Nghiên cứu phát hiện và khảo sát chức năng của các vi khuẩn acid lactic có nguồn gốc việt nam lên tế bào ung thư và vi sinh vật gây bệnh

Từ kết quả thu được, nghiên cứu này đã thành công trong việc phát hiện khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư của những vi khuẩn LAB được phân lập từ thực vật và đạt mục tiêu đề ra.. Do đó

i

MỤC LỤC

TÓM TẮT 1

ABSTRACT 2

LỜI CẢM ƠN 3

CHƯƠNG 1: LỜI GIỚI THIỆU 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 5

2.1 Probiotic 5

2.1.1 Đặc tính của probiotic 5

2.1.2 Công dụng của Probiotic 5

2.1.3 Các yều cầu đối với Probiotic 6

2.2 Lactic acid bacteria (LAB) 8

2.2.1 Phân loại và tính chất sinh lý của LAB 8

2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sinh axit lactic 9

2.2.3 Tác động chống ung thư 9

2.3 Các sản phẩm probiotic ở Việt nam 10

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

3.1 Nội dung nghiên cứu 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Phân lập và xác định vi khuẩn 11

3.2.1.1 Phân lập vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy 11

3.2.1.2 Định danh 12

3.2.1.2.1 Thử nghiệm sinh hoá 12

3.2.1.2.2 Định danh bằng gen rRNA 16S 12

3.2.2 Khảo sát tác động lên vi sinh vật gây bệnh và xác định sơ bộ thành phần kháng vi sinh vật 13

ii

3.2.2.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB 13

3.2.2.2 Nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh 13

3.2.2.3 Chuẩn bị mẫu để thử kháng vi sinh vật 13

3.2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật 13

3.2.2.5 Khảo sát tính chất của bacteriocin 14

3.2.2.5.1 Tính nhạy cảm với nhiệt độ 14

3.2.2.5.2 Tính nhạy cảm với pH 14

3.2.2.5.3 Tính nhạy cảm với enzyme 14

3.2.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và môi trường pH lên quá trình sản xuất bacteriocin 15

3.2.2.6.1 Nhiệt độ ủ 15

3.2.2.6.2 Môi trường pH 15

3.2.2.7 Tinh sạch bacteriocin 15

3.2.2.8 SDS-PAGE 16

3.2.2.9 Xác định amino axit đầu N 16

3.2.2.10 Phát hiện gene liên quan đến bacteriocin 16

3.2.2.11 Xác định cyclopeptide 16

3.2.3 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư và xác định sơ bộ thành phần tác động lên tế bào ung thư 17

3.2.3.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB 17

3.2.3.2 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư 17

3.2.3.2.1 Nuôi cấy tế bào 17

3.2.3.2.2 Đánh giá hoạt tính chống tế bào ung thư ở chuột (in vivo) 18

3.2.3.3 Xác định sơ bộ các chất kháng ung thư 18

3.2.3.3.1 Polysaccharide 18

iii

3.2.3.3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do

DPPH 18

3.2.4 Phân tích thống kê số liệu 19

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Định danh vi khuẩn 20

4.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật 23

4.2.1 Thử kháng khuẩn 23

4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng khuẩn 28

4.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 28

4.2.2.2 Ảnh hưởng của pH 31

4.2.2.3 Ảnh hưởng của proteinase K 35

4.2.3 Xác định bacteriocin 36

4.2.3.1 Tinh sạch bacteriocin 36

4.2.3.2 Xác định chuỗi bacteriocin 36

4.2.4 Xác định cyclodipeptide 37

4.3 Hoạt tính kháng ung thư 39

4.3.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư của dịch nổi và exopolysaccharide 39

4.3.2 Cơ chế kháng ung thư 43

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Hình thái học của vi khuẩn phân lập 20

Bảng 2 Định danh bằng kit API 50 CHL 20

Bảng 3 Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của dịch nổi Lactobacillus plantarum ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau 23

Bảng 4 Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của hoạt tính kháng khuẩn của dich nổi Lactococcus rhamnosus ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau 25

Bảng 5 Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của hoạt tính kháng khuẩn của dich nổi Lactococcus lactis ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau 26

Bảng 6 Phần trăm hoạt tính của L plantarum sau khi xử lý nhiệt 28

Bảng 7 Phần trăm hoạt tính của L rhamnosus sau khi xử lý nhiệt 29

Bảng 8 Phần trăm hoạt tính của L lactic sau khi xử lý nhiệt 30

Bảng 9 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum 32

Bảng 10 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus rhamnosus. 33

Bảng 11 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactococcus lactis 34

Bảng 12 Hoạt tính ức ché nấm của các phân đoạn chiết cyclodipeptide 38

Bảng 13 Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L rhamnosus PN04 40

Bảng 14 Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L lactis NCR112 41

Bảng 15 Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L plantarum PN06 42

Bảng 16 Hoạt tính chống oxi hoá của dịch nổi và exopolysaccharide L.lactis NCR112. 46

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Sơ đồ, cây phát sinh loài của vi khuẩn sinh axit lactic, bao gồm một số vi

khuẩn gram dương hiếu khí và kỵ khí ngẫu nhiên của phân nhánh G+C thấp, như là các

nhóm Aerococcus, Listeria, Stapphylococcus và Bacillus (màu xám)6 8

Hình 2 Nội dung nghiên cứu của đề tài 11 Hình 3 Phản ứng khử gốc DPPH (gốc tự do) thành DPPH-H 19 Hình 4 Các sản phẩm PCR được khuếch đại Từ trái sang phải: Marker, L1, L2 và L3.

23

Hình 5 Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum ở những thời điểm khác

nhau (24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) 24

Hình 6 Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus rhamnosus ở những thời điểm khác

nhau (24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) 26

Hình 7 Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus lactic ở những thời điểm khác nhau

(24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ) 27

Hình 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng khuẩn của các dịch nổi của L

Hình 13 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactococcus lactis 35

Hình 14 Tinh chế các bacteriocin 36

Hình 15 Sản phẩm PCR của các gene tham gia sinh tổng hộp Nisin của Lactococcus

lactis Từ trái sang phải: NisA, NisB, NisC, NisI, NisT, NisK tương ứng với các giếng 1,

2,3,5,6,7 Giếng 4: đối chứng âm 37

Hình 21 Mức độ biểu hiện mRNA của IL-12 sau khi sử dụng EPS ở chuột 44

Hình 22 Hoạt tính chống oxi hoá của dịch nổi và exopolysaccharide của Lactobacillus

rhamnosus PN04 45

Hình 23 Hoạt tính chống oxi hoá của dịch nổi và exopolysaccharide L.lactis NCR112.

46

LAB Các bacteriocin đã được tinh chế bằng phương pháp dựa vào tính bền nhiệt độ, khả năng kết tủa với ammonium sulfate, lọc gel và kết hợp với ultrafiltration Độ tinh sạch và khối lượng phân tử của các bacteriocin được xác định bằng SDS-PAGE Vì lý do kinh phí

nên một bacteriocin của Lactobacillus plantarum đã được xác định thành phần aminoaxit đầu

N bằng phương pháp Edward degredation Bằng phương pháp phân tích sự đồng nhất của chuỗi protein dựa trên Blast search, kết quả bacteriocin xác định này có độ tương đồng với

plantaricin Nghiên cứu cũng xác định được cyclopeptide có tính kháng nấm Penicillium citrinum Khả năng kháng tế bào ung thư là Hela, HepG2 và MCF-7 được phát hiện thông qua

phương pháp thử invitro với SRB Khả năng kháng ung thư trên chuột gây ung thư cũng đã được thử nghiệm Tác động chống oxi hoá của EPS cũng được xác định để xem mối liên quan với tác động kháng ung thư Tác động này kháng ung thư một phần là do khả năng kích thích hệ miễn dịch thông qua việc sản xuất Interleukin-12 của exopolysaccharide của vi khuẩn được phát hiện được bằng phương pháp realtime RT-PCR.Tuy nhiên, EPS của

Lactobacillus plantarum cho kết quả chống oxi hoá rất yếu Từ kết quả thu được, nghiên cứu

này đã thành công trong việc phát hiện khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư của những vi khuẩn LAB được phân lập từ thực vật và đạt mục tiêu đề ra

Từ khoá: Vi khuẩn sinh axit lactic, hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, bacteriocin,

cyclodipeptide

2

ABSTRACT

In this study, the lactic acid bacteria (LAB) including Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus showed antibacterial activity and anticancer Their

antibacterial activity on indicator bacteria was determined by agar-well diffusion asssay All

LAB strains were capable of inhibiting the growth of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhi and Candida albicans Especially, Lactobacillus plantarum has expressed its antibacterial activity on Vibrio parahemolyticus and Vibrio haryi LAB produced bacteriocin that gave them antibacterial activity The

bacteriocin was purified by the method based on thermal stability, ability of ammonium sulfate precipitation, gel filtration and combined with ultrafiltration Purity and molecular

weight of the bacteriocin was determined by SDS-PAGE Bacteriocin of Lactobacillus plantarum was identified amino acid sequence of N-terminal by the Edward degradation method, however, Lactococcus lactis and Lactobacillus rhamnosus were not identified

because a reason of funding By homogeneity of protein analysis methods based on NCBI Blast search, the results indicated that a determined bacteriocin was similar with plantaricin

The study also detected cyclodipeptide affecting on Penicillium citrinum Hela, HepG2 and

MCF-7 showed anticancer activities, which were detected in-vitro by SRB Anticancer activities were also tested in mouse cancer models Antioxidant effects of EPS were determined to investigate the relationship with anticancer effects This impact was resistant to anticancer because of enabling to stimulate the immune system through the production of interleukin-12 by bacterial exopolysaccharide, which was detected by real time RT-PCR

However, EPS of Lactobacillus plantarum gave a result of very weak antioxidants As these

results, this study was successful in detecting antibacterial, anticancer of LAB bacteria isolated from plants according to the proposal aims

Keywords: Lactic acid bacteria, antibacterial activity, anticancer, bacteriocin,

cyclodipeptide

3

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn Đại học quốc gia đã tài trợ cho đề tài này

Xin chân thành cảm ơn phòng thí nghiệm công nghệ sinh học của trường Đại học quốc

tế TP.HCM đã tạo điều kiện để thực hiện nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn Viện kiểm nghiệm thuốc đã có tạo điều kiện trong việc thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Hiroshima đã có tạo điều kiện trong việc thực hiện đề tài

4

CHƯƠNG 1: LỜI GIỚI THIỆU

Vi khuẩn acid lactic (LAB) là vi khuản Gram dương, có các sản phẩm được sử dụng trong nhiều trong thương mại như các acid vô cơ, acid hữu cơ, bacteriocin và sản xuất exopolysaccharide1, 2, 3, 6 Những vi khuẩn này ức chế vi khuẩn có hại sống ở thức ăn như thịt,

cá, tôm Ngoài ra, vi khuẩn được sử dụng trong thức ăn hàng ngày và rau quả lên men một cách không ý thức Những năm gần đây, nhu cầu tiêu dùng không chỉ có xu hướng tăng cao

về việc sử dụng vi khuẩn phục vụ trong việc tạo mùi hương cho thực phẩm mà còn dựa trên khía cạnh lợi ích về phục hồi sức khỏe và điều trị bệnh23 Những hoạt tính ức chế của LAB là

do khả năng sản xuất các chất chuyển hoá khác nhau Những chất này là acid vô cơ như lactic acid và những chất giống như acetic acid, H2O2, bacteriocin, những chất giống bacteriocin, diacetyl và CO217 Việc nghiên cứu những chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn cho trong việc duy trì sức khỏe và để ngăn ngừa bệnh tật là cần thiết Do đó, phát hiện những chủng vi khuẩn mới với những đặc tính ưu việt hơn thì ngày càng được quan tâm do tính năng của những vi khuẩn LAB sống trong đường ruột của người, sữa, nước bọt còn nhiều yếu điểm như độ sống sót trong các dạng bào chế thuốc, thực phẩm Các thành phần như enzyme, các hợp chất polymer ở LAB chưa được nghiên cứu sâu Mới đây, có vài nghiên cứu về nhóm LAB có thể được dùng trong điều chế vaccine, trị cholesterol, trị ung thư Tuy nhiên, những

nghiên cứu này chỉ mới là bắt đầu

Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tập trung vào việc phân lập LAB có nguồn gốc từ thực vật nhằm phát huy những đặc điểm của những chủng vi khuẩn này do sự thích nghi trong hoàn cảnh sống phức tạp của những vi khuẩn này Để từ đó, tạo ra những probiotic tốt hơn với những thành phần có khả năng ứng dụng cao hơn cho con người

MỤC TIÊU:

▪ Phát hiện hoạt tính kháng khuẩn

▪ Phát hiện hoạt tính kháng ung thư

Một nhà khoa học người Nga, Parker đoạt giải Nobel làm việc tại Viện Pasteur đã đề nghị tính phụ thuộc của vi khuẩn đường ruột trên thức ăn và làm cho nó thay thế nguồn vi khuẩn hại Từ "probiotic" không được quan tâm mãi đến 196019 Sau đó, Parker đã xác định probiotic tham gia vào cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột Tuy nhiên, Fuller đã lọc lại probiotic là vi khuẩn sống tác động có lợi lên động vật bằng cách cải thiện sự thăng bằng vi khuẩn đường ruột11,23 Cho đến ngày nay, chế phẩm sinh học (probiotic) được đinh nghĩa như

là các vi sinh vật sống, và nếu được sử dụng với một lượng thích hợp, đều gây ra ảnh hưởng đến sức khỏe của sinh vật chủ23

Một số nghiên cứu đã trực tiếp sử dụng các vi khuẩn được phân lập từ hệ tiêu hóa như các probiotic27 Có nhiều loại vi sinh vật đã được tận dụng làm probiotic không chỉnh những

vi khuẩn sinh axit lactic (Lactobacilli, Streptococci, Enterococci, Lactococci, Bifidobacteria)

mà còn là những dòng Bacillus và nấm (Saccharomyces hay Aspergillus) Hiện nay, một số loài thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium là được sử dụng nhiều Những quan tâm về

môi trường đường ruột là cần thiết để có thể hiểu được các ứng dụng của probiotic đến sức khỏe của con người23, 24

Probiotic là được sử dụng rất phổ biến nhưng cách tiếp cận này có thể gặp nhiều khó khăn liên quan đến khả năng sống sót trong hệ sinh thái đường ruột và trong động vật chủ Để tồn tại trong điều kiện cơ thể, vi khuẩn phải vượt qua một số rào cản vật lý và hóa học trong đường tiêu hóa, bao gồm axit dạ dày và các dịch tiết axit mật

2.1.2 Công dụng của Probiotic

Có nhiều nguyên nhân con người thích dùng probiotic Tuy nhiên, LAB được chỉ định dùng trong:

• Ngăn ngừa và xử lý tiêu chảy, bao gồm cả tiêu chảy do nhiễm khuẩn

6

• Phục hồi môi trường vi khuẩn thân thiện bị phá hủy bởi việc sử dụng thuốc kháng sinh

• Tăng cường tiêu hóa và ngăn chặn vi khuẩn có hại

• Ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn có hai trong ruột

• Làm giảm sự nhiễm khuẩn âm đạo và đường tiết niệu

• Tăng khả năng tiêu hóa, hấp thu lactose ở người không có khả năng dung nạp lactose

• Tăng cường khả năng miễn dịch

• Làm giảm các bệnh do dị ứng, ví dụ hen suyễn, sốt mùa hè, dị ứng thực phẩm

và bệnh ở da như eczema

• Ngăn ngừa ung thư ruột và nhiễm khuẩn Helicobacter pylori, loại vi khuẩn gây

lây lan nhiễm loét

2.1.3 Các yều cầu đối với Probiotic

Probiotic có thể được sử dụng làm chế phẩm bổ sung để cung cấp vi khuẩn sống cho quá trình tiêu hóa qua đường uống Để có được những lợi ích này chúng phải:

• Được dùng đúng dòng vi khuẩn, có nguồn gốc từ con người, sống trong ruột

• Đầy đủ số lượng Liều lượng dùng thấp nhất mỗi ngày phải từ 108-109 tế bào

• Không đưa vào cơ thể những vi khuẩn cơ hội gây bệnh như: Samonella typhi, Escherichia coli… và có khả năng sống sót trong môi trường ruột, nơi có pH từ

1 đến 4

• Có khả năng sống sót ở ruột non, nơi nồng độ muối mật có thể lên đến 2% Khả năng dung nạp acid và dịch mật tùy thuộc vào từng chi, họ và loài Hầu hết vi khuẩn có nguồn gốc từ người đều có khả năng tồn tại trong môi trường acid và

dịch mật L rhamnosus và L plantarum là hai loại vi khuẩn có khả năng dung nạp này tốt nhất; trong khi L bulgaricus không có khả năng sống trong môi

trường này

• Có khả năng kháng lại kháng sinh vì probiotics là những vi khuẩn sống được dùng làm chế phẩm bổ sung, chúng có thể bị mất đi do việc sử dụng thuốc

Vì vậy, những vi khuẩn probiotic đạt yêu cầu phải:

• Đựơc xác định đúng chi, họ, loài

• Đầy đủ số lượng

• Có khả năng dung nạp axit và dịch mật

• Có khả năng kết dính trong ruột người

• Có khả năng đề kháng kháng sinh26

• Không chuyển gene đề kháng kháng sinh sang vi khuẩn khác

• Không chứa vi khuẩn cơ hội gây bệnh độc hại

Mặc dù đã có một số tiêu chuẩn của một probiotic, không một probiotic nào có khả năng sở hữu tất cả các thuộc tính nói trên Hơn nữa, các thuộc tính của probiotic là đặc trưng theo dòng vi sinh vật, và các kết quả của dòng probiotic này không thể phản ánh tính chất của dòng khác, thậm chí là đối với dòng liên quan mật thiết Vi khuẩn được sử dụng như các sản

phẩm của probiotic bao gồm các dòng vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium, vi khuẩn Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcuslactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcusacidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Bacillus cereus, Propionibacterium freudenreichii, Saccharomyces cerevisiae, và Saccharomyces boulardii Tuy nhiên, chỉ có Lactobacilli và Bifidobacteria là hai chủng vi khuẩn được sử

dụng phổ biến nhất cho con người

Mặc dù Lactobacilli được phân loại như là các vi khuẩn thuộc nhóm GRAS, điều quan

trọng là vẫn phải đánh giá độ an toàn của những vi khuẩn này bởi vì tính kháng thuốc nghiêm trọng của các chủng vi khuẩn này đôi khi đã được báo cáo Các chủng vi sinh vật làm probiotic có thể chuyển gen kháng vào các vi khuẩn gây bệnh Do đó, các tính chất nhạy cảm với thuốc, đặc biệt là tính nhạy cảm với các kháng sinh của các chủng làm probiotic trên thị

trường cần được kiểm tra mạnh mẽ Mặc dù chủng Lactobacilli được dùng nhiều trong việc

bảo vệ một cách có hiệu quả sức khỏe con người, vẫn có một bằng chứng rõ ràng cho rằng

Lactobacilli từ các nguồn gốc khác nhau mang các đặc tính của probiotic ở các mức khác

8

nhau Để tồn tại và nhân giống trong hệ tiêu hóa, vi khuẩn nên thể hiện mức chịu đựng ở cấp

độ cao đối với môi trường axit và dịch mật, và cũng như thể hiện khả năng bám dính bề mặt thành ruột Sự kháng kháng sinh của những vi khuẩn gây bệnh đang là một vấn đề y tế ngày càng gia tăng, và cũng dấy lên những câu hỏi về việc kiểm tra tính nhạy cảm của kháng sinh

Do đó, chúng ta nên nghiên cứu phát triển các chủng vi sinh vật mới và đánh giá độ an toàn cùng những thuộc tính của probiotic nhằm tạo những probiotic hứa hẹn

2.2 Lactic acid bacteria (LAB)

2.2.1 Phân loại và tính chất sinh lý của LAB

LAB là các trực khuẩn và cầu khuẩn gram dương, không hình thành bào tử, là các vi khuẩn yếm khí đòi hỏi lên men carbohydrate và chủ yếu sản xuất axit lactic trong suốt quá trình lên men đường Mặc dù có sự thay đổi thường xuyên trong sự phân loại LAB, các chi vi

khuẩn vẫn được chấp thuận rộng rãi bao gồm: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Treptococcus, Tetragenococcus, Vagocccus và Weissella (Hình 1)

Hình 1 Sơ đồ, cây phát sinh loài của vi khuẩn sinh axit lactic, bao gồm một số vi khuẩn

gram dương hiếu khí và kỵ khí ngẫu nhiên của phân nhánh G+C thấp, như là các nhóm

9

Thông thường,vi khuẩn LAB là những vi khuẩn sống trong môi trường có nhiệt độ vừa phải, nhưng chúng cũng có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 đến 45C, và có thể sống tốt trong cả hai môi trường axit và kiềm Chúng sản xuất một loạt các sản phẩm, chủ yếu là các axit hữu

cơ, rượu và carbon dioxide, mặc dù chúng thường tạo ra các phân tử thơm, vitamin và peptide hoạt tính sinh học Các axit hữu cơ (lactic, axetic và propionic axit) có tác dụng đối kháng trong đường ruột nhờ sự ức chế của các quá trình vận chuyển tích cực, các phản ứng và việc sửa đổi điện thế màng của chúng Sự thiếu enzyme catalase của LAB gây ra sự tích tụ hydrogen peroxide (H2O2), có khả năng ức chế vi khuẩn và nấm5

Một số dòng LAB mới có khả năng sản xuất hợp chất protein với tính chất đáng chú ý trong việc kháng khuẩn, được biết đến như là các bacteriocin

2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sinh axit lactic

Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sinh axit lactic là gây ra bởi các loại protein kháng khuẩn (bacteriocin), được sản xuất bởi các vi khuẩn, có khả năng giết chết hay tác động ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn Các dòng vi khuẩn sản xuất ra một hay nhiều chất kháng khuẩn, trong đó có dicyclic peptide và bacteriocin Nhiều vi khuẩn sinh axit lactic được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm cũng sản xuất ra bacteriocin Thật vậy, bacteriocin có thể được xem như một hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể giúp thực phẩm để

tự bảo vệ chống lại sự nhiễm khuẩn và/hoặc là kết quả tự nhiên của hệ đường ruột Mặc dù

bacteriocin được xác định nhiều ở một số chủng như Lactobacoccus lactis, Lactobacillus rhamnosus, Enterococcus sp, Lactobacillus plantarum, các bacteriocin có thể khác nhau ở

những chủng có nguồn gốc khác nhau Lợi ích của những bacteriocin này là peptide có kích thước nhỏ, hoạt động của chúng trực tiếp hướng đến màng tế bào, dễ tiêu hóa trong ruột của con người, không độc hại và không gây ra bất kỳ dị ứng nào Vì những tính chất này, các hoạt tính kháng khuẩn cũng được yêu cầu trong các chế phẩm sinh học16, 28, 36 Một loại peptide có phân tử lượng nhỏ khác là cyclodipeptide mới đây cũng đã được phát hiện ở vi khuẩn sinh axit lactic Các cyclodipeptide này cũng có tính kháng khuẩn, kháng nấm, đặc biệt các cyclodipeptide có proline tham gia tác động kháng ung thư

2.2.3 Tác động chống ung thư

Mới đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung những đặc tính kháng ung thư và oxi hoá nhằm ngăn ngừa bệnh cho con người5 Mặc dù những chất tổng hợp có hoạt tính kháng ung thư và kháng oxi hoá19, 41, 47, những chất này không những đắt mà tính bền và an toàn vẫn còn nghi

10

ngờ37 Nhiều báo cáo nói rằng LAB trong sữa có hoạt tính chống ung thư14, 33 Qua thử nghiệm in vitro, hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của LAB sau khi diệt bằng nhiệt

Lactobacillus acidophilus và Lactibacillus casei có tác động trên dòng tế bào ung thư

ruột LS-51337 Cũng có những nghiên cứu sử dụng mô hình chuột để nghiên cứu LAB trong tác động kháng ung thư ruột26

EPS của Bifidobacteria và Lactobacilli tham gia vào việc ngăn ngừa bệnh ung thư, tăng

khả năng miễn dịch và làm giảm những men gây đột biến như β-glucuronidase, nitroreductase and chologlycine hydrolase42, 46 EPS của LAB còn cải thiện việc phóng thích thuốc trị ung thư

2.3 Các sản phẩm probiotic ở Việt nam

Việc sử dụng các probiotic như các loại thuốc điều trị đã được sử dụng rộng rãi như để tăng cường sức khỏe cho con người ở Việt Nam38 Mặc dù probiotic đã được biết đến và đã được sử dụng trên toàn thế giới nhưng những đánh giá về chất lượng ở Mỹ và châu Âu đã chỉ

ra mối tương quan nghèo nàn giữa những nội dung công bố và nội dung thực tế Vì thành phần của hệ sinh vật đường ruột vẫn chưa được biết đến hết, sự hiểu biết về các chức năng probiotic đã bị cản trở

Ngoài ra, các sản phẩm tinh sạch của probiotic chưa được triển khai Do đó, nghiên cứu

và khai thác các thành phần của probiotic là cần thiết

11

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

3.1 Nội dung nghiên cứu

Probiotic được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và ngành Dược Nghiên cứu các chất kháng khuẩn và kháng ung thư là cần thiết Vì vậy, nội dung nghiên cứu như hình 2

Hình 2 Nội dung nghiên cứu của đề tài 3.2 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện các nội dung nghiên cứu đặt ra, phương pháp nghiên cứu được đặt ra theo thứ tự như sau:

- Phân lập và xác định vi khuẩn sinh axit lactic

- Khảo sát tác động và xác định sơ bộ thành phần tác động lên vi sinh vật gây bệnh

- Khảo sát tác động lên tế bào ung thư và xác định sơ bộ thành phần tác động lên tế bào ung thư

3.2.1 Phân lập và xác định vi khuẩn

3.2.1.1 Phân lập vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy

Rau củ và thực phẩm được thu thập ở thành phố Hồ chí minh Nguồn này được vận chuyển đến phòng thí nghiệm của trường Đại học quốc tế

Khảo sát sơ bộ các thành phần tác động lên tế bào

ung thư và vi sinh vật gây bệnh Khảo sát tác động lên tế bào ung thư Khảo sát tác động lên vi sinh vật gây bệnh Phân lập và xác định được vi khuẩn axit lactic có

nguồn gốc Việt nam

12

Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic theo Schillinger và Rodriguez, sử dụng môi trường thạch de Man Rogosa Sharpe (MRS) hoặc lỏng (Merck, Darmstadt, Germany) Cụ thể là, 10g mẫu được trộn với 90 ml NaCl (0.9%) để có tỉ lệ 1/10 Các dung dịch được lắc trong 10 phút để đồng nhất tất cả các chất không hòa tan Sử dụng 1 ml dung dịch pha loãng trải đều trên thạch MRS và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30 °C trong 48 giờ 31

để phân lập Chọn các khuẩn lạc đặc trưng tiếp tục cấy truyền trên thạch MRS để làm thuần Các khuẩn lạc thuần khiết được kiểm tra bằng kính hiển, phản ứng catalase, khả năng di động, hình dạng, kích thước và màu sắc, thử hoạt tính kháng khuẩn Các khuẩn lạc có hoạt tính kháng khuẩn sẽ được định danh bởi các đặc tính sinh hóa bởi bộ kit API CHL 50 (BIOMERIEUX, Lyon, Pháp) và được giải trình tự gen rRNA 16S

3.2.1.2 Định danh

3.2.1.2.1 Thử nghiệm sinh hoá

Bộ kit API 50CH (API Laboratory Products Ltd Biomerieus Saa, France) đã được sử dụng để xác định quá trình chuyển hoá của một số men và carbohydrate Thí nghiệm được thực hiện tại 37oC Kết quả thử nghiệm sinh hóa đã được xác định sau 24 - 48 giờ theo chỉ dẫn của bộ kit API 50CH để xác định các chủng vi khuẩn Các khuẩn lạc được cho vào ống API 50 CHL của bộ kit cho đến khi độ đục đã được điều chỉnh đến 2,0 McFarland thì dịch treo này sẽ được cho đầy vào các giếng của bộ kit Parafin được cho vào từng giếng và ủ ở

30oC Kết quả đã được quan sát quá trình tạo axit và ghi nhận sau 24h và 48h Kết quả dương tính nếu axit tạo được làm cresol đổi màu tím thành màu vàng hoặc xanh tuỳ theo mức độ

3.2.1.2.2 Định danh bằng gen rRNA 16S

13

Phản ứng được thực hiện như sau: 1 cycle/5 phút/95oC, sau đó là 35 cycle và mỗi cycle là 1 phút/95oC, 2 phút/55oC và 2 phút/72oC Sau chu kỳ 35, phản ứng được để thêm 15 phút/72oC Sản phẩm PCR được tinh chế và được giải trình tự ở công ty Nam Khoa Biotek Trình

tự của những chủng cần xác định được so sánh với trình tự của những chủng có nguồn gốc gần dựa trên dữ liệu trình tự gene trong GenBank

3.2.2 Khảo sát tác động lên vi sinh vật gây bệnh và xác định sơ bộ thành phần kháng

vi sinh vật

3.2.2.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB

LAB được nuôi trong môi trường De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics,

Beauvais, India) và được ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí (pH 6.5) Đo OD tại bước sóng

600 nm sau mỗi 2 giờ để từ đó xác định giai đoạn tăng trưởng

3.2.2.2 Nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh

Một khuẩn lạc đơn thuần của vi sinh vật gây bệnh được cấy truyền trong 10 ml LB lỏng

ở 37oC trong 24 giờ15 Các chủng chỉ thị được thử nghiệm ở 6 nồng độ pha loãng từ 10-1-10-6 Theo phương pháp của Deegan et al (2006), vi khuẩn đối chứng hoặc vi khuẩn chỉ thị được nuôi cấy trên môi trường NA trên đĩa petri sau đó bổ sung dịch vi khuẩn đối chứng trên một

lỗ thạch đục lỗ (d=5mm), nhằm so sánh với các lỗ thạch chứa dịch khuẩn LAB trong điều kiện ủ các đĩa ở 37oC trong 24 giờ

3.2.2.3 Chuẩn bị mẫu để thử kháng vi sinh vật

LAB được nuôi trong môi trường De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics, Beauvais, India) và được ủ ở 37oC Những dịch nuôi cấy vi khuẩn này sau đó được thu nhận

ở các giai đoạn ủ khác nhau và được ly tâm 10.000 rpm trong 30 phút để tách vi khuẩn và dịch nuôi Phần nước trong của dịch sau ly tâm được bổ sung enzyme catalase (Sigma Chemical Co., Dorset, England) với nồng độ 100U để loại trừ ảnh hưởng của hydrogen peroxide trước khi thử kháng vi sinh vật Phần kết tủa được rửa sạch với nước cất vô trùng 3 lần để loại bỏ hoàn toàn phần dịch sau ly tâm Tiếp theo đó, phần kết tủa này được sử dụng

để kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của LAB

3.2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật

Đối với phần dịch nổi, tính kháng vi sinh vật được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch17 Nhỏ 20 µl dịch huyền phù vi sinh vật gây bệnh và quét đều trên bề mặt

Vòng tròn kháng khuẩn quanh giếng và đĩa được đo bằng thước đo vòng kháng theo đơn vị milimet Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

3.2.2.5 Khảo sát tính chất của bacteriocin

3.2.2.5.1 Tính nhạy cảm với nhiệt độ

Để kiểm tra tính chất này, 1ml dịch nổi của LAB được để tại nhiệt độ phòng, 60°C,

80oC trong 30 phút, và 100oC trong 20 phút, and 121oC trong 15 phút27, 29, 45 Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của các dịch nổi sau khi xử lý qua các nhiệt độ bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch Mỗi thí nghiệm có độ lặp lại 3 lần

3.2.2.5.2 Tính nhạy cảm với pH

Để kiểm tra tính nhạy cảm với pH, 1ml dịch nổi của LAB được bổ sung với NaOH 0.1N và HCl 0.1N để được các giá trị pH khác nhau (2, 3, 4, 5, 7, 9) 27, 29, 45 Những dịch này được tiến hành kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

Môi trường MRS lỏng được sử dụng như là mẫu chứng âm Mỗi thí nghiệm có độ lặp lại 3 lần

3.2.2.5.3 Tính nhạy cảm với enzyme

Dịch trong của LAB được bổ sung với enzyme proteinase K (pH 7, Sigma, Singapore) nồng độ 2 mg/ml, ở 37°C trong 2 giờ và sau đó được xử lý với nhiệt độ 100oC trong 5 phút Những dịch này sau khi đã được xử lý này được tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

Mẫu không xử lý với enzyme như trên được sử dụng làm mẫu đối chiếu Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần

15

3.2.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và môi trường pH lên quá trình sản xuất bacteriocin

3.2.2.6.1 Nhiệt độ ủ

Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và sản xuất

bacteriocin, các vi khuẩn LAB sinh trưởng đến pha cân bằng trong chu kỳ phát triển của vi

khuẩn LAB với tỷ lệ 1% (v/v, 105 - 106 CFU/ml) trong môi trường MRS lỏng và được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ phòng, 37oC, 40oC và 50oC) 13 Phần dịch nổi của LAB đã được

xử lý này sau đó được sử dụng vào quá trình kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần

60 và 80% Các kết tủa của mỗi trường hợp đã được xử lý này tiếp tục được hòa tan trong nước được khử trùng như mô tả ở trên sau khi ủ qua đêm ở 4C Sử dụng 160 µl của những phần dịch nổi và cả phần dịch nổi để phát hiện hoạt tính kháng vi sinh vật Phân đoạn có hoạt tính sẽ được tinh chế qua cột lọc gel Sephadex và ultrafiltration Các bacteriocin được kiểm tra độ sạch và xác định khối lượng phân tử bằng SDS-PAGE Mỗi thử nghiệm được thực hiện trong ba lần

3.2.2.9 Xác định amino axit đầu N

Bacteriocin tinh sạch sẽ được chuyển lên màng PVDF bằng phương pháp Trans-Blot Màng PVDF được gửi sang Nhật để xác định amino axit đầu N bằng phương pháp Edward degradation

3.2.2.10 Phát hiện gene liên quan đến bacteriocin

Để xác định sơ bộ các bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic phân lập được có giống với các vi khuẩn lactic cùng chủng loại, các gene này được xác định nhờ phương pháp PCR, với thiết kế các cặp mồi dựa trên các đoạn gene liên quan đến bacteriocin được xác

định trên NCBI Đối với Lactococcus lactis, dùng các cặp mồi của NisA, NisB, NisC, NisK, NisT, NisI Đối với Lactobacillus rhamnosus và Lactobacillus plantarum, dùng các cặp mồi

ứng cới rhamnosin và plantaricin Phản ứng PCR được thực hiện bằng phương pháp Newton and Graham trên máy PCR (Eppendorff) Mỗi ống phản ứng có thể tích 50 µl gồm 1x amplification buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2 và 0.1% Triton X-100, Takara, Co Ltd.), 200 µmol dNTP (Takara Co.Ltd.), 20 pmol mồi và Taq polymerase 1U (Takara Co Ltd.), 200 ng DNA Phản ứng được thực hiện như sau: 1 cycle/5 phút/95oC, sau đó là 35 cycle và mỗi cycle là 1 phút/95oC, 2 phút/55oC và 2 phút/72oC Sau chu kỳ 35, phản ứng được để thêm 15 phút/72oC Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng phương pháp điện di Sự hiện diện các sản phẩm PCR cho thấy có sự giống nhau hay khác biệt của các bacteriocin ở chủng phân lập được và các chủng đã có trước đó

3.2.2.11 Xác định cyclopeptide

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường MRS, sau đó, các dịch nổi được thu lại Lắc với chloroform theo các tỉ lệ 50:50, 75:25, 25: 75 (dịch nổi:chloroform) Các lớp chloroform thu lại Bay hơi chloroform Hoà cắn với nước Kiểm tra tính kháng nấm Penicillium citrinum Thêm ethylacetate mẫu nước kháng nấm Tách lấy lớp ethyl acetate Bay hơi ethylacetate Hoà cắn vào nước Kiểm tra tính kháng nấm Mẫu nước sẽ được tinh

17

chế bằng HPLC, cột C18, pha động: acetonitrile: nước (95:5), thu được các phân đoạn Thử tính kháng nấm Xác định cyclopeptide của phân đoạn kháng nấm cao nhất

3.2.3 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư và xác định sơ bộ thành phần tác động lên

tế bào ung thư

3.2.3.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB

LAB được nuôi trong môi trường De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics, Beauvais, India) và được ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí (pH 6.5) Đo OD tại bước sóng

600 nm sau mỗi 2 giờ để từ đó xác định giai đoạn tăng trưởng

3.2.3.2 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư

3.2.3.2.1 Nuôi cấy tế bào

Các tế bào HepG2, HeLa, MCF-7 (Sigma) đã được nuôi trong RPMI 1640 (Invitrogen) chứa 10% FCS (Sigma), 25 mM HEPES (Sigma) và 2 mM glutamine (Sigma) ủ trong CO2

(5%) khoảng 48 giờ Mỗi dòng tế bào ung thư được thêm vào trong đĩa 96-giếng (1.0 x 104 tế bào trong 1 giếng) Sau khi ủ 24 giờ, 5, 10, 15, 20 và 25 mg/mlWSPES được thêm vào mỗi giếng, đem ủ CO2 (5%) trong 48 giờ tại 37oC Sau đó, 50 ml TCA (50%) được cho vào từng giếng có chứa sẵn 200 μl môi trường để đạt được nồng độ cuối là TCA (10%) trong từng giếng, để yên đĩa mẫu 96-giếng trong 1 giờ ở 4C cho phép tế bào cố định

Sau 1 giờ ủ, môi trường nuôi cấy trong mỗi giếng được loại bỏ, các giếng sau đó được rửa sạch nhẹ nhàng với nước 5 lần (200 μl/giếng) và để khô ở nhiệt độ phòng từ 12-24 tiếng Dung dịch SRB (0.2%) được thêm vào mỗi giếng và để tiếp ở nhiệt độ phòng trong 5-20 phút nữa Sau đó, rửa sạch 5 lần các đĩa bằng axit axetic (1%) để loại bỏ hoàn toàn SRB không liên kết Để khô đĩa 96-giếng trong 12-24 giờ trước khi thêm 200 μl Trizma-base (10 mM) để hòa tan SRB Cuối cùng, đặt đĩa 96-giếng lên máy lắc ít nhất là 10 phút Đo độ hấp thu ở bước sóng 492 nm và 620 nm theo phương pháp ELISA (Molecular Devices, Synnyvale, CA, USA) DMSO được sử dụng làm mẫu đối chứng âm Tỷ lệ phần trăm tế bào sống được tính theo công thức:

% Độc tế bào =

18

3.2.3.2.2 Đánh giá hoạt tính chống tế bào ung thư ở chuột (in vivo)

Để thuận tiện cho việc nghiên cứu sự thay đổi khối u trược và sau khi dùng LAB, chuột được tiêm một lượng tế bào ung thư vú MCF-7 và đợi cho đến khi thể tích khối u được 30

mm3 thì được chích dịch nổi của LAB Sử dụng PBS để tiêm chuột nhằm làm mẫu đối chứng Theo dõi trong 3 tuần về kích thước khối u và lượng bạch cầu Cứ sau 2 ngày, huyết thanh và

mô chuột sẽ được sử dụng để chiết RNA Lượng RNA sẽ được sử dụng để thực hiện phản ứng realtime RT-PCR nhằm định lượng mRNA của Interleukin-12

3.2.3.3 Xác định sơ bộ các chất kháng ung thư

3.2.3.3.1 Polysaccharide

3.2.3.3.1.1 Chiết xuất polysaccharide

LAB được nuôi cấy trong De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics, Beauvais, India) và được ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí; thu nhận các dịch trong của LAB

tại các pha tăng trưởng khác nhau sau khi ly tâm 10000 rpm trong 30 phút để tách phần khuẩn với phần dịch nổi của môi trường nuôi cấy Phần dịch nổi này được kết tủa bằng cách thêm 3 lần thể tích ethanol tuyệt đối (EtOH) ở 4oC, và để các mẫu qua đêm Hôm sau, ly tâm

10000 rpm trong 30 phút Phần kết tủa này được hoà tan với nước cất và được tiếp tục kết tủa với 3 lần thể tích EtOH ở 4oC Dung dịch để qua đêm, và hôm sau tiếp tục được ly tâm thu tủa, đó chính là các exopolysaccharides (WSPES) tan trong nước Sản phẩm được sấy khô ở

60oC đến khối lượng không đổi WSPES được lọc qua màn lọc 0.22 μm (Millipore, Bedford, Mass.) và được trữ đông ở -80oC đến khi sử dụng

3.2.3.3.1.2 Đánh giả khả năng kháng tế bào ung thư của EPS

EPS của LAB sau khi phân đoạn, được đem thử tác dụng lên tế bào ung thư Bằng phương pháp SRB và thử nghiệm trên chuột theo quy trình như đối với dịch nổi

3.2.3.3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH

Khả năng khử gốc tự do DPPH (Sigma-Aldrich) của methanol được xác định theo phương pháp của Patel với một vài hiệu chỉnh nhỏ39, 41 Phương pháp DPPH dựa trên khả năng khử gốc DPPH, một dạng gốc tự do bền có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, dạng tự do bền sẽ bắt cặp với một hydro (ví như, một chất chống oxi hóa khử gốc tự do) và bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine

19

(DPPH-H), có màu vàng Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa và DPPH-H tạo được (Hình 3), phản ứng mất màu tím

và tạo màu vàng Sự mất màu càng nhiều thì khả năng khử càng cao

Để thực hiện phản ứng, 4,3 mg DPPH được hòa tan trong 3,3 ml methanol, DPPH được bảo quản trong bóng tối, tránh sáng Lấy 150 ml dung dịch DPPH rồi bổ sung thêm 3 ml methanol và đo độ hấp thu quang học ở bước sóng 517 nm, đây là mẫu đối chứng âm Lấy

50 ml của mẫu thử nghiệm (10 mg/ml) và mẫu đối chứng là axit ascorbic ở các nồng độ khác nhau được bổ sung với methanol tới thể tích 150 ml Mỗi một mẫu kiểm tra sau đó được pha thêm với 3 ml methanol và 150 ml DPPH Đo độ hấp thu sau 12 giờ tại 517 nm, sử dụng methanol như là mẫu trắng (UV-visible spectrometer Shimadzu, UV-1601, Japan) Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:

(DPPH) + H-A → DPPH-H + A

(tím) (vàng)

Hình 3 Phản ứng khử gốc DPPH (gốc tự do) thành DPPH-H 3.2.4 Phân tích thống kê số liệu

Phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) đã được sử dụng để tính toán các trị số trung bình và độ lệch chuẩn trong các thí nghiệm Ý nghĩa thống kê về sự khác biệt quan sát được đánh giá qua bằng cách phân tích phương sai một chiều (ANOVA one-way)

Sự khác biệt ở mức P<0,05 được coi là có ý nghĩa

N N

Bảng 1 Hình thái học của vi khuẩn phân lập

Khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau được xác định bằng cách sử dụng API

50 CHL để kiểm tra Tất cả họ đều có thể sản xuất axit từ chất nền khác nhau (Bảng 2) Định

danh ban đầu được thực hiện bởi cơ sở dữ liệu tương quan của API chỉ ra rằng Lactococcus lactis (L1), Lactobacillus rhamnosus (L2), Lactobacillus plantarum (L3) (Bảng 2) Trong

bảng 2, cả ba chủng có thể lên men lactose để tạo thành axit Chủng L1 có thể sử dụng glycerol, D-arabinose, L-arabinose, ribose và D-Xylose, galactose, glucose, fructose, mannose, rhamnose, α-Methyl-D-Glucoside trong khi chủng L2 thì fructose, mannose, Rhamnose, Dulcitol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, α-Methyl-D-Mannoside Chủng L3 có thể

sử dụng glycerol, L-arabinose, ribose và D-Xylose, galactose, glucose, fructose, mannose, rhamnose, sorbitol, rhamnose, α-Methyl-D-Glucoside Với khả năng sử dụng nguồn carbon khác nhau, có thể phân biệt được các LAB

Bảng 2 Định danh bằng kit API 50 CHL