THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH pptx _ KIỂM NGHIỆM (slide nhìn biến dạng, tải về đẹp lung linh)

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành dược hay nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất”; https:123doc.netusershomeuser_home.php?use_id=7046916. Slide bài giảng môn kiểm nghiệm thuốc pptx dành cho sinh viên chuyên ngành dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết từng bài, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm thuốc bậc cao đẳng đại học chuyên ngành dược

Thẩm Định Quy Trình Phân Tích

Validation of Analytical Procedures

Bài giảng pptx các môn chuyên ngành dược hay

nhất có tại “tài liệu ngành dược hay nhất” ;

https://123doc.net/users/home/user_home.php?

use_id=7046916

 Trình bày được định nghĩa và phân loại quy trình phân tích; sự cần thiết phải thẩm định quy trình phân tích; phạm vi thẩm định và tái thẩm định một quy trình phân tích.

 Thực hiện được các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với một quy trình phân tích

 Đánh giá được một quy trình phân tích sau khi được thẩm định

Nội dung

 Quy trình phân tích

 Thẩm định quy trình phân tích

 Phạm vi thẩm định, tái thẩm định

 Các chỉ tiêu cần được thẩm định đối với một quy trình phân tích

 Thẩm định quy trình định lượng dược chất trong dịch sinh học

 Một số ví dụ cụ thể

1 Asean guideline for validation of analytical procedures (2008), pp 1-17

2 Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 229/QĐ-QLD ngày 12 tháng 08 năm 2010 về

việc ban hành Sổ tay hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc, tr 40-45.

3 Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y tế số 1570/2000/QĐ-BYT ngày 22 tháng 5 năm 2000

về việc triển khai áp dụng nguyên tắc Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc, tr 369

– 370

4 BP 2010, Apendix III, Chromatographic separation techniques, pp 6 -11

5 FDA (2001), Guidance for industry, Bioanalytical method validation, pp 4 – 11

6 ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text

and methodology, pp 1 – 13

7 Dược điển Việt Nam IV (2009), tr 2004, 462, 463, PL-119 – PL-123, PL-311 – PL-312

8 USP 32 (2009), Data elements required for validation, p 736

9 Ludwig Huber (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, second

edition, pp 144, 146

 Mô tả chi tiết các bước cần thiết để thực hiện

 Chuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn đối chiếu, các thuốc thử, sử dụng trang thiết bị

 Xử lý, tính toán và biện giải kết quả, v.v

 Phân loại

 Quy trình định tính: đảm bảo chất phân tích có trong mẫu thử

 Quy trình thử tinh khiết (xác định tạp chất): xác định mức độ tinh khiết của mẫu cần thử

 Định lượng tạp chất (quantitative test for impurities’ content)

 Thử giới hạn tạp chất (limit tests for the control of impurities)

 Yêu cầu thẩm định của quy trình định lượng tạp chất nhiều hơn thử giới hạn tạp chất

 Quy trình định lượng hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác: đo lường chất cần thử trong mẫu thử (nguyên liệu, chế phẩm, độ hòa tan, dược liệu, dịch sinh học, …)

phương pháp

 Chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến

 Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được

 Mục đích: giúp thực hiện các chỉ tiêu và kiểm tra chất lượng của tiêu chuẩn

 Công việc bắt buộc , có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân tích phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích

 Có thể đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở

xây dựng, từ các bài báo,…) hoặc những quy trình có trong Dược điển nhưng có sự thay đổi

 Quy trình phân tích trong Dược điển: chứng minh sự phù hợp của phương

pháp ghi trong Dược điển cho sản phẩm Thẩm định lại các qui trình phân tích sau:

 Định tính: tính đặc hiệu

 Định lượng (hoạt chất hoặc thành phần đã chọn khác, tạp chất, lượng giải phóng hoạt chất ở chỉ tiêu độ hòa tan): tính đặc hiệu, độ đúng và độ lặp lại

 Thử giới hạn tạp chất: tính đặc hiệu

Tái thẩm định một phần hoặc hoàn toàn

 Thay đổi quy trình tổng hợp dược chất

 Thay đổi thành phần công thức thuốc

 Thay đổi quy trình phân tích hoặc thông số trong quy trình

 Thay đổi trang thiết bị phân tích có các đặc tính khác

 Thay đổi phòng thí nghiệm có điều kiện môi trường khác

 Thay đổi hóa chất, thuốc thử hoặc nguồn cung cấp chất chuẩn

 Thử nghiệm tính phù hợp của hệ thống nằm ngoài tiêu chuẩn chấp nhận khi thẩm định lần đầu

 Xét duyệt tại các Cơ quan kiểm nghiệm quốc gia xin đăng ký lại để lưu hành mặt hàng (thẩm định định kỳ)

Lưu ý: Trong quá trình tái thẩm định, tiêu chuẩn chấp nhận của các thông số khi

 Tính đặc hiệu (specificity) hay tính chọn lọc (selectivity)

 Độ đúng (accuracy)

 Độ chính xác (precision)

 Độ lặp lại (repeatability)

 Độ chính xác trung gian (intermediate precision)

 Độ tái lặp (reproducibility) hay độ ổn định (ruggedness)

 Giới hạn phát hiện (limit of detection, LOD)

 Giới hạn định lượng (limit of quantitation, LOQ)

 Tính tuyến tính (linearity) và miền giá trị (khoảng xác định, range)

 Độ bền (robustness)

Loại quy trình phân tích

độ lặp lại

độ chính xác trung gian

độ sao lại







++3

Quy trình phân tích

Loại II

Loại III Loại IV

Định lượng Thử giới hạn

-*: Yêu cầu tùy từng thử nghiệm

Loại I: Định lượng nguyên liệu hay thành phần chính trong thuốc; Loại II: Xác định tạp chất trong nguyên liệu

hay sản phẩm phân hủy trong thuốc; Loại III: Định lượng hoạt chất phóng thích; Loại IV: Định tính

Loại quy trình phân tích

độ lặp lại



++3





+ + 3

 Khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử

 Tùy đối tượng trong quy trình phân tích mà thực hiện thử nghiệm

 Nếu một quy trình phân tích không thể thực hiện được thì phải phối hợp nhiều quy trình phân tích hỗ trợ khác để chứng minh

ảnh hưởng của các thánh phần khác có trong mẫu

 Đối với phép định lượng không hoặc kém đặc hiệu với hoạt chất cần phân tích (ví dụ như định lượng nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ thể tích) cần có phương pháp phân tích hỗ trợ khác (để chứng minh tính đặc hiệu) ví dụ như phải có chỉ tiêu thử tạp chất thích hợp

Đối với qui trình sắc ký

 Cần đưa ra các sắc ký đồ đại diện để chứng minh tính đặc hiệu trong đó từng thành phần riêng biệt phải được ghi lại (chú thích) rõ ràng

 Độ tinh khiết của pic cần được xác định bằng đầu dò PDA hay khối phổ

 Tính đặc hiệu có thể được chứng minh bằng độ phân giải của hai thành phần được rửa giải gần nhau nhất

 Phải đệ trình các sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử

 Các thông số đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký như: số đĩa lý thuyết, độ phân giải, hệ số đối xứng của pic v.v

Ví dụ 3: Xác định tính đặc hiệu của quy trình định lượng desloratadin trong chế phẩm và trong khảo sát độ ổn định của desloratadin trong quá trình xây dựng công thức bào chế siro và thành phẩm bằng HPLC với đầu dò PDA

 Chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng (pha động), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu phân giải (mẫu được để trong các điều kiện khắc nghiệt)

 Tiến hành sắc ký các mẫu trên

 Điều kiện sắc ký: cột pha đảo C8 (250 x 4,6 mm; 5 m) Bước sóng phát hiện

278 nm Tốc độ dòng 1,2 ml/phút Thể tích tiêm 20 l Pha động: hỗn hợp gồm

25 thể tích acetonitril và 75 thể tích dung dịch đệm phosphat 10 mM (pH 2,5)

có chứa 10 mM triethylamin

 Thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu thử và mẫu phân giải tương đương thời

gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng không có pic trùng với pic desloratadin

 Khi thêm một lượng chất chuẩn desloratadin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của desloratadin tăng lên so với trước khi thêm chất chuẩn

 Pic desloratadin tách hoàn toàn các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu phân giải (nếu có)

 Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu thử và mẫu phân giải giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn

 Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic desloratadin không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu

Mẫu trắng

Viên desloratadin

nồng độ 100 µg/ml

Chuẩn desloratadin nồng độ 100 µg/ml

Viên desloratadin thêm chuẩn

Siro desloratadin nồng độ 100 µg/ml Siro desloratadin thêm chuẩn

Chuẩn desloratadin Viên desloratadin Siro desloratadin

Chuẩn desloratadin Viên desloratadin Siro desloratadin

Chuẩn desloratadin

nồng độ 100 µg/ml

Chuẩn chiếu ánh sáng trực tiếp/ 48 giờ

Siro desloratadin

Trên 60 0 C/ 48 giờ

Ánh sáng trực tiếp/48 giờ

Trên 60 0 C/ 48 giờ

Ánh sáng trực tiếp/48 giờ

Viên desloratadin

Siro desloratadin ánh sáng trực tiếp/ 48 giờ

thuộc giữa độ đáp ứng (response) của đại lượng đo được (y) và nồng độ (concentration) là một đường thẳng (x) [hay trựự̣c tiếp tính toán dựa vào tương quan tỷ

lệ giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ (x)]

 Biểu thị bằng hệ số tương quan (coefficient of correlation) r hay r2

 Thực hiện trực tiếp trên mẫu chuẩn (bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc) và/ hoặc cân riêng biệt các hỗn hợp tự tạo chứa các thành phần dược chất dựa trên quy trình đã đặt ra Cần tiến hành ít nhất với 5 nồng độ Trong những trường hợp khác cần nêu rõ lý do

 Kết quả thử phải được đánh giá bằng phương pháp thống kê thích hợp, ví dụ bằng cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương cực tiểu theo phương trình Y= ax + b Thông thường, hệ số tương quan r phải nằm trong khoảng 0,998- 1,002, nếu giá trị thu được nằm ngoài khoảng này cần phải có thuyết minh về

sự phù hợp của việc chấp nhận giá trị này

 Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy

Trắc nghiệm t (phân phối Student)

Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý nghĩa thống kê”

HA: Bj  0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”

Giá trị thống kê:

Biện luận:

Nếu t0 < t0,05 (N-2)  chấp nhận giả thuyết H0

Nếu t0 > t0,05 (N-2)  chấp nhận giả thuyết HA

2

b

i i

X X

S S

i b

Giả thuyết:

H0: Bj = 0 “Phương trình hồi quy không tương thích”

HA: Bj  0 “Phương trình hồi quy tương thích”

F 

Ví dụ: Định lượng một hợp chất bằng phương pháp đo độ hấp thu

Khoảng xác định thường được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc vào việc ứng dụng dự định của quy trình, được thiết lập bởi việc khẳng định quy trình đã xây dựng có tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng định lượng chất phân tích.

Ví dụ: Trong phần kết luận của phương pháp đo quang “Khoảng nồng độ tuyến tính hay khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert-Beer là 4 mcg/ml – 12 mcg/ml” được xác định bằng cách

 Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính

 Khẳng định khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại hay không

Còn phụ thuộc vào mục đích của quy trình

Thử độ hòa tan Cần rộng hơn ± 20 % khoảng qui định trong tiêu chuẩn

Ví dụ: nếu tiêu chuẩn phóng thích hoạt chất của một loại thuốc phóng thích có kiểm soát là 20% sau 1 giờ và 90% sau 24 giờ thì miền giá trị là 0% – 110% so với hàm lượng ghi trên nhản của thuốc

• Độ đúng cao

• Độ chính xác cao

• Độ đúng thấp

• Độ chính xác cao

• Độ chính xác thấp

• Độ chính xác thấp

• Độ đúng thấp

Mức độ sát gần (closeness) giữa các kết quả thử riêng rẽ x i với giá trị trung

bình

Ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên

Biểu thị bằng RSD hoặc CV

Tiêu chuẩn chấp thuận cho độ chính xác phụ thuộc rất nhiều vào loại phân tích

Thông thường RSD ≤ 2% nếu không có quy định riêng

Phân tích các mẫu sinh học: RSD ≈ 20% ở LLOQ và 15% ở nồng độ cao hơn

Phân tích mẫu thực phẩm và mẫu môi trường: RSD 2% - 20%

Phân loại

Độ lặp lại (repeatability)

Độ chính xác trung gian (intermediate precision)

Độ tái lặp (reproducibility)

 Biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời gian ngắn, cụ thể là việc tiến hành thử nghiệm được thực hiện bởi một người trong cùng một phòng thí nghiệm, trên cùng một trang thiết bị và trong cùng một thời gian

 Tiến hành tối thiểu ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 lần trong miền giá trị của phương pháp hoặc tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100%

Biểu thị độ chính xác của quy trình theo các biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều ngày khác nhau (độ chính xác liên ngày), với nhiều kiểm nghiệm viên khác nhau và với các trang thiết bị khác nhau, …

Việc xác định độ chính xác trung gian phụ thuộc vào tình hình cụ thể đối với từng phương pháp phân tích được áp dụng Những thay đổi điển hình cần xem xét bao gồm : ngày phân tích, kiểm nghiệm viên, thiết bị, v.v So sánh kết quả được thực hiện trong cùng một phòng thí nghiệm nhưng bởi các ngày khác nhau, kiểm nghiệm viên khác, thiết bị khác Các kết quả thu được không được khác nhau có ý nghĩa thống kê (có thể dùng test F với khoảng tin cậy 95% để đánh giá)

Độ tái lặp (reproducibility)

Biểu thị độ chính xác của nhiều phòng thí nghiệm (hợp tác nghiên cứu) tiến hành nghiên cứu trên cùng một mẫu đồng nhất đã được phân thành nhiều mẫu nhỏ

Nồng độ chất phân tích (%) Tỷ số nồng độ Đơn vị tương ứng RSD %

Kiểm nghiệm viên 1 và 2 0,39% 0,14% 0,11%

 Chuẩn bị 6 mẫu thử Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần

 Được thực hiện bởi kiểm nghiệm viên L1 tại phòng thí nghiệm X1 ở ngày J1

 Chuẩn bị 6 mẫu thử Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần

 Được thực hiện bởi 3 kiểm nghiệm viên L1, L2, L3 trên cùng 1 mẫu thử

Ảnh hưởng bởi sai số hệ thống

Độ đúng cần được thiết lập trong miền giá trị (khoảng xác định) của phương pháp phân tích

Biểu thị bởi một trong các hình thức sau

 Tỷ lệ % thu hồi : Hàm lượng chất chuẩn cho vào

: Hàm lượng xác định được (tìm lại được)

Tỷ lệ phục hồi phụ thuộc vào mẫu phân tích, qui trình xử lý mẫu và nồng độ chất phân tích

 Độ lệch giữa giá trị trung bình đo được và giá trị thực cùng với khoảng tin cậy

% 100





X

X

độ đúng đã được công bố

 Có thể được suy ra một khi độ chính xác, tính tuyến tính

và tính đặc hiệu đã được thiết lập

Quy trình định lượng

 Thành phẩm

 Xác định hàm lượng của hoạt chất trong mẫu tự tạo (mẫu có thành

phần tá dược giống như công thức thuốc và chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng)

 So sánh kết quả định lượng của quy trình đang được thẩm định với một quy trình phân tích chính thống có độ đúng đã được công bố

 Độ đúng có thể được suy ra sau khi độ chính xác, tính đặc hiệu và tính tuyến tính đã được thiết lập

Quy trình định lượng

 Thành phẩm

 Trong trường hợp không thể tạo được mẫu tự tạo: áp dụng phương pháp

thêm chuẩn Thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn hoặc lượng hoạt chất đã biết hàm lượng (khoảng 10, 20, 30% so với lượng hoạt chất đã có sẵn sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính) rồi tiến hành định lượng theo phương pháp phân tích cần đánh giá Độ đúng phải được tính dựa trên tối thiểu 9 lần định lượng ở 3 mức nồng độ khác nhau trong khoảng xác định của phương pháp phân tích (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) Yêu cầu: Tỉ lệ % thu hồi nằm trong khoảng 98,0-102,0% với RSD ≤ 2% nếu không có quy định khác

Chú ý:

 Tỷ lệ phục hồi nên được xác định ở khoảng nồng độ cần định lượng sau này và phải bao gồm nồng độ gần với giới hạn định lượng

 Tỷ lệ phục hồi ở mỗi nồng độ riêng biệt phải đáp ứng với mức giới hạn cho phép chứ không phải lấy tỷ lệ phục hồi trung bình

 Một qui trình phân tích nếu chỉ đạt riêng độ chính xác hay độ đúng thì chưa đủ

 Một qui trình phải đáp ứng cả độ chính xác lẫn độ đúng