...9 3.2.2 Đánh giá tính nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng PCR riêng lẻ trong phát hiện nấm mốc trên các mẫu nhiễm chủ động.. Với mục đích này, một phương pháp PCR đa mồi đã được phát t
Trang 1MỤC LỤC
MỤC LỤC i
TÓM TẮT iii
ABSTRACT iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii
LỜI CẢM ƠN x
1 Chương 1 - MỞ ĐẦU 1
2 Chương 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
3 Chương 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7
3.1 Thiết kế và chuẩn hóa phương pháp pcr phát hiện nấm mốc A.flavus và a Paraciticus 7 3.1.1 Thiết kế 2 cặp primer đặc hiệu cho 2 lọai nấm mốc A.flavus và A.paraciticus .7
3.1.2 Chuẩn hóa điều kiện PCR cho họat động của từng cặp primer 7
3.1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của từng phản ứng PCR Xác định khả năng phát hiện đúng đối tượng trong điều kiện có mặt nhiều lọai nấm mốc khác nhau .7
3.1.4 Chuẩn hóa điều kiện mutiplex PCR cho 2 cặp mồi họat động cùng lúc 8
3.1.5 Xác định tính đặc hiệu của multiplex PCR 8
3.1.6 Phân tích và diễn giải số liệu thu được 8
3.2 Đánh giá khả năng phát hiện nấm mốc trong thực phẩm nhiễm chủ động 8
3.2.1 Tạo mẫu nhiễm chủ động phục vụ thử nghiệm đánh giá phương pháp PCR .9
3.2.2 Đánh giá tính nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng PCR riêng lẻ trong phát hiện nấm mốc trên các mẫu nhiễm chủ động Chuẩn hóa phương pháp lấy mẫu .9
3.2.3 Thử nghiệm phản ứng multiplex PCR trên mẫu nhiễm chủ động 9
3.2.4 Phân tích và diễn giải số liệu thu được 9
3.3 Đánh giá hiệu lực thứ cấp 10
3.3.1 Thu mẫu thực phẩm 10
3.3.2 Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR 10
3.3.3 Áp dụng phương pháp PCR phát hiện thực phẩm nhiễm nấm mốc 10
3.3.4 Phân tích và diễn giải số liệu thu được 10
4 Chương 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12
Trang 24.1 Thiết kế và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện nấm mốc A.flavus và a Paraciticus
12
4.1.1 Phản ứng PCR phát hiện A flavus 12
4.1.2 Phản ứng pcr phát hiện A parasiticus 14
4.1.3 Phản ứng PCR đa mồi phát hiện cả A.flavus và A.parasiticus 16
4.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN NẤM MỐC TRONG THỰC PHẨM NHIỄM CHỦ ĐỘNG 18
4.2.1 Đánh giá khả năng phát hiện A flavus trên mẫu nhiễm chủ động 18
4.2.2 Đánh giá khả năng phát hiện A parasiticus trên mẫu nhiễm chủ động 18
4.2.3 PCR đa mồi: độ đặc hiệu và độ nhạy 20
4.3 ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC THỨ CẤP 21
4.3.1 Kết quả phát hiện nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy 21
4.3.2 Kết quả phát hiện nấm mốc bằng phương pháp multiplex PCR 22
5 Chương 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
7 PHỤ LỤC 34
Trang 3TÓM TẮT
Thực phẩm và thức ăn gia súc nhiễm Aspergillus sp và aflatoxin là một vấn đề nghiêm trọng liên
quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm vì độc tố aflatoxin được coi là một trong những chất gây ung
thư nguy hiểm nhất trong tự nhiên Hai loài nấm chủ yếu sản sinh ra aflatoxin là Aspergillus flavus
và Aspergillus parasiticus Hiện nay, tại Việt Nam, việc phát hiện các loại nấm này chủ yếu dựa
trên phương pháp nuôi cấy và phân biệt theo kiểu hình, tuy nhiên phương pháp này vẫn còn mấtnhiều thời gian do sự tương đồng về hình thái với các loài nấm khác có liên quan Do đó, cần cóphương pháp hiệu quả hơn để phát hiện nấm mốc trong thực phẩm giúp tránh tiêu thụ thực phẩm bịnhiễm độc Với mục đích này, một phương pháp PCR đa mồi đã được phát triển và đánh giá hiệuquả phát hiện hai loại nấm mốc này trên thực phẩm khô Bước đầu, phản ứng PCR được thiết kế và
tối ưu hóa cho việc phát hiện nấm A flavus và A parasiticus Tiếp theo phản ứng PCR sẽ được
đánh giá khả năng phát hiện nấm trên mẫu nhiễm chủ động Cuối cùng, hiệu lực thứ cấp củaphương pháp này sẽ được đánh giá trên mẫu thực Kết quả cho thấy phương pháp PCR đa mồi đã
được thiết kế thành công, có thể phát hiện A flavus và A parasiticus trong thực phẩm khô trong cả
ba giai đoạn với độ đặc hiệu cao và độ nhạy cao Trên mẫu đậu nhiễm chủ động, phản ứng PCR đamồi có thể phát hiện hai chủng nấm với lượng DNA tối thiểu là 20 ng/phản ứng (0,8 ng/ml), đốivới mẫu bắp là 5 ng/phản ứng (0,2 ng/ml) Với mẫu thực, thu thập trên thị trường, phản ứng PCR
có thể phát hiện nấm với mức độ nhiễm < 104CFU/g Theo kết quả này, phương pháp PCR đa mồinày có thể được dùng để xác nhận kết quả của phương pháp nuôi cấy hoặc là thay thế phương phápnuôi cấy trong tương lai
Trang 4Contamination of food and feed by Aspergillus species and aflatoxins is a serious problem because
aflatoxins known as the notable natural carcinogen predominantly produced by A flavus and A parasiticus greatly effect on human and animal health Currently, in Vietnam, the detection of these
fungi mostly based on the morphological method which is still costly and time consuming due tothe morphological similarities with other fungal related species Thus, more effective methods areneeded to develop for fungal detection in foods that could help to avoid consumption ofcontaminated food For this purpose, a PCR-based method developed in the pre-studies wasevaluated for the effectiveness of fungi detection of corn and peanut samples First, the primer andPCR assays were designed and optimized on the DNA samples collected from fungi isolatedculture Next, the designed primers and prepared multiplex PCR conditions were evaluated byapplication for detection of target DNA sequences from the artificially contaminated samples.Then, the multiplex PCR procedure was evaluated by comparision of the detection ability of thismethod and conventional culture method in the food samples collected directly from the market
The result showed that multiplex PCR assay was successfully designed for the detection of A flavus and A parasiticus in dried food in all three stages with high specificity The LOD of
multiplex PCR assay is 20 ng/assay (0.8 ng/µl) for peanut sample and is 5 ng/assay (0.2 ng/µl) forcorn sample Additionally, although the two methods comparison result proved that there wassignificant difference between them when the detection was directly carried out on the collectedsamples, there was no significant difference between two methods applied in corn sampleincubated with distilled H2O overnight (X2= 0.33 < X2 critical, α=0.05) Thus, the water overnightincubation should be applied in the whole procedure of DNA extraction before multiplex PCR Incase of peanut samples incubating with distilled water overnight, the difference between twoprocedures was slightly significant However, the infection level of peanut samples detected bymultiplex PCR was just about 103 CFU/g which was still lower than the limitation for infectedfungal quantity (104 CFU/g) prescribed by the hygiene regulation These result suggested that theoptimized multiplex PCR assay could be applied as a cost-effective, time-saving alternation for
detection of A flavus and A parasiticus on dried food However, to achieve the high effectiveness,
the nature of infected food which need to be examined should be carefully considered to minimizethe potential PCR inhibitors from these kind of infected food
Trang 5DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABGC : Aflatoxin biosynthesis gene cluster
AF và AP : mồi cho Aspergillus flavus và Apergillus paraciticus
A flavus : Aspergillus flavus
A fumigatus : Aspergillus fumigatus
A nidulans : Aspergillus nidulans
A ochraceus : Aspergillus ochraceus
A parasiticus : Aspergillus parasiticus
AVN
: Averantin
AVNN
: AverufaninAVF
: Averufin
DHDMST
: DihydrodemethylsterigmatocystinDHOMST
: Dihydro-O-methylsterigmatocystin
DHST
: DihydrosterigmatocystinDMST
: Demethylsterigmatocystin
FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations
F graminearum : Fusarium graminearum
F sporotrichioides : Fusarium sporotrichioides
F moniliforme : Fusarium moniliforme
HAVN
: 5’-hydroxyaverantin
Trang 6HACCP : Hazard analysis and critical control points
IARC : International Agency for Research on CancerIHPH : Institute of Hygiene and Public Health
NOR
: norsolorinic acidOAVN
: Oxoaverantin
OMST
: O-methylsterigmatocystin
P cyclopium : Penicillium cyclopium
P expansum : Penicillium expansum
ST
: Sterigmatocystin
VHA
: Versiconal hemiacetal acetate
VAL
: VersiconalVERB
: Versicolorin B
VERA
: Versicolorin A
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Kết quả xét nghiệm nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy cho mẫu bắp 21
Bảng 2: Kết quả xét nghiệm nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy cho mẫu đậu 21
Bảng 3: kết quả xét nghiệm nấm mốc bằng phương pháp multiplex pcr cho mẫu bắp không ủ 22
Bảng 4: kết quả two-tailed z – test so sánh giữa hai phương pháp dựa trên các nhóm mẫu bắp 22
Bảng 5: Kết quả phát hiện nấm dựa trên số trường hợp âm tính và dương tính của mẫu không ủ so sánh giữa phương pháp multiplex PCR và phương pháp nuôi cấy 23
Bảng 6: số liệu dung cho Pearson Chi-Square test (α=0.05) 23
Bảng 7: kết quả xét nghiệm nấm mốc bằng phương pháp multiplex pcr cho mẫu bắp ủ 24
Bảng 8: kết quả two-tailed z – test so sánh giữa hai phương pháp dựa trên các nhóm mẫu bắp 24
Bảng 9: kết quả phát hiện nấm dựa trên số trường hợp âm tính và dương tính của mẫu ủ so sánh giữa phương pháp multiplex pcr và phương pháp nuôi cấy 25
Bảng 10: kết quả xét nghiệm nấm mốc bằng phương pháp multiplex PCR cho mẫu đậu không ủ 26
Bảng 11: kết quả two-tailed z – test so sánh giữa hai phương pháp dựa trên các nhóm mẫu đậu không ủ 26 Bảng 12: kết quả phát hiện nấm dựa trên số trường hợp âm tính và dương tính của mẫu đậu không ủ so sánh giữa phương pháp multiplex pcr và phương pháp nuôi cấy 26
Bảng 13: kết quả xét nghiệm nấm mốc bằng phương pháp multiplex PCR cho mẫu đậu ủ 27
Bảng 14: kết quả two-tailed z – test so sánh giữa hai phương pháp dựa trên các nhóm mẫu đậu ủ 27
Bảng 15: kết quả phát hiện nấm dựa trên số trường hợp âm tính và dương tính của mẫu đậu ủ so sánh giữa phương pháp multiplex PCR và phương pháp nuôi cấy 28
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1: Kiểm Tra Nhiệt Độ gắn mồi của cặp mồi AF trên bộ gene của A.flavus Giếng 1 – 6: 54oC, 57oC,
60oC, 63oC, 66oC, 69oC 12
A FlavusVTCC-F-898; giếng 4:A FlavusAF.IV26.1; giếng 5:A FlavusTN1; giếng 6:A Oryzae
Parasiticus VTCC-F-1132; giếng 10: A Parasiticus VTCC-F-1159; giếng 11: A Niger 16404; giếng 12:A Candidus; giếng 13:P AethiopicumTNTT 12 Hình 3: Kết quả giải trình tự đoạn DNA khuyếch đại bằng cặp mồi AFLA được xác định là đúng với trình tự
ATCC-DNA mong muốn trên bộ gene củaA.flavus 13
100 bp dna; (-) chứng âm; giếng 1-7: 5ng, 1ng, 0.2ng, 0.04ng, 0.008ng, 0.0016ng, 0.00032ng 14 Hình 5: Độ nhạy của phản ứng phát hiện A Flavus trong hỗn hợp DNA của nhiều loài aspergillus khác
nhau M: thang 100 bp DNA; (-) chứng âm; giếng 1 to 7: 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032, 0.00064ng 14 Hình 6: Chuẩn hoá nhiệt độ bắt cặp của mồi AP trên bộ gene A.paraciticus Giếng 1: thang DNA 100bp.
Giếng 2- 7: nhiệt độ bắt cặp của mồi AP ở 56oC, 58oC, 60oC, 62oC, 64oC và 66oC 14 Hình 7: Độ đặc hiệu của mồi cho phản ứng phát hiệnA Parasiticus M: thang 100 bp DNA; (-) chứng âm;
Giếng 1: hỗn hợp DNA củaA parasiticusvà các loài nấm khác; giếng 2:A Parasiticus 1130; giếng 3: A Parasiticus VTCC-F-1132; giếng 4: A Parasiticus VTCC-F-1159; giếng 5:A Flavus VTCC-F-160; giếng 6:A FlavusVTCC-F-898; giếng 7:A FlavusAF.IV26.1; giếng 8:A Flavus TN1; giếng 9: A Oryzae VTCC-F-910; giếng 10: A Oryzae VTCC-F-912; giếng 11: A NigerATCC-16404; giếng 12:A Candidus; giếng 13:P Aethiopicum 15 Hình 8: Trình tự của sản phẩm DNA khuyếch đại được bằng cặp mồi AP 15 Hình 9: Độ nhạy của mồiA Parasiticus M: thang 100 bp DNA (-): chứng âm Giếng 1 - 11: 100, 50, 10, 5,
VTCC-F-1, 0.5, 0.VTCC-F-1, 0.05, 0.0VTCC-F-1, 0.005, 0.001ng 16
chứng âm; giếng 1 – 11: 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001ng 16 Hình 11: Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mỗi cho phản ứng PCR đa mồi phát hiện DNA của A.flavus và
A.paraciticus 17 Hình 12: Tối ưu hoá nồng độ mồi cho phản ứng đa mồi phát hiệnA.flavusvàA.paraciticus Giếng 1: 0.4 µM
AF và 0.4 µM AP; Giếng 2: 0.3 µM AF và 0.3 µM AP; giếng 3: 0.2 µM AF và 0.2 µM AP; Giếng 4: 0.3 µM AF và 0.4 µM AP; Giếng 5: 0.2 µM AF và 0.3 µM AP; Giếng 6: 0.2 µM AF và 0.4 µM AP 17 Hình 13: Độ đặc hiệu và độ nhạy của cặp primer trong phản ứng PCR đa mồi M: thang 100 bp DNA; (-)
chứng âm; giếng 1:A flavus– 70ng; giếng 2:A parasiticus– 70ng; giếng 3-5: hỗn hợp DNA với lượng DNA từ 50ng, 5 ng, và 0.5ng 17
Trang 9Hình 14: Phản ứng PCR phát hiện A flavus dùng mẫu DNA tách từ các mẫu nhiễm chủ động Giếng 1-3:
tách từ 3, 5 7 hạt đậu; giếng 4-6: tách từ 3, 5 7 hạt bắp; giếng (-): chứng âm 18 Hình 15: kết quả PCR dùng DNA tách từ mẫu nhiễm theo phương pháp trực tiếp Giếng 2 -4: DNA tách từ
3, 5, 10 hạt bắp nhiễm; giếng 5 – 7: DNA tách từ 3, 5, 10 hạt đậu nhiễm Giếng 8: chứng âm 19 Hình 16: kết quả PCR dùng DNA tách từ mẫu nhiễm theo phương pháp gián tiếp Giếng 2 -3: DNA tách từ
3, 5 hạt bắp nhiễm; giếng 4 – 5: DNA tách từ 3, 5 hạt đậu nhiễm Giếng 6-7: chứng âm 19
(hỗn hợp DNA từA flavusvàA parasiticus) Giếng 2: hỗn hợp DNA củaA flavus,A parasiticus
và các loài nấm khác Giếng 3:A Niger Giếng 4:A Oryzae Giếng 5:Trichodermaspp Giếng 6: chứng âm 20 Hình 18: Độ nhạy cho phản ứng PCR đa mồi (-) chứng âm Giếng 500 – 0.05ng bên trái là sản phẩm PCR
từ mẫu bắp Bên phải là sản phẩm PCR từ mẫu đậu 20
Trang 10LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi ĐHQG TpHCM dưới đề tài mã số: B2013-28-02 Nhóm
nghiên cứu xin cảm ơn sự hỗ trợ của trường ĐH Quốc Tế trong suốt quá trình thực hiệnnghiên cứu
Xin cảm ơn sự hỗ trợ về cơ sở vật chất của Đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường ĐH Oxford(Oxford University Clinical Research Unit – OUCRU)
Xin cảm ơn Viện Y Tế Công Cộng, thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ thực hiện các thínghiệm kiểm chứng cho nghiên cứu này
Xin cảm ơn phòng Vi sinh, Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 đã hỗ trợthực hiện các thí nghiệm sơ khởi của nghiên cứu này
Xin cảm ơn tất cả các sinh viên đại học, cao học đã tham gia thực hiện nghiên cứu này:Phạm Minh Thông, Nguyễn Hữu Nhiên, Đỗ Thị Ánh, Thân Thị Mỹ Linh, Lý Tuệ Từ, PhạmTường Vi, Lê Trí Nghĩa, Huỳnh Lê Thảo Trinh Cảm ơn các thành viên của đề tài đã tíchcực tham gia thực hiện nghiên cứu này: Ths Phan Ngô Hoang, Ths Hoàng Thanh Hải, Ths.Đặng Thị Lan Anh
Trang 111 CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU
Độc tố mycotoxin là chất chuyển hóa thứ cấp từ nhiều loài nấm và có khả năng gây nhiễm độc chocác loại thực phẩm FAO ước tính rằng 25% của các loại cây trồng bị nhiễm nấm mốc sinh độc tố.Các loài nấm mốc phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới với khí hậu nóng ẩm, vì vậy ở Việt Nam
có nguy cơ nhiễm nấm và độc tố rất cao Trong số các độc tố nấm mốc, aflatoxin là một trongnhững nhóm độc hại nhất, rất nguy hiểm cho người và động vật AF có thể gây tử vong với một liềulượng nhỏ và cũng là một chất gây ung thư mãn tính Aflatoxin chủ yếu được sản xuất bởi hai
chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên nhiều loại thực phẩm khác nhau với điều
kiện nhiệt độ và độ ẩm cao Tuy chúng chia sẻ nhiều điểm chung về hình thái và điều kiện sống,
nhưng các độc tố sinh ra là khác nhau A flavus có thể sinh ra aflatoxin B trong khi A parasiticus
có thể sản xuất cả hai loại B và G Do những tác động của độc tố nấm mốc đối với sức khỏe conngười và nền kinh tế, nên việc phát hiện nấm mốc và độc tố nấm trên cây trồng và thực phẩm là rấtquan trọng Hiện nay có nhiều phương pháp được áp dụng để phát hiện nấm mốc và độc tố, tuynhiên các phương pháp này vẫn còn những điểm yếu Phương pháp nuôi cấy là phương pháp được
sử dụng phổ biến, nhưng mất thời gian và đòi hỏi kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm Trong khi đó, cácphương pháp công nghệ cao như TLC và HPLC có thể được sử dụng với độ chính xác cao trongviệc phát hiện các độc tố aflatoxin, nhưng những phương pháp này yêu cầu khá đắt tiền và trangthiết bị Ngoài ra, phương pháp ELISA có thể được sử dụng với độ nhạy cao nhưng sự gắn kết củaaflatoxin lên các kháng thể không đặc hiệu có thể gây ra kết quả sai Do đó, xét nghiệm phân tửhiện là một hướng tiềm năng có thể khắc phục những điểm yếu của các phương pháp khác trongviệc phân biệt các loài và phát hiện độc tố Hiện nay, các nghiên cứu về bộ gen Aspergillus, đặc biệt
là về cụm gen sản xuất các độc tố aflatoxin, đã tìm thấy một số kết quả cụ thể về trình tự nucleotide
và chức năng của những gen này Đây là một tiền đề cho phát triển xét nghiệm PCR sẽ nhắm đếncác mẫu ADN Aspergillus Mặt khác, ở Việt Nam, vẫn chưa có báo cáo về loại hình phương pháp
trong việc phát hiện Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus vào thực phẩm với hiệu quả cao Cho đến nay, việc phát hiện các loài Aspergillus trong thực phẩm vẫn được tiến hành để đảm bảo
chất lượng của thực phẩm tại Việt Nam Tuy nhiên, những phương pháp thông thường đòi hỏi thờigian dài từ 8 đến 10 ngày và kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm để phân biệt các loại nấm dựa trên sựkhác biệt về hình thái với các loài khác có liên quan Bên cạnh đó, PCR hiện đang là một hướngđáng chú ý vì độ nhạy, độ đặc hiệu và đơn giản trong thực hiện Mặc dù đây là một phương phápkhông mới nhưng vẫn chưa được sử dụng trong phát hiện nấm mốc tại Việt Nam Trong đề tài này,
một quy trình PCR nhanh chóng, đặc hiệu và nhạy dùng để xác định Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus – hai loài nấm sinh Aflatoxin chủ yếu - trong thực phẩm khô sẽ được thiết
Trang 12lập Từ đó, nấm mốc và chất độc nhiễm trong thực phẩm có thể được phát hiện nhanh và chất lượngthực phẩm sẽ được kiểm soát nhằm bảo vệ sức khỏe của người tiêu thụ Hơn nữa, việc phát hiện vàloại bỏ các loại cây trồng nhiễm nấm sẽ giúp cải thiện chất lượng sản phẩm nông nghiệp xuất khẩu.Trong nghiên cứu này, mục tiêu chính là phát triển một phương pháp PCR đa mồi để phát hiện cả
hai loài Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trong thực phẩm khô Để đạt được mục tiêu
này, đề tài được thực hiện qua ba giai đoạn Đầu tiên, mồi và phản ứng PCR đã được thiết kế và tối
ưu hóa trên các mẫu ADN thu được từ nấm mốc Tiếp theo, các mồi và phản ứng PCR này sẽ đượcđánh giá dựa trên việc phát hiện các trình tự ADN mục tiêu từ các mẫu nhiễm nhân tạo Sau đó,hiệu lực thứ cấp của phản ứng PCR đa mồi được đánh giá bằng cách so sánh về khả năng phát hiệncủa phương pháp này và phương pháp nuôi cấy thông thường trong các mẫu thực phẩm được thuthập trực tiếp từ thị trường
Cuối cùng, chúng tôi mong muốn có được một phương pháp PCR đa mồi có thể phát hiện A flavus
và A parasiticus trong các loại thực phẩm khô Một khi điều này được thực hiện, xét nghiệm này có
thể là một lựa chọn đơn giản, giá thành thấp và nhanh chóng cho việc kiểm soát và tăng cường antoàn thực phẩm và y tế Việt Nam
Trang 132 CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Mycotoxin là độc tố sinh ra bởi các loại nấm mốc như là các sản phẩm phụ trong quá trình tiêu hóa
và đồng hóa các thành phần trong nguyên liệu, thức ăn Tổ chức Nông – Lương thế giới đã ước tính
có đến 25% lượng lương thực trên thế giới có chứa một hàm lượng đáng kể độc tố mycotoxin1 Dophương thức thu hoạch, bảo quản nông sản còn chưa tốt cùng với điều kiện khí hậu nóng ẩm của cácnước châu Á đặc biệt là các nước gần xích đạo nên tỷ lệ nhiễm mycotoxin thường cao hơn các nước
có khí hậu ôn đới
Aflatoxin được xem là độc tố nguy hiểm hàng đầu trong nhóm độc tố mycotoxin1,8, rất nguy hiểm đối
với người và động vật Loại độc tố này được sinh ra chủ yếu từ 2 chủng Aspergillus flavus và Aspergilus parasiticus sống trên nhiều chất nền khác nhau, đặc biệt là ở độ ẩm cao3 Hai chủng nấm
này tuy cùng họ Flavi nhưng khác nhau về khả năng sinh độc tố: A flavus sinh 2 loại độc tố B1 và B2, trong khi đó A parasiticus có khả năng sinh được 4 loại độc tố B1, B2, G1 và G24 Do cấu trúchóa học có vòng dihydrofuran nên aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chấtdẫn đến tử vong Ngoài ra, aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA,RNA) gây tổn thương gan và gây ung thư gan Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫnđến di tật thai nhi hoặc quái thai, nặng có thể chết non
Về mặt hình thái, nấm mốc thuộc chủng Aspergillus khá giống nhau khiến việc phân biệt các chủngnấm trong họ Aspergillus vấp phải nhiều khó khăn khi chỉ dựa vào phương pháp truyền thống nhưcấy tăng sinh, quan sát hình thái – tốn nhiều thời gian và đòi hỏi người làm xét nghiệm phải có kinhnghiệm trong lĩnh vực Phương pháp truyền thống phát hiện nấm Aspergillus sinh độc tố Aflatoxinchủ yếu dựa vào đặc điểm sinh học, hình thái sợi nấm và vết loang để lại trên môi trường đã đượccông bố từ thập kỷ 80 Tuy vậy, phương pháp này có nhược điểm là tốn công sức, độ chính xác và độnhạy không cao Tiếp theo, phương pháp sắc ký được sử dụng để phát hiện mức độ nhiễm Aflatoxinnhư: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) Ưu điểm của phương pháp này là cóthể định lượng chính xác hàm lượng Aflatoxin nhiễm trong mẫu thí nghiệm Tuy nhiên, phương phápnày lại có nhược điểm là cần phòng thí nghiệm được trang bị các máy chuyên dụng đắt tiền
Định danh Aspergillus flavus bằng các phương pháp sinh học phân tử đã được thực hiện trong thời gian gần đây cũng đã đạt kết quả bước đầu, tuy nhiên đa số đều chưa phân biệt được giữa A flavus và
A parasiticus Ứng dụng của những kỹ thuật dựa trên DNA cho phép phân biệt nhanh, nhạy và đặc
hiệu, cần thiết cho việc kiểm soát và giảm thiệt hại từ nấm mốc ngay ở những giai đoạn đầu củachuỗi sản xuất thức ăn Đã có nhiều bài nghiên cứu về phân biệt nấm mốc dựa trên kỹ thuật PCR3,7,9-
19
Trong số này chỉ có một nghiên cứu phân biệt Aspergillus parasiticus bằng phương pháp real-time
PCR của Sardiñas N vào năm 2010 với cặp mồi nằm trên vùng ITS2 rDNA Tuy nhiên phương pháp
Trang 14này thể hiện mức chi phí khá cao cho việc phân biệt A parasiticus khi đưa ra ứng dụng trong các
phòng kiểm định vi sinh Sử dụng phương pháp PCR, nhưng Shapira chưa thể phân biệt được
Aspergillus flavus với Aspergillus parasiticus17
Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người có lượng aflatoxin không vượt quá 10ppb
Để phát hiện và định lượng aflatoxin, hiện nay trong nước có hai nhóm phương pháp chính sau:
Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC)
Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch enzym (ELISA) vàcột sắc kí ái lực miễn dịch
Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, trước khi phát hiện phải trải qua rất nhiều thao tác phức tạpnhư chiết lấy aflatoxin từ vật liệu, sau đó phải cô đặc trước khi định lượng nên tốn nhiều thời gianthao tác kĩ thuật, hơn nữa thiết bị đầu tư rất đắt tiền
Với phương pháp ELISA, lại có nhiều hạn chế vì aflatoxin thường không bám đặc hiệu vào cácgiếng polystirene, khoảng phát hiện hẹp, và cần phải có aflatoxin đánh dấu hoặc kháng thể đánhdấu, sai số lớn mặc dù có độ nhạy cao Ngoài ra độ phức tạp do sự hiện diện cùng lúc của nhữngchủng nấm Aspergillus gây độc và không gây độc có khả năng gây kết quả âm tính giả5,6
Bên cạnh đó, phương pháp chẩn đoán phân tử dùng kỹ thuật PCR dựa trên kết quả nghiên cứu hệ
gen nấm Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin và con đường sinh tổng hợp Aflatoxin đã được
triển khai Các nghiên cứu cho thấy, ít nhất có 20 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợpAflatoxin, bốn gen quan trọng là ver-1, omt-1, nor-1 và apa-27đã được công bố trình tự nucleotide
và chức năng gen Trình tự nucleotide của các gen này là cơ sở để sinh tổng hợp các cặp mồi đặchiệu cho phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là ADN tổng số tách chiết từ sợi nấm hoặc các mẫu xétnghiệm Tuy nhiên hiện nay trong nước vẫn chưa có một báo cáo hay công bố nào dùng phương
pháp chẩn đoán phân tử để định danh được cả hai loại nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trong cùng một xét nghiệm với giá thành rẻ, nhanh, chính xác, và đánh giá mức độ
nhiễm nấm và giới hạn cho phép trên thương phẩm
Trong khả năng của đề tài: định danh nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus bằng Multiplex PCR Đối với A flavus, cụm gene sinh độc tố aflatoxin (AF) sẽ được chú ý khai thác làm
mục tiêu phân biệt Aspergillus và các loại nấm mốc khác Gene AF khá bảo tồn giữa các loàiAspergillus20những khác biệt nhỏ trên vùng này sẽ là yếu tố then chốt để thiết kế được cặp mồi đặc
hiệu cho Aspergillus flavus Đối với A parasiticus, hai gene liền kề nằm ở đầu của cụm gene sinh
tổng hợp độc tố aflatoxin – norB-cypA – của Aspergillus được khai thác như chuỗi gene mục tiêu
để thiết kế mồi cho PCR Gene norB-cypA thể hiện sự khác nhau khá lớn giữa A parasiticus với chủng Aspergillus khác và được nghi ngờ là gene giúp A parasiticus sinh được độc tố aflatoxin
Trang 15G20-23 Như vậy việc thiết kế mồi cho PCR sẽ đạt được hiệu quả cao trong việc phân biệt A flavus với A parasiticus và các loài khác kể cả giữa dòng Aspergillus.
B2 Ý tưởng khoa học, tính cấp thiết và tính mới
(Chỉ ra những hạn chế cụ thể trình độ KH&CN trong nước và thế giới, từ đó nêu được hướng giảiquyết mới - luận giải mục tiêu đặt ra của đề tài và tính cấp thiết, lợi ích của kết quả nghiên cứu đốivới ngành, đối với tổ chức chủ trì, đối với xã hội)
Trong 20 loại aflatoxin đã được con người biết đến, aflatoxin B1, B2, G1, G2 là những loại có thểdẫn đến ung thư gan, thận và một số ảnh hưởng trực tiếp đến các cơ quan khác nếu ăn phải
Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus là 2 chủng nấm mốc được xác định là có liên quan
hàng đầu đến việc sinh độc tố aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
Trong lịch sử đã từng xảy ra nhiều vụ ngộ độc thức ăn gây tử vong cho hàng loạt người và gia súc
mà nguyên nhân chính là do độc tố của một số chủng vi nấm mà chúng ta gọi là nấm mốc Năm
1924 Shofield và cộng tác đã phát hiện một loại độc tố được sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh chogia súc Cũng trong thời gian này, Liên Xô tìm ra bệnh không tăng bạch cầu (Aleusemic) ở một sốngười ăn phải ngũ cốc bị mốc Đến năm 1960 có một vụ dịch làm chết hàng ngàn con gà tây tại mộtquần đảo nước Anh do ăn phải lạc thối mốc, các nhà khoa học phương Tây tiến hành nghiên cứu vàphát hiện ra nguyên nhân gà chết là do sưng to gan, sau xét nghiệm và phân tích đã xác định tác
nhân gây chết là độc tố Aflatoxin do nấm A flavus tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển
trên thức ăn
Độc tố aflatoxin là những polyketide với những đặc trưng là dihydro (B1 và G1) hoặc tetrahydro(B2 và G2) Trong các loại này, B1 được xem là loại có độc tính cao nhất [20] Độc tố aflatoxinthường được phát hiện trong các loại hạt có dầu như: lạc, ngũ cốc, bột mì, bánh kẹo, cá khô để lâu.Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả năng nhiễm độc tố nguy
hiểm aflatoxin B1 do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus gây
nên Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong một số dung môi hữu cơ (clorofoc,methanol, acetone,…) và độc tính cao, rất bền vững với tác nhân hóa lí , chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên
120oC trong môi trường kiềm
Riêng Aspergillus flavus thường ký sinh trên các loại nông sản như đậu phộng, gạo, sữa có thể sinh
độc tố aflatoxin B1 và B2 (AFB1, AFB2) [20] – loại độc nhất trong nhóm độc tố aflatoxin [19] Đặc
biệt, đậu phộng (lạc) có độ ẩm trên 15% là môi trường rất tốt cho A flavus phát triển, vì thế chúng
còn có tên gọi khác là khuẩn lạc
Khi lương thực, thực phẩm bị mốc sẽ có màu xanh lục hay màu vàng nâu Nấm mốc làm hao hụtthành phần dinh dưỡng và tạo cho sản phẩm có mùi vị khó chịu Aflatoxin là một độc tố, bền vững
Trang 16với nhiệt độ cao Vì vậy, khi đem rang đậu bị mốc ở nhiệt độ rất cao nhưng độc tố vẫn không bị pháhuỷ hoàn toàn Gia cầm ăn phải lương thực nhiễm nấm mốc sẽ chậm lớn, giảm khả năng sinh sản24.Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10mg), độc tố Aflatoxin còn đượcxem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư Người ta đã biết Aflatoxin là một trong những chất gâyung thư gan mạnh nhất tác động qua đường miệng – nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxintrong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung thư gan hơn 1 năm sau Năm 1961, ở Anh người ta đãtiến hành thực nghiệm trên chuột cống, cho ăn thức ăn đã nhiễm mốc trong đó 20% là bột lạc thối,sau 6 tháng thấy xuất hiện ung thư gan Robinson nghiên cứu trên trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, bằngphương pháp sắc ký lớp mỏng, ông đã tìm thấy Aflatoxin trong nước tiểu của những trẻ bị xơ gan
và trong sữa của những bà mẹ có con bị xơ gan
Các phương pháp truyền thống phân biệt các chủng Aspergillus chủ yếu dựa trên những đặc điểmhình thái đòi hỏi người thực hiện phải có kiến thức, kinh nghiệm do chủ yếu dựa trên sự quan sáthình thái của nấm mốc và thường mất từ 8-10 ngày Một phương pháp hiện đại đang được chú ýtrong chẩn đoán sinh vật với nhiều ưu điểm mà Việt Nam chưa nghiên cứu khai thác để phát hiệnnấm mốc là PCR Với mục tiêu xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu gópphần làm giảm thiểu tác hại của nấm Aspergillus trong sản xuất nông nghiệp và chất lượng sảnphẩm tiêu dùng trong nước cũng như đưa ra một quy trình nhanh, chính xác, đặc hiệu, góp phầngiúp phát hiện sớm và loại bỏ những sản phẩm không đạt chất lượng trước khi xuất khẩu Thực tế,Cục quản lý Thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và ủy ban châu Âu (European Union) đãcấm tất cả các loại thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có chứa aflatoxin Điều đó tạo ra tính cấp thiết
của đề tài này: Phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus bằng phương pháp
PCR
Trang 173 CHƯƠNG 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thiết kế và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện nấm mốc A.flavus và a Paraciticus 3.1.1 Thiết kế 2 cặp primer đặc hiệu cho 2 lọai nấm mốc A.flavus và A.paraciticus.
- Sử dụng kỹ thuật sinh tin học (bioinformatics) nghiên cứu đặc tính bộ gene của 2 lòai nấmứng viên So sánh sự tương đồng và khác biệt về trình tự bộ gene của 2 lọai nấm mốc này
So sánh phân biệt trình tự gene giữa 2 lòai này và các lòai nấm mốc khác Chọn vùng geneđặc hiệu cho từng đối tượng
- Việc chọn vùng gene thích hợp tùy thuộc vào vùng gene đó có tính ổn định cao cho loài haykhông Các đột biến xảy ra có thể gây khó khăn trong việc mồi thiết kế không phát hiện hếtcác chủng mục tiêu Do đó để có thể chọn được vùng gene thích hợp cần phải so sánh nhiểu
bộ gene của các loài nấm mốc với nhau và có thể phải giải trình tự một số chủng mới lạ
- Thiết kế bộ mồi PCR bằng phần mềm Primer3plus
3.1.2 Chuẩn hóa điều kiện PCR cho họat động của từng cặp primer
- Thu nhận, nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA 2 lòai nấm mốc A.flavus và A paraciticus
- Chuẩn hóa điều kiện phản ứng PCR để phát hiện 2 loài nấm mốc ứng viên trong điều kiệnthuần trong 2 phản ứng riêng rẽ Thử nghiệm nhiệt độ họat động của các cặp mồi dựa vàonhiệt độ bắt cặp của các mồi đã thiết kế Thử nghiệm nồng độ các hóa chất PCR sử dụng(dNTP, Mg2+) Xác định nhiệt độ tối ưu, nồng độ mồi và các hóa chất PCR cho phản ứngPCR có thể phát hiện được đối tượng
- Xác định ngưỡng phát hiện cho từng phản ứng bằng cách pha loãng nồng độ DNA sử dụngtrong phản ứng PCR
3.1.3 Kiểm tra tính đặc hiệu của từng phản ứng PCR Xác định khả năng phát hiện
đúng đối tượng trong điều kiện có mặt nhiều lọai nấm mốc khác nhau.
- Trộn lẫn 2 lọai DNA từ 2 lòai nấm mốc với nhau và DNA của các lòai nấm mốc khác đểtạo mẫu DNA tạp nhiễm
- Trộn lẫn các lòai nấm mốc với nhau tạo mẫu nấm mốc tạp nhiễm, sau đó ly trích DNA từmẫu tạp nhiễm để có mẫu DNA tạp nhiễm
- Thử nghiệm phản ứng PCR trên các mẫu DNA tạp nhiễm, đánh giá khả năng phát hiện đốitượng của từng phản ứng PCR cho từng đối tượng
Trang 18- Xác định ngưỡng phát hiện cho từng phản ứng đối với mẫu tạp nhiễm bằng cách pha loãngnồng độ DNA của các mẫu thử nghiệm và theo các tỉ lệ trộn lẫn khác nhau.
- Giải trình tự đoạn DNA được khuyếch đại, so sánh trình tự DNA này và trình tự DNAmong muốn thiết kế trên genebank
3.1.4 Chuẩn hóa điều kiện mutiplex PCR cho 2 cặp mồi họat động cùng lúc.
- Chuẩn hóa phản ứng PCR cho cả 2 cặp mồi họat động trong cùng phản ứng trên mẫu DNAtrộn lẫn 2 đối tượng nấm mốc Chuẩn hóa nhiệt độ phản ứng, nồng độ hóa chất Xác địnhnhiệt độ tối ưu, nồng độ mồi và các hóa chất PCR cho phản ứng PCR có thể phát hiện đượcđối tượng
- Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex trên các mẫu được pha loãng nồng độDNA với các tỉ lệ khác nhau
3.1.5 Xác định tính đặc hiệu của multiplex PCR.
- Thử nghiệm phản ứng multiplex PCR phát hiện 2 đối tượng nấm mốc trong mẫu DNA tạpnhiễm và nấm mốc tạp nhiễm
- Xác định ngưỡng phát hiện của multiplex PCR trên các mẫu tạp nhiễm pha lõang và với tỉ
lệ khác nhau
3.1.6 Phân tích và diễn giải số liệu thu được
- Nồng độ DNA được đo bằng hệ thống Nanodrop cho biết nồng độ và độ tinh sạch của DNA
- Phân tích kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1-2% có chứa 1% Ethidium Bromide, trênđiện trường 100 volt
- Kết quả được đánh giá dựa quan sát hình ảnh chụp của gel agarose bằng hệ thống chụp ảnhgel và phân tích bằng phần mềm GelDOC
- Tính nhạy của phản ứng PCR được đánh giá qua độ sáng của vệt DNA trên gel ở vị trí xácđịnh đúng như thiết kế
- Độ đặc hiệu được tính dựa trên khả năng khuyếch đại DNA của cặp mồi và chỉ cho 1 sảnphẩm PCR duy nhất, rõ nét, không có sự xuất hiện của các vệt DNA ngoại lai hoặc quá mờ -Các thí nghiệm được lặp lại nhiều lần và dùng xác suất thống kê để tính toán mức độ chínhxác
Trang 193.2.1 Tạo mẫu nhiễm chủ động phục vụ thử nghiệm đánh giá phương pháp PCR.
-Cho nhiễm từng đối tượng nấm mốc thuần (VTCC) vào 2 lọai thực phẩm khô (bắp, đậuphộng)
-Thu thập mẫu nhiễm theo thời gian xác định, ước tính nồng độ nhiễm
3.2.2 Đánh giá tính nhạy và tính đặc hiệu của phản ứng PCR riêng lẻ trong phát
hiện nấm mốc trên các mẫu nhiễm chủ động Chuẩn hóa phương pháp lấy mẫu.
- Phân lập nấm mốc từ mẫu bị nhiễm chủ động, cung cấp mẫu nấm mốc cho ly trích DNA ởbước tiếp theo
- Tối ưu hóa phương pháp ly trích DNA nấm mốc trực tiếp từ mẫu thực phẩm bị nhiễm nấmmốc
- Thử nghiệm xác định tính đặc hiệu và tính nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện nấmmốc từ mẫu DNA ly trích
- Thử nghiệm phát hiện nấm mốc trực tiếp từ mẫu nhiễm không qua ly trích DNA
- Xác định lượng mẫu khả thi cho việc phát hiện trực tiếp và gián tiếp
3.2.3 Thử nghiệm phản ứng multiplex PCR trên mẫu nhiễm chủ động
- Chuẩn hóa phản ứng multiplex PCR trực tiếp trên mẫu thực phẩm nhiễm chủ động
- Thử nghiệm xác định tính đặc hiệu và tính nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện nấmmốc trực tiếp từ mẫu nhiễm chủ động
- Xác định ngưỡng phát hiện đánh giá hiệu quả theo tiêu chuẩn ISO 16140:2003
3.2.4 Phân tích và diễn giải số liệu thu được
- Nồng độ DNA được đo bằng hệ thống Nanodrop cho biết nồng độ và độ tinh sạch của DNA
- Phân tích kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1-2% có chứa 1% Brth, trên điện trường
Trang 20- Độ đặc hiệu được tính dựa trên khả năng khuyếch đại DNA của cặp mồi và chỉ cho 1 sảnphẩm PCR duy nhất, rõ nét, không có sự xuất hiện của các vệt DNA ngoại lai hoặc quá mờ
- Các thí nghiệm được lặp lại nhiều lần và dùng xác suất thống kê để tính toán mức độ chínhxác
3.3 Đánh giá hiệu lực thứ cấp
3.3.1 Thu mẫu thực phẩm
- Thu 100 mẫu thực phẩm khô (bắp + đậu phộng)
3.3.2 Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
- Phân lập nấm mốc
- Ly trích DNA
- Hoặc ly trích trực tiếp
- Hoặc chuẩn bị mẫu trực tiếp cho PCR
3.3.3 Áp dụng phương pháp PCR phát hiện thực phẩm nhiễm nấm mốc
- Thực hiện phát hiện nấm mốc, định danh bằng phương pháp nuôi cấy
- Thực hiện phát hiện nấm mốc bằng phương pháp PCR độc lập với phương pháp truyềnthống trên cùng nhóm mẫu
- So sánh kết quả Đánh giá độ chính xác, nhạy của phương pháp
3.3.4 Phân tích và diễn giải số liệu thu được
- Nồng độ DNA được đo bằng hệ thống Nanodrop cho biết nồng độ và độ tinh sạch của DNA
- Phân tích kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1-2% có chứa 1% Brth, trên điện trường
Trang 21- Các thí nghiệm được lặp lại nhiều lần và dùng xác suất thống kê để tính toán mức độ chínhxác.
- Số liệu thực nghiệm được phân tích bằng phầm mềm thống kê để đánh giá tính nhạy, độ đặchiệu của phương pháp PCR so với phương pháp truyền thống
Trang 224 CHƯƠNG4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thiết kế và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện nấm mốc A.flavus và A Paraciticus 4.1.1 Phản ứng PCR phát hiện A flavus
Thiết kế mồi và tối ưu hoá phản ứng PCR khuyếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho
AAGGCATAAAGGGTGTGGAG – 3’) chỉ đặc hiệu cho A flavus Cặp mồi này khuếch đại đoạn
gen 413bp Nhiệt độ bắt cặp cho cặp mồi được tối ưu hóa bằng dãy nhiệt độ từ 540C đến 690C Kếtquả tối ưu được thể hiện trên gel agarose (hình 1) Ở tất cả các nhiệt độ đều xuất hiện sản phẩmnhư mong muốn khoảng 413bp Nhiệt độ càng cao sản phẩm xuất hiện với nồng độ càng giảm
Khoảng nhiệt độ có thể sử dụng cho việc khuyếch đại sản phẩm 413bp của A.flavus có thể chọn là
từ giếng số 2 đến giếng số 5 trong hình 1, tương đương với nhiệt độ từ 54oC đến 66oC Tuy nhiêntrong một số trường hợp các nhiệt độ thấp có thể cho sản phẩm ngoại lai nên các nhiệt độ caonhưng vẫn cho kết quả tốt là lựa chọn tốt nhất Trong trường hợp này nhiệt độ 650C là nhiệt độ tối
ưu được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
Hình 1: Kiểm Tra Nhiệt Độ gắn mồi của cặp
mồi AF trên bộ gene của A.flavus Giếng 1 – 6:
54oC, 57oC, 60oC, 63oC, 66oC, 69oC
Hình 2: Độ Đặc Hiệu Của Mồi A Flavus Giếng 1: hỗn hơp DNA; giếng 2: A Flavus VTCC-F-160; giếng 3: A Flavus VTCC-F- 898; giếng 4: A Flavus AF.IV26.1; giếng 5: A Flavus TN1; giếng 6: A Oryzae VTCC-F-910; giếng 7: A Oryzae VTCC-F-912; giếng 8: A Parasiticus VTCC-F-1130; giếng 9: A Parasiticus VTCC-F-1132; giếng 10: A Parasiticus VTCC-F-1159; giếng 11: A Niger ATCC-16404; giếng 12: A Candidus; giếng 13: P Aethiopicum TNTT.