Nghiên cứu phương pháp sản xuất và tính năng của FPI (fish protein isolate) từ phụ phẩm cá tra

TÓM TẮT Với mục tiêu khai thác tính năng công nghệ và giá trị sinh học của protein cá Tra Pangasius hypophthalmus, luận án “Nghiên cứu phương pháp sản xuất và tính năng của FPI Fi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CAO XUÂN THỦY

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TÍNH NĂNG

CỦA FPI (FISH PROTEIN ISOLATE) TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP HỒ CHÍ MINH NĂM 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CAO XUÂN THỦY

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ TÍNH NĂNG CỦA FPI (FISH PROTEIN ISOLATE)TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA

Chuyên ngành: Chế biến thực phẩm và đồ uống

Mã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: GS.TS Trần Thị Luyến

Phản biện độc lập 2: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm

Phản biện 1: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Phản biện 2: PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

Phản biện 3: PGS.TS Phạm Văn Hùng

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS Trần Bích Lam

2 GS.TS Hà Thanh Toàn

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất

cứ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

Cao Xuân Thủy

TÓM TẮT

Với mục tiêu khai thác tính năng công nghệ và giá trị sinh học của protein cá Tra

(Pangasius hypophthalmus), luận án “Nghiên cứu phương pháp sản xuất và tính năng

của FPI (Fish Protein Isolate) từ phụ phẩm cá Tra” đã khảo sát quá trình thủy phân phụ

phẩm cá Tra bằng enzyme alcalase 2.4L dưới các điều kiện thủy phân được kiểm soát chặt chẽ; nghiên cứu tính năng công nghệ, hoạt tính sinh học của FPI và ứng dụng công nghệ lọc màng để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi Luận án đã đạt được một số kết quả chính như sau:

YBọt = 93,39 + 0,33X1 + 1,06X2 + 0,99X4 – 0,51X1 – 1,74 X2 – 0,36X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4

YNhũ = 29,93 + 0,41X1 + 1,05X2 + 1,16X4 – 1,17X1 – 1,07 X2 + 1,27X3 –1,13X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4

YCa = 30,36 + 1,19X2 + 0,76X4 – 0,55X1 – 1,02 X22 – 0,54 X42 + 0,42X1X3 + 0,45X1X4+ 1,27X2X3 – 0,42X2X4 – 1,05X3X4

 Xác định được mối tương quan giữa kích thước phân tử của FPI phụ phẩm cá tra với tính năng ứng dụng của nó Nhóm protein trong FPI có khả năng tạo nhũ tốt có phân tử lượng từ 7 đến 10kDa Nhóm protein có khả năng tạo bọt tốt có phân tử lượng từ 5 đến 7kDa Riêng hoạt tính cố định canxi của FPI được xác định bởi các protein có kích thước nhỏ (nhỏ hơn 5 kDa) FPI cá tra có hoạt tính cố định canxi rất tốt, khả năng cố định canxi thực tế của FPI đạt 38,36mg Ca2+/g FPI, trong đó có trên 94% liên kết giữa Ca+2 với FPI tạo được cấu trúc EF-hand

(2)Về mặt thực tiễn

 Xây dựng được quy trình công nghệ thu nhận các sản phẩm FPI có giá trị cao từ phụ phẩm chế biến cá Tra gồm phương pháp thủy phân giới hạn và phương pháp lọc màng phân riêng các nhóm phân tử

 Đã sử dụng thành công quá trình lọc nano với 2 loại màng là GE-5-DL, 5 kDa và SRM 347, 10 kDa; xác định các điều kiện tối ưu để phân riêng và thu nhận các FPI

có khả năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi cao nhất Hiệu suất thu hồi protein sau lọc màng cao nhất ở màng GE-5-DL (màng 5 kDa) là 76,06% trong điều kiện vận hành: nhiệt độ 450C, lưu lượng 34 L/h, áp suất 25 bar Hiệu suất thu hồi protein sau lọc màng cao nhất ở màng SRM 347 (màng 10 kDa) khi sử dụng để thu hồi FPI có tính năng tạo bọt là 64,02% trong điều kiện vận hành: nhiệt độ là 350C, lưu lượng

39 L/h, áp suất: 22 bar Khi sử dụng màng SRM 347 để thu hồi FPI có tính năng tạo nhũ, hiệu suất thu hồi protein cao nhất đạt 65,31% trong điều kiện vận hành: nhiệt độ 400C, lưu lượng 44 L/h, áp suất: 22 bar

 Khả năng tạo bọt của FPI từ phụ phẩm chế biến cá Tra tối đa đạt 112,18%, tương đương với khả năng tạo bọt của WPI và cao hơn SPI Khả năng tạo nhũ của FPI tối

đa đạt 39,88%, cao hơn khả năng tạo nhũ của SPI và WPI Đặc biệt là khả năng cố định canxi của FPI rất cao Các khám phá này mở ra nhiều hướng ứng dụng mới của FPI cá tra trong công nghiệp thực phẩm

Những kết quả trên bước đầu tạo tiền đề cho việc triển khai công nghệ, ứng dụng vào thực tế, đồng thời là nguồn tham khảo tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo trong cùng lĩnh vực

(1) The theoretical results

 Researching successfully the hydrolysis process, identify rules affected by

technical parameters during hydrolysis of Pangasius hypophthalmus byproduct;

determining the relationship between the degree of hydrolysis (DH) and emulsifying, foaming, calcium binding abilities of FPI

 Conducting the optimization, building the empirical regression equation describing the simultaneous influences of pH factor (X1), the E/S ratio (X2), temperature (X3) and time (X4) to the hydrolysis; optimization the hydrolysis conditions for each objective function of foaming, emulsifying, calcium binding:

Yfoaming = 93,39 + 0,33X1 + 1,06X2 + 0,99X4 – 0,51X1 – 1,74 X2 – 0,36X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4

Yemulsifying = 29,93 + 0,41X1 + 1,05X2 + 1,16X4 – 1,17X1 – 1,07 X2 + 1,27X3 –1,13X42 + 0,41X1X3 + 0,57X1X4 + 1,08X2X3 – 1,02X3X4

Ycalcium binding = 30,36 + 1,19X2 + 0,76X4 – 0,55X1 – 1,02 X22 – 0,54 X42 + 0,42X1X3 + 0,45X1X4 + 1,27X2X3 – 0,42X2X4 – 1,05X3X4

 Determining the correlation between molecular weight cut-off (MWCO) of protein in FPI with the features of its application The group of proteins with MWCO from 7 to 10 kDa has good emulsifying ability The one with MWCO from 5 to 7 kDa has good foaming ability Particularly, the calcium binding capacity of FPI has been determined by the relatively small proteins (less than 5 kDa) The maximum calcium binding of FPI from Pangasius hypophthalmus is high, reaching 38,36 mg Ca2+/g FPI,

which has over 94% of the links between Ca+ 2 with FPI by creating structured EF-hand

(2) Experimental results

• To develop a technological process for producing of high quality FPI from

Pangasius hypophthalmus byproducts, including limited hydrolysis process and

membrane application for separating protein clusters with different mocular weight

• To use successfully the 5 kDa GE-5-DL and 10 kDa SRM 347 membranes Thereby, determining the optimum conditions of the membranes filtration process for acquiring FPI with the emulsifying, foaming, calcium binding abilities The highest proteins yield of membrane GE-5-DL membrane (5 kDa membrane) is 76.06%; in operating conditions: temperature of 450C, flow 34 L/h, pressure: 25 bar The one of SRM 347 (10 kDa membrane) for colleting FPI with foaming ability is 64.02%; in operating conditions: temperature of 350C, flow 39 L/h, pressure: 22 bar The highest proteins yield of SRM 347 membrane with emulsifying ability is 65.31% in the operating conditions: temperature 400C, flow 44 L/h, pressure: 22 bar

• The maximum foaming ability of FPI from Pangasius hypophthalmus byproducts

reached 112.18%, equivalent to the foaming capability of WPI and higher than the one

of SPI Maximum emulsifying ability of FPI reaches 39.88%, higher than the ones of SPI and WPI Especially the calcium binding ability of FPI is very high The discovery opens up many new application directions of FPI fish in food industry

The above initial results, on the premise, have been contributed to the application for food production, and considered as a reliable reference source for further studies in the same field

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự động viên đúng lúc của TS Trần Bích Lam Từ đáy lòng mình, bằng những tình cảm chân thành nhất cùng với sự kính trọng sâu sắc, tôi muốn bày tỏ lời biết ơn của mình đến Cô Cảm ơn Cô đã cho em nhiều suy nghĩ về sự phấn đấu không ngừng để trở thành một nhà khoa học chân chính Cảm ơn Cô đã trang bị thêm cho em cách tiếp cận với các phương pháp luận khoa học để em tự tin hơn trên con đường phía trước Xin cảm ơn GS.TS Hà Thanh Toàn đã giúp đỡ, góp nhiều ý kiến cho luận án kể từ những ngày đầu tiên xây dựng đề cương nghiên cứu đến nay

Lúc này đây, con xin được nói lời cảm ơn cha; kính cẩn chắp tay và thâm tâm hướng về vong linh của mẹ Muôn vàn lời cảm ơn cũng không thể nói hết được tình thương của cha mẹ với con Con cảm ơn cha mẹ đã cho con hình hài này, cảm ơn cha mẹ luôn luôn ở bên con kể cả những hoàn cảnh khó khăn nhất để con thêm vững bước trong cuộc sống

Nhân dịp này, với tư cách là người chồng, người cha, tôi muốn gửi thật nhiều lời cảm ơn sâu sắc, tình cảm yêu thương vô bờ của tôi đến gia đình nhỏ bé, nơi đó có vợ và hai con trai yêu quí - Huy Hoàng, Minh Trí Tổ ấm ấy đã là điểm tựa tinh thần vững chắc cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu đầy gian nan vừa qua Cảm ơn vợ và các con đã mang lại năng lượng và niềm vui để bố được yên tâm trong sự nghiệp phấn đấu

Xin bày tỏ niềm tri ân vì những giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban Giám hiệu trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, sự động viên tinh thần của các đồng nghiệp, bạn bè

Tôi cũng xin cảm ơn khoa Kỹ thuật Hóa học - Trường Đại học Bách khoa; các thầy, cô đang công tác tại khoa Công nghệ Thực phẩm; các cán bộ, viên chức phòng Công tác chính trị - Học sinh sinh viên, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp

Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và chia sẻ vui - buồn với tôi trong thời gian vừa qua

1.1 Cá Tra và phụ phẩm chế biến cá Tra

1.2 Các chế phẩm protein thủy sản

1.3 Các enzyme sử dụng trong thủy phân protein cá

1.4 Sử dụng kỹ thuật membrane trong sản xuất FPI và BP

1.5 Tính chất công nghệ của các chế phẩm protein

1.6 Hoạt tính sinh học của các chế phẩm protein

1.7 Những vấn đề tồn tại trong nghiên cứu thu nhận và tính năng của FPI

1.8 Hướng nghiên cứu và nội dung nghiên cứu của luận án

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.2 Hóa chất

2.3 Màng lọc nano

2.4 Thiết bị

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.6 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

2.7 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu quá trình thuỷ phân phụ phẩm cá Tra

3.2 Nghiên cứu tính năng công nghệ của FPI từ phụ phẩm cá Tra

3.2.1 Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thuỷ phân (DH) và

khả năng tạo bọt, tạo nhũ của FPI

i

ii

iv

vi vii

ix xii xiv

3.2.2 Nghiên cứu điều kiện tối ưu thu nhận FPI có tính năng tạo bọt

3.2.3 Nghiên cứu điều kiện tối ưu thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ

3.2.4 So sánh khả năng tạo bọt, tạo nhũ của FPI với các chế phẩm protein

thương mại (SPI và WPI)

3.3 Nghiên cứu hoạt tính cố định canxi của FPI từ phụ phẩm cá Tra

3.3.1 Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thuỷ phân (DH) và

hoạt tính cố định/liên kết canxi của FPI

3.3.2 Nghiên cứu hoạt tính cố định canxi của đạm cá phân lập

3.4 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lọc membrane để phân riêng các nhóm phân tử

protein trong FPI

3.4.1 Lựa chọn loại membrane

3.4.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân riêng các nhóm protein

mục tiêu trong FPI bằng kỹ thuật lọc màng

3.4.3 Lựa chọn các thông số công nghệ thích hợp cho quá trình lọc màng để

thu nhận các nhóm protein trong FPI có tính năng ứng dụng khác nhau

3.5 Kiểm tra thành phần hóa học và tính năng công nghệ của FPI sau quá trình lọc

membrane

3.5.1 Kiểm tra thành phần hóa học của FPI

3.5.2 Kiểm tra khả năng tạo bọt

3.5.3 Kiểm tra khả năng tạo nhũ

3.6 Kiểm tra hoạt tính cố định canxi của FPI sau quá trình lọc màng

3.7 Đề xuất phương pháp sản xuất các chế phẩm FPI có tính năng công nghệ, hoạt

tính sinh học từ phụ phẩm cá Tra

3.7.1 Sơ đồ quy trình

3.7.2 Thuyết minh quy trình

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT

4.1 Kết luận

4.2 Đề xuất

CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của Alcalase

Hình 1.2 Minh họa 2 giai đoạn tác động của alcalase đến cơ chất

Hình 1.3 DH của phản ứng thủy phân bằng alcalase và flavourzyme trên cơ chất là cá

chép bạc

Hình 1.4 Sử dụng các loại membrane dựa trên khối lượng phân tử các chất trong dòng

qua màng (dòng permeate)

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc EF-Hand

Hình 1.6 Mô hình liên kết giữa Ca+2 với axit amin khởi đầu mạch peptid của protein

trong FPI

Hình 2.1 Phụ phẩm cá Tra

Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận, vận chuyển, bảo quản phụ phẩm cá Tra

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát quá trình thủy phân

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí hệ thống lọc membrane (thu nhận protein ≤ 5 kDa)

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí hệ thống lọc membrane (thu nhận protein >5 kDa÷10 kDa)

Hình 2.7 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát quá trình lọc membrane

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến mức độ thủy phân

Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến mức độ thủy phân

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mức độ thủy phân

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất/nước đến mức độ thủy phân

Hình 3.5 Đạm cá phân lập (FPI) từ phụ phẩm cá Tra

Hình 3.6 Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân và khả năng tạo

bọt của FPI

Hình 3.7 Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân và khả năng tạo

nhũ của FPI

Hình 3.8 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên khả năng

tạo bọt của PI

Hình 3.9 Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong

FPI có khả năng tạo bọt tốt nhất

Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên khả năng

tạo nhũ của FPI

Hình 3.11 Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein

trong FPI có khả năng tạo nhũ tốt nhất

Hình 3.12 Khả năng tạo bọt của WPI, FPI, SPI

Hình 3.13 Khả năng tạo nhũ của FPI, SPI, WPI

Hình 3.14 Mối quan hệ giữa thời gian thủy phân với mức độ thủy phân và khả năng

cố định canxi của FPI

Hình 3.15 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên hoạt tính

cố định canxi của FPI

Hình 3.16 Liên kết giữa Ca+2 và các protein trong FPI từ phụ phẩm cá tra

Hình 3.17 Kết quả phân tích LC-MS xác định thành phần khối lượng của các phân tử

protein trong FPI có khả năng cố định canxi tốt nhất

Hình 3.18 Ảnh hưởng của lưu lượng tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng

GE-5-DL

Hình 3.19 Ảnh hưởng của lưu lượng tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc

màng GE-5-DL

Hình 3.20 Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua

màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*)

Hình 3.21 Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua

màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**)

Hình 3.22 Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi

lọc màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*)

Hình 3.23 Ảnh hưởng của lưu lượng tới tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi

lọc màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**)

Hình 3.24 Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng

GE-5-DL

Hình 3.25 Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc

màng GE-5-DL

Hình 3.26 Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng

SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*)

Hình 3.27 Ảnh hưởng của áp suất tới độ phân riêng, thông lượng dòng qua màng

SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**)

Hình 3.28 Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc

màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo bọt (SRM 347*)

Hình 3.29 Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu hồi protein trong FPI sau khi lọc

màng SRM347 để thu nhận FPI có tính năng tạo nhũ (SRM 347**)

Hình 3.30 Đường đồng mức thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm lên hiệu

suất thu hồi protein trong FPI ở màng GE-5-DL và màng SRM 347*

Hình 3.31 Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm khi lọc màng

SRM 347** lên hiệu suất thu hồi protein trong FPI có khả năng tạo nhũ

Hình 3.32 Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein

trong FPI có khả năng tạo bọt tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347*

Hình 3.33 Khả năng tạo bọt của FPI trước và sau khi lọc membrane và so sánh với

khả năng tạo bọt của SPI, WPI

Hình 3.34 Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein

trong FPI có khả năng tạo nhũ tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347**

Hình 3.35 Khả năng tạo nhũ của FPI trước và sau khi lọc membrane và so sánh với

khả năng tạo nhũ của SPI, WPI

Hình 3.36 Kết quả phân tích LC-MS xác định phân bố khối lượng phân tử protein

trong FPI có khả năng cố định canxi cao nhất sau khi lọc màng GE-5-DL

Hình 3.37 Kết quả xử lý trong môi trường tia bức xạ đơn sắc để xác định mật độ các

liên kết canxi với protein trong FPI sau khi lọc membrane

Hình 3.38 Sơ đồ quy trình sản xuất các loại FPI từ phụ phẩm cá Tra

Bảng 2.4 Đặc tính kỹ thuật của màng M-Pr2516A8

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc

màng GE-5-DL

Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc

màng SRM 347

Bảng 2.7 Các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu

hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo bọt của FPI)

Bảng 2.8 Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng tạo bọt của FPI)

Bảng 2.9 Các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu

hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ của FPI)

Bảng 2.10 Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng tạo nhũ của FPI)

Bảng 2.11 Các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu

hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố định canxi của FPI)

Bảng 2.12 Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng

đến khả năng cố định canxi của FPI)

Bảng 2.13 Mức của các yếu tố trong thí nghiệm tối ưu hóa (trong bài toán tối ưu

hoá các yếu tố ảnh hưởng đến HSTH protein của FPI khi lọc membrane)

Bảng 2.14 Ma trận thực nghiệm (trong bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng

đến hiệu suất thu hồi protein của FPI)

Bảng 2.15 Các bước chung xây dựng bài toán tối ưu

Bảng 3.1 Thành phần khối lượng của phụ phẩm cá Tra

Bảng 3.2 Thành phần hóa học của phụ phẩm cá Tra dùng để thủy phân

Bảng 3.3 Thành phần hóa học của chế phẩm protein từ phụ phẩm cá Tra

Bảng 3.4 Hàm lượng một số nguyên tố khoáng trong chế phẩm protein từ phụ

Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài

toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo bọt của FPI)

Bảng 3.6 Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả

năng tạo bọt tốt nhất

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài

toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo nhũ của FPI)

Bảng 3.8 Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả

năng tạo nhũ tốt nhất

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy (trong bài

toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến cố định canxi của FPI)

Bảng 3.10 Kiểm tra khả năng cố định canxi thực tế của FPI

Bảng 3.11 Kết quả phân tích kiểm định liên kết giữa Ca+2 và protein trong FPI

Bảng 3.12 Kết quả phân tích tỷ lệ thành phần khối lượng phân tử của FPI có khả

năng cố định canxi cao nhất

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát sơ bộ các loại màng sử dụng trong quá trình phân tách

các nhóm protein trong FPI

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lọc của các loại màng

Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra tính tương thích của các phương trình hồi quy (trong

bài toán tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi protein

của FPI)

Bảng 3.16 Thành phần hoá học của các loại protein isolate

Bảng 3.17 Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả

năng tạo bọt tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347*

Bảng 3.18 Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả

năng tạo nhũ tốt nhất sau khi lọc màng SRM 347**

Bảng 3.19 Hàm lượng một số nguyên tố khoáng trong FPI từ phụ phẩm cá Tra sau

khi lọc màng có khả năng cố định canxi cao nhất

Bảng 3.20 Kết quả xác định phân bố khối lượng phân tử protein trong FPI có khả

năng cố định canxi cao nhất sau khi lọc màng GE-5-DL

Bảng 3.21 Kiểm tra khả năng cố định canxi thực tế của FPI sau khi lọc màng

Bảng 3.22 So sánh khả năng cố định canxi thực tế và kiểm định liên kết giữa

Ca+2 với protein của FPI trước và sau khi lọc membrane

Bảng 3.23 Hiệu suất thu hồi FPI mục tiêu

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết

tắt

angiotensin

HPLC High Performance Liquid

Chromatography/High Pressure Liquid Chromatography

sắc ký lỏng hiệu năng cao/sắc ký lỏng cao áp

PI/FPI Protein Isolate/Fish Protein Isolate Đạm phân lập/Đạm cá phân lập

VASEP Vietnam Association of Seafood

Exporters and Producers

Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thủy sản Việt nam

MỞ ĐẦU

Ngành công nghiệp nuôi trồng và chế biến cá Tra (Pangasius hypophthalmus) ở

Việt Nam phát triển không ngừng, kỹ thuật quản lý sản xuất ngày một cao Trong năm

2014, sản lượng nuôi cá Tra của Việt Nam đạt trên 1,22 triệu tấn, tổng giá trị xuất khẩu khoảng 1,8 tỷ USD, chiếm 24,81% tổng giá trị thương mại của ngành thuỷ sản Với sản lượng cá Tra nuôi như trên thì sau khi chế biến philê sẽ tạo ra lượng phụ phẩm cá Tra khổng lồ (khoảng 0,65÷0,69 triệu tấn) Việc sử dụng hiệu quả nguồn phụ phẩm này để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng vừa mang lại hiệu quả kinh tế, vừa có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đạm cá phân lập (FPI) là một dạng chế phẩm protein cao cấp từ cá Ngoài giá trị dinh dưỡng rất cao, FPI còn có nhiều tính năng công nghệ có thể ứng dụng tốt vào công nghiệp thực phẩm như: khả năng hòa tan, tạo màng, tạo nhũ, tạo bọt, tạo gel… Một số sản phẩm FPI còn có các hoạt tính sinh học: hoạt tính cố định canxi, kháng khuẩn, chống đông máu, chống oxy hóa, tác động tích cực gây an thần hoặc hưng phấn hệ thần kinh… Việc nghiên cứu phương pháp sản xuất FPI từ nguồn nguyên liệu trong nước dồi dào như phụ phẩm cá Tra và tìm hiểu các tính năng công nghệ cũng như hoạt tính sinh học của FPI là vấn đề thực sự cần thiết, có ý nghĩa khoa học, có giá trị thực tiễn và tính

xã hội cao

Mục tiêu của luận án:

Khai thác giá trị sử dụng mới của phụ phẩm cá Tra để làm cơ sở ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm

Nội dung nghiên cứu tổng quát của luận án

(1) Nghiên cứu quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme alcalase 2.4L

nhằm thu nhận các sản phẩm đạm cá phân lập có tính năng công nghệ và hoạt tính sinh học Nghiên cứu tập trung vào khai thác tính năng tạo bọt, tạo nhũ và hoạt tính cố định canxi của các sản phẩm FPI từ phụ phẩm cá Tra Thông qua các mô hình tối ưu hóa xác định các thông số kỹ thuật thích hợp nhất cho quá trình thủy phân với các hàm mục tiêu

là khả năng tạo nhũ, tạo bọt và hoạt tính cố định canxi

(2) Xác định kiểu liên kết giữa ion canxi với các peptide trong FPI từ phụ phẩm cá

Tra

(3) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ lọc màng để phân riêng các nhóm protein có

khối lượng phân tử khác nhau trong FPI theo tính năng công nghệ (tạo nhũ, tạo bọt) và hoạt tính sinh học (khả năng cố định canxi) đã được xác định

Tính mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

(1) Đã xác định được quy luật của mối quan hệ giữa khối lượng phân tử của các

protein trong FPI với khả năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi của FPI theo thời gian thủy phân Trong đó, lần đầu tiên đã xác định và chứng minh được FPI từ phụ phẩm cá Tra có hoạt tính cố định canxi Đây là nội dung mang tính mới trong các nghiên cứu của luận án, có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn Các kết quả nói trên sẽ được sử dụng cho việc tham khảo của các nhà khoa học khi nghiên cứu về ứng dụng của FPI

(2) Đã nghiên cứu một cách có hệ thống về quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra

bằng enzyme alcalase 2.4L để thu nhận FPI; chứng minh rằng mỗi một tính năng công nghệ hay hoạt tính sinh học của FPI phụ thuộc vào mức độ thủy phân (DH) và phải kiểm soát được các thông số của quá trình thủy phân nhằm thu được FPI có tính năng công nghệ và hoạt tính sinh học phù hợp Điều này sẽ là cơ sở quan trọng cho việc chủ động trong sản xuất FPI, hướng tới quy mô công nghiệp

(3) Đã có các khảo sát, đánh giá và so sánh khả năng tạo nhũ, tạo bọt của FPI từ

phụ phẩm chế biến cá Tra với các sản phẩm tương đương đang được sử dụng trong sản xuất thực phẩm Điều này mở ra các hướng ứng dụng thực tiễn của FPI sau khi được sản

xuất

(4) Đã xác lập được chế độ lọc màng (membrane) thích hợp để phân riêng các phân

tử protein nhằm thu được FPI có khả năng tạo nhũ, tạo bọt, cố định canxi cao nhất

(5) Đã nghiên cứu thành công phương pháp sản xuất chế phẩm FPI từ phụ phẩm cá

Tra có hoạt tính cố định canxi cao (38,36 mg Ca+2/g FPI); mở ra triển vọng sản xuất các sản phẩm mới giúp tăng cường hấp thu can-xi cho con người

Luận án được trình bày trong 162 trang, bao gồm:

 Phần mở đầu (16 trang)

 Chương 1: Tổng quan (29 trang)

 Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (23 trang)

 Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận (92 trang)

 Chương 4: Kết luận và kiến nghị (2 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Cá Tra và phụ phẩm chế biến cá Tra

1.1.1 Nguồn lợi và tình hình nuôi, chế biến, xuất khẩu cá Tra của Việt Nam

Cá Tra là loài cá da trơn rất quan trọng trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến thủy sản xuất khẩu ở nước ta [1], [2] Nghề nuôi cá Tra đã và đang phát triển nhanh chóng Từ năm 2006 đến năm 2013, sản lượng nuôi cá Tra của Việt Nam tăng khoảng 3,5 lần Hiện nay, sản lượng cá Tra hàng năm ổn định và đạt khoảng trên dưới 1,22 triệu tấn [3][4], [5], [6]

Diện tích nuôi cá Tra tập trung chủ yếu tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, cao nhất là Đồng Tháp (1.489 ha, chiếm 28,9%), Cần Thơ (1.110 ha, chiếm 21,5%), An Giang (1.023 ha, chiếm 19,9%) Chỉ riêng 3 tỉnh trên đã chiếm khoảng 70,3% diện tích nuôi và hơn 80% sản lượng cá Tra toàn vùng [7], [8], [9], [10], [11]

Theo VASEP (2014), cả nước có 281 doanh nghiệp xuất khẩu cá Tra, trong đó chỉ khoảng 100 doanh nghiệp có nhà máy chế biến Hầu hết cá Tra đến tay người tiêu dùng dưới dạng các sản phẩm đông lạnh như: cá nguyên con, cá cắt khúc, xiên que, cá philê…[12] Trong đó sản phẩm philê là mặt hàng chủ lực và giá trị lớn nhất Giá trị xuất khẩu cá Tra đóng góp rất lớn vào sự tăng trưởng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam [13], [14], [15]

1.1.3 Thành phần khối lượng và thành phần hóa học của phụ phẩm cá Tra

Thành phần khối lượng của phụ phẩm chế biến cá Tra thông thường được chia ra 4 phần: Đầu - xương - vây - thịt bám, mỡ bụng, nội tạng, mỡ lá Khi phân tích tỷ lệ khối lượng của phụ phẩm cá Tra: đầu - xương - vây - thịt bám chiếm tỷ lệ lớn nhất (64,23%) Đây cũng là phần phụ phẩm quan trọng nhất do giàu protein, phải được tận dụng để sản

xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng khác Tỷ lệ các phần khác: mỡ bụng 18,71%, nội tạng 10,97%, mỡ lá 6,1% [18]

Theo kết quả của một số nghiên cứu (Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự (2012); Nguyễn Duy Tân và cộng sự (2009): thành phần hóa học của phụ phẩm cá Tra sau khi tách philê có hàm lượng protein tương đối cao (10,32±1,85%); khoáng (8,35±0,83); lipid (23,80±1,48); hàm ẩm (57,37±2,25) [18], [19]

Với thành phần hóa học như trên, phụ phẩm cá Tra có thể được chế biến thành các sản phẩm riêng rẽ, có giá trị sử dụng khác nhau như FPI, mỡ cá, bột xương cá…[8], [9]

1.1.4 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá Tra

Với lượng phụ phẩm cá Tra ở Việt Nam hiện nay từ 645.000 đến 685.000 tấn [8], [12], [16], nếu được tận dụng tối đa để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị sẽ đem lại nguồn lợi to lớn cho người nuôi trồng và chế biến thủy sản

1.1.4.1 Tận dụng phụ phẩm cá Tra cho tiêu dùng con người

Về mặt cơ sở khoa học và thực tiễn thì hầu hết các thành phần của phụ phẩm chế biến cá Tra có thể tận dụng cho nhu cầu của con người: ức, bong bóng, bao tử cá Tra sử dụng làm thực phẩm; gan có thể đóng hộp hoặc chế biến thành dầu cá - một sản phẩm được sử dụng ngày càng phổ biến do những lợi ích về sức khỏe của Omega-3 đã được công nhận gần đây [14], [20], [21]

Mỡ cá Tra là sản phẩm có giá trị cao dành cho con người do chứa nhiều axit béo không no thiết yếu cho cơ thể, nhất là EPA, DHA DHA, EPA là những axit béo đặc biệt quan trọng đối với não người và không tìm thấy trong dầu thực vật Cả DHA và EPA thường được bổ sung trong các thực phẩm như bánh mì, sữa chua, sữa và sữa công thức cho trẻ sơ sinh Ngoài ra, mỡ cá Tra còn chứa nhiều Vitamin A, D, E… [9], [20]

Da cá Tra có thể tận dụng để sản xuất các sản phẩm cao cấp dùng trong dược phẩm hoặc mỹ phẩm như collagen, gelatine, thực phẩm chức năng chứa vi chất Ruột và nội tạng cá Tra có thể được tận dụng để sản xuất enzyme protease, lipase

Tuy nhiên, việc sử dụng phụ phẩm chế biến cá Tra phổ biến hiện nay ở Việt Nam chủ yếu mới chỉ tập trung tận dụng thịt vụn hay phần thịt màu sẫm để làm chả cá hoặc xúc xích Một số phần khác sử dụng làm thực phẩm trực tiếp cho con người Tận dụng phụ phẩm cá Tra để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị cao hầu như chưa được nghiên cứu và áp dụng [20], [21]

1.1.4.2 Tận dụng phụ phẩm cá Tra làm thức ăn chăn nuôi

Nhu cầu bột cá chăn nuôi trên toàn cầu đang có xu hướng gia tăng mạnh mẽ, giá bán bột cá ngày càng cao [6], [18] Theo Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam - VASEP (2014), tỷ lệ bột cá sản xuất từ phụ phẩm cá Tra so với tổng số bột cá sản xuất tại Việt Nam tăng từ 22,6% trong năm 2009 lên 35,9% trong năm 2013 Đối với dầu cá, ước tính đã có khoảng 71% sản lượng được dùng làm thức ăn thủy sản và 26% dành cho con người [12], [22]

Phụ phẩm cá Tra có nguồn khoáng chất, đặc biệt là canxi dồi dào Nguồn canxi này

có vai trò rất lớn trong việc tăng trọng gia súc, gia cầm Vì vậy, phụ phẩm cá Tra thường được nghiền nhỏ, gia nhiệt, ủ lên men Sản phẩm sau đó được hòa trộn cùng với dầu cá làm thức ăn cho heo, gia cầm và các loài cá khác (trừ cá hồi) [3], [21]

1.1.4.3 Tận dụng phụ phẩm cá Tra trong sản xuất axit béo hoặc các chất có hoạt tính sinh học

EPA và DHA có lẽ là các axit béo thương mại thành công nhất có nguồn gốc từ dầu cá Tra Mặc dù việc phát triển sản xuất ở Việt Nam khá chậm từ năm 2000, thị trường omega-3 hiện nay đã có những tăng trưởng rất đáng kể

Mặc dù đã có một số báo cáo của Lưu Thị Hà (2008) đã đề cập tới sự hiện diện của một số protein có giá trị sinh học có nguồn gốc từ thủy sản nói chung với nhiều công dụng như chống oxy hóa, cố định canxi, chống đông máu, kháng khuẩn, hạ huyết áp hoặc có các đặc tính sinh học khác [23] Tuy nhiên các nghiên cứu cụ thể về các hoạt tính sinh học của protein với đối tượng là cá Tra nói chung và phụ phẩm chế biến cá Tra nói riêng hầu như không có [15], [18]

Như vậy, từ các tài liệu về nguồn lợi cá Tra và tình hình sử dụng phụ phẩm chế biến cá Tra cho thấy: sản lượng cá Tra của Việt Nam ngày càng tăng, số lượng phụ phẩm cá Tra hiện nay khoảng từ 0,65 đến 0,69 triệu tấn Thành phần hoá học của phụ phẩm cá Tra có hàm lượng các chất có thể sử dụng để sản xuất ra các sản phẩm giá trị gia tăng Lượng phụ phẩm khổng lồ này đang được tận dụng để phục vụ cho các nhu cầu của con người nhưng chưa thực sự hiệu quả Vì vậy, đòi hỏi cấp bách phải đẩy mạnh các nghiên cứu khoa học để sản xuất được các sản phẩm cao cấp, có giá trị hơn nữa nhằm mang lại lợi ích kinh tế cho người nông dân, góp phần đảm bảo sự phát triển

ổn định, bền vững của ngành thuỷ sản

1.2.1.2 FPC (Fish Protein Concentrate) - Đạm cá đậm đặc

Trong FPC, hàm lượng protein chiếm khoảng 70% tuỳ phương pháp chế biến Tổ chức Nông - Lương Liên Hiệp Quốc (FAO) xác định có 2 loại FPC là: FPC.A và FPC.B:

(1) Loại A: là bột cá ít mùi, có thành phần chất béo <2,75%, phương pháp chế biến FPC loại A dạng bột mịn sấy trong chân không, chủ yếu là lấy nước, chất béo ra khỏi nguyên liệu (2) Loại B: dạng bột đạm cá còn mùi cá, thành phần chất béo chiếm 3÷5% [27], [28], [29]

1.2.1.3 FPI (Fish Protein Isolate) - Đạm cá phân lập

FPI thực chất là các sản phẩm chứa nhiều protein có khối lượng phân tử nhỏ, hàm lượng protein chiếm khoảng trên 90%, lipid <1,0% [24] Đến nay, công nghệ sản xuất và tìm hiểu các ứng dụng của FPI vẫn còn mới mẻ ở Việt Nam

Trên thế giới, nguồn nguyên liệu chủ yếu trong sản xuất FPI là các loại cá biển

nguyên con có giá trị kinh tế thấp như cá tuyết, cá đù vàng, cá san… Một số nước sản xuất FPI từ nguồn nguyên liệu là các loại surimi

Từ năm 1986, FPI đã được sản xuất tại Mỹ nhưng theo công nghệ lọc màng đơn giản nên độ tinh khiết còn thấp và ít được ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao [29], [32] Sản xuất FPI từ phụ phẩm của cá sẽ gặp khó khăn do nguồn nguyên liệu sản xuất rất lớn nhưng hàm lượng FPI thu được lại ít hơn so với việc sản xuất FPI từ nguồn nguyên liệu là cá nguyên con hay surimi [22], [27] Tuy nhiên, sản xuất FPI từ phụ phẩm có lợi ích kinh tế lớn hơn nhiều do không phải cạnh tranh nguồn nguyên liệu đầu vào và quan trọng nhất là giá trị khác biệt của sản phẩm thu được

Đề cập tới việc ứng dụng FPI trong công nghệ thực phẩm - các nghiên cứu thực nghiệm đã cho thấy rằng khi sử dụng FPI có thể cải thiện rất rõ các đặc tính của thực phẩm Một ưu điểm rất lớn của FPI là các protein trong FPI có khối lượng phân tử nhỏ,

có các tính chất công nghệ như: tạo màng, tạo bọt, tạo nhũ, có tính đàn hồi, tạo độ kết dính, độ nhớt, khả năng giữ nước nên sau khi khử mùi có thể được sử dụng để phối trộn hay thay thế một số chất phụ gia trong chế biến thực phẩm [28],[30]

Năm 2011, M.B.K Foh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năng tạo

gel của FPI từ cá Oreochromis niloticus, cho thấy FPI có khả năng tạo gel ở ngay trong

điều kiện nhiệt độ thường, có khả năng giữ được màu sắc, cố định mùi cho sản phẩm thực phẩm, làm tăng giá trị cảm quan của các sản phẩm cuối cùng [32]

FPI sau khi khử mùi còn có thể ứng dụng làm nguồn dinh dưỡng nitơ trong sản xuất các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, lên men vi sinh vật [33]

1.2.1.4 Các peptide có hoạt tính sinh học (BP)

Nhìn chung các protein có hoạt tính sinh học là các protein có kích thước phân tử tương đối nhỏ gọi là biopeptide [26], [34], [35] Theo H.G Kristinsson (2000): hoạt tính sinh học của các FPI, FPH được qui định bởi một số peptide trong thành phần của chúng Theo đó, peptide có hoạt tính sinh học được định nghĩa là các phân đoạn protein đặc biệt có tác động tích cực lên các chức năng (có điều kiện) của cơ thể [36]

Theo kết quả nghiên cứu của S Sathivel và cộng sự (2003), A.D Neklyuddov và cộng sự (2000), B Liaset và cộng sự (2002): các peptide sinh học có nguồn gốc thủy sản

đã được chứng minh là có nhiều chức năng sinh lý đặc biệt, bao gồm khả năng chống tăng huyết áp hay chức năng ức chế enzyme angiotensin-I-converting (ACE), chức năng

chống oxi hóa, khả năng chống đông máu, khả năng liên kết khoáng và khả năng kháng khuẩn Thêm vào đó, một vài trong số các peptide này còn có tiềm năng tăng cường sức khỏe và giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch [31], [37], [38].

1.2.1.5 FPH (Fish Protein Hydrolysate) - Đạm cá thủy phân

FPH là sản phẩm thủy phân protein từ cá, thành phần bao gồm các axit amin tự do,

các polypeptide với chiều dài mạch khác nhau FPH có thể tiếp tục được phân riêng một

cách chọn lọc để thu các đoạn peptide đồng nhất hơn về kích thước phân tử và có hoạt tính sinh học cao [23], [24]

Khi nghiên cứu về tính chất chức năng và hoạt tính sinh học của FPH, FPI từ một

số loài cá da trơn, A E Theodore (2005) cho rằng: hoạt tính sinh học của biopeptide được quy định bởi khối lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp các axit amin của protein trong biopeptide [25] FPH có thể được sản xuất từ các nguyên liệu thô hoặc thủy phân một phần các sản phẩm giàu protein Mức độ thủy phân tùy thuộc vào yêu cầu sản phẩm và các quá trình xử lý [24], [26]

1.2.2 Các phương pháp sản xuất chế phẩm giàu protein từ cá

Dạng chế phẩm giàu protein đơn giản nhất là bột cá, việc sản xuất bột cá hiện nay trên thế giới được thực hiện theo 2 phương pháp: (1) sản xuất bột cá tách nước nhưng không tách chất béo; (2) sản xuất bột cá tách chất béo và tách nước Việc sản xuất bột cá thường dùng nguyên liệu là cá nguyên con hoặc phụ phẩm của công nghiệp chế biến cá

và gồm các công đoạn: hấp chín, làm nguội, tách béo, khử mùi, nghiền nhỏ, sấy khô, ổn định rồi đóng bao [8], [23]

Công nghệ sản xuất FPC theo phương pháp truyền thống bao gồm việc loại bỏ hầu hết nước và một phần hoặc triệt để nhất chất béo bằng dung môi hữu cơ như ethanol hay propanol; ethylene dichloride… bột cá sau đó được loại sạch dung môi, nghiền và đóng gói Tuy nhiên, ngày nay FPC còn có thể được sản xuất bằng công nghệ enzyme nhằm mục đích thu được FPC có chất lượng cao hơn [23], [30], [31]

Sản xuất FPH phải thực hiện quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme trong những điều kiện kiểm soát để thu nhận được những peptide có các tính chất mới, được

sử dụng như những thành phần của thực phẩm Nhiều enzyme protease đã được nghiên cứu ứng dụng để thủy phân protein cá, trong đó phổ biến nhất là các enzyme thương mại như: papain, alcalase, neutrase, flavourzyme, protamex [22], [24], [25] Từ FPH người

ta sẽ tiến hành quá trình tinh sạch để sản xuất các chế phẩm có giá trị kinh tế cao hơn nữa như FPI, FBP [14], [20]

Khi thủy phân phụ phẩm cá để sản xuất PH có thể sử dụng axit, base hoặc enzyme Tuy nhiên việc sử dụng enzyme ngày càng phổ biến và được áp dụng ở quy mô rộng lớn Theo các kết quả nghiên cứu của N Souissi và cộng sự (2007), N Bhaskara và cộng

sự (2008), A.D Neklyuddov và cộng sự (2000): để tăng hiệu quả sản xuất FPH từ cá

Sardinella aurita [33], phụ phẩm cá Catla catla [39] hay từ phụ phẩm chế biến lươn

đầm lầy (Eri siljk) [37], người ta có thể thực hiện bằng các phương pháp: thủy phân bằng

axit, thủy phân base, thủy phân sơ bộ bằng enzyme sau đó thủy phân bằng axit, thủy phân không hoàn toàn bằng enzyme sau đó thủy phân bằng base thì hiệu suất thu hồi protein trong PH có thể tăng lên đáng kể và đạt từ 72,08% đến 75,31%

Theo Foh và cộng sự (2011), Neklyuddov và cộng sự (2000): khi thủy phân phụ

phẩm cá Oreochromis niloticus, áp dụng phương pháp thủy phân bằng enzyme, sau đó

ứng dụng membrane để tinh sạch sản phẩm sau thủy phân thì có thể thu được FPC có hàm lượng protein từ 77,3% đến 83,6% [32], [37]

Theo A.E Theodore (2005), S Arason và cộng sự (2009): khi sản xuất các chế phẩm protein có giá trị kinh tế cao như FPI, BP phải sử dụng các công nghệ hỗ trợ và kỹ thuật hiện đại: sắc ký lọc gel, kỹ thuật membrane [25], [35] Trong đó, kỹ thuật membrane đã trở thành giải pháp hiệu quả trong việc thu nhận các chế phẩm protein với nhiều ưu thế hơn các kỹ thuật truyền thống Các kết quả nghiên cứu của G.A.Bogouri và cộng sự (2004), N Souissi và cộng sự (2007) còn cho thấy: một trong những ưu điểm nổi trội là khi sử dụng kỹ thuật membrane có thể không sử dụng hóa chất và xử lí nhiệt [26], [33] Vì vậy, kỹ thuật membrane có thể hạn chế những biến đổi làm giảm chất lượng bán thành phẩm và thành phẩm Nhờ đó, kỹ thuật membrane được ứng dụng ngày càng phổ biến trong sản xuất PI để phân riêng protein sau quá trình thủy phân

Bảng 1.1 dưới đây tóm tắt các phương pháp công nghệ đang được sử dụng trong sản xuất FPH và FPI

H.lượng protein trong sản phẩm cuối

- Thời gian thủy phân nhanh

- Sản phẩm thu được giảm giá trị dinh dưỡng nhiều và bị lẫn nhiều tạp chất Các sản phẩm thủy phân bằng acid hay base thường chỉ dùng làm thức ăn gia súc

- Khó có thể kiểm soát được quá

trình thủy phân Ngoài ra, acid có thể kết hợp với một số thành phần trong nguyên liệu làm giảm giá trị dinh dưỡng của protein

- Protein bị phân cắt sâu hơn và thời gian thủy phân nhanh

- Có thể giữ lại một số hoạt tính sinh học điển hình của chế phẩm cuối cùng

- Chi phí khá cao

- Yêu cầu chất lượng enzyme phải

ổn định

- Có lẫn tạp chất

- Hệ thống hoạt động gián đoạn

- Thực hiện nhiều thí nghiệm khảo sát và nhiều loại enzyme mới hiệu quả, điều khiển điều kiện hoạt động của enzyme khó khăn

- PH

- FPC

- 1số ít FPI có tính năng công nghệ

50÷80%

Thủy phân sử

- Tương đối đơn giản

- Chế phẩm protein chất lượng cao

- Kiểm soát được mức độ thủy

- Khó khăn trong việc điều khiển điều kiện hoạt động của enzyme

- PH

- FPC

60÷85%

enzyme hay

nhiều loại

enzyme

- Có khả năng tự động hóa

phân

- Điều kiện tiến hành ôn hòa, sản phẩm thu được có hàm lượng protein cao

- Có thể giữ được thành phần các peptide có tính năng công nghệ và hoạt tính sinh học

- Chi phí khá cao - FPI có nhiều

tính năng công nghệ và một

số hoạt tính sinh học

Thủy phân sau

đó kết hợp sắc

ký lọc gel để

thu nhận PI

Cần hệ thống tinh lọc đồng

bộ, đắt tiền

- Có thể áp dụng với nồng độ nhập liệu khá cao

- Hệ thống có thể vận hành liên tục

- Khả năng tự động hóa cao, dễ triển khai ở quy mô sản xuất công nghiệp

- Không sử dụng phụ gia, dung môi hữu cơ độc hại

- Hệ thống có thể vận hành liên tục, có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp

- Khả năng tự động hóa cao, dễ triển khai ở quy mô sản xuất công nghiệp

- Dễ điều khiển các thông số công nghệ, hiệu quả kinh tế khá cao

- Không tạo ra sản phẩm phụ trong quá trình tinh sạch

- Không lẫn tạp chất

- Chế độ vệ sinh và bảo trì màng nghiêm ngặt

- FPI

- FPI có giá trị dinh dưỡng cao

- FPI có nhiều tính năng công nghệ điển hình

- BP

Trên 90%, có thể đạt 100%

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm protein từ phụ phẩm cá Tra chưa nhiều Một số kết quả nghiên cứu của Vũ Hòa Bình (2006), Mạc Xuân Hoà (2012): khi thu nhận các chế phẩm protein FPC, FPH từ phụ phẩm chế biến cá Tra chủ yếu là thủy phân bằng enzyme alcalase 2.4L sau đó dịch thủy phân được tách mỡ bằng phương pháp làm lạnh và kiểm tra khả năng tạo nhũ, tạo bọt của sản phẩm cuối cùng [14], [22]

Tóm lại, các chế phẩm protein thủy sản có hàm lượng protein cao do đã loại bỏ

một phần hoặc hầu hết những tạp chất phi protein khỏi nguyên liệu ban đầu Có nhiều phương pháp sản xuất chế phẩm protein nhưng phương pháp phổ biến nhất là thủy phân chọn lọc bằng enzyme rồi tinh sạch thu chế phẩm Cũng có nhiều phương pháp để tinh sạch protein (sắc ký lọc gel, membrane, enzyme cố định trên membrane ) Trong đó, sử dụng membrane là kỹ thuật có nhiều ưu thế Các dạng chế phẩm protein gồm FPC, FPI, FPH, BP; tuỳ loại có thể có các giá trị dinh dưỡng và tính năng công nghệ, hoạt tính sinh học khác nhau Trong số các dạng chế phẩm protein thủy sản thì FPI và BP hiện nay được quan tâm nghiên cứu hàng đầu Trong khi giá trị dinh dưỡng của nguồn protein trong FPI, BP hầu như không thay đổi (mang tính chất “tĩnh”) thì tính năng công nghệ và hoạt tính sinh học lại phụ thuộc nhiều vào phương pháp sản xuất (mang tính chất “động”)

1.3 Các enzyme sử dụng trong thủy phân protein cá

1.3.1 Các loại enzyme dùng để sản xuất chế phẩm protein

Đã có rất nhiều loại protease khác nhau được dùng trong công nghiệp sản xuất chế phẩm protein, nhưng có thể chia theo 2 nhóm: endoprotease và exopeptidase [37]

Các endoprotease cắt các liên kết peptide bên trong các chuỗi polypeptide, sản phẩm sinh ra thường là polypeptide nhỏ hơn; trong khi các exopeptidase cắt từng axit amin ở cuối mạch và sản phẩm sinh ra thường là các axit amin và dipeptide [38]

Trong các kết quả nghiên cứu đã công bố thời gian gần đây của M.B.K Foh và cộng sự (2011), N Bhaskara và cộng sự (2008) thì khi thủy phân phụ phẩm cá bạc má,

cá rô phi sử dụng exopeptidase sẽ cho sản phẩm có thể sử dụng làm phụ gia cải thiện hương vì khi protein bị thủy phân sẽ tạo thành những peptide rất nhỏ và axit amin Tuy nhiên, sự phân giải protein bằng endoprotease có thể dẫn đến sự hình thành các peptide

có vị đắng [32], [39] Theo Dirk Pette (2013), G.Z.S Shaviklo và cộng sự (2006): phụ phẩm thủy sản khi thủy phân chưa hoàn toàn thường có vị đắng Vị đắng được cho là

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của

Alcalase [45]

gây ra bởi sự có mặt của các peptide chứa các axit amin kị nước ở cuối mạch Với endoprotease, các protein chỉ bị thủy phân chưa hoàn toàn và tạo thành những đoạn peptide ngắn, trong đó có những đoạn peptide chứa các axit amin kị nước ở cuối mạch Đây chính là nguyên nhân gây ra vị đắng Nếu tiếp tục thủy phân thêm bằng các exopeptidase sẽ cắt đứt những axit amin kỵ nước cuối mạch và vị đắng sẽ mất đi [40], [41]

Vị đắng không chỉ phụ thuộc vào mức độ thủy phân mà còn phụ thuộc vào cấu trúc của các peptide Ví dụ: khi thủy phân casein bằng alcalase sẽ bắt đầu sinh ra vị đắng thậm chí ở mức độ thủy phân là 1% Vị đắng giảm khi thủy phân với protamex và giảm

nhiều hơn khi sử dụng flavourzyme [14], [18], [42], [43], [44]

1.3.2 Sử dụng enzyme alcalase 2.4L

1.3.2.1 Đặc điểm, trung tâm hoạt động và đặc tính xúc tác của enzyme alcalase 2.4L

Enzyme alcalase 2.4L là một enzyme thương mại trong nhóm alcalase Enzyme

alcalase được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis Enzyme alcalase 2.4L có khối

lượng phân tử là 27.300 Dalton, chứa 308 gốc axit amin

Alcalase 2.4L là tên thương mại của substilisin (EC 3.4.21.12), một endo-protease,

thuộc lớp serine protease, có serine và histidine ở trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của alcalase 2.4L gồm 3 axit amin theo thứ tự Asp-His-Ser, bền vững ngay cả khi có mặt của dung môi hữu cơ [39], [43] Đây là một enzyme kiềm tính, xúc tác cho phản ứng thủy phân xảy ra trong môi trường trung tính hoặc kiềm tính Vì vậy, rất phù hợp trong sử dụng thủy phân cơ chất protein thủy sản do pH trong cơ thịt hầu hết thực phẩm thủy sản ở vào khoảng 7,0 [32], [34]

Bằng cách điều khiển và kiểm soát các điều kiện thủy phân, alcalase 2.4L có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thuỷ phân tất cả các liên kết peptide nội phân tử để chuyển phân tử protein thành các đoạn peptide có khối lượng phân tử khác nhau Do alcalase 2.4L có khả năng cắt đứt cả các liên kết peptide của các axit amin kỵ nước nên làm giảm

Hình 1.2 Minh họa 2 giai đoạn tác

động của alcalase đến cơ chất [43]

đáng kể vị đắng của sản phẩm thủy phân Phân tích cấu trúc của alcalase 2.4L cho thấy: enzyme alcalase 2.4L có trung tâm hoạt động chứa 2 nhánh: một nhánh gọi là G67 và một nhánh gọi là S65G Hai nhánh này gần như đối xứng nhau trong cấu trúc không gian (hình 1.1) [30], [45] Điều kiện tối ưu cho hoạt động xúc tác của alcalase 2.4L: nhiệt độ 55÷700C (131÷1580F), tùy thuộc vào kiểu cơ chất, pH từ 6,5÷8,5 Hoạt tính của enzyme alcalase 2.4L thường được xác định theo đơn vị Anson/g (AU/g) Enzyme alcalase 2.4L

có thể bị mất hoạt tính ở: 500C, pH=4 trong 40 phút; hoặc 850C, pH=8,5 trong 10 phút [22], [37]

1.3.2.2 Cơ chế thủy phân của alcalase 2.4L với cơ chất là phụ phẩm từ cá

Alcalase 2.4L với đặc trưng là cắt chuỗi polypeptide thành các đoạn peptide có khối lượng phân tử khác nhau Việc phân cắt chủ yếu tại các liên kết peptide của các acid

amin kỵ nước [25], [29], [34] Dưới những điều kiện thủy phân thích hợp, các protein trong phụ phẩm cá được biến đổi một cách nhanh chóng thành các chất có cấu trúc mềm mại hoặc chất hòa tan, phản ứng thuỷ phân bao gồm tối thiểu 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Các enzyme liên kết và kết hợp với các thành phần của phụ phẩm cá

Giai đoạn 2: Sự thủy phân xảy ra, dẫn tới sự phóng thích các polypeptide, peptide, axit amin Một tỷ lệ lớn phân tử enzyme alcalase 2.4L đã được gắn trên bề mặt ngoài của thành phần phụ phẩm cá theo một tiến trình tương đối nhanh Sau đó, sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần của phụ phẩm cá xảy ra chậm hơn

Sự liên kết giữa enzyme và cơ chất xảy ra dưới những điều kiện pH, nhiệt độ… tối ưu của quá trình thủy phân [26], [29], [30]

1.3.2.3 So sánh DH khi sử dụng enzyme alcalase 2.4L và một số protease khác

Một số nghiên cứu của nhiều tác giả như: N Souissi và cộng sự (2011), G.Z Shaviklo và cộng sự (2006), R Slizyte và cộng sự (2005) sử dụng các enzyme thương mại trên các cơ chất có nguồn gốc thuỷ sản khác nhau cho kết quả thực nghiệm hầu hết đều thấy sử dụng enzyme alcalase 2.4L để thủy phân thì có DH cao hơn khi dùng các

Hình 1.3 DH của phản ứng thủy

phân bằng alcalase và flavourzyme

trên cơ chất là cá chép bạc [37]

enzyme khác [33], [36], [41], [46]

Khi sử dụng enzyme alcalase để thủy phân protein cá, tốc độ thủy phân bị giảm dần

và dần dần dừng lại khi các liên kết peptide dễ bị thủy phân ít dần Protein thu hồi trongdịch thủy phân phần lớn là các protein có khối lượng phân tử nhỏ, chúng được giải

phóng trong suốt giai đoạn đầu của quá trình thủy phân [47], [48].

A.D Neklyuddov và cộng sự (2000), R Ravallec-ple và cộng sự (2001) giải thích rằng: sự ức chế có thể xảy ra bởi sự có mặt của sản phẩm hình thành khi thủy phân

Nồng độ peptide hòa tan cao trong hỗn hợp phản ứng làm giảm cả hai tốc độ thủy phân

và hàm lượng protein thu hồi Do vậy, tách các hydrolysate khỏi hỗn hợp phản ứng cần được thực hiện nhằm làm tăng tốc độ thủy phân và hiệu suất thu hồi protein [37], [48]

Tóm lại: Enzyme alcalase 2.4L là một

enzyme endoprotease phù hợp cho thủy phân trong môi trường trung tính và kiềm tính Enzyme alcalase 2.4L được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, rất phổ biến trong thủy phân protein thủy sản do khi thủy phân bằng alcalase 2.4L cho DH cao, tính đặc hiệu rộng, làm giảm vị đắng của sản phẩm cuối, chịu được trong điều kiện môi trường khắc nghiệt hơn so với các protease khác… Đặc biệt, đây là enzyme có khả năng phân cắt chuỗi polypeptide thành các đoạn peptide có khối lượng phân tử khác nhau Do vậy, khi sử dụng enzyme này sẽ rất thuận lợi khi mục tiêu thủy phân là thu nhận các đoạn peptide có khối lượng phân tử xác định, chứa các tính năng công nghệ hay hoạt tính sinh học quý giá cần hướng tới

1.4 Sử dụng kỹ thuật membrane trong sản xuất FPI và BP

1.4.1 Sản xuất FPI

Từ năm 2004 đến năm 2015, trong các kết quả nghiên cứu đã được công bố của A Trusek-Hollownia (2008), W Li và cộng sự (2004), Mark Wilf (2015), các tác giả đã khẳng định: quá trình sản xuất đạm cá phân lập (FPI) theo công nghệ màng được ứng

dụng rất rộng rãi tại Mỹ Quá trình phân riêng bằng màng có thể sử dụng cả 4 loại màng như sau: vi lọc (MF), siêu lọc (UF), lọc nano (NF) và thẩm thấu ngược (RO) Khi tinh sạch protein, màng UF có ưu thế và được sử dụng nhiều nhất Tuy nhiên, với các protein trong FPI có khối lượng phân tử nhỏ hoặc rất nhỏ (từ 1 kDa đến 20 kDa) thì màng NF thường được sử dụng hơn Tùy thuộc vào nguyên liệu và yêu cầu công nghệ của sản phẩm mà lựa chọn loại màng và phương pháp phân riêng thích hợp Theo đó, người ta có thể thu được song song cả đạm cá đậm đặc (FPC) và đạm cá phân lập (FPI) tại cùng một thời điểm bằng cách sản xuất FPH sau đó cho qua hệ thống lọc màng 2 lần [44], [49], [50], [51]

Khi sử dụng công nghệ màng để sản xuất FPI, cũng như ứng dụng công nghệ màng trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm khác, tồn tại bất lợi của các quá trình lọc là sự giảm tốc độ dòng vật chất qua màng (dòng permeate) Hiện tượng fouling (giảm tốc độ dòng qua màng) hình thành do việc giữ lại một số thành phần nhập liệu trên bề mặt màng lọc Vì vậy, mặc dù quá trình phân riêng bằng màng trong sản xuất FPI là một giải pháp tốt trong công nghiệp thực phẩm nhưng các hiện tượng làm giới hạn tốc độ dòng (gồm có hiện tượng fouling và tình trạng tập trung nồng độ) có thể ít nhiều làm giảm khả năng áp dụng công nghệ màng [49], [50]

Việc lựa chọn màng trong thu nhận protein thủy sản phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng phân tử của protein (hình 1.4) Quá trình phân đoạn protein thường sử dụng màng

UF, khối lượng phân tử protein trong dòng qua màng (permeate) khi lọc màng UF giao động từ 1 kDa đến 100 kDa, thậm chí 300 kDa÷500 kDa tùy thuộc vào kích thước lỗ lọc [139], [144] Màng NF thường được sử dụng cho việc khử khoáng trong protein, lọc đường FOS (fructo oligosaccharide), tách đường lactose trong sữa Tuy nhiên với protein có khối lượng phân tử nhỏ (từ 1 kDa đến 20 kDa), việc sử dụng màng NF lại chiếm ưu thế hơn màng UF do màng NF có thể vận hành ở áp suất dòng nhập nhiệu cao hơn rất nhiều so với màng UF [49], [51]

Áp suất dòng nhập liệu của màng NF có thể đạt 30÷40 bar hoặc cao hơn trong khi màng UF thường ít khi vượt quá 10 bar Áp suất vận hành cao là đặc điểm nổi trội của màng NF so với màng UF nên khi vận hành để tinh sạch các protein có khối lượng phân

tử nhỏ (1 kDa÷20 kDa) sẽ hạn chế tối đa việc tập trung nồng độ và hiện tượng foulding, làm cho hiệu quả lọc màng tốt, tình trạng nghẹt màng ít khi xảy ra hơn [45], [50]

Hình 1.4 Sử dụng các loại membrane dựa trên khối lượng phân tử các chất trong

dòng qua màng (dòng permeate) [51]

Khi nghiên cứu quá trình lọc màng, H G Kristinson (2005), J.G Wijmans và R.W Baker (1995) đã kết luận về ảnh hưởng của hiện tượng fouling đối với hiệu quả của quá trình phân riêng qua màng lọc khi sản xuất FPI, các điều kiện tối ưu để giảm hiện tượng fouling trong quá trình siêu lọc sản xuất FPI bao gồm: tốc độ dòng nhập liệu thấp và áp suất xuyên màng cao Bên cạnh đó, phải chú ý rằng tốc độ dòng thấp và áp suất xuyên màng cao làm tăng khả năng thấm qua màng, nhưng họ không tìm thấy mối quan hệ nào giữa hiện tượng fouling và tính thấm [52], [53]

Sử dụng màng UF và NF để sản xuất và tinh sạch FPI từ nguồn nguyên liệu là các loại cá biển nguyên con có giá trị kinh tế kém như cá tuyết, cá đù biển… với cả hai hình thức lọc Dead-end (dòng nguyên liệu cần lọc chạy vuông góc với màng lọc) và lọc Cross-flow (dòng nguyên liệu cần lọc chạy song song với màng lọc) cho kết quả khả quan Các phân tích thành phần hóa học của FPI cho thấy hàm lượng protein đảm bảo trên 90%, đặc biệt là hàm lượng mỡ hầu như không có nhưng vấn đề khử mùi tanh của FPI lại chưa thực hiện được [54], [55], [56]

G.M Rios và cộng sự (2014) cho rằng: trong quá trình sản xuất FPI, có thể sử dụng lọc diafiltration (DF) Để thu được FPI có 90÷92% protein thì sau giai đoạn siêu lọc

(UF), cần thiết phải có quá trình lọc DF để loại các khoáng còn sót lại Việc loại bỏ khoáng sẽ rất quan trọng trong việc xác định khối lượng phân tử của các protein trong FPI khi thực hiện phương pháp điện di [54] Với các phương pháp diafiltration (VVD

0,95:1), sử dụng màng DS-5-DL, khi lọc dịch thủy phân từ cá Sardine sardine có thể thu được

sản phẩm FPI với nồng độ protein 90÷94% [49], [50]

1.4.2 Thu nhận biopeptide (BP) bằng kỹ thuật membrane

Khi sản xuất BP có thể sử dụng các phương pháp như: lọc membrane, kỹ thuật điện

di, phương pháp sắc ký nhưng sử dụng membrane là phương pháp ngày càng phổ biến [52] Theo Z Alibhai và cộng sự (2006) và M Wilf (2014): bình thường, một số protein trong nguyên liệu ban đầu đã chứa sẵn những đoạn peptide có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, khi nằm trong chuỗi polypeptide, các hoạt tính này tồn tại dưới dạng tiềm ẩn, không thể hiện được Một khi được giải phóng ra khỏi mạch peptide ban đầu bằng cách thủy phân với enzyme một cách chọn lọc, các đoạn peptide tự do này sẽ thể hiện được hoạt tính vốn có của chúng [56], [57]

Nếu như PH chứa hỗn hợp các sản phẩm thủy phân protein, từ các axit amin đến các peptide, polypeptide với mạch dài ngắn khác nhau thì biopeptide chỉ chứa các loại peptide nhất định có hoạt tính sinh học định sẵn Để sản xuất biopeptide, bên cạnh quá trình thủy phân bằng protease đặc hiệu để giải phóng ra các đoạn peptide có hoạt tính sinh học mong muốn, cần thiết phải có các quá trình phân riêng đi kèm để tách một cách

có chọn lọc các peptide cần thu ra khỏi hỗn hợp sản phẩm thủy phân [41], [58] Quá trình phân riêng các biopeptide mong muốn có thể thực hiện bằng kỹ thuật membrane hoặc các phương pháp sắc ký [36] Để đảm bảo duy trì tối đa hoạt tính sinh học của các biopeptide, phương pháp thủy phân bằng enzyme kết hợp phân riêng bằng membrane là thích hợp nhất

Với khoảng cách về thời gian nghiên cứu tương đối cách xa nhau nhưng các kết quả nghiên cứu của M Wilf (2014), V Scardi và cộng sự (1980) đều khẳng định: việc phân tách biopeptide ra khỏi hỗn hợp sản phẩm thủy phân hoàn toàn có thể thực hiện bằng kỹ thuật membrane với kích thước lỗ mao quản định sẵn sao cho thích hợp với kích thước các biopeptide cần phân tách [57], [59] Cũng cần lưu ý, quá trình siêu lọc (UF) có thể sử dụng để phân tách các sản phẩm thủy phân với khối lượng phân tử mong muốn nhưng phổ biến là các polypeptide có khối lượng phân tử từ 20 kDa trở lên [60]

Như vậy, nhằm đảm bảo tối đa hoạt tính sinh học của các chế phẩm protein,

phương pháp thủy phân bằng enzyme kết hợp với lọc membrane là thích hợp nhất Với nguyên liệu là cá, khi tách riêng các nhóm phân tử protein theo khối lượng phân tử và

có tính năng nhất định thì lọc màng là một biện pháp hiệu quả nhất Đặc biệt là đối với các chế phẩm protein cao cấp như FPI, BP Đây là điểm rất cần được lưu ý, đóng vai trò quan trọng trong sản xuất các loại chế phẩm protein từ cá

Ngoài ra, khi sản xuất, tinh sạch FPI, BP bằng enzyme kết hợp sử dụng màng lọc còn rất nhiều ưu điểm khác như: hệ thống có thể vận hành liên tục, tiến hành ở nhiệt độ thấp, khả năng tự động hóa cao, dễ triển khai ở quy mô công nghiệp, hàm lượng protein

ở sản phẩm cuối cao trên 90%, không tạo ra sản phẩm phụ trong quá trình tinh sạch… Tuy nhiên, theo các nghiên cứu trước đây thì cần chú ý: khi lựa chọn màng để phân riêng hay tinh sạch protein, việc sử dụng màng UF có ưu thế tuyệt đối khi khối lượng phân tử protein cần tinh sạch lớn hơn 20 kDa Trong trường hợp tinh sạch protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn 1 kDa thì chỉ sử dụng màng NF mà không được sử dụng màng UF Còn lại, khi polypeptide có khối lượng phân tử từ 1 kDa đến 20 kDa có thể sử dụng cả màng UF và NF nhưng màng NF là sự lựa chọn có ưu thế Việc điều khiển các thông số công nghệ trong quá trình lọc màng phải được khảo sát kỹ càng

1.5 Tính chất công nghệ của các chế phẩm protein

Theo S Benjakul và M.T Moissey (1997), tính chất chức năng của protein là bất kỳ đặc tính hóa lý nào ảnh hưởng đến quá trình và trạng thái của protein trong các hệ thống thực phẩm được xác định bởi đặc tính chất lượng của sản phẩm cuối cùng [61]

Theo kết quả nghiên cứu của G.I Raein đã được FAO công bố vào năm 2011, các phương pháp sử dụng để sản xuất các chế phẩm protein cũng như các thông số quá trình sản xuất cần phải được chọn lọc và kiểm soát nghiêm ngặt nhằm hạn chế tối đa việc làm biến tính protein [62]

Tính chất chức năng của các chế phẩm protein chủ yếu được quyết định bởi: (1) tỷ

lệ phần trăm theo thành phần khối lượng của các peptide (2) cấu trúc và sự tương tác lẫn nhau của các peptide hoặc các đại phân tử bổ sung vào thực phẩm để cải thiện chất

lượng hoặc tính chất chức năng [35] Nhiều nghiên cứu đang hướng đến việc ứng dụng

những kỹ thuật mới, hiện đại, điều kiện vận hành ôn hòa để thu được chế phẩm protein

có chất lượng cao; mang những tính chất chức năng quan trọng Tính năng công nghệ có thể được chia thành nhiều nhóm Tuy nhiên, có 3 nhóm chính theo cơ chế của hoạt động: [29], [37], [63], [64]

- Các tính chất do tương tác giữa protein với nước (hydrate hóa): khả năng hấp thụ

và giữ nước, trương nở, dẻo dính (adhesion), phân tán, hòa tan

- Các tính chất do tương tác giữa protein với protein: tạo nhớt, tạo gel, tạo màng, tạo sợi, tạo bột nhão…

- Các tính chất bề mặt, liên quan đến sức căng bề mặt: khả năng tạo nhũ, tạo bọt

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định tính chất chức năng của nguyên liệu và sản phẩm thực phẩm, phần lớn đây là những phương pháp thực nghiệm [59], [60]

1.5.1 Một số tính chất công nghệ do tương tác giữa protein với nước (hydrate hóa) và khả năng giữ béo

Khả năng hòa tan trong nước

Theo M.B.K Foh và cộng sự (1992): khả năng hòa tan là điều quan trọng hàng đầu đối với một protein để đóng vai trò là thành phần chức năng trong thực phẩm [44] Tính tan tốt của PC và PI được sử dụng để bổ sung vào các loại thức uống giàu năng lượng hay một số thực phẩm dạng lỏng [34] Công bố của G Thorkelsson và cộng sự (2007) cho rằng: sản phẩm PH có tính tan gia tăng đáng kể so với nguyên liệu ban đầu, nguyên nhân chính là do quá trình thủy phân đã tạo ra nhiều peptide nhỏ hơn, làm lộ ra các nhóm amino và carboxyl (-NH2, -COOH) tương tác với nước, tăng tính tan, nhờ đó sản phẩm được sử dụng rộng rãi trong nhiều hệ thực phẩm [65]

Hàm lượng nitơ hòa tan cao của các chế phẩm protein có thể ứng dụng trong sản phẩm có độ mềm mịn và có bề mặt hấp dẫn Khả năng hòa tan cao trong khoảng pH rộng là quan trọng đối với nhiều ứng dụng thực phẩm vì nó còn ảnh hưởng đến tính chất chất chức năng khác, chẳng hạn như tính chất nhũ hoá và tạo bọt [66]

Sự cân bằng về năng lượng tự do của các gốc kỵ nước và ưa nước trong peptide là nguyên nhân làm tăng độ hòa tan Các peptide nhỏ lộ ra các gốc phân cực nhiều hơn và tăng khả năng hòa tan [34]

Khả năng hấp thụ béo và giữ béo

Khả năng hấp thụ béo của bột FPH và FPC là rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến hương vị của sản phẩm, đến tính chất cảm quan của thực phẩm Theo nghiên cứu của M Ovissipour và cộng sự (2010) về khả năng giữ béo/nước thì khả năng giữ béo của dịch đạm cô đặc và dịch đạm hòa tan lần lượt là 2,27 và 2,23 ml/g [29] So sánh khả năng giữ béo của PH với protein đối chứng (protein không thủy phân), kết quả cho thấy khả năng

liên kết với lipid của PH từ cá Sardinella (DH 11,5%) cao hơn so với protein đối chứng

Khả năng đàn hồi

Samaranayaka (2010) cho rằng khả năng đàn hồi của các chế phẩm protein phụ thuộc nhiều vào mức độ tinh khiết và khối lượng phân tử của chúng Mức độ tinh khiết càng cao thì khả năng đàn hồi càng tăng Tính chất này thể hiện rất rõ trong các chế phẩm protein thủy sản Điều này giải thích độ đàn hồi của surimi cao hơn rất nhiều so với protein nguyên thủy từ cá Nếu từ surimi sản xuất ra FPC hay FPI thì độ đàn hồi của các chế phẩm này so với surimi tăng từ 6÷8 lần [66]

Các nghiên cứu của Samaranayaka (2010) và D’Avila (2011) đều cho kết quả tương đồng: khối lượng phân tử của protein trong chế phẩm protein ảnh hưởng tới khả năng đàn hồi ít hơn so với mức độ tinh khiết Tuy nhiên, các phân tử protein trong chế phẩm FPI từ cá mối có số lượng axit amin từ 20 đến 100 axit amin cho độ đàn hồi cao nhất [66], [68]

thường được sử dụng như các chất hoạt động bề mặt Tính tạo nhũ của FPH đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả Độ hoạt động liên pha (chỉ số tạo nhũ, chỉ số ổn định nhũ, tính tạo bọt, tính ổn định bọt) tăng ở mức độ thủy phân giới hạn và khi mức độ thủy phân tăng quá mức thì độ hoạt động liên pha giảm [32], [34]

Theo Kristinson (2005), protein có thể được sử dụng như chất nhũ hoá trong thực phẩm nhờ khả năng hình thành, cải thiện sự ổn định hệ nhũ và tạo ra các tính chất hóa lý mong muốn trong hệ nhũ tương dầu trong nước [45]

Thorkelsson và Kristinsson (2009) đã khẳng định: FPH có khả năng tạo nhũ tương đương so với protein sữa và protein đậu nành khả năng tạo nhũ và ổn định nhũ của FPH từ cá trích và phụ phẩm cá trích thấp hơn so với protein trứng và protein đậu nành Protein cá hồi sấy khô có độ hòa tan tương đương với albumin trứng nhưng khả năng tạo nhũ bằng hoặc thấp hơn so với albumin trứng và protein đậu nành [69]

Các chế phẩm protein có khả năng làm bền hệ nhũ tương thực phẩm nhờ hấp phụ được lên bề mặt phân chia giữa các giọt dầu phân tán và pha nước liên tục, ngăn cản các giọt béo hợp nhất Một số ứng dụng phổ biến là sử dụng PC và PI trong các sản phẩm thịt nhũ hóa, sốt, xúc xích, bơ, phomat, và trong các sản phẩm kem [29] Đối với các chế phẩm PC thì khả năng tạo nhũ nhìn chung giảm nên ít được sử dụng với mục đích tạo nhũ so với chế phẩm PI [62]

Sự khác biệt trong khả năng tạo nhũ giữa các loại PH có thể là do tính kị nước và

độ dài của peptide Các peptide nhỏ hơn thường có khả năng tạo nhũ ít hơn Có mối tương quan mật thiết giữa hoạt động bề mặt và độ dài peptide đã được báo cáo Một peptide nên có một chiều dài tối thiểu là 20 gốc axit amin, tối đa là khoảng 80÷90 gốc axit amin để có khả năng tạo nhũ tốt và tính bề mặt tốt [30] Khả năng tạo nhũ ổn định của các protein là quan trọng do sự tác động tương hỗ giữa protein và chất béo trong thực phẩm Sự gia tăng số lượng các phân tử peptide và lộ ra các axit amin kỵ nước do thủy phân protein góp phần cải thiện việc hình thành nhũ tương [61]

Khả năng tạo nhũ của chế phẩm protein từ phụ phẩm cá Pacific whiting, thay đổi

nồng độ protein từ 0,02% đến 0,2% Kết quả cho thấy, khả năng tạo nhũ tăng khi tăng nồng độ protein và sau đó giảm, DH quá cao không cải thiện khả năng tạo nhũ [61]

Khả năng tạo bọt

Theo S Ariyawansa (2000), protein là chất tạo bọt và làm bền bọt Sự hình thành bọt liên quan đến sự khuếch tán các protein hòa tan đến bề mặt phân chia khí/lỏng Tại

đó chúng duỗi ra, tập trung lại và trải dài ra một cách tức thời để làm giảm sức căng bề mặt phân chia Sự hấp thụ của protein lên bọt được thực hiện qua các vùng kỵ nước Các chế phẩm protein là những chất tạo bọt và làm bền bọt, được ứng dụng trong sản phẩm bia, bánh ngọt, bánh mì… [64]

Các công bố của các tác giả: Kristinsson và Rasco (2000), Shaviklo và cộng sự (2006) đã khẳng định: sự hình thành các bọt protein liên quan đến sự khuếch tán của các protein hòa tan đến bề mặt liên pha nước - không khí và nhanh chóng sắp xếp lại ở bề mặt phân cách Theo Hoyle và Merritt (1997); S Benjakul và Moissey (1997): sự ổn định của bọt yêu cầu phải hình thành lớp màng dày, gắn kết và đàn hồi xung quanh mỗi bong bóng khí Sự ổn định bọt là do phân tử protein tạo thành các chuỗi liên kết bao bọc quanh các bong bóng khí, sự liên kết giữa các phân tử và độ đàn hồi rất quan trọng để

tạo ra sự ổn định bọt [24], [61] Nghiên cứu của Kristinsson và Rasco (2000) cho thấy:

protein từ phụ phẩm cá có khả năng tạo và giữ bọt tốt [36] Kết quả này giống với các báo cáo của B Liaset và cộng sự (2007) khi nghiên cứu khả năng tạo bọt của protein từ

cá hồi (Salmo salar, L) [38]

Tóm lại, trong mỗi thực phẩm, để tạo cấu trúc đặc trưng của nó có thể có sự tham

gia tương hỗ của nhiều tính chất chức năng của những thành phần khác nhau trong nguyên liệu tạo ra Các tính năng công nghệ quan trọng bậc nhất cần xem xét của các chế phẩm protein nói chung và chế phẩm protein cao cấp ở dạng FPI nói riêng là khả năng hoà tan, tạo nhũ, tạo bọt

1.6 Hoạt tính sinh học của các chế phẩm protein

1.6.1 Hoạt tính liên kết canxi

Canxi có vai trò quan trọng trong cấu tạo hệ khung xương và duy trì tính ổn định của các quá trình sinh lý trong cơ thể Nguồn canxi ngoại bào (extracellular calcium) có vai trò quan trọng đối với các kích thích thần kinh trong cơ bắp [71]

Nguồn canxi nội bào cần thiết cho hoạt động của actin và myosin trong quá trình

co cơ Canxi cũng cần thiết cho quá trình đông máu, đặc biệt là quá trình biến đổi fibrinogen và prothrombin thành fibrin và thrombin Canxi liên tục được giải phóng và

osteoblast (tế bào tạo xương) Trạng thái cân bằng nồng độ canxi ở cả nội và ngoại bào được duy trì trong một khoảng rất hẹp [72] Theo K Tsumuraa và cộng sự (2005) thì canxi nội bào được duy trì trong khoảng nồng độ 50÷100 nM; nồng độ canxi ngoại bào được duy trì trong khoảng 1,1÷1,3 mM Sự thay đổi nồng độ canxi ra ngoài các khoảng trên đều dẫn đến các tác động tiêu cực lên nhiều hệ thống của cơ thể; đặc biệt là hệ thống thần kinh cơ bắp và hệ thống tim mạch [72] Theo S Sathivel và cộng sự (2003), P Bourseaua và cộng sự (2009), D’Avila và cộng sự (2011): quá trình hấp thu canxi được thực hiện theo 2 con đường sau: [31], [63], [68]

 Con đường chủ động (transcellular): Con đường này bao gồm 3 bước riêng biệt: (1) quá trình vận chuyển ion canxi từ khoang ruột vào tế bào; (2) quá trình vận chuyển ion canxi trong nội bào; (3) quá trình vận chuyển ion canxi ra khỏi tế bào ruột vào khoảng gian bào (intercellular space) S.Sathivel và cộng sự (2003) cho rằng động lực của quá trình vận chuyển này được giải thích bởi 2 cơ chế: (a) cơ chế vận chuyển chủ động ion canxi qua màng tế bào được thực hiện bằng các chất mang là các phân tử hữu

cơ có khối lượng phân tử nhỏ; (b) cơ chế vận chuyển qua các kênh dẫn cho phép ion canxi khuếch tán vào tế bào nhờ gradient điện hóa

 Con đường thụ động (paracellular): canxi ở dạng ion và ở dạng tạo phức với các chất hữu cơ phân tử lượng nhỏ sẽ khuếch tán qua ruột theo các kênh dẫn ở khoảng giữa các tế bào Động lực của quá trình này chịu ảnh hưởng bởi gradient điện hóa giữa khoang ruột và khoảng không gian giữa các tế bào

Các sản phẩm sữa có chứa hàm lượng casein cao và cung cấp canxi tốt Tuy nhiên, một số người châu Á mắc chứng dị ứng với sữa do cơ thể họ thiếu enzyme tiêu hóa đường lactose Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra nguồn cung cấp canxi thay thế cho sữa (ví dụ: PI từ đậu nành, fructo-oligosaccharide, bột cá ) [73]

Hoạt tính liên kết canxi của các peptide phụ thuộc vào trình tự axit amin và số lượng của chúng có trong mẫu thử nghiệm Các peptide này thường chứa từ 10 đến 50 axit amin Cơ chế liên kết Ca+2 của các peptide này đã được một số tác giả giải thích Theo đó, một số phân đoạn peptide có khả năng tạo phức với canxi thông qua quá trình phosphoryl hóa [30], [69]

1.6.1.1 Hoạt tính liên kết canxi của các chế phẩm protein thủy sản