Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu: Phân lập, tuyển chọn và định danh một số dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy hoạt chất Propoxur từ nền đất bảo quả[r]
Trang 1PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN BẢN ĐỊA
PHÂN HỦY CHUYÊN BIỆT HOẠT CHẤT PROPOXUR
TỪ NỀN ĐẤT BẢO QUẢN HÀNH TÍM
TẠI THỊ XÃ VĨNH CHÂU, TỈNH SÓC TRĂNG
Đỗ Hoàng Sang1, Đỗ Thị Xuân1, Dương Minh Viễn1, Võ Thị Gương1 và Nguyễn Khởi Nghĩa1
1 Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ
Thông tin chung:
Ngày nhận: 17/06/2014
Ngày chấp nhận: 30/10/2014
Title:
Isolation and identification
of specifically Propoxur
degrading bacteria from
soil samples in onion
storage sites at the Vinh
Chau town, Soc Trang
Province
Từ khóa:
Propoxur, phân hủy,
Paracoccus sp., vi khuẩn,
Vĩnh Châu
Keywords:
Propoxur, degradation,
Paracoccus sp., bacteria,
Vinh Chau
ABSTRACT
Three soil samples from onion fields which had a history of intensive application of Propoxur at Vinh Chau, Soc Trang were collected for isolating bacteria being capable to degrade specifically Propoxur Soil bacteria were enriched in mineral salt medium solution containing 30 ppm Propoxur as the only carbon source for bacterial growth The whole procedure of isolation was established under the laboratory conditions on the shaker in dark with a total of 5 repeated generations The results showed that two microbial communities coded as P1-2 and P2-3 degraded well Propoxur (90% of the initial Propoxur concentration was degraded after 10 experimental days) Seventy-eight bacterial strains were isolated in total from these 2 potentially applicable microbial communities Two out of four selected strains which were coded as P23-7 and P23-26 degraded 100% initial Propoxur concentration in the liquid solution after 4 incubation days According to the sequencing of gene 16S rRNA, these 2 Propoxur degrading bacterial strains were identified as a species specy of Paracoccus sp P23-7 and Paracoccus sp P23-26, respectively
TÓM TẮT
Ba mẫu đất có lịch sử sử dụng hoạt chất Propoxur trong canh tác và bảo quản hành tím lâu năm tại khu vực trồng hành tím tại Vĩnh Châu, Sóc Trăng được thu thập để phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chuyên biệt Propoxur Vi khuẩn được làm giàu mật số trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung 30 ppm Propoxur như là nguồn carbon duy nhất Toàn bộ tiến trình phân lập được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, trên máy lắc và trong tối với tổng số 5 lần cấy chuyển liên tục Kết quả nghiên cứu cho thấy hai hệ vi sinh vật ký hiệu P1-2 và P2-3 thể hiện khả năng phân hủy cao Propoxur (90% Propoxur sau 10 ngày nuôi cấy) Tổng cộng có 78 dòng vi khuẩn được phân lập từ hai hệ vi sinh vật này Hai trong
số bốn dòng vi khuẩn được chọn để đánh giá khả năng phân hủy Propoxur trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng có bổ sung 45 ppm trong 18 ngày ký hiệu P23-7 và P23-6 phân hủy 100% Propxur sau 4 ngày thí nghiệm Dựa vào trình tự gen 16S rRNA giải mã cho thấy hai dòng vi khuẩn này thuộc lớp Prokaryote, Bacteria, Paracoccus và được định danh lần lượt như loài Paracoccus sp P23-7 và Paracoccus sp P23-26.
Trang 21 GIỚI THIỆU
Thị xã Vĩnh Châu tỉnh Sóc Trăng được biết đến
với nghề trồng hành tím và củ hành tím cung cấp
không chỉ cho Đồng bằng sông Cửu Long mà còn
cho cả nước Sản lượng hàng năm khoảng 20.749
tấn năm 1994; đạt 83.603 tấn trong năm 2004 và
khoảng 130.000 tấn vào năm 2012 Hiện nay, năng
suất bình quân của củ hành tím là 14-15 tấn/ha
Diện tích trồng hành tím được qui hoạch giai đoạn
2016 – 2020 là 7.500 ha (Dương Vĩnh Hảo, 2013)
Trong quá trình canh tác và bảo quản hành giống
người dân thường sử dụng nhiều loại thuốc bảo vệ
thực vật với liều cao để phòng trừ sâu bệnh trong
đó có hoạt chất Propoxur (tên thương mại là
Mipcin) Nông dân tại khu vực này thường bảo
quản hành giống sau thu hoạch bằng cách trộn hỗn
hợp bột Talc (Mg3(SiO10)(OH)2) và Mipcin hoặc
Sherpa với liều lượng trung bình 60 kg Talc + 3-4
kg Mipcin hoặc 300-400 cc Sherpa để xử lý
(Nguyễn Đức Thắng, 1999)
Hoạt chất Propoxur độc cho con người và động
vật, hoà tan mạnh trong nước, khả năng hấp phụ
trên keo đất là yếu và khả năng phân hủy của thuốc
trong đất bởi vi sinh vật trong đất chậm (25 %
trong vòng 100 ngày trong đất cát) Propoxur làm
bất hoạt các enzyme acetylcholinesterase và làm tê
liệt hệ thần kinh của côn trùng (Hayes, 1982; Berg,
1986) Các thí nghiệm nghiên cứu trên động vật
cho thấy Propoxur gây giảm số lượng con và trọng
lượng thai trên chó, một số có hiện tượng quái thai,
gây ra khối u ở bàng quang và tử cung trên chuột
khi nhiễm mãn tính ở liều cao (NCEA, 1999)
Trong đất, Propoxur có thể bị phân hủy bởi một
số vi sinh vật như: Arthrobacter sp (Nkedi-Kizza
và ctv., 1992), Pseudomonas sp (Karmanavalli và
Ninnerkar 2000), Streptomyces spp (Rahmansyah
và ctv., 2012) Mặc dù, việc ứng dụng công nghệ vi
sinh trong xử lý độc chất ô nhiễm môi trường đặc biệt trong xử lý đất ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật được ứng dụng rộng rãi trên thế giới, nhưng ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu này còn hạn chế Ở ĐBSCL một số công trình nghiên cứu về lĩnh vực nghiên cứu này đã được công bố gồm: nghiên cứu
về phân lập vi khuẩn phân hủy hoạt chất trừ cỏ
2,4-D (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv., 2011), hoạt chất
thuốc trừ sâu Chlorpyriphos ethyl (Nguyễn Thị Lan Hương, 2012), hoạt chất thuốc trừ cỏ Pretilachlor (Nguyễn Thị Tố Quyên, 2013) và hoạt chất kích thích ra hoa cây ăn trái Paclobutrazol (Đặng Phạm
Thu Thảo và ctv., 2014) Tuy nhiên, chưa có
nghiên cứu nào về phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy hoạt chất Propoxur Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu: Phân lập, tuyển chọn và định danh một số dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy hoạt chất Propoxur từ nền đất bảo quản hành tím tại thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguồn vi khuẩn
Ba mẫu đất ký hiệu P1-2, P2-3 và VH-4 được thu thập từ nền đất canh tác và kho bảo quản hành tím tại Phường 1, Phường 2, xã Vĩnh Hải của thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng dùng để phân lập một
số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy chuyên biệt Propoxur vì nông dân tại ba điểm lấy mẫu này
sử dụng hoạt chất Propoxur mỗi năm để trồng và bảo quản hành tím Mẫu đất được lấy với độ sâu
0-20 cm Một số thông tin về 3 địa điểm thu mẫu đất được trình bày trong Bảng 1
Bảng 1: Một số đặc điểm mô tả của 3 mẫu đất thí nghiệm
Mẫu
Thời gian sử dụng Propoxur (năm)
P12 Bảo quản hành tím giống Phường 1, Vĩnh Châu, Sóc Trăng 40
P23 Bảo quản hành tím giống Phường 2, Vĩnh Châu, Sóc Trăng Lâu năm
2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn bản địa có
tiềm năng phân hủy hoạt chất Propoxur từ 3
mẫu đất thu thập
Mật số vi sinh vật ban đầu trong các mẫu đất
được xác định theo phương pháp hòa loãng của Ian
và Charles (2004) Sau khi đã trải dịch vi khuẩn lên
bề mặt, các đĩa môi trường nuôi cấy được đặt vào
túi nylon và ủ ở nhiệt độ phòng Số khuẩn lạc đếm
theo hệ số pha loãng và thể tích để xác định mật số
vi khuẩn ban đầu của các mẫu đất
Cân 1 g đất (trọng lượng khô kiệt) cho vào bình tam giác tiệt trùng chứa 24 mL dung dịch khoáng tối thiểu có bổ sung 30 ppm Propoxur Thành phần của môi trường khoáng tối thiểu trong 1 L dung dịch như sau: 3,75 g K2HPO4, 1 g KH2PO4, 0,25 g
Trang 3nồi hấp tiệt trùng sau đó bổ sung 10 mL dung dịch
vi lượng Thành phần vi lượng trong 1 L dung dịch
như sau: 10 mg Na2MoO4.H2O, 25 mg H2BO3, 15
mg ZnCl2, 5 mg CuCl2, 10 mg FeCl3 Các mẫu
nuôi cấy được đặt trên máy lắc với tốc độ 90 rpm
(nhằm tạo khả năng trao đổi oxy tốt cho dung dịch)
ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối
Đây được xem là thế hệ nuôi cấy đầu tiên Sau
7-10 ngày nuôi cấy, hút 1 mL dung dịch nuôi cấy và
lọc qua màng lọc tiệt trùng, sau đó, xác định nồng
độ Propoxur trong mẫu trên hệ thống HPLC
(Shimazu-LC20A) với các thông số như sau: sử
dụng cột C18, tỉ lệ pha động acetonitrile : nước
tương ứng là 45:55, bước sóng 214 nm, lưu lượng
của pha động 1 ml/phút, thời gian xác định phổ
Propoxur là phút thứ 7,5 Việc nuôi và chuyển sang
thế hệ mới chỉ thực hiện khi nồng độ Propoxur
trong mẫu giảm hơn 50% Toàn bộ qui trình nuôi
cấy được lặp lại trong 5 lần liên tục Sau lần nuôi
cấy thứ 5, 100 µL môi trường nuôi cấy vi khuẩn
với các nồng độ pha loãng khác nhau được trải lên
trên bề mặt môi trường agar TSB (gồm 30g
Tryptone soya broth và 15g agar cho 1 L nước cất)
để phân lập các dòng thuần và tiến hành khảo sát
các đặc tính về hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế
bào, Gram và đặc tính oxidase
2.3 Đánh giá khả năng phân hủy hoạt chất
Propoxur của 2 hệ vi sinh vật ký hiệu P1-2 và
P2-3 trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng
Trong quá trình phân lập ở mục 2.2 qua quan
sát cho thấy hệ vi sinh vật ký hiệu VH-4 đã không
thể hiện khả năng phân hủy tốt hoạt chất Propoxur
nên hệ vi sinh vật này đã được loại ra và chỉ còn lại
2 hệ vi sinh vật ký hiệu: P1-2 và P2-3 được sử
dụng cho việc phân lập các dòng vi khuẩn có tiềm
năng phân hủy Propoxur Khả năng phân hủy
Propoxur của 2 hệ này được đánh giá trước khi tiến
hành phân lập dòng vi khuẩn trên đĩa agar Thí
nghiệm được thực hiện như sau: hút 1 mL dịch vi
khuẩn ở thế hệ nuôi cấy thứ năm cho vào bình tam
giác 100 mL có chứa 24 mL dung dịch khoáng tối
thiểu bổ sung 30 ppm Propoxur Thí nghiệm được
tiến hành với 3 lần lặp lại cho mỗi hệ vi sinh vật và
nghiệm thức đối chứng được tiến hành tương tự
nhưng không chủng hệ vi sinh vật Các mẫu được
lắc trên máy lắc với tốc độ 90 rpm, ở nhiệt độ
phòng thí nghiệm, trong tối và trong 10 ngày
Các chỉ tiêu theo dõi trong thời gian bố trí thí
nghiệm bao gồm: 1) Nồng độ Propoxur vào các
thời điểm: 0, 1, 5 và 10 ngày sau bố trí thí nghiệm;
2) Mật số vi khuẩn trong dung dịch môi trường nuôi cấy vào các thời điểm: 1, 5 và 10 ngày sau khi
bố trí thí nghiệm Mật số vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhỏ giọt trên môi trường TSB Đĩa chứa vi khuẩn được đặt vào túi nylon và ủ trong tủ ủ với nhiệt độ 30oC trong ba ngày Sau đó, đếm mật số khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt đĩa và tính mật số vi khuẩn vào các thời điểm thu mẫu
2.4 Đánh giá và so sánh khả năng phân hủy Propoxur của 4 dòng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng
Bốn trong tổng số 78 dòng vi khuẩn phân lập
ký hiệu: P12-3; P23-7; P23-19 và P23-26 được tuyển chọn để tiến hành đánh giá khả năng phân hủy Propoxur của chúng Bốn dòng vi khuẩn này được làm giàu mật số trong môi trường GYE (glucose yeast extract) trong 3 ngày trên máy lắc Thành phần của môi trường GYM trong 1 L dung địch bao gồm: 10 g glucose và 10 g yeast extract Sau đó, sinh khối vi khuẩn được thu hoạch Hiệu chỉnh độ đục của dung dịch chứa vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng bằng máy đo quang phổ về OD 600 nm = 0,7 Hút 1mL dịch vi khuẩn
đã hiệu chỉnh độ đục cho vào bình tam giác 100
mL chứa 24 mL dung dịch khoáng tối thiểu có bổ sung 45 ppm Propoxur Thí nghiệm được tiến hành với 4 lặp lại Các mẫu được lắc trên máy lắc với tốc độ 90 rpm, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, trong tối và trong 18 ngày
Các chỉ tiêu theo dõi trong thời gian bố trí thí nghiệm bao gồm: nồng độ Propoxur và mật số dòng vi khuẩn vào các thời điểm: 0; 1; 4 và 18 ngày bố trí thí nghiệm (tham khảo mục 2.2 và 2.3 cho phương pháp xác định nồng độ Propoxur trong mẫu nuôi cấy và xác định mật số vi khuẩn)
2.5 Giải mã trình tự gen 16S rRNA và xác định ở mức độ loài của hai dòng vi khuẩn ký hiệu P23-7 và P23-26
DNA của 2 dòng vi khuẩn ký hiệu P23-7 và P23-26 thể hiện phân hủy cao hoạt chất Propoxur
trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng (mục 2.4)
được trích theo quy trình của Ihrmark và ctv.,
2012 Sau đó, sản phẩm trích DNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với với bộ mồi 27F-907R
(Xuan và ctv., 2012) có trình tự như sau:
27F 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' 907R 5' CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT 3' Hai đoạn mồi này nhắm vào đoạn gene 16S
Trang 4rRNA của vi khuẩn Chu trình nhiệt cho phản ứng
PCR: giai đoạn sơ khởi 94°C (3 phút), 25 chu kì:
92°C (30s)-50°C (45s)-72°C (30s), 72°C (7 phút);
trữ sản phẩm ở 4°C (Xuan và ctv., 2012) Sản
phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%
trước khi giải trình tự
Các hóa chất để thực hiện phản ứng PCR bao
gồm (thể tích/1 phản ứng): 4µL Dream taq buffer
(5x); 0,4 µL mồi xuôi 27F (10 µM); 0,4 µL mồi
ngược 907R (10 µM); 6 – 10 µL DNA tinh sạch;
2,5 µL mQ-H2O, 0,4 µL dNTP (10mM); 2,2 µL
MgCl2 (25 mM); 0,1 µL Dream taq (5 U/µL) Kết
quả giải trình tự được so sánh và dò tìm trên
ngân hàng gene thế giới trên trang web
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xác định
mức độ loài của hai dòng vi khuẩn khảo sát
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập các dòng vi khuẩn có tiềm
năng phân hủy Propoxur từ 2 hệ vi sinh vật thể
hiện khả năng phân hủy tốt Propoxur
Kết quả mật số vi khuẩn ban đầu của 3 mẫu đất
thí nghiệm được trình bày trong Bảng 2 Có sự
khác nhau về mật số vi khuẩn ban đầu của 3 mẫu
đất thu thập Mật số vi khuẩn cao nhất ở mẫu đất
P1-2, kế đến là P2-3 và thấp nhất ở mẫu VH-4
Bảng 2: Mật số ban đầu của 3 mẫu đất thí nghiệm
Sau thời gian làm giàu mật số và phân lập vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Propoxur trong môi trường lỏng và agar từ 2 hệ vi sinh vật ký hiệu P1-2
và P2-3, tổng cộng 78 dòng vi khuẩn đã được phân lập Trong tổng số 78 dòng vi khuẩn được phân lập
có 38 dòng từ hệ vi sinh vật kí hiệu P12 và 40 dòng
từ hệ vi sinh vật kí hiệu P23 Từ 78 dòng vi khuẩn phân lập, được nhóm lại thành 15 nhóm dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc Hình dạng tế bào của
15 dòng vi khuẩn đại diện cho 78 dòng phân lập được quan sát dưới kính hiển vi và kết quả ghi nhận có 3 dạng hình như sau: que ngắn, que dài và hình cầu (Hình 1) Nhóm 1: dạng tế bào hình que ngắn gồm có 8 dòng ký hiệu: 7, 17,
P12-27, P12-37, P23-7, P23-20, P23-26 và P23-29 (8/15 dòng, chiếm 53%) Nhóm 2: dạng tế bào hình que dài gồm 2 dòng ký hiệu: P12-24b’ và P23-18 (2/15 dòng, chiếm 13%) và Nhóm 3: dạng tế bào hình cầu gồm có 5 dòng ký hiệu: P12-3, P12-34, P23-25, P23-27 và P23-35 (5/15 dòng, chiếm 34%)
(A) (B) (C)
Hình 1: Ba hình dạng tế bào vi khuẩn điển hình được quan sát trên kính hiển vi (A): Hình cầu;
(B): Hình que ngắn và (C): Hình que dài (quan sát ở E100)
Kết quả kiểm tra về gram vi khuẩn cho thấy
như sau: 9 trên tổng số 15 dòng vi khuẩn được
phân loại như là vi khuẩn gram dương (60%), còn
lại 6/15 dòng vi khuẩn được phân loại như là gram
âm (40%) Cuối cùng, kiểm tra khả năng oxidase
của vi khuẩn để xác định vi khuẩn có enzyme
cytochrome oxidase hay không Vi khuẩn thể hiện
phản ứng dương tính (positive) khi test oxidase có
thể sử dụng oxi tham gia vào chuỗi dẫn truyền điện
tử, sinh ATP trong quá trình hô hấp, kết quả kiểm
tra khả năng oxidase của 15 dòng vi khuẩn đại diện
dòng vi khuẩn thể hiệm âm tính với phản ứng oxidase
3.2 Đánh giá khả năng phân hủy Propoxur trong dung dịch khoáng tối thiểu của 2 hệ vi sinh vật ký hiệu: P1-2 và P2-3
Kết quả về khả năng phân hủy Propoxur của 2
hệ vi sinh vật ký hiệu P1-2 và P2-3 trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng được trình bày trong Hình 2 Nhìn chung, nồng độ Propoxur ở các nghiệm thức, bao gồm cả nghiệm thức đối chứng giảm dần theo thời gian nuôi cấy Khả năng phân
Trang 5không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) tại các thời
điểm thu mẫu Tuy nhiên, nồng độ Propoxur trong
cả 2 hệ vi sinh vật thấp hơn và khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p<0.05)
Nồng độ Propoxur giảm nhanh vào thời điểm 5
ngày sau khi nuôi cấy, từ 30 ppm xuống còn 7 ppm
ở cả 2 hệ vi sinh vật Sau 10 ngày nuôi cấy, nồng
độ Propoxur ở cả 2 hệ vi sinh vật giảm xuống dưới
5 ppm Sự giảm nồng độ Propoxur trong nghiệm thức đối chứng được giải thích là do Propoxur có thể bị thủy phân (1,5%/ngày) trong môi trường nước có pH trung tính (pH=7.0) (Hartley và Kidd, 1983)
Hình 2: Khả năng phân hủy hoạt chất Propoxur của 2 hệ vi sinh vật ký hiệu: P1-2 và P2-3 trong dung dịch khoáng tối thiểu bổ sung 30 ppm Propoxur sau 10 ngày nuôi cấy (n=3 và sai số chuẩn)
Kết quả thể hiện sự phát triển mật số vi khuẩn
theo thời gian nuôi cấy được trình bày trong Hình
3 Nhìn chung, mật số vi khuẩn có xu hướng tăng
dần theo thời gian nuôi cấy Giai đoạn từ 1 đến 5
ngày mật số vi khuẩn tăng nhanh nhất, sau đó ổn
định về sau Không có sự khác biệt thống kê về
mật số vi khuẩn giữa 2 hệ vi sinh vật kí hiệu P1-2
và P2-3 ở tất cả các thời điểm thu mẫu Sự không
khác biệt về mật số vi khuẩn giữa 2 hệ vi sinh vật
vào các thời lấy mẫu là cơ sở phù hợp để giải thích
cho hiện tượng không khác biệt về khả năng phân
hủy Propoxur của 2 hệ vi sinh vật vào các thời điểm thu mẫu Giai đoạn 1-5 ngày sau khi bố trí thí nghiệm mật số vi khuẩn tăng lên rất mạnh, đồng thời, nồng độ Propoxur trong môi trường nuôi cấy cũng giảm một lượng rất đáng kể, điều này chứng
tỏ, vi sinh vật đã sử dụng nguồn carbon từ Propoxur cho sinh trưởng và phát triển mật số Ở nghiệm thức đối chứng không có bất cứ vi khuẩn nào tìm thấy trên đĩa agar, điều này cho thấy các thao tác về tiệt trùng trong quá trình bố trí thí nghiệm đã được bảo đảm và đáng tin cậy
Hình 3: Sự phát triển mật số vi khuẩn trong dung dịch khoáng tối thiểu bổ sung 30 ppm Propoxur
trong 10 ngày nuôi cấy (n=3 và sai số chuẩn)
Trang 63.3 Đánh giá khả năng phân hủy Propoxur
trong môi trường khoáng tối thiểu lỏng của 4
dòng vi khuẩn được tuyển chọn
Kết quả đánh giá khả năng phân hủy Propoxur
trong môi trường lỏng sau 18 ngày thí nghiệm của
4 dòng vi khuẩn ký hiệu: P12-3, P23-7, P23-19 và
P23-26 được trình bày ở Hình 4 Kết quả cho thấy
trong 4 dòng vi khuẩn thử nghiệm thì chỉ có 2 dòng
ký hiệu: P23-7 và P23-26 là thể hiện khả năng
phân hủy rất tốt Propoxur trong dung dịch khoáng
tối thiểu khi so sánh với nghiệm thức đối chứng,
trong khi đó các dòng vi khuẩn còn lại khả năng phân hủy Propoxur kém hơn hai dòng này và phân hủy Propoxur không đáng kể so với nghiệm thức đối chứng Dòng vi khuẩn ký hiệu P23-7 phân hủy được 30 ppm Propoxur trong môi trường lỏng sau
1 ngày thí nghiệm và sau 4 ngày nuôi cấy nồng độ Propoxur trong môi trường đã bị phân hủy hoàn toàn Trong khi đó, dòng vi khuẩn ký hiệu P23-26 chỉ phân hủy 10 ppm Propoxur sau 1 ngày nuôi cấy Tuy nhiên, vào ngày thứ 4 dòng vi khuẩn này
đã phân hủy hoàn toàn Propoxur
Hình 4: Khả năng phân hủy Propoxur của 4 dòng vi khuẩn tuyển chọn trong dung dịch khoáng tối
thiểu bổ sung 45 ppm Propoxur sau 18 ngày nuôi cấy (n=4 và sai số chuẩn)
Kết quả về sự phát triển mật số của 4 dòng vi
khuẩn thử nghiệm trong môi trường nuôi cấy
khoáng tối thiểu lỏng bổ sung 45 ppm Propoxur
trong 18 ngày được trình bày trong Hình 5 Kết quả
cho thấy như sau: Mật số của tất cả các dòng vi
khuẩn thử nghiệm đều có xu hướng tăng theo thời
gian Mật số vi khuẩn dòng P23-26 ở ngày thứ nhất
thấp hơn so với dòng P23-7 Đồng thời, khả năng
phân hủy thuốc Propoxur của dòng P23-26 cũng
thấp hơn rất nhiều so với dòng P23-7 vào ngày 1
Tuy nhiên, ở ngày thứ 4, mật số vi khuẩn dòng
P23-26 tăng lên mạnh và không khác biệt thống kê
so với mật số dòng P23-7 Bên cạnh đó, kết quả phân tích nồng độ Propoxur trong môi trường lỏng của 2 dòng vi khuẩn này đều bằng 0 ppm vào ngày thứ 4 Điều này rõ ràng cho thấy, sự gia tăng mật
số của 2 dòng này là nguyên nhân dẫn đến sự giảm nồng độ thuốc Propoxur trong môi trường nuôi cấy
và 2 dòng vi khuẩn này đã sử dụng Propoxur như
là nguồn carbon cho việc tăng mật số, sinh trưởng
và phát triển
Trang 7Tóm lại, kết quả thí nghiệm cho thấy 2 dòng vi
khuẩn phân lập trong nghiên cứu này ký hiệu
P23-7 và P23-26 thể hiện khả năng phân hủy chuyên
biệt Propoxur trong môi trường khoáng tối thiểu
lỏng và cả 2 dòng này có tiềm năng ứng dụng cao
trong việc xử lý đất bị ô nhiễm với Propoxur và
nên được chọn cho những nghiên cứu tiếp theo
3.4 Giải mã trình tự gen 16S rRNA và xác
định ở mức độ loài của hai dòng vi khuẩn ký
hiệu P23-7 và P23-26
Hai dòng vi khuẩn ký hiệu P23-7 và P23-26 29
được giải mã trình tự và so sánh trình tự đoạn gene
16S rRNA với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gene thế giới Kết quả cho thấy trình tự đoạn gen của vi khuẩn P23-7 và P23-26 lần lượt tương đồng với
đoạn gene 16S rRNA của loài Paracoccus sp dòng Y3B-1 (số đăng kí: HM018693.1) và Paracoccus
sp SMIC-4 (số đăng kí: FJ877155.1) với độ tương đồng lần lượt là 100% và 99% Như vậy, 2 dòng vi khuẩn ký hiệu: P23-7 và P23-26 được sắp xếp theo bậc phân loại như sau: Prokaryote, Bacteria, Proteobacteria, Alphaproteobacteria, Rhodobacterales,
Rhodobacteraceae, Paracoccus, Paracoccus sp
(Bảng 3)
Bảng 3: Định danh các dòng vi khuẩn thể hiện sự phân hủy Propoxur theo độ tương đồng của đoạn
gen 16S rRNA
STT Dòng Nguồn gốc Độ tương đồng (%) Vi khuẩn Các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu Số đăng kí Định danh
1 P23-7 Vĩnh Châu, Phường 2,
Paracoccus sp
Paracoccus
sp P23-7
2 P23-26 Vĩnh Châu, Phường 2,
Sóc Trăng
99% Paracoccus sp SMIC-4 FJ877155.1 Paracoccus sp P23-26
4 KẾT LUẬN
Hai mẫu đất ký hiệu: P1-2 và P2-3 thu thập
từ nền đất trong kho bảo quản hành tím tại thị
xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng có chứa nguồn vi
khuẩn có khả năng phân hủy rất cao và chuyên
biệt Propoxur Hai dòng vi khuẩn ký hiệu P23-7 và
P23-26 thể hiện khả năng phân hủy rất hữu
hiệu Propoxur trong dung dịch khoáng tối thiểu và
được xem như là 2 dòng có tiềm năng ứng
dụng cao nhất trong việc xử lý đất ô nhiễm với
hoạt chất Propoxur và cả 2 được định danh lần lượt
như là loài Paracoccus sp P23-7 và Paracoccus
sp P23-26
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Berg, G L., 1986 Farm Chemicals
Handbook Willoughby, Ohio: Meister
Publishing Co
2 Dương Vĩnh Hảo., 2013 Trồng và tiêu thụ
củ hành tím Vĩnh Châu
(http://www.soctrang.gov.vn/wps/wcm/con
nect/ed00168040ca0aa0bc7cfd66b90c36b8/
03-2013_Bai 7)
3 Đặng Phạm Thu Thảo, Đỗ Thị Xuân, Dương
Minh Viễn và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2014
Phân lập và đỊnh danh các dòng vi khuẩn bản
địa có khả năng phân hủy thuốc kích thích ra
hoa Paclobutrazol từ đất vườn trồng cây ăn
trái ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Tạp chí khoa học Trường đại học Cần Thơ, phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ và Môi trường: 32 (2014): 80-86
4 Hayes, W J 1982 Pesticides studied in
man Baltimore, MD: Williams and Wilkins
5 Hartley, D; Kidd, H., 1983 The Agrochemicals Handbook Nottingham, England: Royal Society of Chemistry
6 Ian, L.P; Charles, P.G., 2004
Environmental microbiology Elsevier Academic Press
7 Ihrmark, K; Inga, T.M; Bödeker, K.C.M; Hanna, F; Ariana, K; Jessica, S; Ylva, S; Jan S; Mikael, B.D; Karina, E.C; Björn, D.L, 2012 New primers to amplify the fungal ITS2 region – evaluation by 454-sequencing of artificial and natural communities Article first published online:
27 JUL 2012.DOI: 10.1111/j.1574-6941.2012.01437.x
8 Kamanavalli, C.V., and Ninnekar, H.Z.,
2000 Biodegradation of Propoxur by
Pseudomonas sp C.M Department of
biochemistry, Karnatak University Dharwad, India
9 Nkedi-Kizza, P; Ou, L.T ; Cisar, J.L ; Snyder, G.H., 1992 Microbial degradation
Trang 8of Propoxur in turfgrass soil J Environ
Sci Health B Soil Science Department,
University of Florida
10 Nguyễn Thị Lan Hương., 2012 Khảo sát lưu
tồn và phân lập vi khuẩn có khả năng phân
hủy Chlorpyriphos ethyl trên mô hình canh
tác màu Luận văn Thạc Sĩ chuyên ngành
Sinh thái học Trường Đại học Cần Thơ
11 Nguyễn Thị Phi Oanh., 2011 Vi khuẩn
phân hủy 2,4-D trong đất lúa ở Tiền Giang
và Sóc Trăng Tạp chí khoa học 2011:18a
65-70 Trường Đại học Cần Thơ
12 Nguyễn Thị Tố Quyên., 2013 Khảo sát lưu
tồn và phân hủy sinh học Pretilachlor trên
một số ruộng chuyên canh lúa tại đồng bằng
sông Cửu Long Luận văn thạc sĩ chuyên
ngành Công nghệ sinh học Trường đại học
Cần Thơ
13 Nguyễn Đức Thắng., 1999 Điều tra hiện
trạng canh tác, cách tồn trữ và bước đầu thử
nghiệm hiệu quả một số nông dược trong
việc bảo quản hành tím (Allium cepa group
aggregatum) tại Sóc Trăng Luận văn Thạc
sĩ chuyên ngành Nông học Trường Đại học Cần Thơ
14 Rahmansyah, M; Dwi, A; Heddy, J; Tirta, K.D., 2012 Growth and adaptation of four
Streptomyces isolates in the media
containing Propoxur Research Center for Biology, Indonesian Institute of Sciences Cibinong Science Center, Jalan Raya Jakarta Bogor, Cibinong, Indonesia
15 U.S Environmental Protection Agency (NCEA)., 1999 Integrated Risk Information System (IRIS) on Baygon National Center for Environmental Assessment, Office of
Research and Development, Washington, DC
16 Xuan, D.T; Guong, V.T; Rosling, A;
Alström, S; Chai, B; Högberg, N., 2012 Different crop rotation systems as drivers of change in soil bacterial community structure
and yield of rice, Oryza sativa Biology and Fertility of Soils 48 (2): 217- 225.