khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của các nhóm gen có liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung

Một trong những kiểu epigenetic được chứng minh có tiềm năng trở thành dấu chứng sinh học cao, đó là sự bất hoạt của các gen đè nén u tumour suppressor gene bằng cơ chế methyl hoá quá m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HOÁ TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC NHÓM GEN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số: B2010.32.10

Chủ nhiệm đề tài: TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP Hồ Chí Minh, 10/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HOÁ TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC NHÓM GEN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số: B2010.32.10

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

TP Hồ Chí Minh, 10/2011

Thành viên tham gia: ThS Lê Thị Trúc Linh

CN Hồ Bảo Khuyên

CN Tôn Nữ Tùng Kim

Đơn vị phối hợp chính: Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á

CN Hồ Thị Thanh Thủy

I.2 TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA 3 I.2.1 Định nghĩa sự methyl hóa DNA 4

I.3.3 Gen DNMT3L (DNA methyltransferase 3-like) 10 I.3.3.1 Cấu trúc và chức năng 11

I.3.3.2 Sự methyl hóa gen DNMT3L trong ung thư 12

I.3.4.1 Cấu trúc và chức năng 13 I.3.4.2 Sự methyl hóa gen p16 INK4a trong ung thư 14

I.3.5.1 Cấu tạo và chức năng 15 I.3.5.2 Sự methyl hóa gen DcR1& DcR2 trong ung thư 16 I.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN

SỰ METHYL HÓA DNA

II.2.2.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi trong phản ứng Q-MSP 26 II.2.2.2 Thử nghiệm tách chiết DNA 27 II.2.2.3 Thử nghiệm biến đổi bisulfite DNA bằng phương pháp thủ công 30 II.2.2.4 Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng Epitect bisulfite kit 33

II.2.2.5 Phương pháp MSP trên mẫu bệnh phẩm 34

II.2.2.6 Giải trình tự sản phẩm MSP 36 II 2.2.7 Phương pháp điện di trên gel agarose 36

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1 KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO 38

III.1.2.1 Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG 44 III.1.2.2 Thiết kế - đánh giá mồi 45

III.2.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm Q-MSP sử dụng DNA

III.2.2 Giải trình tự sản phẩm MSP từ DNA chứng 69

III.2.3.1 So sánh hiệu quả của hai phương pháp tách chiết: Phenol/Chloroform và

i-genomic kit

72 III.2.3.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi methyl và unmethyl trên gen

DcR1, sử dụng DNA chưa biến đổi bisulfite

73 III.2.3.3 Thử nghiệm biến đổi DNA bằng Epitect Bisulfite kit và thực hiện MSP 75 III.2.3.4 Thử nghiệm MSP sử dụng DNA biến đổi bisulfite thủ công 76 III.2.4 Thử nghiệm quy trình trên bệnh phẩm 77 III.2.4.1 Đặc điểm methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen

DAPK, RAR, p16 INK4a và DcR1 trong bộ mẫu khảo sát

78 III.2.4.2 Tương quan giữa đặc điểm kiểu type HPV nhiễm và tần số methyl hóa

của các gen DcR1, DAPK, RAR và p16 INK4a

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ II.1: Tiến trình thực hiện nghiên cứu 24

Sơ đồ II.2: Tiến trình thực nghiệm biến đổi bisulfite DNA thủ công 31

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng II.2: Chu kì nhiệt của phản ứng Q-MSP 27

Bảng II.3: Thành phần phản ứng PCR với các cặp mồi WT1, 2 30

Bảng II.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR với WT1, 2 30

Bảng II.5: Thành phần phản ứng biến đổi DNA bằng sodium bisulfite 32

Bảng II.6: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite DNA sử dụng EpiTect bisulfite Kit 34

Bảng II.8: Chu kì nhiệt của phản ứng MSP 35

Bảng II.9: Giá trị nhiệt độ nóng chảy của các mồi 36

Bảng III.1: Phương pháp phân tích và nguồn mẫu sử dụng trong 36 khảo sát 39

Bảng III.2: So sánh số liệu tần số methyl hóa của các nghiên cứu khác nhau dựa

trên yếu tố kỹ thuật và yếu tố nguồn mẫu

40

Bảng III.3: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của các gen DAPK, RARβ

và p16 trong ung thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường

42

Bảng III.4: Trình tự và các thông số IDT của hệ thống mồi thiết kế cho các gen

49

Bảng III.5: Kết quả kiểm tra trên DNA chứng bằng phương pháp QMSP 59

Bảng III.6: Nồng độ và chất lượng DNA được tách bằng 2 phương pháp

i-genomic Kit và Phenol/Chloroform

71

Bảng III.7: Tổng kết đặc nhiễm nhiễm type HPV, đặc điểm loại mẫu bệnh phẩm

và kết quả MSP của DcR1, DcR2, DAPK, RARβ và p16INK4a cho bộ mẫu khảo sát

81

Bảng III.8: Liên quan giữa nhóm tuổi – nguy cơ bệnh – Tính chất methyl hóa bất

thường

83

Bảng III.9: Tần số methyl hóa của các gene DcR1, DAPK, RARβ và p16INK4a

trong mô ung thư cổ tử cung và dịch phết tế bào âm đạo

84

Bảng III.10: Mối tương quan giữa đặc điểm nhiễm type HPV và tần số methyl

hóa của DcR1, DAPK, RAR , p16 INK4a

85

Bảng III.11: Các mẫu có lần lượt không, một, hai, ba, bốn gen bị methyl hóa

trong 31 mẫu bệnh phẩm

86

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình I.1: Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cổ tử cung của virus HPV 3

Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH 3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp

nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT)

Hình III.1: Tần số methyl hóa của các gen DAPK, p16 và RARβ trong ung thư cổ

tử cung và trong tế bào bình thường

43

Hình III.2: Sơ đồ cấu trúc vùng gen DAPK, RAR, p16, DNMT3L, DcR1, DcR2

khảo sát, trình tự đảo CpG sau biến đổi bisulfite và vị trí bắt cặp của các cặp mồi

trong phương pháp MSP

52

Hình III.3: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi RAR  -M và RAR -U

62

Hình III.4: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi p16-M và p16-U

63

Hình III.5: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi DAPK-M và DAPK-U

Hình III.9: Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gen DcR1 69

Hình III.10: Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP unmethyl của gen DcR1 70

Hình III.11: Kết quả phân tích di trên gel agarose DNA bộ gen tách chiết bằng

i-genomic kit (ký hiệu A trên hình) và Phenol/Chloroform (ký hiệu B trên hình) từ ba

mẫu sinh thiết mô 01, 02 và 03

MSP của các mẫu 1, 2 và 3 sử dụng mồi methyl WT3; Giếng 2, 4, và 6 tương

ứng sản phẩm MSP của các mẫu 1, 2 và 3 sử dụng mồi unmethyl WT4; Giếng 7:

sản phẩm MSP của mẫu số 1, sử dụng mồi WT2

Hình III.15: Kết quả điện di sản phẩm MSP với cặp mồi WT3 và WT4 sử dụng

DNA biến đổi thủ công: giếng 1, 2 và 3 tương ứng sản phẩm MSP sử dụng mồi

unmethyl WT4, methyl WT3 và thang chuẩn 100 bp

76

Hình III.16: K ết quả điện di sản phẩm MSP với cặp mồi methyl trên gen DcR2,

trước (A) và sau (B) khắc phục băng ký sinh: ký hiệu mẫu được ghi trên các

giếng, kích thước sản phẩm mong đợi được chỉ ra trên hình; lad: thang chuẩn

100 bp

77

Hình III.17: Phân tích đặc điểm methyl hóa vùng promoter của các gen DcR1,

79

Hình III.18: Giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gen RARβ 80

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AC Adenoma carcinoma

bp Base pair (cặp base)

BSP Bisulfite Sequencing PCR

CDK Cyclin Dependent Kinase

COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis DAPK Death-Associated Protein Kinase

DcR Decoy receptor

DNA Deoxyribonucleic acid

DNMT DNA methyltransferase

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

HPV Human Papilloma virus

HSIL High Grade Squamous Intraepithelial Lesions IDT Integrated DNA Technology

LSIL Low Grade Squamous Intraepithelial Lesions

M Methylated

MBD Methyl-CpG-binding

M-F Methylated forward primer

M-R Methylated reverse primer

MSP Methylation Specific PCR

NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction

QMSP Quantitative Methylation Specific PCR

RARβ Retinoic Acid Receptor beta

SCC Squamous Cell Carcinoma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Trường Đại học Mở TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo CpG thuộc vùng

promoter của các nhóm gen có liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung

- Mã số: B2010.32.10

- Chủ nhiệm: TS Lê Huyền Ái Thúy

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Mở TP.HCM

- Thời gian thực hiện: 18 tháng từ tháng 05/2010 đến tháng 11/2011

2 Mục tiêu: Đưa ra một dữ liệu về sự methyl hóa bất thường của một số gen có

liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung ở người

Việt nam

3 Tính mới và sáng tạo:

- Đây là công trình đầu tiên được thực hiện ở Việt nam về tìm hiểu hiện tượng

“Epigenetics” trên nhóm bệnh nhân ung thư cổ tử cung Để tìm hiểu thông tin này, phương pháp Methylation Specific PCR cũng là lần đầu tiên được xây dựng thành công, cả trên DNA chứng và trên hai nguồn bệnh phẩm: dịch phết tế bào âm đạo

và sinh thiết mô ung thư cổ tử cung Chính vì vậy, kết quả của đề tài về thông tin

sự methyl hóa bất thường trên cụm bốn gen được khảo sát từ 37 bệnh nhân là thông tin “epigenetic” đầu tiên ở Việt nam được công bố

- Để đạt được những kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã khai thác hiệu quả thông tin trên các ngân hàng dữ liệu gen, vận dụng kết hợp các công cụ tin-sinh học mới, phù hợp để khai thác tốt nhất lượng thông tin di truyền trên từng vùng gen (DNA) khảo sát Chính sự kết hợp sáng tạo này đã đưa đến các luận chứng khoa học về mặt lý thuyết làm tiền đề rất tốt, có đủ độ tin cậy để nhóm nghiên cứu đi tiếp bước

thực nghiệm chứng minh

4 Kết quả nghiên cứu:

- Đã thiết kế thành công các cặp mồi đặc hiệu cho phương pháp MSP và BSP để kiểm tra mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gen

DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 và p16 INK4a

- Đã thử nghiệm thành công để chứng minh tính hợp nhất về lý thuyết cũng như chứng minh tính đặc hiệu của tất cả các bộ mồi trong thực nghiệm, sử dụng các nguồn DNA chứng

- Đã rút ra được các tỉ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các

gen DcR1, DAPK, RARβ và p16 INK4a lần lượt là 49%, 58%, 77% và 58% với độ

bao phủ (có ít nhất một trong bốn gen DcR1, DAPK, RAR và p16 INK4a bị methyl hóa) trong bộ mẫu khảo sát là 90% Trong số đó, mức độ methyl hóa của gen

RARβ và p16 INK4a có liên quan chặt chẽ với kiểu gen HPV xâm nhiễm

5 Sản phẩm:

- 6 bộ mồi cho phản ứng MSP và BSP trên các gen DAPK, DNMT3L, RARβ,

DcR1, DcR2 và p16 INK4a

- Quy trình MSP với đầy đủ các thông số

- Tỉ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen DcR1,

DAPK, RARβ và p16 INK4a

6 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

- Ung thư cổ tử cung là một trong những loại ung thư phổ biến và có thể chữa khỏi nếu được phát hiện kịp thời Nghiên cứu này nhằm bước đầu xây dựng cơ sở khoa học về cả lý thuyết lẫn thực nghiệm, nhằm tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về biến đổi epigenetics – methyl hóa bất thường của những gen quan trọng, để từng bước đánh giá khả năng sử dụng dữ liệu này như một dấu chứng sinh học, đặc trưng cho người bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt nam Kết quả bước đầu rất khả quan hướng

đề nghị của chúng tôi đến việc mở rộng cỡ mẫu khảo sát

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

Project title: Surveying DNA methylation at CpG islands in the promoter regions of some genes involved in the formation and development of cervical cancer

Code number: B2010.32.10

Coordinator: Dr Le Huyen Ai Thuy

Implementing institution: HoChiMinh city Open University

Duration: 18 months from 5/2010 to 11/2011

2 Objective(s): Given an aberrant methylation data of some genes involved in the formation and development of cervical cancer in Vietnamese people

3 Creativeness and innovativeness:

- This is the first work done in Vietnam to explore of the "Epigenetics"

information of cervical cancer patients in Vietnam In order to find out this information, Methylation Specific PCR method was first successfully established, both on the DNA controls and DNA extracted from two kinds of clinical samples: vaginal smears and biopsies of cervical cancer tissues Consequently, the final results of this research about the aberrant methylation of four gene clusters were examined from 37 patients first published in Vietnam

- To achieve the above results, the research group was effective exploitation of genetic information in the Genbanks, combined use of new bioinformatics tools, suitable for getting the most of genetic information in each gene (DNA) surveying Above creativity combination led to the scientific arguments in theory to be a good premise, has enough confidence to go forward step experimentally demonstrated

4 Research results:

- Successfully designing specific primer pairs for MSP and BSP methods to surveying the aberrant methylation at CpG islands in the promoter region of the 6

genes including DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 and p16INK4a

- Successfully demonstrating the consistency of the theory and the experiments, demonstrating the specific of primer pairs in MSP using DNA controls

- Giving the frequencies of DNA methylation at CpG islands in the promoter

regions of 4 genes DcR1, DAPK, RARβ and p16INK4a reaching 49%, 58%, 77%

and 58%, respectively, the coverage (methylated at least one of the four genes) is

90% Especially, the aberrant methylation of p16INK4a and RARβ genes is

associated with HPV genotype infection

5 Products:

- 6 sets of primers for MSP and BSP at at CpG islands in the promoter regions of 6

genes including DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 and p16INK4a

- MSP protocols with all of parameters

- The frequency of CpG island methylation in the promoter regions of 4 genes

DcR1, DAPK, RARβ and p16INK4a

6 Effects, transfer alternatives of research results and applicability:

Cervical cancer is one of the most common cancer types and can be cured if detected in time This study is the first step to build the scientific basis of both theory and experiment, to proceed to build the database for epigenetics - aberrant methylation of important genes in order to get final purpose: use this data as a biomarker for cervical cancer in Vietnam Initial results are very positive towards our proposal to expand the sample size

MỞ ĐẦU

I.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG:

I.1.1 Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và tại Việt Nam:

Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế IARC, công bố năm

2008, ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh ung thư thường gặp, có tần suất thứ hai sau ung thư vú và chiếm 13% trong các bệnh ung thư xảy ra ở phụ nữ trên thế giới, với tỉ lệ tử vong cao, chiếm 52% trong số người mắc phải căn bệnh này [65] Tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính có khoảng 529.828 ca ung tư cổ tử cung mới và 275.128 ca tử vong trong năm 2008 và khoảng 86% các trường hợp này xảy ra ở các nước đang phát triển, mà nguyên nhân chủ yếu là do sự thiếu các chương trình tầm soát và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung đối với các đối tượng ít được chăm sóc về y tế Ngoài ra, chất lượng của một số chương trình tầm soát bằng tế bào học cổ tử cung thường chưa đạt yêu cầu [65]

Cũng theo IARC, tỉ lệ nhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13%, nghĩa là cứ 10 phụ nữ có 1 người nhiễm HPV Ở Việt nam, nếu chỉ tính riêng ung thư cổ tử cung thì số người chết vì HPV đã cao hơn nhiều so với HIV Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung, cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện kịp thời Tuy nhiên thực tế ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời, và hiện nay bệnh này đang là nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ hai ở Việt Nam nói chung và đứng đầu ở Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng Hiện tại, có khoảng 30,77 triệu phụ

nữ tuổi từ 15 tuổi trở lên có nguy cơ mắc phải ung thư cổ tử cung Kết quả thống

kê của IARC cho thấy rằng có 2.472 ca tử vong trong số 5.174 trường hợp được chẩn đoán ung thư cổ tử cung mỗi năm tại Việt Nam [65]

I.1.2 Tác nhân gây bệnh:

Các nhà khoa học đã xác định thủ phạm gây ra hầu hết các dạng ung thư cổ tử cung là Human Papilloma Virus (HPV) – một loại virus gây u nhú ở người, chiếm khoảng 82% số trường hợp phụ nữ bị ung thư cổ tử cung ở các nước đang phát triển [46]

HPV là virus có vật liệu di truyền là DNA, thuộc họ Papovaridae Bởi vì virus này không thể phát triển trong thực nghiệm và không có xét nghiệm huyết thanh nào đáng tin cậy, nên sự nhận diện và định type HPV chỉ căn cứ vào nucleic acid Một đặc điểm rất quan trọng nữa của virus này là chúng không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm [46] nên để nghiên cứu, người ta chỉ có thể

dựa vào in vivo trên người hay động vật bị nhiễm

Tùy thuộc vào khả năng dẫn đến ung thư, người ta chia HPV thành hai nhóm [46]:

 Nhóm “nguy cơ thấp” (low risk): những type HPV thuộc nhóm này chỉ gây những mụn cóc hoặc khối u lành tính Bộ gen của chúng tồn tại độc lập với tế bào chủ Các type HPV trong nhóm nguy cơ thấp thường gặp như L1 (6, 42, 43, 81), L2 (11, 61, 70, 71)

 Nhóm “nguy cơ cao” (high risk): bao gồm những type có khả năng gắn xen DNA của chúng vào bộ gen người, gây ra những rối loạn hình thành các khối u ác tính Các type HPV trong nhóm nguy cơ cao thường gặp là H1 (16, 18,

31, 45), H2 (33, 35, 39, 52), H3 (51, 56, 66, 68), H4 (53, 58, 59, 82)

Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của hai type HPV là do vùng gen E6, E7 Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của người và không có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ

Mặc dù có sự khác biệt về tần suất nhiễm các type HPV giữa các vùng địa lý nhưng type 16,18 thường gây ung thư ở hầu hết các nơi trên thế giới [44, 55] Hầu hết những trường hợp nhiễm HPV là tạm thời Nếu bệnh nhân có sức đề kháng mạnh thì có thể khỏi bệnh Do cơ chế nào chưa rõ , có khoảng 5-10% phụ

nữ nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao sẽ còn tồn tại tình trạng nhiễm HPV này Những bệnh nhân ấy có khả năng tiến triển sang các tổn thương tiền ung thư cổ tử

cung, nếu khơng điều trị sẽ tiến đến ung thư Gần đây, các nhà khoa học đã tìm thấy sự hiện diện của HPV trong 93-100% các trường hợp carcinom tế bào gai ở

cổ tử cung Một số týp gây nên những u nhú quanh bộ phận sinh dục, hậu mơn thường gọi là bệnh mào gà (condylomata acuminatum) đĩ là týp 6, 11 thường xuất hiện vài tuần hoặc nhiều tháng tế bào nhân to, nhiều thùy nhiều năm sau khi tiếp xúc Khảo sát vi thể các tổn thương gây ra do HPV cho thấy lớp tế bào bề mặt cĩ hình ảnh loạn sừng (dyskeratosis), á sừng (parakeratosis) và những tế bào rỗng (koilocyte) cĩ nhân to, đa nhân, tăng sắc là đặc trưng của tế bào nhiễm HPV [58] Loại ung thư cổ tử cung thơng thường nhất là ung thư tế bào gai và thường do HPV 16, 18 Ung thư tế bào tuyến thì ít , chủ yếu cĩ liên quan đến HPV 18 [58]

Sự tiến triển của bệnh

Niêm mạc

bình thường Nhiễm HPV; Tế bào rỗng CIN I

Tổn thương thượng mô gai mức độ thấp (LSILs)

CIN II CIN III

Tổn thương thượng mô gai mức độ cao (HSILs)

Hình I.1: Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cở tử cung của virus HPV

I.2 TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HỐ DNA:

Epigenetics cĩ thể được định nghĩa là những biến đổi di truyền trong sự biểu hiện kiểu gen nhưng khơng đi kèm với những biến đổi trong trình tự DNA [6] Trong những năm gần đây, hiện tượng epigenetic đang được nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm theo khuynh hướng sử dụng chúng như dấu chứng sinh

học (biomarker) và thực tế cho thấy có một sự liên quan hết sức chặt chẽ giữa hiện tượng epigenetic với nhiều loại ung thư Một trong những kiểu epigenetic được chứng minh có tiềm năng trở thành dấu chứng sinh học cao, đó là sự bất hoạt của các gen đè nén u (tumour suppressor gene) bằng cơ chế methyl hoá quá mức ở các nucleotide cytosine hiện diện trong đảo CpG, và sự methyl hoá quá mức này thường được ghi nhận tại vùng promoter hay kéo dài qua đến exon thứ nhất của các gen nói trên

Trong những công bố của những năm qua và gần đây, các tác giả đã khẳng định: (1) Ung thư là bệnh của sự methyl hóa bất thường và (2) sự methyl hóa DNA – là một dấu chứng sinh học tiềm năng lớn có thể dùng để tiên lượng và chẩn đoán ung thư

I.2.1 Định nghĩa sự methyl hóa DNA:

Sự methyl hóa DNA là một biến đổi cộng hóa trị dẫn đến sự bổ sung nhóm

-CH3 vào vị trí carbone số 5 của Cytosine trong cặp nucleotide CpG nhờ sự xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs), enzyme này thúc đẩy phản ứng chuyển nhóm -CH3 từ S-adenosylmethionine (SAM) đến Cytosine (Hình I.2) Sự methyl hóa này là biến đổi epigenetics chính trong bộ gen động vật có vú Khoảng 70% các cặp nucleotide CpG trong bộ gen của động vật có vú đều bị methyl hóa [34]

I.2.2 Enzyme xúc tác:

Quá trình methyl hóa DNA được thực hiện bởi một nhóm enzyme DNMTs (Hình I.2) đã được biết đến như DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b và DNMT3L [13] Trong đó, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành sự methyl

hóa de novo và duy trì sự methyl hóa này là nhờ 3 enzyme DNMT1, DNMT3a, DNMT3b DNMT3a và DNMT3b là các de novo DNA methyltransferase có

nhiệm vụ thiết lập DNA methyl hóa đầu tiên bằng cách gắn những gốc methyl mới vào Cytosine trong cặp CpG mà trước đó không bị methyl hóa, DNMT1 là methyltransferase có nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở những vị trí Cystosine trên sợi đơn DNA vừa được tổng hợp trong quá trình tái bản DNA Do đó sự methyl hóa

DNA được di truyền cho các thế hệ tế bào tiếp theo nhờ vào cơ chế methyl hóa DNA mạch khuôn [21] Các enzyme này cũng góp phần vào sự methyl hóa bất thường và dẫn đến sự phát triển của ung thư Sự biểu hiện quá mức của gen

DNMTs ở mức độ mRNA đã được nhận thấy ở một vài bệnh ung thư, và sự biểu

hiện của DNMT1 tăng trong tế bào bình thường thì có thể gây nên sự methyl hóa

de novo bất thường ở đảo CpG Mức độ mRNA của DNMTs được qui định một

cách khác nhau trong suốt chu trình tế bào, và sự biểu hiện DNMTs không phù hợp có thể góp phần thay đổi sự methyl hóa trong các tế bào ung thư [42]

Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH 3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT)

I.2.3 Sự methyl hoá DNA trong ung thư:

Sự methyl hóa có một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các quá trình của tế bào như: sự phát triển phôi thai, sự phiên mã, ức chế nhiễm sắc thể X (X chromosomes inactivation), và “in dấu bộ gen” (genome imprinting) [24] Tuy nhiên khi sự methyl hóa diễn ra bất thường trên các cặp nucleotide CpG thuộc vùng promoter của gen đè nén u hay các gen liên quan đến khối u sẽ gây ra những biến đổi có thể dẫn tới ung thư vì nó ảnh hưởng tới sự giảm hoạt tính của quá trình phiên mã các gen này Trong một số bệnh ung thư đang được chú ý gần đây thì người ta nhận thấy có sự gia tăng một số lượng lớn các gen đã bị methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen đó [45] Điều này củng cố hơn về vai trò của sự methyl hóa quá mức đảo CpG trong phát sinh ung thư, và là một biểu

hiện sớm trong sự phát triển tế bào ung thư Do đó sự methyl hóa DNA có thể được sử dụng như một dấu chứng sinh học phân tử hữu ích để tiên đoán ung thư [45]

Đảo CpG là những vùng thuộc gen có chứa nhiều cặp nucleotide CpG Trong

bộ gen động vật có vú, đảo CpG có ít nhất khoảng 200bp và có tỷ lệ CG lớn hơn 50% Đảo CpG thường không bị methyl hóa trong tế bào bình thường và được phân bố ở gần đầu 5’ của gen [34] Khoảng một nửa tất cả các gen của người đều chứa đảo CpG [13] và gần đây người ta đã ước tính bộ gen người chứa khoảng 29.000 đảo CpG [45] Cặp nucleotide CpG phân bố ngẫu nhiên trong bộ gen nhưng đảo CpG thường nằm trong những vùng nhỏ riêng biệt của gen và khoảng 40% đảo CpG nằm trong và gần vùng promoter Sự methyl hóa quá mức trên đảo CpG là một hiện tượng chung trong ung thư Sự kìm hãm quá trình phiên mã của gen đè nén khối u bởi hiện tượng methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen có thể sẽ góp phần đến sự phát sinh ung thư [34]

Hai nhóm gen chính mà khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư là các gen ung thư (oncogene) và gen đè nén khối u Trong

đó gen đè nén khối u có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào và hạn chế tối đa các đột biến hay tổn thương có thể truyền cho thế hệ tế bào kế tiếp Do đó khi hiện tượng methyl hóa xảy ra quá mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen đè nén khối u sẽ làm giảm sự biểu hiện của gen bằng cách ngăn chặn trực tiếp sự liên kết với các yếu tố phiên mã hoặc chỉ đạo gen liên kết với các protein kìm hãm Từ

đó sẽ làm bất hoạt hay làm im lặng gen này, dẫn tới tế bào sẽ phân chia liên tục và những tổn thương được tích lũy lại dần dần hình thành ung thư (Hình I 3)

Hình I.3: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen Sự methyl hóa quá mức đảo CpG ở vùng promoter của gen gây ức chế quá trình phiên mã

của gen, làm cho gen im lặng dẫn đến sự phát sinh ung thư

I.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC GEN DAPK, DNMT3L, RARβ, p16 INK4a , DcR1 & 2:

I.3.1 Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase):

I.3.1.1 Cấu trúc và chức năng:

Gen DAPK thuộc nhiễm sắc thể số 9 ở vị trí 9q34.1, dài khoảng hơn 210 kb gồm 24 exon Gen DAPK mã hóa cho cùng một protein trong khi được điều hòa

bởi hai promoter, trong đó promoter thứ nhất dài 1508 bp hoạt động mạnh hơn từ 40-50% so với promoter thứ hai-exon 1b-intron 1 dài 969 bp Đồng thời mức độ biểu hiện của sản phẩm phiên mã từ exon 1 cao gấp 2,4 lần so với exon 1b Ngoài

ra, trong promoter thứ nhất còn chứa một vùng promoter tối thiểu cần cho hoạt động đầy đủ của promoter, có chiều dài 332 bp (từ -1357 đến -1025, tính từ vị trí khởi đầu phiên mã) chứa các vị trí liên kết với yếu tố phiên mã CP2, Sp1, MZF;

do đó khi có sự đột biến tại các vị trí này sẽ ảnh hưởng sự phiên mã của gen Đột biến ở vị trí liên kết CP2 (-1184) có một ảnh hưởng mạnh, làm giảm hoạt động của gen đã được ghi nhận trên 65% trong tất cả các dòng tế bào từ khối u phổi Ngược lại, hoạt động của gen chỉ bị giảm khoảng 25% khi đột biến xuất hiện tại vị trí liên kết Sp1 (-1301) hoặc MZF (-1169) [53]

Gia đình DAPK là một phân họ mới của các kinase serine/threonine tiền chương trình chết (pro-apoptotic), bao gồm ít nhất năm thành viên DAPK, ZIPK

(Dlk), DRP-1, DRAK1 và DRAK2 [57] Thành viên của gia đình được nghiên cứu

sớm và nhiều nhất là DAPK, một gen đè nén khối u có vai trò kiểm soát chu trình

chết của tế bào DAPK tham gia vào nhiều con đường dẫn truyền trung gian trong chu trình tế bào nhờ các tín hiệu của con đường apoptosis như p53, Interferon-γ, TNFα, TGF-β…[21] như là một chất điều hòa dương DAPK còn có vai trò quan trọng trong sự bất hoạt chu trình tế bào tại điểm kiểm soát nhờ vào khả năng hoạt hóa con đường apoptosis của p53 phụ thuộc p19ARF thông qua sự phosphoryl hóa p19ARF Protein p53 có vai trò ức chế chu kỳ tế bào ở pha G1, cho phép sự tham gia của những cơ chế sửa sai DNA trước khi bước vào giai đoạn phân chia nhờ vào sự kích hoạt quá trình phiên mã hệ thống enzyme sửa chữa DNA; điều này nhằm hạn chế tối đa khả năng các sai hỏng này được truyền cho thế hệ tế bào kế tiếp Nếu quá trình sửa chữa DNA thất bại thì p53 sẽ cảm ứng cho tế bào đi vào con đường apoptosis Protein p19ARF là một protein có vai trò trong sự tiến triển của chu trình tế bào Protein này liên quan đến sự hoạt hóa p53 bằng cách ức chế protein Mdm2 (Murine double minute) Mdm2 liên kết với p53 sẽ ức chế hoạt động phiên mã của p53, do đó bằng cách ngăn cản Mdm2, p19ARF cho phép hoạt hóa sự phiên mã của p53 từ đó chu trình tế bào sẽ bị ngừng lại hoặc đi vào con đường apoptosis nếu có sự sai hỏng DNA Vì vậy, khi mất đi sự biểu hiện của

DAPK có thể dẫn đến sự bất hoạt con đường apoptosis quan trọng này trong các

khối u nên DAPK được xem như là một gen đè nén khối u liên quan chặt chẽ đến

sự xuất hiện, sự phát triển và xâm lấn của khối u

I.3.1.2 Sự methyl hóa gen DAPK trong ung thư:

DAPK đóng vai trò quan trọng trong bệnh lí và sự di căn của khối u Sự mất

chức năng của những gen ức chế khối u có thể xảy ra thông qua các đột biến điểm,

sự xóa bỏ alen, sự xóa bỏ đồng hợp tử, hoặc do sự methyl hóa bất thường của

vùng promoter Nhưng sự mất biểu hiện của DAPK thường xảy ra bởi sự methyl

hóa bất thường, mặc dù những cơ chế khác cũng đã được mô tả [60] Sự im lặng

phiên mã của DAPK xảy ra trong nhiều loại ung thư khác nhau thông qua sự methyl hóa quá mức ở những mức độ khác nhau Sự methyl hóa quá mức DAPK là một cơ chế chính cho sự bất hoạt DAPK trong các khối u ở người dẫn đến sự phát

triển các giai đoạn bệnh lí, tăng kích thước khối u và sự hình thành các nút bạch

huyết trong các mẫu khối u [21] Mất đi sự biểu hiện của DAPK sẽ tạo một sự phát

triển chọn lọc có lợi cho các tế bào ung thư mà nó có thể chuyển sang sự tấn công

và phát triển khối u [53]

DAPK đã được khẳng định có liên quan đến một số bệnh ung thư trong thời

gian gần đây và tỷ lệ methyl hóa gen DAPK trên những loại ung thư đó lần lượt là:

ung thư phổi (34 %) [48], ung thư gan (52%) [68], u tủy nhiều chỗ (52,7%) [11], u tuyến yên (34%) [59], ung thư bàng quang (48%) [61]… Riêng trong ung thư cổ

tử cung, tỉ lệ methyl hóa ở gen này khoảng 43,3% [42] và tỉ lệ methyl hóa này trong những giai đoạn khác nhau của ung thư cổ tử cung thì khác nhau như: tổn thương trong biểu mô vảy cấp cao HSIL (44,5%) và trong ung thư cổ tử cung xâm lấn ICC là 40,5% [19], đối với ung thư tế bào biểu mô vảy SCC là 61% và trong ung thư biểu mô AC là 36% [16], theo như Zambrano và các cộng sự thì tỉ lệ

methyl hóa trên DAPK trong các mẫu khối u lên đến 100% [73] Đặc biệt, trong tế

bào bình thường gen DAPK không bị methyl hóa [16]

I.3.2 Gen RARβ2 (Retinoic Acid Receptor, beta):

I.3.2.1 Cấu trúc và chức năng:

Gen RARβ là một gen đè nén khối u mã hóa cho thụ thể RARβ Gen RARβ

nằm trên nhiễm sắc thể số 3 ở vị trí 3p24 với kích thước khoảng 170 kb, gồm 6

exon Trên gen RARβ có sự hiện diện của hai vùng promoter P1 và P2 ở đầu 5’ của gen giúp phiên mã ra bốn loại mRNA khác nhau: mRNA RARβ1, mRNA RARβ2, mRNA RARβ3, mRNA RARβ4 lần lượt mã hóa cho các thụ thể RARβ1, RARβ2, RARβ3, RARβ4 Promoter P1 trực tiếp phiên mã cho RARβ1, trong khi đó promoter P2 thì phiên mã cho RARβ2 và RARβ4 RARβ3 được điều hoà biểu hiện

bởi promoter P1 ở chuột nhưng lại vắng mặt ở người Retinoids, một tập hợp các hợp chất hóa học liên quan đến vitamin A, có nhiều vai trò quan trọng trong khắp

cơ thể bao gồm khả năng điều chỉnh sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, tế bào của xương; giữ vai trò quan trọng trong việc quy định sự phát triển và biệt hóa tế bào, chức năng miễn dịch và kích hoạt gen đè nén khối u [63, 27] Những vai trò này được thực hiện thông qua trung gian là các thụ thể acid retinoic (Retinoid Acid Receptors-RARs) và các thụ thể retinoid X (Retinoid X receptors-RXRs), mà các thụ thể này có vai trò kích thích các yếu tố phiên mã trong việc đáp ứng liên kết của một phối tử acid retinoic bằng cách gắn các yếu tố RAREs lên vùng promoter

của gen đích [63]

Những thụ thể của gia đình RARs được biểu hiện khác nhau trong suốt đời sống sinh trưởng và phát triển của tế bào, và người ta cho rằng protein RARβ2 hạn chế sự phát triển của nhiều loại tế bào bằng cách điều chỉnh biểu hiện của gen qua quá trình phiên mã Trong tế bào biểu mô bình thường, người ta nhận thấy rằng

khi được xử lí với RA thì sự điều hòa phiên mã của RARβ2 được tăng lên giúp

kiểm soát quá trình phiên mã trong nhân Ngược lại trong các tế bào ác tính, sự thiếu hụt RA ở các tế bào biểu mô được thể hiện thông qua sự phân bào tăng liên tục và mất sự biệt hóa của tế bào [27]

I.3.2.2 Sự methyl hóa gen RARβ2 trong ung thư:

Sự methyl hóa quá mức trong đảo CpG thuộc vùng promoter dẫn đến sự mất

biểu hiện của gen RARβ2 đã được khảo sát trên nhiều bệnh ung thư khác nhau

như: ung thư vú [9], ung thư phổi [1], ung thư dạ dày [38], ung thư tuyến tiền liệt [38] Riêng trong ung thư cổ tử cung, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự

methyl hóa có thể là nguyên nhân cho sự giảm biểu hiện của gen RARβ2 trong tế

bào ung thư cổ tử cung Cụ thể theo nghiên cứu của Ivanova và các cộng sự thì 8/20 mẫu (40%) ung thư tế bào vảy (Squamous Cell Carcinoma-SCC) bị methyl hóa có sự giảm hoặc mất đi sự biểu hiện của RARβ2 Trong khi đó những mẫu tế

bào cổ tử cung bình thường thì RARβ2 không bị methyl hóa và biểu hiện bình

thường [24] Đối với giai đoạn ung thư cổ tử cung xâm lấn thì mức độ methyl hóa

quá mức của RARβ2 dao động từ 33-66% [17]

I.3.3 Gen DNMT3L (DNA methyltransferase 3-like)

I.3.3.1 Cấu trúc và chức năng:

Phản ứng gắn nhóm methyl (-CH3) vào vị trí Cacbon 5 của Cytosine trong

cặp nucleotide CpG được xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferase mà các enzyme này được mã hóa bởi họ gen DNA (cytosine-5-)-methyltransferase Các sản phẩm của họ gen này chịu trách nhiệm phần lớn trong tình trạng methyl hóa DNA của các tế bào Thực tế nhiều nghiên cứu đã chứng minh cho thấy có sự methyl hóa bất thường trên một số gen đè nén khối u và gen gây ung thư dưới xúc tác của họ enzyme DNA methyltransferase có liên quan chặt chẽ với ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng [24, 9, 17] Vì vậy, những biến đổi bất

thường trên họ gen DNMTs như sự bất hoạt hay hoạt hóa bất thường trên gen

DNMTs sẽ gây nên sự giảm biểu hiện hay sự biểu hiện quá mức của các protein

DNMTs, điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến tình trạng methyl hóa bất thường

của tế bào

DNA methyltransferase ở Eukaryote được chia thành DNMT1, DNMT2,

DNMT3 (DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L) [6, 12, 41] Tất cả DNMTs đều có cấu trúc phân tử tương tự nhau Miền xúc tác - C chịu trách nhiệm về hoạt động xúc tác của enzyme, và có mười vùng bảo tồn đặc trưng, sáu trong số này có độ bảo tồn cao có mặt ở gần như tất cả methyltransferases cytosine từ vi khuẩn đến các loại nấm, thực vật, động vật có vú [38, 54] Trong khi đó miền đuôi –N của DNMTs có độ bảo tồn thấp [42] chứa các vùng tương tác khác nhau

Gen DNMT3L nằm trên nhiễm sắc thể số 21, thuộc chuỗi dài ở vị trí 21q22.3,

có kích thước gần 16 kb gồm 12 exon và 11 intron Vùng promoter của gen này có chiều dài khoảng 477 nucleotide và vùng 5’ promoter của gen này không chứa đảo CpG Đặc biệt gen này có vùng promoter thiếu trình tự hộp TATA ở gần vị trí bắt đầu phiên mã và chứa nhiều vị trí gắn yếu tố phiên mã Sp1 Gen này mã hóa cho protein DNA methyltransferase 3L Protein DNMT3L có chiều dài 387 acid amin chứa các miền chức năng khác nhau như: vùng giàu cystein ATRX (α-thalassemia/mental retardation syndrome, X-linked), vùng PHD (polybromo homology domain), miền -N tương ứng trong DNMT3A và DNMT3B [33], miền -

C chứa các vùng bảo tồn cao I, IV, VI, VIII Protein này được biểu hiện cụ thể ở các tế bào mầm trong thời kỳ hình thành giao tử và giai đoạn phát triển phôi thai [8]

Protein DNMT3L không được cho là DNA methyltransferase đúng nghĩa bởi

vì trong phân tử của protein này thiếu những acid amin quan trọng cần cho hoạt động của chính nó [8]nhưng DNMT3L đóng một vai trò quan trọng cho sự điều chỉnh mức độ epigenetics của tế bào Chúng cũng có vai trò methyl hóa de novo và

sẽ được hoạt hóa khi tương tác với DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3)/ DNA methyltransferase 3 beta (DNMT3) [30] Protein DNMT3L giúp hoat động

de novo methyltransferases bằng cách liên kết với các miền –C của DNMT3A và

DNMT3B và làm tăng mức độ hoạt động của các enzyme này dẫn đến làm tăng

khả năng bám vào DNA của DNMT3A và DNMT3B DNMT3L có thể được xem

như là một yếu tố trao đổi chất nền cho các chức năng của DNMT3A và DNMT3B và là một yếu tố kích thích trung gian chung cho tất cả hoạt động

methyl hóa de novo của DNMT3A và DNMT3B Ngoài ra, protein DNMT3L

cũng có chức năng ngăn chặn sự phiên mã khi nó liên kết với (HDAC1) Các vùng bảo tồn PHD của DNMT3L tương tác và kích hoạt HDAC1 đã cho thấy rằng protein này cũng tham gia góp phần cùng với de-acetylation histone, tu bổ chất nhiễm sắc và ức chế phiên mã [15]

I.3.3.2 Sự methyl hóa gen DNMT3L trong ung thư:

Một số nghiên cứu in vitro cho thấy rằng sự methyl hóa promoter DNMT3L

liên quan đến hoạt động phiên mã của gen[25] Những biến đổi trên gen DNMT3L

có thể xảy ra như sự giảm hoặc tăng cường sự methyl hóa trên promoter DNMT3L,

có thể làm tăng hay giảm mức độ biểu hiện của gen trong các tế bào bất thường

Với vai trò của DNMT3L trong việc điều hòa hoạt động methyltransferase,

DNMT3L xứng đáng là gen cần thiết để thành lập một mô hình methyl hóa trong tế

bào mầm [8] Sự methyl hóa CpG trong vùng promoter của gen DNMT3L có ý

nghĩa rất quan trọng trong sự phát triển phôi thai, khử hoạt tính nhiễm sắc thể X[25]

Mặc dù vậy, nghiên cứu về sự methyl hóa gen này trong ung thư không được

đề cập nhiều Theo kết quả nghiên cứu của Gokul và các cộng sự, có mối tương quan của sự giảm methyl hóa DNA (hypomethylation) trong vùng promoter

DNMT3L với bệnh ung thư cổ tử cung Tuy nghiên cứu chỉ tiến hành trên 14 mẫu

ung thư, nhưng đây thực sự là kết quả quan trọng bước đầu cho thấy việc tiếp tục tìm kiếm thông tin hữu methyl hóa này trên gen là cần thiết, đặc biệt trong việc hướng đến mục tiêu tìm kiếm một dấu chứng sinh học nhằm tiên lượng, đánh giá nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung cho bệnh nhân (risk assessment marker) và khuynh hướng điều trị bệnh cho bệnh nhân [20]

I.3.4 Gen p16 INK4a:

I.3.4.1 Cấu trúc và chức năng:

Gen CDKN2A (Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A) nằm trên nhiễm sắc thể 9p21, mã hóa cho hai protein p16 (16kDa, còn gọi là p16 INK4a ) và p14 (còn gọi

là p14 ARF ) [38] Trong đó, p16 được mã hóa bởi exon 1α, 2 và 3, có chức năng

điều hòa âm chu trình tế bào thông qua sự ức chế các CDK (Cyclin Dependent Kinase) tương tác với cyclin D1 [33] Sự biểu hiện p16 gia tăng theo tuổi tác, quá trình biểu hiện này liên quan đến quá trình lão hoá của tế bào, khi càng lớn tuổi thì nồng độ p16 sẽ càng cao p16 chi phối quá trình lão hoá bằng cách giới hạn sự tự

làm mới của các tế bào có khả năng nhân đôi

CDK và cyclin là hai nhóm protein có vai trò quan trọng tại các điểm kiểm soát (checkpoint) trong chu trình tế bào [19] Khi không có mặt p16, CDK cùng cyclin tạo phức hợp cyclin/CDK thực hiện phosphoryl hóa pRb (protein Retinoblastoma), dẫn đến mất đi sự hình thành liên kết giữa pRb và E2F, E2F được tự do hoạt hóa các gen sao chép DNA thúc đẩy chu trình tế bào đi qua điểm kiểm soát G1/S Tuy nhiên, khi qua điểm kiểm soát này nếu phát hiện DNA hư hỏng, chu trình tế bào sẽ tạm ngưng lại để sửa chữa DNA Quá trình tạm ngưng này được thực kiện nhờ p16 tương tác với các thành phần CDK4/6 cản trở sự hình thành phức hợp cyclin/CDK dẫn tới pRb không được phosphoryl hóa hoặc phosphoryl hóa ở mức thấp và không tách rời E2F, quá trình sao chép DNA không

diễn ra, chu trình tế bào ngưng lại tại điểm kiểm soát G1/S, lúc này các gen chịu trách nhiệm sửa chữa DNA hư hỏng sẽ làm việc [43, 40] Vì vậy, khi mà p16 bị bất hoạt sẽ làm cho các tế bào hư hỏng sao chép một cách không kiểm soát đến một lúc nào đó sẽ chuyển sang trạng thái ung thư

I.3.4.2 Sự methyl hóa gen p16 trong ung thư:

Trong nhiều loại ung thư, p16 được tìm thấy ở trạng thái bị bất hoạt do hai

nguyên nhân đột biến và biến đổi epigenetics Sự methyl hóa đảo CpG trong vùng

exon 1α dẫn đến sự mất biểu hiện của p16 được tìm thấy trong nhiều loại khối u ác

tính như: ung thư phổi, ruột kết, tuyến tụy, u màng não [7] Đặc biệt, một vài

nghiên cứu đã xác định rằng sự methyl hóa quá mức vùng promoter gen p16 là

một sự kiện xảy ra thường xuyên trong ung thư cổ tử cung, ảnh hưởng đến quá

trình sao chép và biểu hiện gen [16] như đảo CpG của gen p16 đã bị methyl hóa

19-61% trong ung thư cổ tử cung [43], và sự methyl hóa bất thường của p16 xảy

ra sớm với cả khối u tại chỗ và khối u xâm lấn trong ung thư cổ tử cung [62] Theo

Nuovo và các cộng sự thì sự methyl hóa quá mức p16 luôn hiện diện một cách thường xuyên dẫn đến làm bất hoạt hoạt động của p16 trong các giai đoạn của ung

thư cổ tử cung [50] Sự vắng mặt của hiện tượng methyl hóa quá mức vùng

promoter p16 trong mẫu mô bình thường cũng chứng minh được giá trị của hiện

tượng này như một dấu chứng sinh học đặc trưng dùng chẩn đoán ung thư cổ tử cung

Đã có rất nhiều nghiên cứu khám phá mức độ methyl hóa vùng promoter của nhiều gen đè nén khối u chọn lọc trong các trường hợp ung thư cổ tử cung và những tổn thương tiền ung thư Một nghiên cứu lớn gần đây đã giải thích những biến đổi trong mức độ methyl hóa DNA, từ cổ tử cung bình thường qua những tổn thương khối u tiền ung thư và đến ung thư cổ tử cung xâm lấn, đã cho thấy rằng sự methyl hóa quá mức của một gen đè nén khối u đặc hiệu có thể được sử dụng như

là một dấu chứng sinh học để tiên lượng bệnh, tiên đoán khả năng hình thành và phát triển của khối u, chẩn đoán bệnh và cả khuynh hướng chữa trị bệnh ung thư

cổ tử cung theo liệu pháp sử dụng thuốc làm giảm methyl hóa [19]

Từ những dữ liệu phân tích ở trên, chúng tôi cho rằng việc tiến hành khảo sát tình trạng methyl hóa tại vùng promoter của một số gen, đặc biệt tập trung vào các

gen đè nén u (p16INK4a, DAPK, RARβ2) hay gen chịu trách nhiệm xúc tác trực tiếp cho quá trình methyl hóa (DNMT3L) là rất cần thiết, đặc biệt đối với một

nghiên cứu khởi đầu về epigenetics trên khuynh hướng methyl hóa này đối với bệnh ung thư cổ tử cung

I.3.5 Gen DcR1 và DcR2:

I.3.5.1 Cấu tạo và chức năng:

Họ ligand của yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor Ligand-TNF ligand) bao gồm TNF-, FasL và TRAIL có vai trò cảm ứng chương trình chết theo chu trình của tế bào (apoptosis) [5, 53] Giống như những thành viên khác, TRAIL (tumor necrosis factor - related apoptosis - inducing ligand) là một loại protein vận chuyển màng nhưng nó có thể gây ra chương trình apoptosis sau khi

liên kết với các thụ thể tiền apoptotic (pro-apoptotic) của nó như DR4 (TRAIL-R1)

và DR5 (TRAIL-R2) Không giống như FasL và TNF-, TRAIL gây ra con đường apoptosis một cách chọn lọc trong các tế bào khối u mà không tác động đến các tế bào bình thường [3] TRAIL được điều hòa bởi 4 thụ thể khác nhau và cả 4 thụ thể này đều nằm trên nhiễm sắc thể thứ 8 ở vị trí 8p 21–22 bao gồm: DR4 và DR5, chúng chứa miền chết (death domain) đóng vai trò thiết yếu trong việc truyền phát tín hiệu apoptosis; ngược lại, các thụ thể DcR1 (TRAIL-R3) và DcR2 (TRAIL-R4), còn được gọi là những thụ thể bẫy (decoy receptors), thì không chứa miền chết (DcR1) hoặc chứa miền chết không hoàn chỉnh (DcR2), nên DcR1 và DcR2 không có vai trò cảm ứng apoptosis mà được biết đến với khả năng chống lại con đường apoptosis (anti-apoptotic) [4] Trong nhiều loại tế bào khác nhau, các thụ thể bẫy được cho là ức chế con đường apoptosis bằng cách cạnh tranh với các thụ thể pro-apoptotic để liên kết với TRAIL [3] Sự cân bằng của các thụ thể TRAIL giúp tế bào bình thường không bị apoptosis

Ngoài vai trò trong việc tham gia con đường apoptosis, các thụ thể TRAIL cũng được biết đến với vai trò hoạt hóa con đường NF-kB Con đường NF-kB

được xem là có vai trò chống lại apoptosis và liên quan đến quá trình bệnh lý của nhiều loại ung thư ác tính [56] Khi tham gia điều khiển apoptosis, trước khi hoạt hóa caspase 8 (được kích hoạt bởi các thụ thể chết, có vai trò thiết yếu trong apoptosis), DR4 và DR5 cần phải gắn vào phân tử FADD, TRADD Sự gắn của DR4 và DR5 với FADD dẫn đến hoạt hóa apoptosis, sự gắn với TRADD dẫn đến hoạt hóa con đường NF-kB ức chế apoptosis [10] DcR1 không chứa miền chết nên có chức năng như một thụ thể đối kháng để bảo vệ tế bào khỏi con đường apoptosis DcR2 chỉ chứa một đoạn ngắn miền chết (thiếu 4 trong 6 amino acid cần thiết để phát tín hiệu apoptosis), nên cũng không có khả năng truyền tín hiệu apoptosis [56] Bên cạnh đó, DcR2 còn có khả năng hoạt hóa NF-kB để phát động tín hiệu ngăn chặn apoptosis [14]

Trong tế bào ung thư, có thể TRAIL kích hoạt chủ yếu con đường NF-kB hơn là con đường apoptosis [49] Một vài cơ chế được đưa ra để giải thích vấn đề này, thứ nhất, khi lượng FADD trong tế bào giảm, DR4 và DR5 gắn với TRADD nhiều hơn, dẫn tới không hoạt hóa chu trình apoptosis mà hoạt hoá con đường NF-

kB Thứ hai, do DcR1 không được biểu hiện dẫn đến TRAIL gắn được nhiều với các thụ thể DR4, DR5, DcR2 dẫn tới con đường NF-kB được hoạt hóa nhiều hơn bình thường [2]

I.3.5.2 Sự methyl hóa DcR1& DcR2 trong ung thư:

DcR1 và DcR2 được xem như là những gen ung thư vì khả năng chống lại

con đường apoptosis, và sự biểu hiện của gen được cho là có lợi cho các tế bào khối u [56] Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây lại khẳng định có sự giảm biểu hiện của hai gen này trong các dòng tế bào ung thư não, ung thư da, ung thư ruột kết, u nguyên bào thần kinh và các nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng sự giảm biểu

hiện của DcR1 và 2 trong các loại khối u là do sự methyl hóa quá mức vùng

promoter của các gen này [49] Sự methyl hóa và mức độ biểu hiện của các gen thụ thể TRAIL đã được nghiên cứu trong một số bệnh ung thư phổ biến cho kết

quả là tình trạng methyl hóa bất thường của DcR1 và 2 xảy ra 70% trong ung thư

vú sơ cấp, 31% trong ung thư phổi sơ cấp, 63% trong ung thư trung biểu mô ác

tính sơ cấp, 60% trong ung thư tuyến tiền liệt, 42% trong ung thư bàng quang, 43% trong ung thư buồng trứng, 41% trong ung thư hệ bạch huyết, 26% trong bệnh bạch cầu, 56% trong u tủy và đặc biệt 100% trong ung thư cổ tử cung [56]

Trong khi đó sự methyl hóa DR4 và DR5 thì rất hiếm trong các loại ung thư phân

tích trên và sự methyl hóa của cả 4 thụ thể TRAIL thì cũng rất hiếm trong tế bào bình thường [56] Như vậy, sự methyl hóa bất thường tại vùng 5’ của các thụ thể bẫy TRAIL có thể là nguyên nhân gây mất sự biểu hiện của chúng và là một cơ chế quan trọng trong sự phát sinh và phát triển tế bào ung thư

Đối với ung thư cổ tử cung, tuy không có nhiều công trình nghiên cứu công

bố về tình trạng methyl hóa liên quan đến bệnh nhiều, nhưng công trình của Narayan Shivapurkar và cộng sự năm 2004 [56], cho thấy sự methyl hóa trên các thụ thể của TRAIL DcR1, DcR2 đạt 100% đối với mô ung thư cổ tử cung Tiếp theo sau đó, công trình nghiên cứu của Alfonso Duenxas-Gonzalez và cộng sự năm 2005 [2] cũng cho thấy hiện tượng methyl hóa quá mức đối với các thụ thể DcR1, DcR2 trong epigenetic có liên quan chặt chẽ đến ung thư cổ tử cung

Chúng tôi tiếp tục lựa chọn phân tích tình trạng methyl hóa trên vùng promoter của hai gen này như là một tìm hiểu thử nghiệm về epigenetics cho nhóm oncogene và hơn nữa sự methyl hóa tuyệt đối trong ung thư cổ tử cung đã được công bố

I.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA DNA:

Sự methyl hóa bất thường của các đảo CpG đã liên quan chặt chẽ với sự bất hoạt phiên mã của những gen ức chế khối u nhất định trong các bệnh ung thư ở người Ngày nay, hàng trăm đảo CpG đã được biết đến để hiển thị những đặc trưng của sự methyl hóa quá mức trong các tế bào khối u Vì vậy, việc lập bản đồ

mô hình methyl hóa tại các đảo CpG đã trở nên quan trọng cho việc tìm hiểu những biểu hiện của gen trong cả các trường hợp bình thường và bệnh lý

Mức độ methyl hóa của gen có thể được phân tích dễ dàng bằng phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) và một số phương pháp khác đi từ MSP như

MSP-kết hợp giải trình tự (Bisulfite Sequencing PCR-BSP), MSP định lượng (Quantitative MSP) hay MSP-kết hợp sử dụng enzyme cắt hạn chế (MSP Combined Bisulfite Restriction Analysis-COBRA)

MSP khác với phản ứng PCR ở chỗ mạch khuôn DNA được xử lý sodium bisulfite, và khuếch đại với các cặp mồi methyl và không methyl, dựa vào kết quả

có thể phân biệt DNA có methyl hóa hay không Mồi cho phản ứng MSP được thiết kế sao cho có nhiều cytosine và vị trí cặp CpG ở gần đầu 3’ của mồi [23]

Hình I.4: Phương pháp MSP

I.4.1.2 Xử lý DNA bằng sodium bisulfite:

Phản ứng xử lý sodium bisulfite được sử dụng để phân biệt cytosines và cyosines methyl hóa (5mC) trong DNA Phản ứng xử lý DNA với sodium bisulfite

để chuyển đổi tất cả cytosine không bị methyl hóa thành uracil, trong khi đó 5mC

không phản ứng Như vậy, xử lý bisulfite cho biết sự thay đổi đặc biệt trên trình tự DNA, nó phụ thuộc vào tình trạng methyl hóa của các cytosine đơn lẻ còn lại, thông tin của các cytosine này quyết định tình trạng methyl hóa chung cho từng đoạn gen [23]

Hình I.5: Sự chuyển từ Cytosine thành Uracil trong sodium bisulfite

I.4.1.3 Đọc kết quả phản ứng MSP:

Ví dụ về cách đọc kết quả phản ứng MSP được mô tả trong hình I.6 như sau:

Hình I.6: Đọc kết quả MSP

 Mẫu A: Kết quả điện di có hai vạch Như vậy, các cặp mồi

methylation và unmethylation đều đều bắt cặp đặc hiệu trong phản ứng MSP

Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát bị methyl hóa không hoàn toàn

 Mẫu B: Kết quả điện di chỉ có cặp mồi unmethylation cho kết quả Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát không bị methyl hóa

 Mẫu C: Kết quả điện di có một vạch cho cặp mồi methylation Kết

luận mẫu này bị methyl hóa hoàn toàn

I.4.2 Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR):

Đối với phương pháp BSP, DNA đầu tiên phải được biến đổi bisulfite để chuyển đổi tất cả Cytosine thành Uracil ngoại trừ các Cytosine đã bị methyl hóa, sau đó PCR được thực hiện để tiến hành khuếch đại DNA đã biến đổi bisulfite [37] Trong phương pháp này một cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại vùng gen khảo sát, đặc điểm quan trọng trong việc thiết kế cặp mồi này là không chứa bất kì vị trí CpG nào trên trình tự của chúng để có thể khuếch đại cả allele methyl và allele unmethyl trên DNA đã biến đổi bisulfite [37] Phương pháp BSP

có ưu điểm là có thể phát hiện được tình trạng methyl hóa của nhiều vị trí CpG nằm trong vùng khảo sát

I.4.3 Phương pháp Q-MSP (Quantitative-MSP):

Phương pháp QMSP là phương pháp kết hợp giữa kỹ thuật Real-time PCR và phương pháp MSP Phương pháp QMSP có thể cung cấp sự phát hiện và định lượng chính xác các allele bị methyl hóa Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phản ứng QMSP dựa trên cơ sở phản ứng MSP sử dụng chất phát huỳnh quang là Sybergreen đối với các mẫu DNA control của Qiagen Sybergreen là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của DNA sợi đôi nhờ vào khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích trong máy real-time PCR Phương pháp QMSP có ưu điểm hơn so với phương pháp MSP là có thể dùng để định lượng tương đối sự methyl hóa ở mức độ thấp trong các mẫu mô bình thường [22] nhờ vào tín hiệu huỳnh quang có thể được phát hiện ở cường độ rất thấp

- Thứ hai là về ý nghĩa của nghiên cứu: nhằm bước đầu xây dựng cơ sở khoa học về cả lý thuyết lẫn thực nghiệm, nhằm tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về biến đổi epigenetics – methyl hóa bất thường của những gen quan trọng, để từng bước đánh giá khả năng sử dụng dữ liệu này như một dấu chứng sinh học, đặc trưng cho người bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt nam Việc nghiên cứu tìm ra một dấu chứng sinh học nhằm tiên lượng, chẩn đoán sớm, dự báo và theo dõi tiến triển của quá trình hình thành khối u trong ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng, luôn là mục đích hàng đầu của các nhà nghiên cứu, trên bình diện quốc tế và ở Việt nam Việc tìm hiểu về tính mẫn cảm của con người đối với bệnh, mức độ biến đổi vật chất di truyền của tế bào chủ hay mức độ biến đổi theo epigenetics trên cộng đồng dân cư Việt nam sẽ là những dữ liệu ban đầu hết sức cần thiết Thêm một lý do nữa cũng nên nói đến sự hứa hẹn của dấu chứng epigenetic (epigenetic marker), đó là khuynh hướng đưa đến một liệu pháp chữa trị mới cho ung thư bằng epi-drug (thuốc điều hoà hiện tượng biểu sinh) Đã có nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm thuốc làm ức chế sự hoạt động của enzyme xúc tác cho quá trình methyl hóa (DNA methyltransferases) như decitabine hay cisplatin (2'-deoxy-5-azacytidine) Liệu pháp đang được thử nghiệm hiện nay được nhiều người ủng hộ, đó là kết hợp hóa trị (các thuốc có khả năng làm tổn thương DNA

và gia tăng sự methyl hóa) với thuốc làm giảm methyl hóa

- Thứ ba là về khả năng tiếp cận các kiến thức, thông tin, kĩ thuật hiện đại trên thế giới, đồng thời áp dụng vào thực tế Việt nam: nghiên cứu về những vấn đề còn rất mới (cả trên thế giới và Việt nam) - được tiếp cận, trau dồi kiến thức hiện đại; đồng thời áp dụng trên người bệnh Việt nam, với điều kiện sinh môi khác biệt, chúng tôi tin chắc rằng thông tin epigenetics của chúng tôi tìm kiếm sẽ có nhiều điểm đặc biệt so với các công bố trên thế giới

I.6 MỤC TIÊU:

- Mục tiêu cuối cùng của đề tài là nhằm tìm ra các dấu chứng sinh học đại diện đặc trưng cho bệnh ung thư cổ tử cung ở người Việt nam Các dấu chứng sinh học này

sẽ giúp tiên lượng, phát hiện sớm và xác định mức độ tiến triển của bệnh Từ đó,

đề xuất liệu pháp điều trị mới cho bệnh

- Để dần đạt được mục tiêu lớn này, mục tiêu trước mắt của đề tài này là nhằm đưa

ra một dữ liệu về sự methyl hóa bất thường của một số gen có liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung ở người Việt nam

- Để đạt được mục tiêu trên, cách tiếp cận của chúng tôi là:

- Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của DAPK, DNMT3L, RARβ &

p16INK4a , DcR1, DcR2 và phân tích mối tương quan về sự methyl hóa trên các gen

này với ung thư cổ tử cung

- Thiết kế các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của từng gen trong phản ứng MSP và BSP

- Thử nghiệm mồi trong các phản ứng MSP và BSP, sử dụng DNA chứng

- Thử nghiệm các phương pháp tách chiết DNA, biến đổi bisulfite DNA, tinh sạch DNA sau biến đổi

- Thực hiện phản ứng MSP và BSP trên mẫu bệnh phẩm thu nhận từ các bệnh

nhân ung thư cổ tử cung khu vực miền Nam, Việt Nam cho các gen nói trên

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1 VẬT LIỆU:

Mẫu DNA chứng được cung cấp bởi hãng Qiagen bao gồm hai nguồn DNA người: 1/ DNA đã bị methyl hóa và 2/ DNA chưa bị methyl hóa Sử dụng nguồn DNA chứng này sẽ giúp chúng tôi đánh giá được độ đặc hiệu của cặp mồi trong phản ứng MSP

Mẫu bệnh phẩm dịch phết mà chúng tôi sử dụng để phân tích được cung cấp từ phòng khám Âu lạc, công ty CP Công nghệ Việt Á Các mẫu mô tươi được cung cấp từ BV Khánh hòa và BV Hùng vương TP HCM Đối với loại mẫu dịch phết tế bào, chúng tôi thu nhận những mẫu đã được khẳng định nhiễm HPV type độc Các mẫu mô tươi đều là mô được phẫu thuật cắt bỏ từ những bệnh nhân mắc bệnh ung thư cổ tử cung Trong tổng số mẫu thu được có 5 mẫu mô tươi và 32 mẫu dịch phết Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -300C trước khi tiến hành tách chiết DNA II.2 PHƯƠNG PHÁP:

Nghiên cứu được chúng tôi bố trí gồm hai phần Đầu tiên, chúng tôi tiến hành

thu thập, khai thác dữ liệu của các nghiên cứu thực hiện trước đó Khảo sát in silico

được tiến hành cẩn thận cho từng gen Phần thực nghiệm tiếp theo được chia làm các giai đoạn (1) Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi (sử dụng DNA chứng); (2) Thử nghiệm các quy trình tách chiết, biến đổi DNA bằng sodium bisulfite, tinh sạch DNA sau biến đổi, (3) Thử nghiệm MSP và (4) Giải trình tự kiểm tra tính đặc hiệu sản phẩm MSP Có thể tóm tắt tiến trình thực hiện nghiên cứu đề tài này theo sơ đồ như sau:

Sơ đồ II.1: Tiến trình thực hiện nghiên cứu

II.2.1 Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico:

II.2.1.1 Khai thác dữ liệu:

Tiến hành khai thác dữ liệu trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) và pubmeth (http://www.pubmeth.org/) bằng một số từ khóa như cervical cancer, epigenetics, DNA methylation Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích mức độ methyl hóa tại các giai đoạn khác nhau của ung thư cổ tử cung được phân loại dựa trên tế bào học [63] (theo mức độ tổn thương tăng dần): Giai đoạn tiền ung thư bao gồm tổn thương bên trong biểu mô vảy ở mức độ thấp (Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions, LSIL); tổn thương bên trong biểu mô vảy ở mức độ cao (High-grade Squamous Intraepithelial Lesions, HSIL) và ung thư tế bào biểu mô vảy xâm lấn

(Squamous cell carcinoma) Các bài tổng quan không tiến hành thực nghiệm sẽ

không được phân tích trong nghiên cứu này.

Ngoài ra, để tìm ra loại dấu chứng sinh học đặc hiệu cho các dạng ung thư cổ

tử cung, chúng tôi cũng tiến hành đánh giá và so sánh tần số methyl hóa của các gen

Khai thác dữ liệu trên NCBI

và Pubmeth

Khảo sát in silico các gen

DcR1, DcR2, DAPK, DNMT3L, RARβ

và p16 INK4a

Thiết kế mồi cho MSP, BSP

Thử nghiệm tách chiết DNA từ các loại mẫu bệnh phẩm, kiểm tra chất lượng, nồng độ DNA sau tách chiết

Đánh giá mồi

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm MSP sử dụng DNA chứng, giải trình tự kiểm tra

Q-Thử nghiệm biến đổi bisulfite DNA và tinh sạch sản

phẩm sau biến đổi

Thử nghiệm MSP, giải trình tự kiểm tra

ở hai dạng ung thư cổ tử cung phổ biến là ung thư tế bào vảy (Squamous cell carcinoma-SCC) và ung thư tế bào tuyến (Adenoma carcinoma-AC)

Chúng tôi tiến hành so sánh và đánh giá loại mẫu và kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa, là những yếu tố dẫn đến tần số methyl hóa khác nhau của các nghiên cứu khảo sát hiện nay

II.2.1.2 Khảo sát in silico:

a Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG:

Chúng tôi tiến hành thu nhận trình tự nucleotide từ ngân hàng gen bằng mã số truy cập (Accession number) NM_001190943 và AF524869 lần lượt cho hai gen

DcR1, DcR2 và các gene ID (Identification number) lần lượt 1612, 29947, 5915,

1029 cho các gen DAPK, DNMT3L, RARβ và p16 INK4a

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định vị trí một số vùng quan trọng trong cấu trúc của gen có liên quan đến nội dung nghiên cứu như vùng promoter, 5’UTR, exon 1 , sử dụng phần mềm Methprimer (http://www.urogen.org) để xác định các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen

b Phương pháp đánh giá – thiết kế mồi:

- Trước khi thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng một số phần mềm TF SEARCH (www.cbrc.jp/Research /db/TFSEARCH.html): nhằm xác định vị trí gắn của các nhân tố phiên mã lên trên vùng promoter của gen, từ đó nhận định các vị trí CpG được cho là hot spot (là các vị trí gắn của các nhân tố phiên mã hoặc chứa các vị trí này) (Ở đây, chúng tôi tham khảo các công trình nghiên cứu có thực nghiệm chứng minh sự methyl hóa tại các vị trí này sẽ có khả năng làm thay đổi chức năng của gen, hạn chế khả năng phiên mã) với giả thuyết chính

sự hạn chế này có liên quan đến sự hình thành và phát triển của ung thư

- Sử dụng MethBlast (www.medgen.ugent.be/methBLAST/) và BLAST với các thông số mặc định sẵn trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov): nhằm kiểm tra độ đặc hiệu của các bộ mồi thiết kế

- Sử dụng công cụ “IDT analyzer“ nhằm xác định các thông số quan trọng của mồi như kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo hairpin loop, primer-dimer…

Trong giai đoạn xây dựng quy trình, bước kiểm tra hiệu quả của các mồi, chúng tôi sử dụng nguồn DNA chứng gồm hai loại: DNA methyl hóa hoàn toàn và DNA không methyl hóa Phản ứng Q-MSP được sử dụng nhằm hạn chế mọi rủi ro khi thực hiện phản ứng, đánh giá được hiệu quả phản ứng khuếch đại thông qua các tín hiệu huỳnh quang xuất hiện cho mỗi phản ứng (cho dù hiệu quả khuếch đại có thấp đi nữa và có thể khó phát hiện qua điện di)

Bảng II.1: Thành phần phản ứng Q-MSP

Thành phần Thể tích (l)

Mồi ngược (10 M) 1.5

Bảng II.2: Chu kì nhiệt của phản ứng Q-MSP

Bước Nhiệt độ( 0 C) Thời gian Chu kì

*: X thay đổi tuỳ theo các mồi sử dụng, xem bảng II.9

Phản ứng kết thúc, việc phân tích đường cong nóng chảy (melting curve) của sản phẩm QMSP được tiến hành Đồng thời, để xác định chính xác kích thước của sản phẩm khuếch đại, chúng tôi tiến hành chạy điện di sản phẩm QMSP, kích thước sản phẩm khuếch đại sẽ được hiển thị dưới tia UV nhờ ethidium bromide

II.2.2.2 Thử nghiệm tách chiết DNA:

a Sử dụng i-genomic CTB DNA Minikit

 Nguyên tắc

Mẫu bệnh phẩm được ủ với hỗn hợp dung dịch tẩy, phá màng (buffer CG, proteinase K, RNase) lớp mô sẽ bị phá vỡ, đồng thời biến tính protein Khi ly tâm, hỗn hợp trên sẽ phân tách thành hai phase trong đó phase lỏng chứa DNA ở trên Sau đó DNA được gắn lên màng của cột i-genomic Kit nhờ buffer CB Sau các bước ly tâm và rửa loại bỏ các thành phần không cần thiết, DNA được tách rửa ra khỏi màng bằng buffer CE

 Thiết bị, hóa chất

- Thành phần bộ kit Intronbio