS., 2012)

Kết quả của các công trình nghiên cứu trên thế giới được phân tích ở trên cho thấy việc nghiên cứu đa dạng di truyền của dựa vào chỉ thị SSR và chỉ thị trên gen đích qui định một số tính trạng chọn lọc của khoai mỳ ở nước ta hoàn toàn có thể thực hiện được

1.3 Hạn chế về trình độ khoa học, công nghệ và tính cấp thiết của đề tài

Đông Nam Bộ là một trong những vùng sản xuất khoai mỳ hàng hóa quan trọng ở Việt Nam Năm 2009 diện tích trồng khoai mỳ là 115 ngàn ha, với sản lượng 2,7 triệu tấn Năng suất các giống khoai mỳ đến năm 2010 chỉ đạt 17 tấn/ha, thấp hơn nhiều so thế giới (35-40 tấn/ha) Ngoài

ra, việc trồng đơn giống khoai mỳ ở nước ta là nguy cơ giảm đa dạng di truyền Hiện nay ở miền Đông Nam Bộ giống khoai mỳ được trồng phổ biến là KM94 Để việc trồng khoai mỳ mang lại hiệu quả kinh tế và nâng cao đời sống cho người nông dân các tỉnh Đông Nam Bộ, vấn đề đặt ra hàng đầu là phải nghiên cứu chọn tạo và xác định được bộ giống khoai mỳ có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao Để giải quyết được vấn đề này, nhiệm vụ tiền khởi là phải xác định được

đa dạng di truyền với khoảng cách di truyền tin cậy giữa các giống khoai mỳ tuyển chọn, làm cơ sở

để chọn lọc và lai tạo ra các giống khoai mỳ mang các tính trạng mong muốn

Ở Việt Nam, các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử đối với khoai mỳ còn rất hạn chế Khoai mỳ là cây trồng có thời gian thu hoạch kéo dài tới 1 năm, để chọn tạo và phát triển khoai mỳ

ra sản xuất mất thời gian khá lâu Chính vì vậy việc ứng dụng các kỹ thuật phân tử nhằm rút ngắn thời gian trong công tác chọn tạo giống và cải biến di truyền các giống khoai mỳ theo hướng có lợi cho con người là rất cần thiết Do vậy, yêu cầu trước tiên đặt ra là cần có các nghiên cứu phân tích

đa dạng di truyền đối với các tập đoàn giống khoai mỳ sẵn có ở Việt Nam Trên cơ sở đó, các giống khoai mỳ ưu việt và các nguồn gen quý được khai thác và ứng dụng trong các nghiên cứu cải tạo giống khoai mỳ bằng công nghệ sinh học phân tử

1.4 Tiếp cận hướng giải quyết để thực hiện mục tiêu của đề tài

1.4.1 Ứng dụng công nghệ sinh học

Các bộ sưu tập về giống là nguồn vật liệu cho chọn tạo và nhân giống Các giống khoai mỳ địa phương, đột biến thực nghiệm và lai tạo truyền thống là nguồn vật liệu di truyền quí để chọn lọc các tính trạng mong muốn như chống chịu stress, chịu bệnh và có chất lượng hàm lượng tinh

bột cao Việc đánh giá chính xác các vật liệu có sẵn là hết sức cần thiết để xác định những khác biệt di truyền và thúc đẩy việc tham gia của nguồn vật liệu cây khoai mỳ một cách có hiệu quả trong các chương trình chọn tạo giống khoai mỳ Việc dùng các đặc điểm hình thái và đặc tính nông học để phân loại các giống mới chỉ mang tính đặc trưng, phản ánh đa hình thấp

Trong những năm qua, chỉ có một phần rất nhỏ nguồn gen có sẵn trong nước được sử dụng trong các chương trình lai tạo giống khoai mỳ, vì thế một trong những mục tiêu của đề tài là xác định đa dạng di truyền giữa các giống khoai mỳ địa phương thu thập từ các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau và được lưu trữ trên cơ sở dựa vào các chỉ thị phân tử (SSR và các gen đích) Kết quả của đề tài là cơ sở để đánh giá hiệu quả ứng dụng của các chỉ thị phân tử trong việc cải thiện giống cũng như quản lý nguồn tài nguyên di truyền giống khoai mỳ ở Việt Nam

Các chỉ thị phân tử SSR và gen đích có khả năng phân nhóm với khoảng cách di truyền tin cậy các tính trạng cần quan tâm nghiên cứu ở cây khoai mỳ, như các tính trạng về năng suất củ tươi, tỷ lệ chất khô trong đó có tỷ lệ tinh bột Vì vậy, đề tài sẽ tiếp cận thông tin nhằm sử dụng những chỉ thị phân tử đã được ứng dụng hiệu quả trên thế giới để lựa chọn các dòng, giống khoai

mỳ có những đặc tính mong muốn, và sàng lọc nhanh các dòng, giống mang những tính trạng mong đợi trong tập đoàn nguồn gen khoai mỳ hiện có Kết quả của đề tài là cơ sở đảm bảo lựa chọn chắc chắn các giống khoai mì tiềm năng làm vật liệu lai tạo có định hướng và khảo nghiệm giống

1.4.2 Sử dụng nguồn vật liệu có sẵn trong nước

Kế thừa tập đoàn quỹ gen hiện có của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển cây có củ, Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc và các kết quả từ các đề tài liên quan từ cấp

bộ, cấp cơ sở, đề tài nhánh, đề tài hợp tác với các địa phương, để tiếp tục khai thác và tạo nguồn vật liệu Hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc có 244 mẫu giống đã nghiên cứu, phân loại sơ bộ theo các nhóm nguồn gen dựa vào các chỉ tiêu kiểu hình về thời gian sinh trưởng, năng suất củ tươi, tỷ lệ tinh bột, dạng cây, khả năng kháng bệnh

1.5 Tính mới của đề tài

Ở nước ta, đề tài là tiên phong trong nghiên cứu về đa dạng di truyền của các giống khoai mỳ

đã được tuyển chọn ứng dụng chỉ thị phân tử Kết quả nghiên cứu là cơ sở để chọn tạo nhân vô tính cũng như xác định những cặp lai hữu tính cho năng suất và chất lượng cao về các tính trạng chọn lọc Ngoài ra, thành công của đề tài có thể rút ngắn được thời gian chọn giống và giảm giá thành trong công tác chọn tạo giống khoai mỳ cho năng suất củ tươi, tỷ lệ tinh bột cao phù hợp với sản xuất tinh bột và nhiên liệu sinh học từ khoai mỳ ở nước ta

1.6 Kết luận tổng quan

Từ những luận giải trên, việc thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền liên quan đến

một số tính trạng chọn lọc một số giống khoai mỳ Manihot esculenta Crantz ở Đông nam bộ Việt

Nam dựa vào chỉ thị SSR và một số gen đích qui định tính trạng trên” là hết sức cấp thiết Kết quả thực hiện của đề tài nhằm:

- Đạt được mục tiêu chính trong định hướng phát triển của ngành nông nghiệp đối với cây có củ như khoai mỳ: Minh chứng được đa dạng và khoảng cách di truyền của các giống khoai mỳ đã được tuyển chọn làm cơ sở để chọn lọc và lai tạo ra giống khoai mỳ cho năng so năng suất củ tươi

và hàm lượng tinh bột cao

- Nâng cao trình độ thực nghiệm về ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu cây có củ đối với tổ chức chủ trì: xây dựng được về lý thuyết và thực hiện được về thực nghiệm nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA đối với cây có củ nói chung và khoai mỳ nói riêng Đây là hệ thống dữ liệu cần thiết cho công tác nghiên cứu, đào tạo về công nghệ cao ở các trường đại học và các cơ sở đào tạo

- Tăng lợi ích về xã hội: phát triển khoai mỳ là một trong những thành phần kinh tế trong nông nghiệp để tạo thêm việc làm và tăng thu nhập, từ đó hưởng ứng chương trình xóa đói giảm nghèo của chính phủ ta Xác định được đa dạng di truyền, các chỉ thị phân tử như mục tiêu của đề tài đề ra

sẽ nâng cao năng suất cả về chất và lượng của khoai mỳ, từ đó giảm giá thành sản xuất và tăng lãi suất cho người nông dân, doanh nghiệp và lợi ích xã hội

Chương 2 - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nội dung

2.1.1 Xác định các cặp mồi SSR và thiết kế các cặp mồi trên gen đích

- Xác định các cặp mồi SSR liên quan đến các tính trạng năng suất củ tươi từ các cặp mồi SSR đã được CIAT công bố

- Thiết kế các cặp mồi trên gen đích GBSS1 và 2 liên quan đến các tính trạng về hàm lượng tinh bột của khoai mỳ từ các công trình khoa học đã công bố

2.1.2 Tiến hành các phản ứng PCR dựa trên các cặp mồi đã thiết kế và DNA tổng số của các giống khoai mỳ đã tuyển chọn

- Tách chiết DNA tổng số của 44 dòng khoai mỳ triển vọng

- Thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi SSR và mồi nhân gen đích và DNA tổng số của các mẫu

- Điện di các sản phẩm PCR trên gel metaphor agarose 3,5% đối với SSR và agarose 1% đối với các gen đích

2.1.3 Phân tích đa dạng di truyền các giống khoai mỳ

- Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đa hình chiều dài sản phẩm PCR

- Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đa hình trình tự nucleotide của sản phẩm PCR

2.2 Nguyên liệu

Lá non của 44 giống khoai mỳ do tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc cung cấp Các mẫu đã được chọn lọc từ 244 giống trong tập đoàn khoai mỳ có triển vọng được Trung tâm chăm sóc và lưu giữ

Lá non được thu hoạch và sấy khô ngay lập tức ở 55oC trong 4-6 h Lá khô được giữ trong túi ni-lông có chứa Silicagen đến khi tách DNA tổng số

Giá trị trung bình về năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột của 44 giống khoai mỳ do Trung tâm cung cấp Các giống thí nghiệm phân làm 3 nhóm, nhóm 1 gồm các giống có hàm lượng tinh bột >20%; nhóm 2: có hàm lượng tinh bột 10-20% Hai nhóm có năng suất củ tươi giao động

từ 5-30kg/5 gốc Riêng nhóm 3, cả 2 chỉ tiêu chọn lọc thấp nhất: hàm lượng tinh bột <10% và năng suất củ tươi <5kg/ 5 gốc để làm đối chứng Từ kết quả phân nhóm dựa vào chỉ thị SSR, mỗi nhóm chọn 2-6 mẫu để nhân bản đoạn gen đích liên quan đến hàm lượng tinh bột trong khoai mỳ Đại diện của 44 giống khoai mỳ trong nghiên cứu này được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Bốn mươi bốn dòng khoai mỳ sử dụng cho nghiên cứu

NS củ tươi (tấn/

ha)

Tỷ lệ tinh bột (%)

Số TT Ký hiệu các dòng

Chiều cao cây (cm)

NS củ tươi (tấn/ha)

Tỷ lệ tinh bột (%)

2.3.1 Xác định các cặp mồi SSR và thiết kết các cặp mồi trên gen đích

- Thiết kết các cặp mồi SSR: Đến nay chưa có công bố nào về các cặp mồi SSR chỉ liên quan đến

tỷ lệ tinh bột (StC) của khoai mỳ Trong khi chỉ tiêu này có thể liên quan đến hàm lượng chất khô (DMC), trong đó có tỷ lệ tinh bột của khoai mỳ Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi thu thập

và phân tích các chỉ thị SSR được thiết kế từ hệ gen của khoai mỳ và đã được CIAT và các nghiên cứu trên thế giới đã công bố liên quan đến năng suất củ tươi và hàm lượng chất khô trong đó có tỷ

lệ tinh bột của khoai mỳ

- Thiết kế các cặp mồi trên gen đích: Tham khảo, tìm hiểu các gen đích liên quan đến chất lượng tinh bột trong khoai mỳ Thu thập trình tự các gen đích liên quan đến tính trạng chọn lọc từ ngân hàng gen sử dụng chương trình BLAST; thiết kế các cặp mồi sử dụng phần mềm DNAMAN4.10 Xác định tính chất của các cặp mồi như nhiệt độ bắt cặp (Ta) sử dụng phần mềm DNAMAN4.10

2.3.2 Tách DNA tổng số

DNA tổng số được tách theo phương pháp CTAB của Dellaporta và CS (1987) Quy trình chi tiết được tóm tắt như sau:

- 200 mg lá được thu vào trong các ống eppendorf và nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn

- Bổ sung 0,75 ml dung dịch đệm tách DNA tổng số đã được đung nóng ở 65°C có thành phần như sau: 2% CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide), 2% PVP (Polyvinyl pyrrolidone), 100mM Tris HCl pH7.0, 1M NaCl, 30mM EDTA, 2% mercapto Ethanol

- Ủ trong 65°C trong vòng 10 phút, sau đó ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở điều kiện 4°C

- Thu phần dịch nổi sang ống eppendorf mới và bổ sung 2 lần thể tích Ethanol 70%

- Tủa DNA qua đêm ở điều kiện -20°C

- Thu DNA bằng ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút ở điều kiện 4C

- Kiểm tra chất lượng DNA thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

2.3.3 Tiến hành phản ứng PCR sử dụng DNA tổng số và các cặp mồi đã thiết kế

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR GeneAmp Thermal Cyclers của công ty Applied Biosystems Về điều kiện phản ứng PCR, mỗi phản ứng (50 μl) chứa 100ng DNA tổng số,

20 mM Tris HCl có pH 8,4, 50 mM KCl, 0,2 mM/loại dNTP, 0,2 μ M/mồi, 3 mM MgCl 2 và 1,25 đơn vị enzyme (Taq DNA Polymerase) Chu trình PCR gồm 1 chu kỳ biến tính ban đầu 96oC trong

5 phút, tiếp tục 30 chu kỳ: 95oC – 0,5 phút, 48-55oC – 1 phút, 72oC – 1,5 phút; kết thúc chu kỳ cuối ở 72oC trong 10 phút Sản phẩm PCR được giữa ở 4oC cho đến khi điện di

Các sản phẩm SSR-PCR được chạy trên gel polyacryl amide Sản phẩm PCR chạy từ gen đích chạy trên gel-agarose 1% Kết quả điện di được ghi lại ở dạng tệp ảnh (.JPG)

2.3.4 Giải trình tự các sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được nhân bản giữa DNA tổng số với các cặp mồi được thiết kế trên gen đích liên quan đến tính trạng về hàm lượng tinh bột trong củ khoai mỳ được gắn vào vector pTZ57R/T (Fermentas, Đức), nhân dòng trong vi khuẩn Plasmid DNA được tách bằng kít GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit và được giải trình tự nucleotit từ cả 2 đầu tại Công ty Macrogen (Korea) sử dụng cặp mồi M13

2.3.5 Phân tích đa dạng di truyền

- Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đa hình chiều dài sản phẩm SSR-PCR

Đa hình chiều dài các sản phẩm PCR của từng cặp mồi và DNA tổng số của các giống khoai

mỳ là các alen hay chỉ thị SSR khác nhau Các chỉ thị được xác định bằng mã (1) và (0) khi chúng

có hay không xuất hiện ở từng mẫu Đa dạng di truyền giữa các giống dựa vào số liệu hình thái và SSR được đánh giá bằng hệ số tương đồng DICE (d = 1-D; d là khoảng cách di truyền; D là mức tương đồng, DICE) trên đồ thị UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic average)

sử dụng phần mềm NTSYS-pc 2.10v Từ số liệu SSR, POPGENE1.32 được sử dụng để xác định tần suất xuất hiện của các alen (f), mức thông tin đa hình của từng cặp mồi (PIC), mức độ dị hợp tử (Ho) của các giống Trong đó PIC=1-∑pi2, i là tần suất xuất hiện của alen i tại locus p Ho=1-

∑Gi2, i tần suất alen tại kiểu gen G

- Phân tích đa dạng di truyền dựa vào đa hình trình tự DNA

Phần mềm Mega3.1 và DnaSp 4.10.9 được sử dụng để phân tích trình tự DNA của các mẫu Kết quả phân tích của hai phần mềm sẽ phản ánh đa dạng di truyền trong mỗi quần thể và khác biệt

di truyền giữa các quần thể Trong đó, đa dạng di truyền trong quần thể dựa vào đa dạng về haplotype (Hd) hoặc allen (A) và khoảng cách di truyền (d) giữa các cá thể hoặc nhóm cá thể Khác biệt di truyền giữa các nhóm (Kst) dựa vào so sánh đa dạng allen trung bình và khoảng cách

di truyền (d) giữa các quần thể Trong Mega 3.1, cây phát sinh chủng loại phản ánh nguồn gốc và khoảng cách di truyền trong quần thể và giữa các quần thể (giá trị bootstrap) được tạo ra theo phương pháp Neighbour-Joining trong chương trình Consense Tất cả số liệu được tính toán bằng Bootstrap với 1000 nhắc lại trên chương trình Seqboot Tiếp theo chương trình DNADIST sẽ ước lượng sự sai khác giữa các trình tự dựa vào những đột biến điểm ở cả 3 vị trí mã hoá và không mã hoá của mỗi bộ ba mã hoá theo mô hình Kimura 2-parameter distance

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định các cặp mồi SSR và thiết các cặp mồi trên gen đích

3.1.1 Xác định các cặp mồi SSR

Đến nay đã có khoảng 500 cặp mồi SSR được CIAT công bố (Mba và CS., 2001) Trong đó

đa số các cặp mồi được chứng minh có số lượng alen/locus từ 2-8 và có giá trị ứng dụng cao để nghiên cứu đa dạng di truyền của các quần thể khoai mỳ trên thế giới (ví dụ Fregene và CS., 2003; Raghu và CS., 2007; Montero-Rojas và CS., 2011) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào công bố về các cặp mồi SSR liên quan đến tỷ lệ tinh bột trong khoai mỳ (Starch Content, StC), ngoại trừ 4 trong 6 cặp mồi liên quan đến hàm lượng chất khô (Dry Matter Content, DMC) trong danh sách

500 trình tự cặp đã được CIAT công bố về (Kizito và CS , 2007) Theo các tác giả này chỉ tiêu về DMC có thể bao gồm tỷ lệ tinh bột của khoai mỳ Tương tự, gần đây Chen et al (2012) mới đưa ra

5 cặp mồi SSR liên quan chặt chẽ với năng suất củ tươi (Fresh Root Yield, FRY) Một số thông tin

về 11 cặp mồi SSR liên quan đến năng suất củ tươi và hàm lượng chất khô của khoai mỳ chọn lọc trong 500 cặp mồi của CIAT được liệt kê ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả xác định 11 cặp mồi SSR liên quan đến năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột của khoai mỳ

1 SSRY28 TTGACATGAGTGATAT

TTTCTTGAG

GCTGCGTGCAAAACTAAAAT

7 SSRY32 CAAATTTGCAACAATA

GAGAACA

TCCACAAAGTCGTCCATTACA

8 SSRY41 TATCACAATCGAAACC

GACG

TTTTCCAACAATCTGATACTCGT

9 SSRY45 TGAAACTGTTTGCAAA

TTACGA

TCCAGTTCACATGTAGTTGGCT

3.1.2 Thiết kế các cặp mồi trên gen đích

Đến nay, trình tự DNA của 2 gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp tinh bột (StC) của khoai mỳ là granule-bound starch synthase 1 và 2 (GBSS1 và 2) đã được phân lập và giải trình tự Trong 2 gen, toàn bộ cDNA của GBSS1 (Salehuzzaman và CS., 1993) một phần (731bp) với 4 đoạn mã hóa (exon) và 3 đoạn không mã hóa (intron) (Opabode và CS., 2011) và toàn bộ gen (Aiemnaka và CS., 2012) đã được giải trình tự Trong khi, các trình tự gen GBSSII của khoai mỳ đăng tải GenBank chỉ gồm cDNA Đối với thực vật, trình tự đoạn intron được biết thường có đa hình cao hơn exon Vì vậy đã có nhiều công trình nghiên cứu tiến hành thiết kế các cặp mồi trên vùng exon ở 2 đầu để nhân bản 1 hay nhiều đoạn intron nhằm xác định chỉ thị phân tử liên quan đến alpha-amylase ở lúa mạch (Erkkilä, 1999), nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống lúa nước (Wang et al 2005), hoặc nghiên cứu đa dạng di truyền và phân biệt các dòng thuần và cây lai của một số loài thuộc chi liễu, Salix (Trung và CS., 2008; Triest và CS., 2009)… Hơn thế, đã có nghiên cứu chứng minh rằng intron đóng vai trò trung gian trong biểu hiện của gen (Rose, 2008) Trong nghiên cứu này, cặp mồi GBSS_F1 và GBSS_R1 được thiết kế ở 2 exon1 và 3 của gen GBSS1 để nhân bản đoạn trên gen này bao gồm 1 phần của 2 vùng exon và toàn bộ intron 1 và 2 giữa chúng Tương tự như GBSS1, nhiều trình tự DNA của GBSS2 cũng đã được công bố trên GenBank với các mã truy cập: HM038440, HM046981, EF667961… Tuy nhiên, các trình tự của GBSS2 đều là cDNA, chưa có trình tự nào phân tích cấu trúc gồm cả exon và intron của toàn bộ hoặc một phần của gen Vì vậy các cặp mồi GBSS_F2 và GBSS_R2 được thiết kế bằng cách so sánh một trình tự GBSS2 của khoai mỳ với cùng gen từ một số loài cây trồng khác Kết quả thiết

kế các cặp mồi trên gen đích GBSS1 và GBSS2 được trình bày ở Bảng 3.2 (chi tiết về thiết kế các cặp mồi ở Phụ lục 1) Các cặp mồi có chiều dài 21-23bp; nhiệt độ bắt cặp trong các phản ứng PCR 52oC và chiều dài sản phẩm PCR

Bảng 3.2 Kết quả thiết kế 2 cặp mồi trên gen GBSSI và II liên quan đến hàm lượng tinh bột của khoai mỳ

STT Gen Mồi xuôi (5'-3') Mồi ngược (5'-3') Ta PCR

52OC 450

Ghi chú: Ta, nhiệt độ bắt cặp khi nhân bằng PCR giữa cặp mồi nhân với DNA tổng số của các mẫu khoai mỳ *) chiều dài sản phẩm PCR ước lượng

3.2 Thực hiện phản ứng PCR giữa các cặp mồi đã thiết kế với DNA tổng số

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số của đại diện 44 dòng khoai mỳ

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB của của Dellaporta và CS., (1987), được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo OD Từ kết quả đo, nồng độ DNA tổng số của các các mẫu được pha chỉnh đồng đều khoảng 25ng/µl như được trình bày ở Hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng sắn thí nghiệm 1µl/giếng 1-44 thứ tự các

dòng sắn như ghi ở Bảng 1 M: thang chuẩn DNA (100bp-GeneRuler DNA Ladder Mix,

và CS., 2007), trong đó có tỷ lệ tinh bột của khoai mỳ Kết quả thực hiện các phản ứng PCR giữa 5 cặp mồi SSR và DNA tổng số của đại diện 44 giống khoai mỳ được thể hiện trên các bản gel metaphor agarose ở Hình 3.2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M

-200bp -300bp

M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 M 39 40 41 42 43 44

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M

-100bp

-200bp -300bp

200bp

300bp

-M 20 21 22 23 24 25 26 2728 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44