Phân họ protein DREB (Dehydration Responsive Element Binding) thuộc họ AP2 là nhân tố phiên mã kích hoạt biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn, làm tăng khả năng chống chịu các stre[r]
Trang 1ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB6 PHÂN LẬP
TỪ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN DT2008
Lò Thị Mai Thu 1 , Nguyễn Việt Nga 2 , Nguyễn Thị Ngọc Lan 2 , Chu Hoàng Mậu 2*
1 Trường Đại học Tây Bắc; 2 Trường Đại học Sư phạm- ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loài cây họ Đậu có giá trị dinh dưỡng và hiệu quả kinh tế
cao, nhưng rất mẫn cảm với tác động của hạn Hạn là yếu tố phi sinh học làm giảm năng suất và chất lượng hạt đậu tương Để chống lại stress hạn, cây đậu tương tổng hợp nhiều loại protein, trong đó có các nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt động các gen chức năng Phân họ protein DREB (Dehydration Responsive Element Binding) thuộc họ AP2 là nhân tố phiên mã kích hoạt biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn, làm tăng khả năng chống chịu các stress hạn của cây đậu tương
Tăng cường biểu hiện gen GmDREB là giải pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của
cây đậu tương, trong đó khâu quan trọng là tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen Trong nghiên cứu này,
gen GmDREB6 (cDNA) đã được khuếch đại và tách dòng từ mRNA của giống đậu tương DT2008
Gen GmDREB6 có kích thước là 693 bp, mã hóa 230 amino acid, sai khác ở 16 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid suy diễn so với trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank Trình tự gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008 được sử dụng để
thiết kế vector chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn ở cây đậu tương
Từ khóa: Gen GmDREB6, Glycine max, khả năng chịu hạn, nhân tố phiên mã, vùng AP2
MỞ ĐẦU*
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] là cây
thực phẩm dễ trồng và có hiệu quả kinh tế
cao Hạt đậu tương giàu dinh dưỡng, hàm
lượng protein trong hạt đạt từ 30%-52%, hàm
lượng lipid từ 12%-25%, có nhiều loại
vitamin, khoáng và đặc biệt trong hạt chứa
nhiều amino acid thiết yếu cho người và động
vật Cây đậu tương không chỉ có giá trị kinh
tế và dinh dưỡng mà còn giữ vai trò quan
trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng
bền vững tài nguyên đất canh tác do rễ đậu
tương có khả năng cố định đạm [1], [2] [3]
Trong những năm gần đây do biến đổi khí
hậu mà hạn hán đã xảy ra ở nhiều quốc gia
trên thế giới, trong đó có Việt Nam Ở một số
vùng ở nước ta như các tỉnh miền Trung, Tây
Nguyên, hạn đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến
sản xuất nông nghiệp, làm suy giảm rõ rệt khả
năng sinh trưởng và phát triển của cây trồng,
trong đó có đậu tương Đậu tương được xem
là loại cây trồng rất mẫn cảm với tác động của
hạn và hạn là yếu tố phi sinh học nghiêm
trọng nhất có thể làm giảm năng suất hạt đậu
*
Tel: 0913 383289; Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn
tương [2] Câu hỏi đặt ra là, có thể cải thiện được khả năng chịu hạn của cây đậu tương hay không và nếu có thì ứng dụng công nghệ nào để tăng cường khả năng kháng hạn của loài cây họ đậu này Cho đến nay các nghiên cứu đã khẳng định rằng, có thể cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng kỹ thuật chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện đại
Để chống lại stress hạn, cây đậu tương tổng hợp nhiều loại protein, trong đó có các loại protein là nhân tố phiên mã kích hoạt hoạt động phiên mã của các gen chức năng [5]
Protein DREB ở đậu tương (Dehydration
Responsive Element Binding) là một phân họ thuộc họ AP2, có chức năng điều khiển sự biểu hiện của một số gen cảm ứng với hạn, tạo ra khả năng chống chịu các stress hạn từ ngoại cảnh Một số thành viên của phân họ
gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb,
GmDREB7 [7] Trên bản đồ gen của đậu
tương, gen GmDEB6 có một exon ở vị trí
LOC100101914 thuộc nhiễm sắc thể số 5
Trang 2(Hình 1) [10] Tăng cường biểu hiện gen
GmDREB sẽ kích hoạt mạnh sự phiên mã của
nhóm gen chịu hạn, do vậy việc lựa chọn kỹ
thuật biểu hiện mạnh gen GmDREB sẽ là giải
pháp công nghệ nhằm nâng cao khả năng chịu
hạn của cây đậu tương mà khâu quan trọng là
tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen
Giống đậu tương DT2008 trồng phổ biến ở
miền Bắc Việt Nam được chọn tạo bằng
phương pháp xử lý đột biến chiếu xạ tia
gamma trên hạt khô dòng 2001HC từ tổ hợp
lai DT2001 với HC100 được đánh giá là
giống chịu hạn [9] Trong nghiên cứu này
chúng tôi trình bày kết quả tách dòng và phân
tích trình tự nucleotide của gen GmDREB6
phân lập từ mRNA của giống đậu tương chịu
hạn DT2008
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu: Giống đậu tương DT2008 là giống
chịu hạn do Viện Di truyền Nông nghiệp cung
cấp được sử dụng làm vật liệu để phân lập và
nghiên cứu đặc điểm gen GmDREB6
Phương pháp
Quá trình thực hiện phân lập gen GmDREB6
từ giống đậu tương DT2008 được thực hiện
theo sơ đồ ở hình 2 Nghiên cứu thông tin và
thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R để nhân gen GmDREB6 dựa trên trình tự gen DREB6
đã công bố trên GenBank có mã số EF551166
[6] cặp mồi DREB6-F/ DREB6-R thiết kế có
trình tự là:
DREB6-F:5’-ATGGTCATGGAAGAATCTAAC-3’;
DREB6-R:5’-TTAATATGATTCCCATAGA-3’
Kích thước của đoạn DNA được nhân bản dự kiến là 693 bp
Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit Trizol Reagents của hãng Invitrogen cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số bằng bộ KIT SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis PCR được thực hiện theo chương trình:
95C/5 phút; 30 chu kỳ (95C/30 giây;
55C/30 giây; 72C/30 giây); 72C/8 phút và giữ ở 4C Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,0% và được tinh sạch theo bộ kit GeneJET PCR Purification của hãng Fermentas Tách dòng gen được thực hiện theo Sambrook và Russell (2001) [8] Trình
tự DNA được xác định trên máy đọc trình tự
tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer và trình tự nucleotide của gen được đọc trên phần mềm BLAST và BioEdit
Hình 1 Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu tương
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tách dòng và giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008
Mẫu lá non từ giống đậu tương giống DT2008 được sử dụng để tách chiết RNA tổng số, kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số được thể hiện trên hình 3A RNA tổng số sau khi xử lý bằng DNase được sử dụng để tổng hợp cDNA bằng phản ứng phiên mã ngược Từ
cDNA, bằng PCR với cặp mồi DREB6-F/DREB6-R đoạn mã hóa của gen GmDREB6 đã được
Trang 3khuếch đại Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 thu được băng DNA đặc hiệu
với kích thước gần 0,7 kb, đúng như tính toán theo lý thuyết (Hình 3B) Sản phẩm PCR nhân bản
gen GmDREB6 đã tinh sạch được sử dụng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT (kích thước 2705 bp) để tạo vector tái tổ hợp pBT_GmDREB6 Vector tái tổ hợp được biến nạp vào
E.coli DH5α, các khuẩn lạc được chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh ampicillin, có chất
cảm ứng IPTG và cơ chất X-Gal Năm dòng khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiến hành phản
ứng PCR nhằm kiểm tra sự có mặt của gen GmDREB6 Kết quả điện di sản phẩm
colony-PCR ở hình 3C cho thấy một băng DNA có kích thước gần 0,7 kb là kích thước của gen
GmDREB6 Khuẩn lạc số 2 không xuất hiện đoạn DNA Các dòng khuẩn lạc cho kết quả dương
tính với colony-PCR được nuôi tăng sinh và sử dụng để tách chiết plasmid phục vụ giải trình tự
nucleotide Kết quả giải trình tự đoạn DNA từ plasmid tái tổ hợp pBT_GmDREB6 trên thiết bị tự
động thu được trình tự nucleotide có kích thước 693 bp Kết quả phân tích bằng BLAST trong
NCBI cho thấy, trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có
độ tương đồng 100% so với hai trình tự gen mang mã số NM_001248412 và EF551166 Kết quả phân tích BLAST cho phép khẳng định đoạn gen phân lập từ giống đậu tương DT2008 là gen
Glycine max dehydration-responsive element binding protein 6 (GmDREB6) mRNA của cây đậu
tương Trình tự gen GmDREB6 có kích thước 693 bp mã hóa 230 amino acid (Hình 4).
RNA tổngsố
cDNA
Trình tự nucleotide của gen GmDREB6
Giải trình tự nucleotide
Gen GmDREB6 củađậu tương
Cặpmồi
DREB6-F/ DREB6-R
GENBANK
Thiết kế
PCR
Hình 2 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008
Trang 4A B C
Hình 3 Hình ảnh điện di trên gel agarose A: Kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách từ lá non giống đậu
tương DT2008; B: Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 (M-thang DNA 1 kb; làn điện di 1, 2, 3- Sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008); C: Sản phẩm colony-PCR nhân bản gen GmDREB6 từ 5 dòng khuẩn lạc màu trắng (M: Thang DNA 1 kb; Làn điện di số 1, 3, 4, 5 cho sản phẩm
colony-PCR; làn điện di số 2 không có sản phẩm colony-PCR)
Hình 4 Kết quả phân tích BLAST gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008
So sánh trình tự nucleotide và trình tự
amino acid suy diễn từ gen GmDREB6 của
giống đậu tương DT2008 với trình tự
EF551166 và NM_001248412 trên
GenBank
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen
GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương
DT2008 với gen GmDREB6 mang mã số trên
GenBank là NM_001248412 [4] và
EF551166 [6], kết quả được thể hiện ở bảng
1 Bảng 1 cho thấy, trình tự nucleotide của
gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương
DT2008 có 16 vị trí nucleotide sai khác so với
trình tự nucleotide của gen GmDREB6 mang
mã số EF551166 và NM_001248412 trên
GenBank, đó là các vị trí 19, 20, 51, 52, 75,
197, 319, 320, 408, 409, 580, 581, 635, 636,
680, 681 Tất cả những sai khác này đều là sự
thay thế cặp T bằng G-C hoặc G-C bằng
A-T Vấn đề đặt ra là sự thay thế cặp nucleotide
có làm thay đổi amino acid hay không cần phải tiến hành so sánh trình tự amino acid suy
diễn của gen GmDREB6
Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn
của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu
tương DT2008 với hai trình tự amino acid suy
diễn của gen GmDREB6 mang mã số
EF551166, NM_001248412 trên GenBank cho thấy có 8 vị trí amino acid sai khác, đó là các vị trí 6, 18, 66, 107, 137, 194, 212, 227 (Bảng 2)
Phân tích vùng AP2 và các điểm liên kết với sợi DNA, kết quả so sánh ở hình 5 cho thấy, vùng AP2 của protein suy diễn từ gen
GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương
DT2008 có 2 vị trí sai khác, đó là amino acid thứ 66 và 107 Hai điểm sai khác về amino acid không thuộc vào những vị trí DNA binding (60,
61, 63, 65, 67, 69, 73, 75, 82, 84, 87)
Trang 5Bảng 1 Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương
DT2008 và trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank
Bảng 2 Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu
tương DT2008 và suy diễn từ trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank
Hình 5 So sánh trình tự amino acid của vùng AP2 trong protein suy diễn từ gen GmDREB6 của giống đậu
tương DT2008 và EF551166, NM_001248412 trên GenBank
KẾT LUẬN
Gen GmDREB6 (cDNA) đã được khuếch đại và tách dòng thành công từ mRNA của giống đậu tương DT2008 có kích thước là 693 bp, mã hóa 230 amino acid Gen GmDREB6 của giống đậu
tương Việt Nam DT2008 có 16 vị trí nucleotide và 8 vị trí amino acid suy diễn sai khác so với
trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 trên GenBank Trình tự gen
GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen trong mục đích
tăng cường khả năng chịu hạn ở cây đậu tương
Trang 6LỜI CẢM ƠN: Nghiên cứu này được hỗ trợ
và trong khuôn khổ của Đề tài cấp Bộ Giáo
dục & Đào tạo mang mã số B2017-TNA-38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ngô Thế Dân (1999), Cây Đậu Tương, Nxb
Nông nghiệp, Hà Nội
2 Chu Hoàng Mậu (2011), Gen và đặc tính chịu hạn
của cây đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội
3 Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu tương – Kỹ
thuật trồng và chế biến sản phẩm, Nxb Nông
nghiệp, Hà Nội
4 GenBank (2017), Glycine max
dehydration-responsive element binding protein 6
(LOC100101914, mRNA NCBI Reference
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_00124
8412
5 Li X P., Tian A G., Luo G Z., Gong Z Z.,
Zang J S., Chen S Y (2005), “Soybean
DRE-binding transcription factors that are responsive to
abiotic stresses”, Theor Appl Genet., 110(8), pp
1355-1362
6 Liu Y W., Chen M., Xu Z S., Zh G Y., Li L
C., Ma Y Z (2007), Glycine max dehydration-responsive element binding protein 6 mRNA, complete cds GenBank: EF551166.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF551166
7 Mizoi J., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki
K (2012), “AP2/ERF family transcription factors
in plant abiotic stress responses”, Biochem Biophys Acta., 1819(2), pp 86-96
8 Sambrook J F and Russell D W (2001),
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1, 2 and 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2100 pp
9 Saad Sulieman, Chien Van Ha, Maryam Nasr Esfahani, Yasuko Watanabe, Rie Nishiyama, Chung Thi Bao Pham, Dong Van Nguyen, and Lam-Son Phan Tran (2015), “DT2008: A promising new genetic resource for improved drought tolerance in soybean when solely
dependent on symbiotic N2 fixation”, BioMed Research International, Article ID 687213, 7
pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/687213 10.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=EF5 51166
SUMMARY
CHARACTERISTICS OF THE GmDREB6 GENE ISOLATED FROM
DROUGHT-RESISTANT DT2008 SOYBEAN CULTIVAR
Lo Thi Mai Thu 1 , Nguyen Viet Nga 2 , Nguyen Thi Ngoc Lan 2 , Chu Hoang Mau 2*
1
Tay Bac University; 2 – TNU – University of Education
Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is a species of legume, which has economic values and high
nutrition, but is very sensitive to the effects of drought Drought is abiotic stress reduces the yield and quality of soybean seeds To against drought stress, soybean plants synthesize the proteins, including transcription factors that activate functional genes Dehydration responsive element binding protein subfamily in soybean of the AP2 family is a transcription factor that activates the expression of drought-induced genes, increases tolerance to drought stress in soybean plants
Enhancing GmDREB gene expression is technological solution in order to improve the drought tolerance of soybean, which GmDREB gene isolation is important engineering to create genetic material for transgenic technicque In this study, gene GmDREB6 (cDNA) was amplified and cloned from mRNA of soybean DT2008 The coding region of GmDREB6 gene isolated from
DT2008 soybean cultivar was 693 nucleotides in length, encoding 230 amino acids, a difference in
16 nucleotide positions and 8 amino acid positions in comparison to GmDREB6 gene sequences with codes EF551166, NM_001248412 on GenBank GmDREB6 gene isolated from
drought-resistant DT2008 soybean cultivar was used to design transgenic vector for create transgenic soybean lines with high drought tolerance
Key words: drought tolerance, AP2 region, Glycine max, GmDREB6 gene, transcription factor
Ngày nhận bài: 19/10/2018; Ngày phản biện: 25/10/2018; Ngày duyệt đăng: 31/10/2018
*
Tel: 0913 383289; Email: chuhoangmau@tnu.edu.vn