Phân lập, tuyển chọn, khảo sát đặc điểm chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase từ bã dong riềng sau khi trồng nấm và ứng dụng cho sản xuất phân bón

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---***--- NGUYỄN PHƯƠNG ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG NẤM VÀ ỨNG DỤ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN PHƯƠNG ANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG

NẤM VÀ ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HÀ NỘI, 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN PHƯƠNG ANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG

NẤM VÀ ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình bạn bè và đồng nghiệp

Trước tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Minh Hiếu

và PGS.TS Trần Liên Hà công tác tại Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử

- Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội, thầy cô là người đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi tận tình, chu đáo trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn Đồng thời cũng cảm ơn sinh viên Trương Thị Phượng – K58 khoa Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã cùng tôi thực hiện quá trình nghiên cứu luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nôi, ngày tháng năm 2018

Nguyễn Phương Anh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Kết quả của luận văn này là kết quả nghiên cứu của nhóm nghiên cứu chúng tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Liên Hà và TS Đặng Minh Hiếu công tác tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội, cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận văn

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nguyễn Phương Anh

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1 Tình hình sử dụng dong riềng tại Việt Nam 3

2 Thực trạng môi trường tại các làng nghề sản xuất miến dong 4

3 Khả năng tái sử dụng bã thải dong riềng 6

3.1 Thành phần bã thải 6

3.2 Những nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng 7

4 Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 10

4.1 Enzyme cellulase 10

4.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 13

5 Tình hình sử dụng phân bón hữu cơ ở Việt Nam 14

6 Vai trò của vi khuẩn phân giải cellulose trong phân bón hữu cơ 16

7 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng phân bón hữu cơ 17

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

1 Đối tượng nghiên cứu 19

2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 19

2.1 Thiết bị và dụng cụ 19

2.2 Hóa chất và môi trường 19

3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn 21

3.2 Phương pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase 21

3.3 Định danh vi khuẩn 23

3.3.1 Phương pháp định danh dựa trên đặc tính sinh lý, sinh hóa 23

3.3.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 25

3.4 Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 26

4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng 26

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 27

4.2 Ảnh hưởng của pH 27

4.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống 27

4.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 27

4.5 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton 27

5 Ứng dụng vi khuẩn trong ủ phân bón hữu cơ 27

5.1 Quy trình thử nghiệm ủ phân bón 27

5.2 Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu trong phân bón 28

5.2.1 Xác định nhiệt độ 28

5.2.2 Phương pháp xác định độ ẩm 28

5.2.3 Phương pháp xác định pH 28

5.2.4 Phương pháp xác định nitơ tổng trong phân bón 28

5.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng cacbon hữu cơ trong phân bón 29

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

1 Kết quả phân lập 31

2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase 32

2.1 Tuyển chọn dựa trên phương pháp cấy chấm điểm 32

2.2 Tuyển chọn dựa trên phương pháp đục lỗ thạch 34

2.3 Tuyển chọn dựa trên phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase 34

3 Định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn 35

3.1 Đặc tính hình thái và sinh lý – sinh hóa của chủng NDK5 35

3.2 Định danh sinh học phân tử 36

4 Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng 3-indol acetic acid (IAA) 38

5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 39

5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

5.2 Ảnh hưởng của pH 41

5.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 42

5.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 43

5.5 Ảnh hưởng của nồng độ pepton 44

6 Ứng dụng vi khuẩn trong ủ phân bón hữu cơ 45

6.1 Độ sụt giảm thể tích 46

6.2 Nhiệt độ 47

6.3 pH 48

6.4 Độ ẩm 48

6.5 Hàm lượng Cacbon tổng số 49

6.6 Hàm lượng Nitơ tổng số 49

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC BẢNG 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BOD Biochemical Oxygen Demand

CMC Cacboxyl methyl cellulose

C/N Tỷ lệ Cacbon / Nitơ

COD Chemical Oxygen Demand

DNA Deoxyribonucleic Acid

DNS 3,5-dinitrosalicylic

IAA Acid 3-indol acetic

PCR Polymerase Chain Reaction

TCCP Tiêu chuẩn cho phép

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu 5

Bảng 1.2 Thành phần của bã dong 7

Bảng 1.3 Khả năng tái sử dụng bã thải rắn tại làng nghề Dương Liễu 9

Bảng 3.1: Các chủng đã phân lập được từ các nguồn bã dong riềng sau khi trồng nấm khác nhau 31

Bảng 3.2: Khả năng phân giải cellulose của các chủng chọn lọc thông qua phương pháp cấy chấm điểm 33

Bảng 3.3: Khả năng phân giải cellulose của qua phương pháp đục lỗ thạch 34

Bảng 3.4: Hoạt lực enzyme của các chủng tuyển chọn 35

Bảng 3.5: Đặc tính sinh lý - sinh hóa chủng NDK5 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hiện trạng môi trường tại làng nghề sản xuất miến dong 5

Hình 1.2 Mô hình enzyme cellulase 11

Hình 1.3 Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulose 12

Hình 3.1: Các chủng được tuyển chọn theo phương pháp cấy chấm điểm 33

Hình 3.2: Các chủng được tuyển chọn theo phương pháp đục lỗ thạch 34

Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc và chuỗi bào tử của chủng vi khuẩn NDK5 35

Hình 3.4: Sản phẩm PCR chủng NDK5 (Với: -ve:mẫu nước; +ve: chủng E.coli) 37

Hình 3.5: Tương quan cấu trúc 16S rRNA của chủng NDK5 với chủng khác 38

Hình 3.6 Thử định tính khả năng sinh IAA của chủng NDK5 39

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 theo thời gian 40

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 tại thời điểm 48 giờ 40

Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 41

Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 tại thời điểm 48 giờ 42

Hình 3.11: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 42

Hình 3.12: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 tại thời điểm 48 giờ 43

Hình 3.13: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 44

Hình 3.14: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 tại thời điểm 24 giờ 44

Hình 3.15:Ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả năng sinh trưởng của chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 tại thời điểm 24 giờ 45

Hình 3.16: Sự thay đổi thể tích trong quá trình ủ 47

Hình 3.17: Sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình ủ 47

Hình 3.18: Sự thay đổi pH trong quá trình ủ 48

Hình 3.19: Sự thay đổi độ ẩm trong quá trình ủ 49

Hình 3.20 Hàm lượng C tổng trước và sau khi ủ 49

Hình 3.21 Hàm lượng N tổng trước và sau khi ủ 50

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp, hàng năm lượng phụ phẩm nông nghiệp tạo ra từ ngành chế biến nông sản là vô cùng lớn và đa dạng, phong phú như: rơm,

rạ, cây ngô, bã mía, bã dong riềng, bã sắn Miến dong là một loại sản phẩm trong

số đó, miến dong được sản xuất từ dong riềng và được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡng cũng như mùi vị của nó Quá trình chế biến tinh bột dong từ củ dong riềng tạo ra một lượng chất thải lớn là bã dong Lượng bã này tại một số làng nghề sản xuất được tận thu và tái sử dụng rất ít còn lại xả thẳng ra môi trường mà không qua

xử lý gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, ô nhiễm đất cũng như bầu không khí tại làng nghề Tuy nhiên với thành phần chủ yếu là cellulose, bã dong có thể tận dụng làm nguồn nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế đặc biệt là tái

sử dụng bã dong riềng để trồng nấm Theo Nguyễn Như Ngọc và cs (2017) đã nghiên cứu thu bã thải dong riềng làm nguồn cơ chất để nuôi nấm sò trắng

Pleurotus florida và đạt năng suất thu quả thể là 49,52% [10] Song bên cạnh đó,

nghề trồng nấm cũng tạo ra một sản lượng bã thải nấm khổng lồ Thông thường người ta chỉ để bã thải nấm hoại mục tự nhiên kéo dài sau đó bón trực tiếp cho cây trồng nhưng hiệu quả thấp Ở một số cơ sở sản xuất lớn, lượng bã thải để tồn đọng quá nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường, thẩm mỹ, cảnh quan nông thôn và ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân Bã thải trồng nấm có hàm lượng khoáng, photphát và độ xốp cao có tác dụng điều hòa rất tốt cho đất và là nguồn phân bón kích thích hạt giống nảy mầm Nguồn nguyên liệu ban đầu để trồng nấm chủ yếu là các hợp chất khó phân hủy, bã thải trồng nấm khi thải ra môi trường vẫn còn hệ sợi

ăn trắng xung quanh nên bịch nấm ban đầu vẫn còn giá trị dinh dưỡng đối với một lượng lớn các loài vi sinh vật và nấm bệnh Do đó nếu không có biện pháp xử lý kịp thời ổ nấm bệnh sẽ dễ lây lan nhanh trong quá trình trồng nấm và làm ô nhiễm môi trường xung quanh do quá trình phân hủy chậm của các hợp chất lignin, hemicellulose và cellulose Việc sử dụng vi sinh vật phân giải cellulose đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới và ở Việt Nam nghiên cứu rất nhiều Ở Ấn Độ, Behera và cs (2014) đã phân lập được vi khuẩn phân giải cellulose từ đất rừng Đước

và xác định đó là các loài Micrococcus spp., Baccilus spp., và Pseudomonas

spp.[26]; ở Trung Quốc, Yang Ling Liang và cs (2011) đã phân lập được 22 dòng

vi khuẩn phân lập cellulose [43] Ở Việt Nam Nguyễn Thị Ngọc Trúc và cs (2015),

Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011), cũng đã nghiên cứu vi sinh vật phân giải cellulose [11,21] Hiện nay có rất nhiều biện pháp xử lý nguồn phế thải nông nghiệp hiệu quả và không gây ô nhiễm môi trường, tái sử dụng nguồn phế thải thành sản phẩm có giá trị kinh tế Trong đó biện pháp sử dụng phân bón hữu cơ từ phế thải nông nghiệp như bã thải trồng nầm, rơm rạ, chất thải gia súc, gia cầm, thân cây ngô, thân cây đậu kết hợp với bổ sung vi sinh vật dùng để bón vào đất làm tăng

độ phì nhiêu, tăng năng suất cây trồng, giảm ô nhiễm môi trường Phân hữu cơ vi sinh có ưu điểm làm tăng độ tơi xốp, giữ độ ẩm cho đất, hạn chế được rửa trôi, an toàn và vệ sinh cho cây trồng, vật nuôi và con người, hạn chế các chất độc hại tồn

dư trong cây trồng Chính vì vậy tôi lựa chọn đề tài “Phân lập, tuyển chọn, khảo sát đặc điểm chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase từ bã dong riềng sau khi trồng nấm và ứng dụng cho sản xuất phân bón”

Mục tiêu của đề tài:

- Phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt độ cao, có hoạt tính cellulase cao

- Xác định được ảnh hưởng một số yếu tố đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn phân lập được

- Thử nghiệm ứng dụng vi khuẩn trong ủ phân bón hữu cơ

Đồi tƣợng và phạm vi nghiên cứu:

- Mẫu bã thải trồng nấm của các cơ sở trồng nấm trên địa bàn thành phố Hà Nội

- Vi khuẩn có khả năng xử lý cellulose trong bã thải trồng nấm, sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ cao

- Thử nghiệm ủ phân bón quy mô phòng thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu:

- Khảo sát một số thành phần bã thải dong riềng sau khi trồng nấm

- Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy cellulose cao,

có khả năng sinh trưởng trong môi trường nhiệt độ cao Định danh chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase

- Khảo các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng

- Đánh giá các chỉ tiêu trong phân bón sau khi ủ thành phân bón hữu cơ

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1 Tình hình sản xuất và chế biến dong riềng tại Việt Nam

Nhiều năm nay cây dong riềng đc coi là cây thế mạnh của ngành nông nghiệp nước ta Các sản phẩm từ củ dong như tinh bột dong và miến dong rất được

ưa chuộng trên thị trường bởi giá trị dinh dưỡng cũng như mùi vị của nó Dong

riềng có tên khoa học là Canna edulis Ker Gawl, thuộc họ Chuối hoa - Cannaceae

Cây cao 1,2-1,5m; có thể tới 2m Thân rễ phình to thành củ, chứa nhiều tinh bột Lá

có phiến thuôn dài, thường có màu tía, bẹ tía, gân giữa to, gân phụ song song Hoa xếp thành cụm ở ngọn thân; đài 3, cánh hoa 3; nhị lép màu đỏ son, rộng 1cm; nhị vàng, môi vàng Ở nước ta, cây dong riềng được trồng ở hầu hết các tỉnh thuộc đồng bằng, trung du và miền núi phía Bắc Các tỉnh có diện tích và sản lượng dong riềng lớn phải kể đến là: Bắc Kạn, Sơn la, Cao Bằng, Hòa Bình, Quảng Ninh, Tuyên Quang, Yên Bái,…

Năm 2010 toàn tỉnh Bắc Cạn chỉ có hơn 270ha dong riềng tập chung chủ yếu

ở Na Rì và Ba Bể Sang năm 2012, diện tích trồng dong đã lên đến hơn 1.800ha và phủ khắp các huyện, thị xã (nay là TP Bắc Cạn) mang lại nhiều hiệu quả cao Như năm 2015, được mùa năng suất trung bình đạt 60-70 tấn/ha, sản lượng củ dong ước đạt 63.000 tấn củ, tương ứng 9.000 tấn tinh bột để sản xuất ra được khoảng 5.000 tấn miến/năm

Hiện nay trên địa bàn tỉnh Bắc Cạn có 112 cơ sở, hộ gia đình hoạt động chế biến dong riềng (bao gồm cả các cơ sở, hộ gia đình đầu tư mới, nâng công suất trong năm 2013) Trong đó, 24 cơ sở, hộ gia đình vừa chế biến tinh bột, vừa sản xuất miến; 14 cơ sở, hộ gia đình chuyên sản xuất miến; 74 cơ sở, hộ gia đình chuyên chế biến tinh bột Đối với 98 cơ sở, hộ gia đình (vừa sản xuất bột, miến và chuyên sản xuất bột cộng lại) có tổng công suất chế biến tinh bột dong riềng trên địa bàn tỉnh khoảng 1.170 tấn củ/ngày tương đương sản lượng củ dong riềng được chế biến khoảng 117.000 tấn (tính trong thời gian 100 ngày), đáp ứng 65,5% sản lượng

củ dong riềng của năm 2013 Với tỷ lệ thu hồi tinh bột là 18% thì sẽ thu được khoảng 21.000 tấn tinh bột thương phẩm, còn lại sản lượng củ dong riềng xuất bán

ra ngoài tỉnh khoảng 61.760 tấn [45]

Tại làng nghề Minh Hồng, Minh Quang, Ba Vì, Hà Nội với lợi thế diện tích đất đồi rộng lớn, gần chân núi Ba Vì nên cây dong riềng ở Minh Hồng rất phát triển, tổng diện tích dong riềng ở đây là 250ha, sản lượng bột thu được hàng năm khoảng 20.000 tấn [44], một phần bột này sử dụng làm nguyên liệu sản xuất miến dong tại làng nghề Bên cạnh các làng nghề sản xuất miến dong đi từ nguyên liệu là củ dong, một số làng nghề sản xuất miến dong như Cát Quế, Minh Khai (Hoài Đức, Hà Nội),

Cự Đà (Thanh Oai, Hà Nội) chủ yếu mua tinh bột dong từ các làng nghề khác và tiến hành chế biến

Huyện Bình Liêu (Quảng Ninh) có diện tích trồng cây dong riềng năm 2017 trên toàn huyện đạt 257,9ha bằng 237,5% so với cùng kỳ năm 2016; sản lượng củ dong đạt trên 8.309 tấn, tăng trên 3.363 tấn so với năm 2016 Tại các xã vùng núi cao của huyện Tiên Yên trung bình 1ha cây dong riềng cho sản lượng 60-90 tấn củ, doanh thu 155 triệu đồng, lãi 60-70 triệu đồng, gấp 3 lần so với trồng lúa

Tuy nhiên đặc thù của nghề chế biến củ dong là lượng bã thải lớn, chiếm 70% Để sản xuất ra 1 kg miến dong, lượng bã dong thải ra tương ứng là 9-10 kg tươi, mỗi năm ở một làng nghề có thể thải ra hàng vạn tấn bã dong tươi Nguyễn Phương Hạnh và Chu Thị Thu Hà (2012) khảo sát tại làng nghề Dương Liễu (Hà Nội) 95% bã dong sau khi thu tinh bột đã thải ra ngoài môi trường gây ô nhiễm rất nặng nề [34]

65-2 Thực trạng môi trường tại các làng nghề sản xuất miến dong

Đặc thù của làng nghề chế biến nông sản là lượng bã thải và nước thải lớn nhưng hầu hết các làng nghề chế biến tinh bột dong riềng ở khắp nước ta đều chưa được xây dựng các mô hình và hệ thống xử lý nước thải, bã thải hoặc có nhưng chưa triệt để Hầu như toàn bộ khối lượng nước thải và bã thải đều được nông dân

xả thẳng ra môi trường xung quanh, do đó môi trường ở các làng nghề này và các vùng lân cận đều bị ô nhiễm nghiêm trọng

Hình 1.1 Hiện trạng môi trường tại làng nghề sản xuất miến dong

Hình 1.1 là hai ví dụ cụ thể về ô nhiễm nước thải và bã thải tại các làng nghề sản xuất tinh bột dong và miến dong xung quanh Hà Nội Do không đầu tư nhiều cho vấn đề môi trường, nước thải được xả trực tiếp ra các kênh mương mà không qua xử lý nên gây ô nhiễm nghiêm trọng và ảnh hưởng đến sức khỏe của dân cư làng nghề và các vùng lân cận

Quá trình sản xuất tinh bột dong và tinh bột sắn thải ra một lượng lớn chất thải rắn là vỏ, bã, đất cát, Hiện nay bã thải này được người dân tận dụng làm thức

ăn chăn nuôi, phơi khô làm nhiên liệu rất ít Còn lại đổ ra đường, đổ xuống cống rãnh gây tắc nghẽn, khi bị phân hủy gây mùi hôi thối khó chịu Nguồn thải này gây

ô nhiễm môi trường đất, nước và không khí ở làng nghề

Tại làng nghề Dương Liễu, mùa sản xuất chính kéo dài từ tháng 10 năm trước đến tháng 4 năm sau, trung bình mỗi ngày làng nghề thải ra hơn 500 tấn bã thải và 15000 m3 nước thải Trong số này, gần 300 tấn bã thải từ quá trình chế biến tinh bột sắn thô được tận dụng làm thức ăn gia súc Còn lại hơn 200 tấn bã thải từ quá trình chế biến tinh bột dong riềng không được thu gom, xử lý mà xả thẳng vào

hệ thống thoát nước Nguyên liệu để sản xuất tinh bột là củ sắn và củ dong Lượng nguyên liệu đưa vào sản xuất tăng 5 – 10% theo từng năm

Bảng 1.1 Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu [34]

Vật liệu Nguyên liệu đầu vào (tấn) Bã thải rắn (tấn)

2000 2001 2008 2010 2000 2001 2008 2010

Củ sắn 116.000 125.000 150.000 171.000 47.000 48.000 51.000 57.000

Củ dong 31.000 52.000 66.000 82.000 10.000 16.000 22.000 25.600 Tổng 147.000 177.000 216.000 253.000 57.000 64.000 73.000 82.600

Tại làng nghề chế biến tinh bột và miến dong Cộng Hòa, huyện Quốc Oai ô nhiễm nặng nề từ mùi chua từ giàn miến, kênh mương, đống rác, cống rãnh… bốc

ra Một thực tế đáng báo động là trong quá trình sản xuất tinh bột dong, tỉ lệ thành phẩm sau khi chế biến chỉ được 25-30%, còn lại hơn 70% trọng lượng tồn tại dưới dạng chất thải rắn và lỏng như vỏ và bã dong Do không có nơi tập kết nên các chủ

hộ đành đổ xuống ao, kênh mương nên hầu hết các nguồn nước ở các làng nghề đều

có các thông số ô nhiễm vượt mức cho phép nhiều lần

Ở Minh Hồng- Ba Vì-Hà Nội, nơi đây có nghề mài bột và chế biến miến dong truyền thống Hầu hết các công đoạn trong quy trình sản xuất tinh bột dong và miến dong đều thải ra môi trường nước thải và bã thải Cứ 1 tấn củ dong nguyên liệu sau khi chế biến thu đươc 200kg tinh bột ướt Như vậy 80% phần bã được loại

bỏ, chỉ thu được 20% tinh bột Chỉ số COD dao động từ 2550 – 6800 mg/l Chỉ số ô nhiễm này cao gấp hàng chục lần so với tiêu chuẩn cho phép Toàn bộ lượng nước thải và bã thải từ tất cả các hộ gia đình mài bột trong thôn đều được xả trực tiếp ra ngoài môi trường, mà không có bất cứ một biện pháp xử lý nào, gây ô nhiễm môi trường trong thôn và các vùng lân cận Vào những tháng cao điểm trung bình mỗi

hộ chế biến khoảng 4 tấn nguyên liệu/ngày thì cả làng sẽ thải ra khoảng trên 400 tấn

bã và hàng nghìn m3 nước thải ra môi trường qua các mương, cống chung của làng rồi đổ ra suối và sông Do xả nguồn nước bẩn này ra sông Đà nên con sông này cũng chịu ô nhiễm nặng

3 Khả năng tái sử dụng bã thải dong riềng

3.1 Thành phần bã thải

Quy trình sản xuất tinh bột dong riềng đã thải ra một lượng bã thải với khối lượng lớn gấp 7 - 8 lần so với củ tươi Từ một tấn củ dong sau khi qua quá trình mài dong chỉ thu được 190 – 200 kg tinh bột, phần lớn bã thải được loại bỏ Theo Hoàng Toàn Thắng và cộng sự từ 5486,29 tấn củ ước tính lượng bã thải ra là 4115 tấn [18],

có nghĩa là khoảng 80% bã bị loại ra Từ đó ta có thể thấy hằng năm lượng bã thải

ra là rất lớn Tuy nhiên theo Đỗ Thị Quý, trung bình 1 tấn củ dong sau khi chế biến thu được 250 -300 kg tinh bột ướt, nghĩa là có khoảng 70-75% bã bị loại [12] Với đặc điểm bã thải chứa độ ẩm lên tới 80 -90%, trong 90% lignicellulose đó thì cellulose chiếm từ 35 – 50% Với thành phần chủ yếu là cellulose, bã dong có thể

tận dụng làm nguồn nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế đồng thời giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường [18]

3.2 Những nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng

Tuy lượng bã rắn từ sản xuất tinh bột dong riềng thải ra hàng năm rất lớn, xong mới chỉ một phần rất nhỏ, không đáng kể được tận dụng làm thức ăn gia súc, trồng nấm hoặc làm phân bón phân bón Đa số lượng bã này được thải bỏ ra môi trường xung quanh: cống, mương, ao, sông hoặc đổ xuống ven đường làng, thậm chí đổ đống ngay trong vườn của các hộ làm nghề gây ô nhiễm và mất mỹ quan

Ở một số nơi như Hà Nội, Hưng Yên cũng đã triển khai một số mô hình tái

sử dụng bã dong riềng làm thức ăn gia súc, làm phân bón hoặc làm than hữu cơ,… nhưng mới chỉ giải quyết được một phần rất nhỏ trong tổng số bã thải dong riềng

Hiện nay, các nhà khoa học trong nước đang nỗ lực nghiên cứu tìm ra phương pháp hiệu quả để chế biến bã thải dong riềng thành các sản phẩm có giá trị khác

Ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu về tình trạng ô nhiễm ở các làng nghề và đưa ra những chiến lược để quản lý và giảm thiểu ô nhiễm Tuy nhiên, chưa

có một công bố nào về việc sản xuất ra các chế phẩm sinh học để xử lý triệt để sự ô nhiễm đã và đang xảy ra ở các làng nghề, đặc biệt là việc sản xuất các sản phẩm sinh học để xử lý và tận thu nguồn chất thải rắn ở các làng nghề sản xuất tinh bột dong còn rất hạn chế

Giải pháp tận thu chất thải từ bã dong:

 Tận thu bã thải làm chất đốt

Do lượng bã thải lớn, hàm lượng cellulose cao nên có thể áp dụng giải pháp đơn giản, không cần kỹ thuật cao mọi người dân đều có thể làm được, đó là mang

phơi khô sau đó dùng làm chất đốt Tuy nhiên do đặc điểm của bã thải sau quá trình tách bột là chứa hàm lượng nước cao (90%) nên việc phơi khô mất khá nhiều thời gian và công sức Mặt khác nếu gặp phải trời mưa thì khó thực hiện và có nguy cơ gây ô nhiễm nhanh hơn Với giải pháp này đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thu hồi thấp

và giá trị gia tăng thu lại từ nguồn bã thải là không đáng kể

 Tận thu bã thải để trồng nấm

Bã thải dong riềng chứa hàm lượng nước lớn và giàu hợp chất hữu cơ như hemicellulose, cellulose tinh bột, khoáng, protein, khi bị vi sinh vật phân hủy bốc mùi hôi thối làm ô nhiễm môi trường không khí, nước mặt, nước ngầm.Tuy nhiên

có thể tận dụng bã dong để nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu thì giảm thiểu ô nhiễm môi trường do nấm phát triển làm cho bã dong không bị phân hủy hôi thối đồng thời mang lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho người dân làm nghề từ nấm Ngoài

ra, bã dong sau khi trồng nấm hoàn toàn có thể sử dụng để trồng cây nên có thể giải quyết được triệt để, không gây ô nhiễm môi trường, thu hiệu quả kép [34] Theo Nguyễn Như Ngọc và Cs (2017) đã nghiên cứu tái sử dụng bã dong riềng để nuôi

trồng nấm sò trắng (Pleurotus florida) Cụ thể sau khi xử lý với nước vôi nồng độ

1%, bổ sung 5% cám gạo và 1% CaCO3, hệ nấm sợi phát triển sau 25 ngày kín bịch nguyên liệu và năng suất thu quả thể đạt 49,52% [10]

Nấm được trồng ở hơn 100 quốc gia và việc sản xuất nấm hàng năm trên thế giới đạt 5 triệu tấn và dự kiến đến năm 2016 đạt 7 triệu tấn Tại Việt Nam nấm được xem là ngành hàng mang lại hiệu quả kinh tế cao thu hút sự tham gia của nhiều bà con nông dân Các loại nấm chính trồng ở Việt Nam là nấm sò, nấm rơm, nấm hương, nấm tai mèo và nấm linh chi

 Tận thu bã thải làm phân bón

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong việc tận dụng phế thải nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất phân bón phục vụ lại cho ngành sản xuất nông nghiệp

Bã dong được bổ sung thêm dinh dưỡng để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, đồng thời bổ sung chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật phân giải cellulose

để đẩy nhanh quá trình mùn hóa tạo thành phân Sau khi nguyên liệu mùn hóa hết

tạo thành phân thì có thể phối trộn thêm NPK và các chủng vi sinh vật đặc hiệu để tạo thành phân hữu cơ vi sinh với chất lượng cao

Với dự án “Xây dựng mô hình xử lý chất thải từ quá trình chế biến tinh bột dong riềng làm thức ăn gia súc và phân bón hữu cơ tại tỉnh Bắc Kạn” của Viện Môi trường Nông Nghiệp đã xây dựng thành công mô hình sản xuất bã dong làm phân bón hữu cơ sinh học Dự án đã hoàn thành quy trình sản xuất phân bón hữu cơ từ bã thải dong riềng tại xã Côn Minh với chất lượng phân bón đạt tiêu chuẩn cho phép Qua kết quả sản xuất thực tế cho thấy: Cây lúa được bón phân hữu cơ sinh học sản xuất từ bã dong riềng có thân cao hơn, số hạt chắc trên bông cao hơn so với lúa không bón phân hữu cơ Khi bón phân hữu cơ từ bã thải dong kết hợp với bón phân khoáng đã cho năng suất lúa xuân tăng từ 7,6 - 10,9% và năng suất lúa mùa tăng từ 15,6 - 21,8% so với canh tác truyền thống của nhân dân

Năm 2016, chi cục PTNT Lào Cai phối hợp với UBND xã Bản Xèo – HTX Thành Sơn – Bát Xát tổ chức tập huấn kỹ thuật ủ phân hữu cơ vi sinh từ bã dong riềng bằng chế phẩm Emic cho bà con nông dân, dùng để bón vào đất làm tăng độ phì nhiêu, giảm ô nhiễm môi trường Ở Điện Biên, người dân đã sử dụng bã dong riềng làm phân hữu cơ bón cho cây cà phê

 Tận thu làm thức ăn chăn nuôi

Bảng 1.3 Khả năng tái sử dụng bã thải rắn tại làng nghề Dương Liễu [34]

Bã thải rắn

Bã thải rắn sử dụng (%) Bã thải rắn không sử

dụng (%) Thức ăn chăn nuôi Nhiên liệu Phân bón

Tại làng nghề Dương Liễu bã thải từ sắn hầu như được sử dụng lại, trong khi

bã thải từ dong riềng không được tái sử dụng Để quản lý và xử lý lượng bã thải này sao cho tạo ra lợi ích kinh tế và giảm tác động của nó với môi trường xung quanh là một thách thức lớn đối với địa phương Vì vậy, sử dụng bã dong riềng làm thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu quả xử lý và hiệu quả kinh tế cao, giảm ô nhiễm môi trường Sau khi nghiền, lọc và tách tinh bột có thể thu được trên 800 kg bã/1 tấn

nguyên liệu củ Bã dong có hàm lượng cellulose cao hợp với đặc điểm của thức ăn cho gia súc như: trâu, bò Tận dụng các thành phần dinh dưỡng trong bã dong làm thức ăn chăn nuôi đem lại hiệu quả kinh tế cao, giảm ô nhiễm môi trường, tránh lãng phí nguồn nguyên liệu dồi dào này

Đã có một số nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm thành công sử dụng bã dong làm thức ăn chăn nuôi Đề tài nghiên cứu cấp bộ: “Nghiên cứu sử dụng bã dong riềng làm thức ăn chăn nuôi trâu, bò tại các làng nghề vùng núi Đông Bắc Việt Nam”, đã đưa ra được công thức ủ bã dong để bảo quản dự trữ bã dong làm thức ăn chăn nuôi trâu, bò và đưa ra khuyến cáo thử nghiệm ở địa bàn thí nghiệm chuồng trại và áp dụng trong chăn nuôi trâu bò [18]

4 Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

4.1 Enzyme cellulase

Cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β – 1,4- glucoside trong cellulose Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, các axitamin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm EG và cellobiohydrolase giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân giải cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose

Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC) Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu

cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng tối thích trong khoảng 4-5 Nhiệt độ tối ưu từ 40-50 độ C

Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại:

- 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)

- 1,4- β-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)

- β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Enzyme thủy phân cellulose ở các sinh vật khác thì khác nhau, có thể có các loại enzyme khác nhau, bao gồm một hoặc nhiều enzyme cellobiohydrolase,

enzyme Endo-β-1,4-cellulase và có thể có β-glucosidase Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm cellobiohydrolase celulase, Endo-β-1,4-cellulase và β-glucosidase phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose Các enzyme exo-cellobiohydrolases và

endocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành các đoạn ngắn

oligosaccharides Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó được thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase [27]

Hình 1.2 Mô hình enzyme cellulase

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loại enzyme trên thì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng

Từ những nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulase, cụ thể cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase như sau: đầu tiên Endo-β-1,4-cellulase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đó cellobiohydrolase tấn công cắt ra từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của Endo-β-1,4-cellulase và cellobiohydrolase tạo ra các

celloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose

Hình 1.3 Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lượng enzyme,… một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzyme cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase

Cellulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế

1

2

3

phẩm enzyme Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme được ứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

4.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí Các loài vi sinh vật thay nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme có trong tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn

và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân hủy này Trong số các vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đáng chú ý

nhất là vi khuẩn, Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn) Hầu hết các loại nấm có thể

sử dụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose [40], trong khi ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặc điểm này được

khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn Nấm Trichoderma

reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại bào Hầu hết các

nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung vào các loài nấm (Trichoderma,

Humicola, Penicilium, Aspergillus, Actinomucor), vi khuẩn Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes và Streptomyces)

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạp được sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [36] Mặc dù những loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên, thế nhưng vi khuẩn lại

có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn để được dùng trong việc sản xuất cellulase Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm

Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của vài giống vi khuẩn như Cellulomonas,

Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga, Bacillus và Micrococcus đã được

nghiên cứu và báo cáo trên thế giới [36] Đặc biệt, với các chủng Bacillus được chú

ý hơn cả về khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme như cellulase, amylase, protease có ứng dụng rất nhiều trong đời sống của con người

Howard và cộng sự đã chỉ ra rằng có nhiều chủng vi sinh vật thuộc chi

Baccillus đã được phân lập và định tên đến loài, bao gồm B subtilis, B macerans,

B licheniformis, B sphaericus [35] Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm

nghiên cứu và ứng dụng do vi khuẩn có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo được nhiều sinh khối hơn so với nấm mốc hay nấm sợi do đó giá thành khi sản xuất chế phẩm sẽ rẻ hơn [24,37]

Đào Thị Lượng và công sự đã phân lập được vi khuẩn lactic có khả năng sinh

enzyme cellulase và định tên loài là Lactobacillus plantarum, Enterococus lactis

[9] Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase phân giải cellulose thành các phần tử nhỏ

hơn giúp động vật hấp thu tốt hơn

5 Tình hình sử dụng phân bón hữu cơ ở Việt Nam

Với đặc điểm là một nước nông nghiệp, hàng năm lượng phế thải trong quá trình sản xuất nông nghiệp rất lớn Bên cạnh đó, phế phẩm trong chế biến các loại cây công nghiệp, ngành nấm… cũng rất đa dạng Với tiềm năng dồi dào như vậy, có thể tận dụng tái chế làm phân bón hữu cơ sinh học để chăm sóc cây trồng hướng tới nền nông nghiệp sạch và thân thiện với môi trường Theo số liệu thống kê của Cục Bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT), đến tháng 12/2017, số lượng sản phẩm phân bón hữu cơ được sản xuất, kinh doanh và sử dụng là 713 sản phẩm

Phân hữu cơ là loại phân bón thành phần chủ yếu là bã thải thực vật, động vật mà thông qua hoạt động trực tiếp hay gián tiếp của vi sinh vật cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng, nhằm góp phần nâng cao chất lượng và năng suất của sản phẩm Ngoài ra phân bón hữu cơ còn giúp tăng thêm độ màu mỡ, tơi xốp cho đất bằng cách cung cấp các chất hữu cơ, chất mùn Tùy theo từng nguồn nguyên liệu

mà sản phẩm sau khi ủ có hàm lượng chất dinh dưỡng khác nhau Phân hữu cơ cung cấp nhiều chất vi lượng và chất kích thích sinh trưởng như auxit, axit indoaxetic, các enzyme, vitamin, chất kháng sinh…giúp cây trồng có thể chống chịu sâu bệnh

và điều kiện bất lợi

Phân hữu cơ sinh học là phân hữu cơ được bổ sung thêm các chủng vi sinh vật sống đã được chọn lọc Thông qua các hoạt động của chúng tạo nên các chất sinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K,…) hay các hợp chất sinh học khác góp phần nâng cao năng suất hoặc chất lượng nông phẩm Phân hữu cơ tuy có tác dụng đến cây trồng chậm hơn, nhưng một số ưu điểm lớn như làm tăng

độ mùn, độ phì nhiêu của đất Chính vì vậy hiện nay phân hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

Phân hữu cơ sinh học cung cấp được nhiều chất dinh dưỡng cho cây trồng Ảnh hưởng của nó đối với cây trồng thường chậm nhưng lại có tính ưu việt là duy trì được lâu dài Đặc biệt phân hữu cơ sinh học có tác dụng trong việc cải tạo đất Việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật là tác nhân sinh học trong xử lý phế thải giàu hữu cơ tạo nguồn phân bón hữu cơ phụ vụ sản xuất nông nghiệp đã được các nhà khoa học thực hiện trong những năm gần đây Xí nghiệp phân hữu cơ Tân Kỳ thuộc Công ty hóa chất Vinh chuyên sản xuất phân hữu cơ sinh học phục vụ sản xuất từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên là than bùn Loại than bùn giàu mùn hữu cơ và chất axit humic Năm 2007, Tăng Thị Chính và cs đã nghiên cứu thành công chế phẩm

vi sinh vật Biomix ứng dụng trong xử lý phế thải hữu cơ và được ứng dụng rộng rãi [3] Chế phẩm Bio-F do Võ Thị Hạnh và cs nghiên cứu sản xuất (2005) chứa các vi

sinh vật như xạ khuẩn Streptpmyces sp., nấm mốc Trichoderma sp và vi khuẩn

Bacillus sp có tác dụng phân hủy nhanh các hợp chất hữu cơ Sau 3 ngày các vi

sinh vật hữu ích phát triển mạnh phân giải và làm mất mùi hôi Nhiệt độ trong khối

ủ tăng lên tới 60-700C, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh trong đống ủ Sau 7-10 ngày, tiếp tục ủ chín giai đoạn kết thúc và sản phẩm thu được là phân bón hữu cơ chất lượng cao, có tác dụng phòng chống nấm gây hại cây trồng[5]

Quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ tự nhiên bởi quần thể vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, động vật nguyên sinh…) dưới tác động của độ ẩm, nhiệt độ, không khí tạo nên các sản phẩm cuối cùng là chất mùn và chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể hấp thu được Quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ xảy ra

do những nhóm vi sinh vật dị dưỡng như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm trong đó vai trò của hệ vi sinh vật phân giải xelluloza, ligin, protein, lipit… là rất quan trọng Khi phân hủy các chất hữu cơ với sự có mặt của oxy, thì quá trình được gọi là hiếu khí

Vi sinh vật yếm khí phân hủy các hợp chất không có oxy tham gia nhóm đặc biệt đầu tiên là nhóm vi khuẩn sinh axit và nhóm vi khuẩn chuyển hóa trực tiếp thành metan, amoniac, CO2, H2…Trung bình 6-8 tháng quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ

tự nhiên kết thúc, thời gian kéo dài có ảnh hưởng đến hiệu quả quay vòng của các

chất thải hữu cơ Trong các nghiên cứu Gaus và các cộng sự đã cho thấy các vi sinh vật phân giải xelluloza đã làm tăng hàm lượng nitơ và photpho trong phân hữu cơ cùng với việc giảm giá thành công nghệ

6 Vai trò của vi khuẩn phân giải cellulose trong phân bón hữu cơ

Hiện nay phân bón hữu cơ vi sinh được làm từ phế phụ phẩm nông nghiệp ngày càng tăng Trong đó hàm lượng các chất hữu cơ đặc biệt là cellulose, còn lại rất nhiều Đây là những chất hữu cơ không tan trong nước, bền vững nhưng lại bị

thủy phân dễ dàng bởi enzyme cellulase do vi sinh vật tiết ra (Coughlan et al., 1979;

Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2003)[17,28] Hệ vi sinh vật phân hủy cellulose rất phong phú và đa dạng bao gồm cả vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Các vi khuẩn có khả

năng phân hủy mạnh cellulose đã được chỉ ra là Bacillus, Cellulomonas, Vibrio,

Archomobacter, [17] Theo Walke (1975), vi khuẩn có vai trò đáng chú ý nhất

trong quá trình phân hủy và giữ vị trí đầu tiên trong giai đoạn phân hủy chất hữu cơ của đống ủ, vi khuẩn phân hủy các chất dinh dưỡng có thể phân hủy được nhanh hơn so với các vi sinh vật khác[42] Vi khuẩn còn là sinh vật sống nhiều nhất trong đống ủ chất hữu cơ Vi khuẩn là hệ thống năng động chiếm ưu thế ở tầng đáy và bề mặt đống ủ, hoạt động mạnh mẽ vào giai đoạn trước và sau khi ủ Trong quá trình ủ chất hữu cơ, khi nhiệt độ trong đống ủ ở dưới mức 40oC thì số lượng vi khuẩn ưa

ấm chiếm nhiều nhất 108 (CFU/g), nhiều hơn 102 đến 104 lần so với số lượng xạ khuẩn và nấm, khi nhiệt độ đống ủ ở 40 - 70oC thì số lượng vi khuẩn ưa nóng là 109

(CFU/g), lớn hơn gần 107 lần so với xạ khuẩn và nấm [33]

Vi khuẩn Bacillus là trực khuẩn gram dương, có khả năng sinh bào tử, rất phổ biến trong tự nhiên [4] Enzyme từ Bacillus như amylase, cellulase, protease và

lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền

nhiệt Do đó, enzyme từ Bacillus đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế

biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất

chất tẩy rửa [22] Bacillus là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng

trừ bệnh hại cho cây trồng Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác động rộng, không gây hại cho con người và cây trồng

Mặt khác Bacillus còn tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy thành những chất hữu có đơn giản, giúp cải tạo đất Vi khuẩn Bacillus

được chứng minh có khả năng đối kháng với nhiều loại nấm như: Rhizoctonia,

Sclerotinia, Fusarium, Pythium và Phytopthora và một số vi khuẩn khác nhờ vào

khả năng sinh ra các chất kháng sinh (Nguyễn Xuân Thành và ctv 2003) [17] Bên

cạnh đó, nhóm B amyloliquefaciens nội cộng sinh rễ cây sinh phytase đã được công

bố và gen mã hóa phytase đã được biểu hiện thành công trong tế bào B subtilis [36] Trịnh Thành Trung và cs (2013) đã phân lập được chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum SP 1901 có khả năng phân giải các loại carbohydrate cùng khả

năng sinh các chất kháng nấm và IAA (3-indol acetic acid) kích thích sinh trưởng thực vật và đã chứng minh tiềm năng ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh [22] Thí nghiệm thực tế trên đồng ruộng đã chứng minh khi bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn

B amyloliquefaciens FZB24 đã làm tăng 30% sản lượng thu hoạch bông so với đối

chứng bổ sung với N:P:K (kg/ha) là 180:120:60 Đó là kết quả của khả năng sống

nội cộng sinh trong rễ cây của B amyloliquefaciens, qua đó làm tăng khả năng hấp

thụ chất dinh dưỡng của cây [25,27]

7 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng phân bón hữu cơ

Trong quá trình ủ các phế phụ phẩm nông nghiệp, rác thải hữu cơ thành phân bón hữu cơ có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chât lượng phân ủ - phân hữu cơ

- Độ ẩm và không khí:

Quá ẩm hoặc quá khô đều ảnh hưởng xấu đến sự phân hủy rác thải Quá ẩm

sẽ làm oxi (không khí) khó lọt qua đống phân và tạo điều kiện cho vi sinh vật yếm khí hoạt động Quá khô sẽ ảnh hưởng đến hoạt động của các vi sinh vật vì vi sinh vật cần độ ẩm Tạo được độ ẩm tối ưu cho đống ủ sẽ giúp quá trình ủ diễn ra nhanh

và chất lượng phân tốt

- Nhiệt độ:

Nhiệt độ tăng là quá trình ủ phân diễn ra tốt Các loại mầm bệnh cũng bị tiêu diệt Tuy nhiên không để nhiệt độ tăng quá cao 600C Ở nhiệt độ này nhiều vi sinh vật có ích cũng bị tiêu diệt Muốn giảm nhiệt độ chỉ cần đảo lại đống phân Nhiệt độ tối ưu cho đống phân ủ là khoảng 500C

- Nguồn đạm trong nguyên liệu

Cacbon và nitơ là thức ăn của vi sinh vật phân giải chất thải thành phân hữu

cơ Nếu nguyên liệu phân ủ thiếu đạm thì quần thể vi sinh vật phát triển kém

- Kích thước nguyên liệu

Kích thước nguyên liệu trong đống phân ủ càng nhỏ, diện tích bề mặt tiếp xúc với vi sinh vật càng tăng, tốc độ phân giải càng nhanh Do vậy rơm rạ, phế phụ phẩm nông nghiệp cần băm nhỏ hoặc nghiền

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu bã phế phụ phẩm nông nghiệp thu thập được tại các trang trại trồng nấm ở Sóc Sơn (Hà Nội), Quốc Oai (Hà Nội), Đồ Văn (Hà Nam) và Viện Di truyền Việt Nam:

- Mẫu bã dong riềng sau khi trồng nấm đầu khỉ

- Bã dong riềng sau khi trồng nấm đầu khỉ và nấm rơm

- Mẫu bã mùn cưa sau khi trồng nấm linh chi

- Mẫu bã mùn cưa sau khi trồng nấm linh chi và nấm sò

2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.1 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là của Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

và phòng Thử nghiệm 1 – Công ty cổ phần Chứng nhận và Giám định VinaCert: Tủ

cấy ESCO (Tủ cấy ESCO), Tủ sấy Binder (Đức), Nồi hấp Sturdy (Đài Loan), Nồi hấp Hirayama (Nhật Bản), Tủ ấm LabTech (Hàn Quốc), Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ

ấm lạnh Memmert (Đức), Bể ổn nhiệt (Đức), Máy quang phổ tử ngoại khả kiến VIS (Mỹ), Máy lắc (Đài Loan), Máy ly tâm lạnh (Đức), Cân phân tích KERN (Đức),…

UV-2.2 Hóa chất và môi trường

 Hóa chất và môi trường

Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong quá trình nghiên cứu bao gồm:

Merck: Cao thịt, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, CaCl2, NaCl, Agar, Lugol,

Bộ nhuộm Gram, KOH, 1-Naphthol; MR-VP broth; Blood agar …

Himedia: Peptone, Cao nấm men, Cellulose, D(+) Xylose, D - Lactose, ONPG, Thuốc thử Kovacs', Creatin; Triple sugar iron agar (TSI); Ure agar; Lysine decarboxylase (LDC); Ornithine decacboxylase (ODC); Arginine dihydrolase (ADH); Tryptophan; Carbohydrate consumption broth (CCB); Simmons Citrat Agar …

Trung Quốc: K2Cr2O7, Ag2SO4, HgSO4, H₂ SO₄ đặc, FeSO₄ 7H₂ O,

H2O2, [(NH₄ )₂ Fe(SO₄ )₂ 6H₂ O], MgSO4.7H2O, D-Glucose, D-Mannitol, Sucrose, Ure,…

Việt Nam: Máu cừu khử sợi huyết

 Thành phần của một số môi trường

Môi trường dinh dưỡng lỏng (NB): Pepton 10 g/l, cao thịt 10 g/l, NaCl 5 g/l Môi trường thạch NB: Pepton 10 g/l, cao thịt 10 g/l, NaCl 5 g/l; Agar 15 g/l Môi trường thạch phân lập vi khuẩn phân giải cellulose Hans: K2HPO4 0,5 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, (NH4)2SO4 1,0 g/l, MgSO4.7H2O 0,1 g/l, CaCl2 0,1 g/l, NaCl 6,0 g/l, cao nấm men 0,1 g/l, CMC 10,0 g/l, agar 15,0 g/l

Môi trường thử hoạt tính Cellulase ngoại bào với thành phần: CMC 10,0 g/l, Agar 15,0 g/l

Môi trường Luria Bertani có bổ sung L-Tryptophan: Bacto-trypton 10,0g/l; cao nấm men 5,0g/l; NaCl 5g/l; L-Tryptophan 1g/l

Môi trường thử sinh hóa:

MR-VP broth: Pepton 7 g/l, glucose 5 g/l, K2HPO4 5 g/l

Blood agar: Pepton 20 g/l; NaCl 5 g/l, agar 15 g/l

TSI: Cao thịt 3 g/l, cao nấm men 3 g/l, pepton 20 g/l, NaCl 5 g/l, lactose 10 g/l, sucrose 10 g/l, glucoes 1 g/, Sắt (III) xitrat 0,3 g/l, Natri thiosulphat 0,3 g/l, Phenol đỏ 0,024 g/l, agar 1 g/l

Ure agar: Pepton 1 g/l, glucose 1 g/l, NaCl 5 g/l, KH2PO4 2 g/l, phenol đỏ 0,012 g/l, agar 15 g/l

LDC: L-Lyzin monohydroclorua 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, glucose 1 g/l, bromocresol đỏ tía 0,015 g/l

ODC: L-Ornithin monohydroclorua 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, glucose 1 g/l, bromocresol đỏ tía 0,015 g/l, NaCl 10 g/l

ADH: L-Arginin monohydro clorua 5 g/l, cao nấm men 3 g/l, glucose 1 g/l, bromocresol đỏ tía 0,015 g/l, NaCl 10 g/l

Tryptophan: Trypton 10 g/l, NaCl 5 g/l, DL-Tryptophan 1 g/l

Carbohydrate consumption broth: Pepton 10 g/l, NaCl g/l, cao thịt 1 g/l, bromocresol tím 0,1 g/l

Simmons Citrat Agar: MgSO4 0,2 g/l, NH4H2PO4 1 g/l, K2PO4 1 g/l, NaCl 5 g/l, Na3C6H5O7 1 g/l, Bromothymol xanh 0,08 g/l, agar 15 g/l

Thuốc thử Salkowski: 15ml FeCl3 0,5M; 300ml H2SO4 98%; nước cất 500ml

Các môi trường hấp khử trùng ở 121o

C trong 15 phút

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn

Từ các mẫu bã thải, cân 10g cho vào bình tam giác 250ml chứa 90ml môi trường NB, pH = 6,5, nuôi lắc 150 vòng/phút ở 37oC trong 48 giờ

Xử lý mẫu trên ở 80oC trong 15 phút, sau đó để mẫu về nhiệt độ phòng và tiến hành pha loãng mẫu bằng cách: Hút 1ml mẫu cho vào 9ml môi trường pha loãng NaCl 0,85% được dung dịch mẫu ở độ pha loãng 10-1, tiến hành tương tự để thu được các độ pha loãng tiếp theo, pha loãng đến 10-6

Lấy 0,1 ml mẫu ở các độ pha loãng trên cấy chang lên môi trường chọn lọc, mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần, sau đó nuôi ủ các mẫu ở 37oC trong 48 giờ Sau thời gian nuôi ủ, chọn, nhận dạng các chủng riêng biệt cấy ria trên môi trường chọn lọc đến khi thu được chủng thuần khiết

Nhận diện, phân loại sơ bộ các loài vi khuẩn qua đặc điểm hình thái [4]

3.2 Phương pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase

Tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm,

đục lỗ thạch và xác định hoạt độ enzyme cellulase

Phương pháp cấy chấm điểm: Cấy chấm điểm các chủng trên môi trường

thử hoạt tính có chứa CMC, nuôi ở 37oC trong 48 giờ Sau thời gian nuôi, để đĩa Petri vào tủ lạnh trong 12 giờ Sau đó cho vào tủ ấm 40oC trong 6 giờ Lấy ra, cho vào mỗi đĩa Petri 5 ml thuốc thử lugol, dàn đều khắp mặt thạch; để trong 15 phút rồi gạn bỏ hết thuốc thử và đo kích thước vòng phân giải Tính tỷ số giữa đường kính vòng phân giải (D1) và đường kính khuẩn lạc (d1) [11]

Phương pháp đục lỗ thạch: Các chủng được chọn tăng sinh trên môi trường

NB bổ sung thêm CMC 1%, nuôi 48 giờ ở 37oC Sau thời gian nuôi, đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong phía trên Hút 100µl dịch trong thu được sau ly tâm của mỗi chủng cho vào từng giếng (đường kính giếng d2

= 8mm) trên môi trường thử hoạt tính cellulase ngoại bào Nuôi các đĩa thạch này ở

37oC trong vòng 48h Sau đó tiến hành nhuộm lugol và tính hiệu số giữa vòng phân giải (D2) và đường kính giếng (d2) [11]

Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase: Hoạt độ cellulase được

xác định chính xác dựa vào lượng đường khử tạo thành sau phản ứng bằng phương pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [39]

 Xây dựng đồ thị đường chuẩn:

Chuẩn bị dung dịch gốc glucose: Cân 50 mg glucose và định mức đến 50ml

ta được dung dịch gốc nồng độ 1mg/ml

Cho dung dịch gốc vào các ống nghiệm theo thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ml Cũng theo thứ tự đó cho lần lượt nước cất với lượng 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ml Sau đó lắc đều, ta thu được các ống nghiệm với nồng độ glucose lần lượt là 0, 1, 2, 3, 4, 5,

6 mg/ml

Sau đó lấy 0,2 ml dịch đường ở mỗi nồng độ, thêm 0,6 ml thuốc thử DNS đem lắc đều Đun sôi trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá Đem đo OD540 nm với mẫu trắng là nước cất

- Các bước đo hoạt độ enzyme

Dịch enzyme thô thu từ canh trường nuôi lỏng được ly tâm loại sinh khối sau

đó mang đi xác định hoạt độ

Cơ chất sử dụng: CMC 1% pha trong đệm citrat pH5

+ Cho lần lượt 180l cơ chất, 600l DNS vào ống ependorf rồi lắc đều Sau

đó thêm 20l enzyme, lắc đều Đun sôi cách thủy đúng 10 phút Làm nguội nhanh

+ Đo mật độ quang (OD540 nm)

- Công thức tính hoạt độ enzyme cellulase

Một đơn vị hoạt độ enzym cellulase được tính bằng lượng enzyme cần thiết

để thủy phân CMC thành một lượng đường khử tương ứng với một μmol đường glucose trong thời gian 1 phút tại 50˚C , pH 5 Phương pháp này dựa trên sự thủy phân cơ chất CMC của enzyme cellulase

Trong đó: X – nồng độ đường khử (mg/ml)

0,8 – tổng thể tích phản ứng (ml)

1000 – quy đổi ra mol

180 – khối lượng đường glucose

30 – thời gian phản ứng (phút) 0,02 – thể tích enzyme phản ứng (ml)

f – hệ số pha loãng

3.3 Định danh vi khuẩn

3.3.1 Phương pháp định danh dựa trên đặc tính sinh lý, sinh hóa

Vi khuẩn có các phản ứng hóa sinh đặc trưng, dựa trên cơ sở này để chọn lọc

sơ bộ các chủng phân lập

Phương pháp nhuộm Gram: Gram vi khuẩn được xác định dựa trên sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi khuẩn Cấu trúc thành tế bào của mỗi vi khuẩn khác nhau nên khả năng bắt màu cũng khác nhau, vi khuân Gram (+) bắt màu tím và Gram (–) bắt màu hồng [13]

Khả năng sinh bào tử của vi khuẩn: được xác định bằng cách xử lý nhiệt ở

80oC trong 15 phút Các vi khuẩn có khả năng sinh bào tử và các vi khuẩn chịu nhiệt được giữ lại

Các tính chất sinh hóa:

- Catalase: Lấy khuẩn lạc cần kiểm tra hòa vào một giọt dung dịch hydro

peroxit trên lam kính Kiểm tra sự hình thành bọt khí Nếu quan sát thấy sủi bọt thì

vi khuẩn phản ứng dương tính catalase, ngược lại là phản ứng âm tính với catalase

- Oxidase: Dùng đũa thủy tinh lấy một phần khuẩn lạc cấy lên đĩa giấy đã

tẩm thuốc thử oxidase Sau 10 giây, quan sát kết quả Phép thử được coi là dương tính nếu đĩa giấy chuyển sang màu tím hoa cà, màu tím hoặc tím sẫm

- Di động: Cấy đâm sâu vi khuẩn vào môi truờng thạch di động, ủ ở 25oC ±

1oC trong 48 giờ Kiểm tra kiểu mọc xung quanh vết cấy, chủng di động khi vết cấy mọc lan Nếu mọc chưa đủ, thì nuôi thêm 5 ngày và kiểm tra lại vết cấy

- Khả năng sinh H2S và phân giải một số loại đường: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy Ủ ở 35oC ± 1oC trong 24h ± 3 h Bề mặt nghiêng của thạch, màu vàng (lactose và/ hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/ hoặc sucrose)), màu đỏ hoặc không đổi màu (lactose và sucrose âm tính (không sử dụng lactose cũng như không sử dụng sucrose)) Cấy đâm sâu, màu vàng (glucose dương tính), màu đỏ hoặc không đổi màu (glucose âm tính), màu đen (sinh hydro sunfua (H2S)), bọt hoặc vết rạn (sinh khí từ glucose)

- Lên men các loại đường: Sử dụng các loại đường: D – Glucose/ D (+)

Xylose/ D – Lactose/ D-Mannitol/ Sucrose Cấy chủng vào từng ống canh thang hydrat cacbon đã bổ sung các loại đường Nuôi ấm ở 35°C ± 1oC đến 5 ngày Các phản ứng dương tính (sinh axit) có màu vàng và phần lớn xảy ra trong vòng từ 24 giờ đến 48 giờ

- Ure: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch Ủ ở 35oC ± 1oC trong 24h ± 3h

và kiểm tra thường xuyên Thạch màu hồng, màu đỏ hồng: Urê dương tính Urê phân giải thành amoniac, làm phenol màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó

chuyển thành màu đỏ hồng Phản ứng thường xuất hiện sau 2 giờ đến 4 giờ

- LDC: Cấy phía dưới bề mặt của môi trường, phủ 1 lớp parafin lỏng Ủ ở

35oC ± 1oC trong 24 giờ ± 3 giờ Màu tím đục và đỏ tía: phản ứng dương tính; Màu

vàng: Phản ứng âm tính

- ODC: Cấy phía dưới bề mặt của môi trường, phủ khoảng 1 ml paraffin lỏng

lên bề mặt môi trường Ủ 35o

C ± 1oC trong 24 giờ ± 3 giờ Đục hoặc có màu tím: phản ứng dương tính; Màu vàng: phản ứng âm tính

- ADH: Cấy phía dưới bề mặt của môi trường, phủ khoảng 1 mL paraffin

lỏng lên bề mặt môi trường Ủ ở 35o

C±1oC trong 24 giờ ± 3 giờ Đục hoặc có màu

tím: phản ứng dương tính; Màu vàng: phản ứng âm tính

- Phát hiện β-galactosidase: Sử dụng các đĩa giấy bán sẵn: Cho một vòng đầy

các khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa 0,1 ml dung dịch NaCl 0,85% và một đĩa giấy, lắc đều Ủ ở 35oC ± 1oC trong 24 giờ ± 3 giờ, kiểm tra ống thường

xuyên Màu vàng: Phản ứng dương tính (phản ứng thường xuất hiện sau 20 phút); Môi trường không đổi màu: Phản ứng âm tính

- VP: Cho một vòng khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 3 ml môi trường VP

Ủ ở 37oC ± 1oC trong 24 giờ ± 3giờ Sau khi ủ, thêm hai giọt dung dịch creatin, ba giọt dung dịch etylic 1-naphtol và thêm hai giọt dung dịch kali hydroxit; lắc đều sau mỗi lần thêm từng loại thuốc thử Màu hồng đến màu đỏ sáng: phản ứng dương tính

(phản ứng xảy ra trong 15 phút); Màu vàng nhạt: Phản ứng âm tính

- Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi trường tryptophan Ủ

- Tan huyết: Cấy chấm điểm các khuẩn lạc cần thử lên môi trường thạch máu Ủ

ở 30oC ± 1oC /24 giờ ± 3 giờ Phản ứng tan huyết xảy ra khi xuất hiện vùng trong

3.3.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

Dựa trên phân tích trình tự 16S rRNA của các chủng vi khuẩn: Tách DNA tổng số dựa trên nguyên tắc phá vỡ thành tế bào và liên kết của các protein với DNA Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA; Điện di gel agarose dựa trên độ lớn và hình thái của DNA trong điện trường Các phân tử DNA tích điện âm dịch chuyển về phía anode (cực dương) với tốc độ tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử, sau đó chúng được phát hiện nhờ kĩ thuật nhuộm Ethidium Bromide [4]

Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn: Để tách chiết được DNA tổng cần

phá vỡ thành tế bào, phá vỡ liên kết của các protein với DNA

Điện di gel agarose: Việc phân tách DNA dựa trên độ lớn và hình thái của

DNA trong điện trường Do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode (cực dương) với tốc độ tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử Vì vậy, các đoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm và sau một khoảng thời gian di chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thước (trọng lượng) khác nhau sẽ tách

xa vị trí ban đầu di chuyển những khoảng khác nhau Do đó, chúng được tách nhau

ra và có thể được phát hiện nhờ kĩ thuật nhuộm Ethidium Bromide

Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA: Đây là phương pháp in vitro sử

dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn

Tinh sạch sản phẩm PCR: Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 1% và được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM-DNA Purification

Xác định trình tự và xử lý số liệu: Trình tự đoạn gen 16S rRNA được giải

trình tự theo phương pháp Sanger cải tiến trên máy tự động ABI PRISM®

3100 Genetic Analyzer Kết quả giải trình tự 16S rRNA của vi khuẩn được phân tích so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI bằng chương trình BLAST

để định tên vi sinh vật

3.4 Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng 3-indol

acetic acid (IAA)

Nuôi chủng trong môi trường dịch thể Luria Bertani có bổ sung L - tryptophan với tốc độ lắc 150r/min ở 370C trong vòng 24 giờ Hút 1ml dung dịch ban đầu vào đĩa petri chứa môi trường thạch Luria Bertani Cấy chang đều rồi ủ ở

370C trong 24 giờ Sau đó nhỏ thuốc thử Salkowski lên khuẩn lạc [13]

4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng

Chuẩn bị giống: Nuôi chủng trên môi trường NB ở 37o

C trong 48 giờ Thu dịch sinh khối, mỗi thí nghiệm cấp 5% dịch nuôi vào bình tam giác 250 mL chứa

250 ml môi trường NB

Tất cả các thí nghiệm sau 6 giờ lấy mẫu 1 lần Tiến hành xác định làm lượng sinh khối của chủng vi sinh vật bằng phương pháp đo quang (OD) ở bước sóng 600nm Từ các giá trị OD tiến hành xây dựng được biểu đồ ở mỗi thí nghiệm

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Cũng giống như các vi sinh vật khác, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt

động của vi khuẩn Tiến hành khảo sát ở các nhiệt độ: 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC

và 50oC trong môi trường NB được chuẩn về pH = 7; cấp giống 5% và nuôi tĩnh

4.2 Ảnh hưởng của pH

Môi trường NB được chuẩn về các pH = 4; 5; 6; 6,5; 7; 8; 9; 10 Nuôi tĩnh

các bình thí nghiệm ở nhiệt độ đã chọn ở trên

4.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống

Cố định nhiệt độ, pH mà tại đó chủng đạt sinh khối cao nhất Tiến hành khảo

sát tỷ lệ cấp giống với các giá trị 1%, 3%, 5%, 7%, và 10%

Nhiệt độ, pH, tỷ lệ cấp giống, tốc độ lắc đã được chọn ở trên, nuôi chủng trong

môi trường NB với hàm lượng pepton lần lượt là 0%; 0,1%; 0,3%; 0,5%; 0,7%; 1%; 1,2%

5 Ứng dụng vi khuẩn trong ủ phân bón hữu cơ vi sinh

5.1 Quy trình thử nghiệm ủ phân bón

- Nghiên cứu được bố trí quy mô phòng thí nghiệm với 1kg bã khô (độ ẩm 10%)/ khối ủ

Sử dụng hộp nhựa có kích thước dài x rộng x cao = 30 cm x 20 cm x 20cm Đáy hộp có đục các lỗ thông khí Tiến hành đảo trộn 2 ngày/ lần

- Nuôi chủng trong môi trường NB ở 40°C với tốc độ lắc 150v/phút, pH = 6,5 trong thời gian sinh khối đạt cao nhất Sau đó tiến hành ủ với bã thải Mật độ chủng

108CFU/g

- Thời gian ủ hiếu khí sẽ diễn ra trong 28-30 ngày Trong quá trình ủ theo dõi các chỉ tiêu: nhiệt độ sẽ được kiểm tra hằng ngày; độ ẩm, pH, độ sụt lún thể tích: 5 ngày/ lần; hàm lượng Cacbon tổng số và Nitơ tổng sẽ được kiểm tra sau 28-30 ngày ủ

- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng

5.2 Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu trong phân bón

5.2.3 Phương pháp xác định pH [14]

Trước khi đo giá trị pH cần dùng tay đảo đều khối ủ Lấy mẫy ở 5 điểm của đường chéo góc trong thùng ủ rồi đem phân tích Bình mẫu có thể tích nhỏ nhất là 50ml làm bằng thủy tinh bosilicat hoặc polyetylen có nắp hoặc nút kín Dùng thìa 5ml để lấy một phần mẫu thử đại diện từ mẫu phòng thí nghiệm Cho phần mẫu thử vào bình mẫu và thêm vào một thể tích nước, dung dịch kali clorua hoặc dung dịch canxi clorua gấp 5 lần thể tích của mẫu thử Trộn hoặc lắc mạnh huyền phù trong 60 phút bằng máy lắc hoặc máy trộn và chờ ít nhất 1giờ nhưng không lâu hơn 3 giờ Phải tránh để không khí lọt vào trong khoảng thời gian sau khi lắc Đo pH trong huyền phù ở 200C ± 20C ngay sau khi hoặc trong khi lắc Quá trình lắc phải đạt được trạng thái huyền phù đồng nhất của các hạt đất nhưng phải tránh không khí lọt vào Đọc giá trị pH sau khi đã đạt được trạng thái ổn định Chú ý ghi giá trị pH tới hai số thập phân

5.2.4 Phương pháp xác định nitơ tổng trong phân bón [15]

Cân 0,1-0,5 g mẫu vào mảnh giấy lọc Gói gọn và thả vào ống kjeldahl Cân khoảng 2g hỗn hợp xúc tác K2SO4:CuSO4 tỉ lệ 10:1 vào ống kendan Thêm 10-12ml

H2SO4 đặc Phá mẫu: Đặt các ống kjendahl vào khay và lắp vào hệ thống phá mẫu:

15 phút ở 2000

C, 15p ở 3000C, 150p ở 3800C, 60 phút ở 4200C Nếu dịch phá còn màu vàng thì tiếp tục phá mẫu ở nhiệt độ 4200C Hút chính xác 25ml H3BO3 5% vào bình tam giác (bình hấp thụ) Cân 0,1- 0,2 g (NH4)2SO4 cho vào ống kendan