(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu(Khóa luận tốt nghiệp) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

LÊ MAI HƯƠNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Thực phẩm

Khóa học: 2016 - 2020

Thái Nguyên, năm 2020

LÊ MAI HƯƠNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Công nghệ Thực phẩm

Khóa học: 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS Lương Hùng Tiến

Thái Nguyên, năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu

từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu” là nội dung em

chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm theo học chương trình

đai học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông lâm Thái

Nguyên

Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, đầu tiên em xin chân thành gửi

lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến toàn bộ quý thầy cô Trường Đại học Nông

lâm Thái Nguyên, cùng với quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực

phẩm đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt bốn năm học

tập và rèn luyện tại trường

Sáu tháng thực tập là cơ hội cho em tổng hợp thêm và hệ thống hóa lại những

kiến thức đã học, đồng thời kết hợp với thực tế để nâng cao kiến thức chuyên môn

đã gặp phải rất nhiều khó khăn nhưng với sự giúp đỡ tận tình của thầy TS Lương

Hùng Tiến đã giúp em có được những kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt kì thực

tập này cũng như viết lên bài báo cáo hoàn chỉnh nhất Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc

nhất đến giáo viên hướng dẫn em - thầy TS Lương Hùng Tiến, người đã nhiệt tình

giúp đỡ, hướng dẫn em thực hiện bài báo cáo này

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô ThS Phạm Thị Phương đã

tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học cho em

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên,

giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình

Với việc hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn nên bài khóa

luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý

báu của các Thầy Cô và các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm 2020

Sinh viên

DANH MỤC VIẾT TẮT

EHEC Enterohaemorrhagic E.coli

MRSA Methicillin resistance Staphulococcus aureus

TSST Toxic shock syndromme toxin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không 4

Bảng 2.2 Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi 5

Bảng 2.3 Phân loại của Staphylococcus aureus 18

Bảng 2.4 Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng 22

Bảng 2.5 Phân loại Escherichia coli 26

Bảng 2.6 Phân loại Salmonella 31

Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng 35

Bảng 3.2 Danh mục hóa chất sử dụng 35

Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu 39

Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng tinh dầu từ lá Trầu không 40

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu 42

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 44

Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết dến hàm lượng tinh dầu 45

Bảng 4.4 Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết tinh dầu từ lá Trầu không 46

Bảng 4.5 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết tinh dầu từ lá Trầu không 47

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tinh dầu đến khả năng kháng khuẩn 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây Trầu không 4

Hình 2.2 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 19

Hình 2.3 Trực khuẩn Escherichia coli 27

Hình 2.4 Tụ cầu khuẩn Salmonella 32

Hình 4.1 Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu lá Trầu không 48

Hình 4.2 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu của hàm lượng tinh dầu lá Trầu không 48 Hình 4.3 Kích thước vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm 50

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn dề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về Trầu không 4

2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không 4

2.1.2 Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không 5

2.1.3 Một số nghiên cứu về trầu không 6

2.2 Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật 10

2.2.1 Khái niệm và mục đích của chiết 10

2.2.2 Các phương pháp tách chiết 10

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 12

2.3.1 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu 12

2.3.2 Những yếu tố thuộc về dung môi 14

2.3.3 Những yếu tố thuộc về kỹ thuật 15

2.4 Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm 17

2.4.1 Tổng quan về Staphylococus aureus (S aureus) 17

2.4.2 Tổng quan về Escherichia coli (E coli) 25

2.4.3 Tổng quan về Salmonella (Sal) 30

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 35

3.1 Vật liệu nghiên cứu 35

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 36

3.3 Nội dung nghiên cứu 36

3.4 Phương pháp nghiên cứu 36

3.4.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 36

3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III 36

3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 41

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không 42

4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu 42

4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 43

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu 45

4.1.4 Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không 46

4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không 48

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn dề

Cây Trầu không có tên khoa học là Piper betle L thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae),

là một trong những loài thực vật nhiệt đới quan trọng ở khu vực châu Á, được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Sri Lanka, Malaysia, Thái Lan, … Tên thường gọi của nó là Trầu (tiếng Việt) Betle (tiếng Anh), Paan (tiếng Ấn Độ), Phlu (tiếng Thái) và Sirih (tiếng Bahasa Indonesia) [33] Lá trầu được nghiên cứu cho thấy trong lá có chứa một số chất dễ bay hơi [35], khoáng chất [30], glycosid [26], enzym, vitamin, các axit amin thiết yếu [21] và tanin [34] Dịch chiết của lá Trầu không có các chất kháng khuẩn, kháng viêm và chống ung thư [31] Các đặc tính chống oxy hóa và chống viêm của

lá trầu được cho là do các thành phần hóa học khác nhau có trong lá Lá trầu mà có hàm lượng phenol và flavonoid càng cao thì có hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư càng cao [36,32] Chống lở loét cũng là do hàm lượng flavonoid trong lá trầu cao Người ta đã thấy rằng khi chiết tách tinh dầu có trong lá Trầu có khả năng chữa lành vết loét dạ dày [35] Còn ở nước ta, trong y học cổ truyền Việt Nam, lá trầu được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như nhai trầu để chắc răng, chữa viêm mủ chân răng, nước sắc lá trầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm,

lá trầu ngâm trong nước sôi dùng nhỏ mắt để chữa bệnh viêm kết mạc [10] Ở Việt Nam PGS.TS Nguyễn Quang Linh cùng các cộng sự ở Khoa Thủy sản – Đại học Nông Lâm Huế chế tạo ra hợp chất Bokashi Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các

vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là Eugenol, Chavicol, Estradiol, Cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm

Lactobacillus Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường

vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường, không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản; khi ao nuôi tôm được bổ sung chế phẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được bổ sung Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở

nồng độ 7,5 ppm có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn: Vibrio, Aeromonas, E coli,

Coliform, Staphylococcus Còn ở nồng độ 5.000 ppm đến 10.000 ppm có khả năng

ức chế các nấm: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng:

Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi

trầu có khả năng ức chế nấm Lagenium và Fusarium Còn kết quả nghiên cứu của các

nhà khoa học Trường đại học Cần Thơ cho thấy, tinh dầu lá Trầu không biểu hiện

hoạt tính kháng vi sinh vật tốt Nó có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương như

Bacillus subtillis và các loại nấm gây hại như Aspergillus niger và Fusarium oxysporum Kết quả này cho thấy tiềm năng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu

lá Trầu không có thể ứng dụng được vào thực tế

Qua các nghiên cứu cho ta thấy khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho tác dụng điều trị các bệnh do nhiễm khuẩn và nấm của tinh dầu Trầu không, đồng thời tinh dầu Trầu không có giá trị kinh tế cao, là mặt hàng hiện đang có nhu cầu lớn trên thị trường vì được sử dụng rất nhiều trong

mỹ phẩm, trong y học và cả ngành nông nghiệp Đồng thời bước đầu được sử dụng trong thủy hải sản

Xuất phát từ thực trạng trên em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu các

yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu”

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu

- Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Đề tài động viên khích lệ sinh viên tham gia công tác nghiên cứu khoa học

- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế, củng

cố các kiến thức đã học

- Bổ sung kiến thức thông qua hoạt động nghiên cứu thực tiễn, trau dồi kiến thức bản thân, tích lũy kinh nghiệm thực tế, đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho công việc nghiên cứu và công tác sau này

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Là cơ sở cho các thử nghiệm sử dụng các hoạt chất có tính kháng khuẩn sử dụng trong y học, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của

lá Trầu không

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Trầu không

2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không

Vị trí phân loại thực vật [10]: Trầu không còn có tên gọi khác là cây trầu, trầu

cay, trầu thược tương, trầu mòlu (Campuchia)

Bảng 2.1 Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không [10]

Hình 2.1 Cây Trầu không

Đặc điểm thực vật học: Trầu không là một cây mọc leo, thân nhẵn Lá mọc so

le, cuống có bẹ, dài 1,5 - 3,5cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 - 13cm, rộng 4,59cm,

phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lên thấy rất nhiều

điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường có năm gân Hoa khác gốc mọc thành bông

có cuống dài bằng cuống lá, mọc đối diện với lá, hoa đơn tính Bông đực dài bằng

phiến lá, trục bông phủ lông, lá bắc không cuống, không có lông, hình tròn hoặc hình

trứng ngược Nhị hoa, bao phấn hình bầu dục, chỉ nhị ngắn Bông cái ngắn hơn, trục

phủ lông [4] Quả mọng, lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh Toàn cây có mùi thơm

cay

Phân bố và thu hái: Cây Trầu được trồng khắp nơi ở nước ta để lấy lá, ăn trầu

Chúng còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á, vùng nhiệt đới như Indonexia,

Philipin [10] Ở Việt Nam có 2 loại trầu chính là trầu mỡ và trầu quế Lá trầu mỡ to

bản, dễ trồng Trầu quế có vị cay, nhỏ lá, được ưa chuộng hơn trong tục ăn trầu Trầu không được trồng bằng dây vào mùa xuân, người ta làm giàn cho cây leo lên Cây

để thuận tiện cho việc tưới và bón thêm vôi cũ Lá được hái thu hái quanh năm, dùng tươi hay phơi khô, có khi tán bột dùng dần [3]

2.1.2 Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không

Theo phân tích, cứ 100g lá Trầu không thì có đến 85,4% độ ẩm, 3,1% protein, 0,8% chất béo, 2,3% muối khoáng, 2,3% chất xơ và 6,1% carbohydrat Hàm lượng khoáng chất và vitamin chủ yếu là canxi, carotene, thiamin, riboflavin, niacin và vitamin C [3] Trong lá trầu không có 0,8 - 1,8%, có khi đến 2,4% tinh dầu, tỷ trọng

0,958 thơm mùi creozot (củi đốt), vị nóng [3] Theo Phạm Thế Chính và cs [5] tinh

dầu lá trầu có chứa các hợp chất như là eugenol, eugeny acetat, chavicol và diacetoxylbenzen, các hợp chất này đều là dẫn xuất của phenol, có nhiệt độ sôi cao,

tỷ trọng và chiết suất cao

Bảng 2.2 Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi [3]

Nguồn: Từ điển thực vật 2, 2004

Công dụng của lá Trầu không: Ngoài công dụng để ăn trầu (lá Trầu không, vôi tôi, cau và vỏ cây), dân gian còn dùng nước lá trầu để sát trùng, chống lở loét, chống

viêm nhiễm… [3] Các hợp chất polyphenol trong lá trầu có khả năng chống oxi hóa cao, ức chế một số nguyên nhân gây bệnh loét dạ dày Nước pha lá trầu không còn được dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, chữa bệnh chàm mặt của trẻ em

Có nơi còn giã lá trầu không đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú để chữa bệnh tắc sữa [3] Trầu không còn có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các vi trùng:

tụ cầu, Subtilit và trực trùng E coli [18]

Một số bài thuốc dân gian từ Trầu không [4]

Bài thuốc chữa đau họng: Khi đau họng, dùng trầu không sẽ rất có công hiệu

Lấy lá trầu không và ít hoa quả xay nhuyễn lấy nước trộn thêm mật ong rồi ngậm thật

lâu, nếu uống được thì càng tốt, sẽ giảm các kích thích gây ho

Bỏng nước sôi: Lá trầu hơ nhẹ để lá mềm ra rồi phết một lớp thầu dầu rồi đặt nhẹ lên vết bỏng Cứ sau vài giờ lại thay một lá trầu mới Sau vài lần, dịch trong vết bỏng sẽ tiêu hết, chỗ rộp không mọng nước, không gây mủ Nên dùng vào ban đêm

và vứt đi vào sáng sớm

Chữa đau mắt đỏ (viêm kết mạc): Lấy ba lá trầu không, năm đến mười lá dâu

vò nát, cho vào ca, đổ ngập nước sôi để xông hơi con mắt đau Xông mỗi lần 5 - 10 phút, ngày 2 lần Thuốc giúp chóng hết viêm, mắt dịu

Rửa vết thương, vết bỏng bị nhiễm khuẩn: Lá trầu không và phèn đen mỗi thứ 20g vò nát hoặc giã nát, đổ 1,5lít nước, sắc lấy 1lít, rửa tại chỗ ngày 1lần

Ngoài ra Trầu không còn có tác dụng tăng sinh lực, làm sạch răng và làm ngọt miệng

2.1.3 Một số nghiên cứu về trầu không

2.1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Dưới tên gọi Bokashi Trầu, chế phẩm sinh học chiết xuất từ lá Trầu không của Trung tâm ươm tạo và chuyển giao công nghệ - Đại học Huế đã được Hội sở hữu trí tuệ Việt Nam trao giấy chứng nhận sản phẩm tin cậy PGS.TS Nguyễn Quang Linh, chủ nhiệm đề tài cho biết, lá trầu sau thu hái được làm sạch, làm khô nước và xay nhuyễn, ly tâm lấy được dịch chiết xuất lá Trầu Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là eugenol, chavicol,

estradiol, cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm lactobacillus

Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường, không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản Khi ao nuôi tôm được bổ sung chế phẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được bổ sung Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở nồng độ 7,5 ppm

có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Vibrio, Aeromonas, E coli, Coliform,

Staphylococcus Bokashi trầu ở nồng độ 5.000 đến 10.000 ppm có khả năng ức chế

các nấm Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng Zoothamnium,

Epistylis, Vorticella, Gregarine Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả năng

ức chế nấm Lagenium và Fusarium

Phạm Thị Thắm và cộng sự đã phân lập các hợp chất trong thân cây Trầu không, kết quả thu được cho thấy các lớp chất trong thân cây Trầu không đã được phân lập lớp thành 3 chất có độ phân cực khác nhau nhờ sử dụng dung môi chiết theo độ phân cực tăng dần Lớp chất kém phân cực được phân bố vào dung môi chiết n-hexan (cặn chiết H), lớp chất có độ phân cực trung bình được phân bố vào dung môi diclometan (cặn chiết D), cặn chiết có độ phân cực cao được phân bố trong dung môi etyl acetat (cặn chiết E) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết H, D, E đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy hai cặn chiết D và E có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Nguyễn Chí Thiện và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng

vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae) Tinh

dầu lá trầu không được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đạt hiệu suất 0,63% Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá Trầu không được xác định là hợp chất 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene với hàm lượng 34,55% Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Phạm Thế Chính với bài báo “Thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu (Piper

betle L.) trồng tại Hải Dương” Trong thí nghiệm sử dụng phương pháp chưng cất lôi

cuốn hơi nước đặc biệt có hiệu ứng muối kết hợp với đun hồi lưu, đã tách thành công tinh dầu lá trầu được trồng tại Hải Dương với hiệu suất đạt 1,01% Tinh lá trầu tách được có tỷ trọng cao là 0,963 và chiết suất lớn là 1,5362 Bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS), họ đã khẳng định tinh dầu lá trầu trồng tại Hải Dương

có thành phần hóa học chính là eugenol, với hàm lượng lên tới 77,24% Từ tinh dầu này họ đã sử dụng phương pháp sắc ký cột thường nhồi bằng silica gel theo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat, 10/1…; đã phân lập được eugenol tinh khiết và đã khẳng định được cấu trúc của nó bằng các phương pháp phổ hiện đại IR, MS, 1H&13C-NMR

2.1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Theo nghiên cứu “Steam and Water Distillation of Piper Betle, Ocimum Basilicum, Cymbopogon Winterianus, and Citrus Hystrix Leaves for Activity of Insect Repellent against Mosquito” của tác giả Engrid Juni Astuti cho thấy lá trầu, lá

số chất có hoạt tính đuổi muỗi như DEET Mục tiêu của đề tài: Để có được loại đuổi muỗi tự nhiên từ tinh dầu Phương pháp: Chưng cất hơi nước để thu được tinh dầu, GC-MS để biết hàm lượng hóa học của nó Thử nghiệm hoạt tính dễ bay hơi của tinh

dầu đối với côn trùng trong các nồng độ khác nhau để chống muỗi vằn (Aedes aegypti)

sử dụng với đối tượng là chuột trong 6 giờ Kết quả: Chưng cất hơi nước và nước thu được dầu với 0,56% v / b (lá trầu), 0,33% v / b (lá húng quế), 1,7025% (lá sả đỏ) và 0,693% (lá chanh) Trong của tinh dầu của lá trầu GC-MS Piper chứa các hợp chất 4-Allylphenyl acetate (19,284%) và C10H12O2 (Trans-isoeugenol) (18,485%), tinh dầu của lá húng quế chứa hợp chất z-citral (54,201%), tinh dầu lá sả đỏ chứa các hợp chất

C10H18O (Citronellal) (35,843%) và tinh dầu của lá chanh chứa C10H18O Citronellal (66,550%) Kết quả của thí nghiệm này cho thấy rằng sự kết hợp giữa tinh dầu lá Trầu không và tinh dầu lá Húng quế có hoạt tính đuổi côn trùng không khác với DEET 13%, ngoại trừ nồng độ thấp hơn 50:50 Trong khi sự kết hợp của tinh dầu lá Sả đỏ

và tinh dầu lá chanh cho thấy có sự khác biệt về bảo vệ giữa các nhóm điều trị và có

sự khác biệt về bảo vệ ở khoảng thời gian thử nghiệm vì giá trị p <0,05 Kết luận: Sự

kết hợp của 2 lá: lá Trầu không và lá Húng quế hoặc lá Sả đỏ và lá chanh có khả năng như một loại thuốc chống côn trùng tự nhiên thay thế DEET [23]

Trong nghiên cứu này, tinh dầu được chiết tách từ 7 loại lá trầu khác nhau tại các tỉnh địa phương khác nhau (Bangla, Bagerhati, Manikdanga, Meetha, Kalibangla, Chhaanchi và Ghanagete) với mục đích cho thấy các loại giống khác nhau thì có các thành phần hóa học và có tính chất ức chế enzyme của các loại là khác nhau Các loại tinh dầu này ức chế glucuronidase, liên quan đến bài tiết xenobamel, và cho thấy các đặc tính gây độc tế bào Nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng tiềm năng của tinh

dầu lá Trầu không (Piper betle L.) trong lĩnh vực y tế và mỹ phẩm [35]

Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới các đặc tính chống oxy hóa và

chống viêm của việc chiết tách lá Trầu không (Piper betle L.) đã được nghiên cứu

Các dung môi được sử dụng là nước, ethanol, ethyl acetate và hexane Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng để xác định cấu hình hóa học và nồng độ của các hợp chất có trong lá trầu không, cụ thể là hydroxychavicol (HC) và eugenol (EU) Khả năng chống oxy hóa của các chất có trong lá Trầu không được đánh giá bằng cách sử dụng hai xét nghiệm quét gốc superoxide-xanthine / xanthine oxyase superoxide (xét nghiệm SOD) và xét nghiệm diệt gốc tự do 1,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Các xét nghiệm chống viêm được sử dụng là các xét nghiệm

ức chế hyaluronidase (HYA), xanthine oxyase (XOD) và lipoxygenase (LOX) Kết quả HPLC cho thấy HC và EU được phát hiện trong tất cả các loại dung môi chiết nhưng nồng độ cao nhất là trong nước Năng suất chiết cao nhất thu được bằng cách

sử dụng nước Tất cả các dung dịch chiết đều có khả năng chống oxy hóa cao nhưng với việc chiết bằng nước cho thấy sự ức chế là mạnh nhất Các chất có trong dịch chiết cũng thể hiện sự ức chế đáng kể trong các xét nghiệm XOD và LOX Kết quả chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của dung dịch chiết có liên quan đến HC và EU [36]

2.2 Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: [16]

2.2.1 Khái niệm và mục đích của chiết

Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng với một pha lỏng không hòa tan với nó

Mục đích của chiết: là chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của các chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên

2.2.2 Các phương pháp tách chiết

Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước:

Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đều bay hơi Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất của môi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước

Ưu điểm: Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản Trong quá trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng tụ từng phần theo thời gian Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng 6 - 10 giờ, nếu thực hiện liên tục thì mất 30 phút đến 1 giờ Có thể tiến hành chưng cất với các cấu tử chịu được nhiệt độ cao

Nhược điểm: Không áp dụng phương pháp này với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng

tụ Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủy phân Không có khả năng tách các thành phần khó bay hơi trong các thành phần của nguyên liệu Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn

Tách chiết bằng dung môi:

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp

để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng

thích hợp ở nhiệt độ phòng Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi do chênh lệch nồng độ Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suất thấp để thu

tinh dầu

Yêu cầu của dung môi chiết: Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi Không tương tác hóa học với tinh dầu Có khả năng thu hồi tái sử dụng Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan tinh dầu của dung môi Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người Khi bay hơi dung môi không

để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm

Tách chiết bằng soxlet: Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu

dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần

liên tục và tiết kiệm dung môi Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14), diclometan (CH2Cl2), etanol (C2H5OH)

Chiết ngâm: Là phương pháp ngâm dược liệu với một loại dung môi với vài ba

lần lắc hoặc khuấy ở nhiệt độ phòng Gồm: phương pháp ngâm một lần, ngâm nhiều lần và ngâm nóng Đây là phương pháp phổ biển trong các phương pháp tách chiết thực vật vì đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền

Phương pháp ngấm kiệt: Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách

thường xuyên tách các chất chiết ra khỏi nguyên liệu Phương pháp này thường xuyên dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian

Chiết siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất Chiết

siêu âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000Hz Dùng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa hai pha

bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp

Chiết xuất ngược dòng: Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di

chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất là phương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan của dung môi Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạt chất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùng làm dung môi chiết cho các bình tiếp theo

Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn: Thay vì sử dụng các loại dung môi

hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước

ở trạng thái siêu tới hạn (3740C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng,

hệ hai pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có

độ tinh khiết, có màu sắc và hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các phương pháp chiết khác

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: [16]

2.3.1 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu

Màng tế bào dược liệu

Màng tế bào dược liệu có ảnh hưởng nhiều đến quá trình khuếch tán

Đối với thực vật còn non hay mỏng mềm như cỏ cây, hoa lá, thành phần của màng tế bào chủ yếu là cellulose Cellulose có tính chất không tan trong nước và không tan trong các dung môi khác, bền vững ở nhiệt độ cao, có tính mềm dẻo đàn hồi Đối với dược liệu loại này, dung môi dễ thấm vào dược liệu, do đó chỉ cần xay

thô dược liệu Nếu xay mịn, dễ kéo theo nhiều tạp vào dịch chiết

Đối với dược liệu đã già, rắn chắc như hạt, gỗ, rễ, vỏ thân thì màng tế bào có thể bị hóa bần, hoá cutin, hoặc có thể bị phủ thêm một lớp sáp đó là những chất có bản chất lipid, có tính chất không thấm nước và khí, do đó dung môi khó thấm vào dược liệu Một số loài thực vật khi già màng tế bào có thể bị hoá gỗ, hoá khoáng, bị phủ thêm lớp dioxyt silic hoặc canxi carbonat, màng tế bào trở nên dày, rắn chắc, nên

dung môi khó thấm vào dược liệu hoặc màng tế bào có thể bị phủ thêm lớp chất nhầy Chất nhầy tan được trong nước, nhưng khi hút nước nó bị trương nở và trở nên nhớt, làm bít kín các ống mao quản trên màng tế bào, gây cản trở sự thấm của dung môi, cản trở quá trình khuếch tán Do đó với những dược liệu đã già, rắn chắc, nên xay nhỏ dược liệu, tạo điều kiện cho dung môi dễ thấm ướt dược liệu, chất tan dễ khuếch tán vào dung môi

Chất nguyên sinh

Chất nguyên sinh có thành phần hoá học rất phức tạp và không ổn định Chất nguyên sinh có tính nhớt, tính đàn hồi, không tan trong nước, không màu và không bền đối với nhiệt ở nhiệt độ 50 - 600C, chúng bị mất hoạt tính sinh học (trừ trường

thể nói chất nguyên sinh là một môi trường dị thể phức tạp, có thể coi đó là một hệ keo nhiều pha, tạo thành từ những hợp chất cao phân tử, phân tán trong môi trường nước (ví dụ: giọt dầu, giọt mỡ, hạt tinh bột, hạt tinh thể ) Chất nguyên sinh có tính chất bán thấm, có nghĩa là chỉ thấm đối với dung môi mà không cho chất tan đi qua

Do đó để chiết được các chất tan trong tế bào, người ta phải tìm cách phá huỷ chất nguyên sinh bằng cách làm đông vón chúng bằng nhiệt (sấy hoặc phơi khô) hoặc bằng

cồn (hơi hoặc cồn nóng)

Một số tạp chất có thể có trong dược liệu

Đó là sản phẩm của các quá trình trao đổi chất, là chất dự trữ hoặc chất thải của cây Các chất này thường gây cản trở hoặc cũng có khi có tác dụng thuận lợi cho quá trình chiết xuất Dưới đây là một số ví dụ:

Đối với những dược liệu chứa nhiều pectin, gôm hoặc chất nhầy: Đó là những chất tan được trong nước, và khi tan trong nước thì bị trương nở, tạo dung dịch keo, làm tăng độ nhớt, gây cản trở cho quá trình chiết xuất Có thể loại các chất này bằng cách cho kết tủa trong cồn cao độ

Đối với những dược liệu chứa nhiều tinh bột: Tinh bột có tính chất không tan trong nước lạnh, nhưng ở nhiệt độ cao tinh bột bị hồ hoá, làm tăng độ nhớt của dung dịch, gây cản trở cho quá trình chiết xuất Do đó đối với những dược liệu loại này,

không nên xay dược liệu quá mịn, tránh giải phóng ra nhiều tinh bột và không nên chiết ở nhiệt độ cao để tránh bị hồ hoá

Đối với những dược liệu chứa chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp, nhựa: Đó là những chất không tan trong nước và thường tan trong các dung môi không phân cực Nếu dùng dung môi chiết là nước, các chất này sẽ làm dung môi khó thấm vào dược liệu, gây cản trở quá trình chiết xuất, do đó cần phải loại chúng đi bằng các dung môi thích hợp trước khi chiết Nếu dùng dung môi không phân cực để chiết, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, những tạp này sẽ bị loại đi trong giai đoạn tinh chế

Đối với những dược liệu chứa enzym: Enzym có bản chất là protein, ở nhiệt độ

60 - 700C enzyme bị mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ lạnh enzym chỉ bị ngừng hoạt động, sau đó nếu nâng đến nhiệt độ thích hợp thì enzym lại được phục hồi Tuỳ từng trường hợp cụ thể mà enzym có thể gây cản trở hoặc cũng có khi lại tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất

Có ba phương pháp để diệt enzym:

Phương pháp nhiệt ướt: nhúng dược liệu vào lỏng sôi (nước sôi hoặc cồn sôi) Phương pháp nhiệt ẩm: cho dược liệu qua hơi ẩm (hơi nước sôi hay hơi cồn sôi) Phương pháp nhiệt khô: cho dược liệu qua luồng không khí nóng

2.3.2 Những yếu tố thuộc về dung môi

Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

Độ phân cực của dung môi

Nói chung dung môi ít phân cực thì dễ hoà tan các chất không phân cực và khó hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hoà tan các chất ít phân cực

Dựa vào độ phân cực của dung môi người ta phân loại như sau:

Dung môi không phân cực: ether dầu hoả, xăng, hexan, heptan, benzen, toluen…

Dung môi phân cực yếu và vừa: chloroform, diclorethan, aceton, ethylacetat

Dung môi phân cực mạnh: nước, glycerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn

(methanol, ethanol, isopropanol )

Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi

Nói chung, dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất còn nếu dung môi có độ nhớt càng cao hoặc có sức căng bề mặt càng lớn thì dung môi khó thấm vào dược liệu, làm cho quá trinh chiết xuất gặp khó khăn

2.3.3 Những yếu tố thuộc về kỹ thuật

Đó là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm tạo ra những điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất

Đó có thể là những yếu tố: nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn,

siêu âm

Nhiệt độ chiết xuất

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:

Đối với những hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá

huỷ một số hoạt chất như vitamin, glycosit, alcaloit

Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà độ tan của tạp cũng đồng thời tăng theo, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một

số tạp như gôm, chất nhầy khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở; tinh bột bị hồ hoá, độ

nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hoà tan toả nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng lại bị giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên ta thấy tuỳ từng trường hợp cụ thể mà cần lựa chọn nhiệt độ sao cho phù hợp (tuỳ thuộc vào các yếu tố như dược liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất )

Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ được hoà tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo ) Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết được hết hoạt chất trong dược liệu; nhưng nếu thời gian chiết dài quá, dịch chiết

sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần phải lựa chọn thời gian chiết xuất sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi,

phương pháp chiết xuất

Độ mịn của dược liệu

Khi kích thước dược liệu thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt dược liệu, hoạt chất khó được chiết vào dung môi Khi độ mịn dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa dược liệu và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuất sẽ nhanh hơn

Tuy nhiên trong thực tế, nếu xay dược liệu quá mịn sẽ gây ra một số bất lợi cho quá trình chiết xuất như sau:

Khi ngâm dược liệu vào dung môi, bột dược liệu bị dính bết vào nhau, tạo thành dạng bột nhão, vón cục Do đó sẽ khó khuấy trộn giữa dược liệu và dung môi, quá trình chiết xuất xảy ra bị chậm lại Mặt khác, vì bột dược liệu bị dính bết vào nhau nên khi rút dịch chiết, dịch chiết bị chảy chậm hoặc không chảy được (gọi là hiện tượng tắc thiết bị)

Khi bột dược liệu quá mịn, nhiều tế bào thực vật bị phá huỷ, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp; gây khó khăn cho quá trình tinh chế, bảo quản

Từ những phân tích trên ta thấy cần phải lựa chọn độ mịn của dược liệu sao cho thích hợp, tuỳ thuộc vào từng trường hợp hợp cụ thể, tuỳ thuộc vào dược liệu, dung

môi, phương pháp chiết xuất

Khuấy trộn

Khi dung môi tiếp xúc với dược liệu, dung môi sẽ thấm vào dược liệu, hoà tan chất tan, chất tan sẽ khuếch tán từ dược liệu vào dung môi qua màng tế bào Sau một thời gian khuếch tán, nồng độ chất tan trong tế bào giảm dần, nồng độ chất tan trong lớp dung môi tăng dần, chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào giảm dần, tốc

độ quá trình khuếch tán cũng giảm dần, đến một lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cân bằng động giữa hai pha Như vậy, nếu không có khuấy trộn, quá trình khuếch tán sẽ xảy ra rất chậm Theo định luật Fick, chênh lệch nồng độ giữa hai pha là động lực của quá trình khuếch tán

Do đó muốn tăng cường quá trình khuếch tán, cần phải tạo ra chênh lệch nồng

độ bằng cách di chuyển lớp dịch chiết ở phía sát màng tế bào (nơi có nồng độ cao hơn) ra phía xa hơn và di chuyển lớp dung môi ở phía xa (nơi có nồng độ thấp hơn) đến sát màng tế bào Điều này được thực hiện bằng cách khuấy trộn Như vậy bằng cách khuấy trộn, người ta đã tăng cường được tốc độ khuếch tán

Tuỳ từng trường hợp cụ thể mà người ta chọn loại cấu tạo cánh khuấy và tốc độ khuấy sao cho phù hợp

Siêu âm

Năng lượng của siêu âm có tác dụng làm tăng mạnh tính thẩm thấu và khuếch tán nhờ những tác dụng của siêu âm như sau: Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ Phá vỡ một phần màng tế bào Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp Có tác dụng làm nóng tại chỗ

Phương pháp siêu âm có nhiều ưu điểm làm tăng cường quá trình chiết xuất Tuy nhiên, phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà chưa được áp dụng trong sản xuất

Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất Ví dụ: áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điện cao áp

…

2.4 Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm

2.4.1 Tổng quan về Staphylococus aureus (S aureus)

2.4.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Staphylococus aureus (S aureus) do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào

năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) nghiên cứu tụ cầu khuẩn

từ thời kì đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học [1]

Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày

tại hội nghị lần thứ 9 của Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử

dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (S aureus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi

khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng

Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi

khuẩn này Ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là S aureus Năm 1926 Julius von

Daranyi là người đầu tiên phát hiện ra mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy

nhiên mãi đến năm 1984, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi [1]

Phân loại S aureus theo khoa học [1]:

Bảng 2.3 Phân loại của Staphylococcus aureus

Phương pháp phân loại dựa vào kháng nguyên: Các tụ cầu khuẩn có nhiều

loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic

Acid teichoic: Là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác

dụng hoạt hóa bổ thể Đây còn là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi Acid này gắn vào polysaccharid vách tụ cầu vàng Đây là thành phần đặc hiệu của kháng nguyên O

Protein A: Là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu

chuẩn để xác định tụ cầu vàng 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này Sở dĩ kháng nguyên này mang tên protein A, vì protein này gắn được phần Fc của IgG Điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu là mất đi opsonin hóa (opsonisation), nên làm giảm thực bào

Vỏ polysaccharid: Một số ít chủng S aureus có vỏ và có thể quan sát được

bằng phương pháp nhuộm vỏ Lớp vỏ này bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên

và có thể chứng minh được bằng phương pháp huyết thanh học Kháng nguyên adherin (yếu tố bám), giống như nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặc hiệu, có tác dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào Adherin có thể là các protein: laminin, fibronectin, colagen

Phương pháp phân loại bằng phage (phage typing): Các phương pháp phân

loại dựa trên kháng nguyên của tụ cầu là rất khó khăn, vì vậy việc phân loại tụ cầu vàng chủ yếu dựa trên phage Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính đặc hiệu

rất cao Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong phân loại S aureus, vì đây là

vi khuẩn gây nhiễm trung nhiều nhất trên người

2.4.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn S aureus

Là loại cầu khuẩn, Gram dương, có đường kính khoảng 0,8 - 1µm Các tế bào thường liên kết với nhau thành hình chùm nho, không có lông, không nha bào và thường không có vỏ

Hình 2.2 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

Là loại vi khuẩn yếm khí tùy tiện, không di động, không sinh bào tử [1] Là loài

có pH phát triển khá rộng, trong khoảng 4 - 9,8, khoảng pH tối ưu là 6 - 7, bị kìm hãm ở pH < 4,8 Chúng phát triển tốt ở aw = 0,83 - 0,86

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 370C, tuy nhiên chúng là loài chịu nhiệt tốt, có thể tồn tại trong 16h ở 600C và pH = 7,3 Có khả năng sống ở nồng độ muối 9

- 10% Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi

của tụ cầu vàng thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà

vi khuẩn có thể phát triển được

Tụ cầu vàng có khả năng kháng một số kháng sinh như penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen của R-plasmid Một số còn kháng được

methicillin resistance Staphylococcus aureus (viết tắt là MRSA), do nó tạo ra được

các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay một số rất ít tụ cầu còn

đề kháng được với cephalosporin các thế hệ kháng sinh được dùng trong các trường hợp này là vancomycin

Tụ cầu vàng có hệ thống enzyme phong phú, những enzyme được dùng trong chuẩn đoán là coagulase, có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi

đã được chống đông Đây là tiêu chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với các

tụ cầu khác Hoạt động coagulase giống như thrombokiase tạo thành một “áo fibrinogen” trong huyết tương Coagulase có hai loại: Một loại tiết ra môi trường gọi

là coagulase tự do và một loại bám vào vách tế bào gọi là coagulase cố định

Khi phát triển vi khuẩn này có khả năng tạo ra sắc tố từ màu trắng đến màu vàng sạm, nhiệt độ 200C - 250C thích hợp nhất cho chúng tạo màu

Tạo độc tố enterotoxin Nhiệt độ thích hợp cho chúng tạo ra độc tố 70C - 470C, khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình này là 400C - 450C, các độc tố này bền với nhiệt,

Có khả năng phát triển trên nhiều môi trường khác nhau Trên môi trường thạch

tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, có đường kính từ 1 - 2mm, bề mặt nhẵn Khuẩn lạc

máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh tạo tan máu hoàn toàn Trên môi trường canh thang,

tụ cầu vàng làm đục môi trường và nếu để lâu nó có thể lắng cặn Tụ cầu vàng có khả năng chịu được nồng độ muối cao, vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường chứa đến 15% NaCl Nguồn nitơ sử dụng là nguồn acid amine Nếu trong môi trường

có chứa các acid amine như: Arginine, cystine, phenylalanine và các vitamin B3, B5,

B1, H sẽ rất thuận lợi cho S aureus phát triển Vi khuẩn sinh thử nghiệm coagulase, có

khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, saccharose

2.4.1.3 Độc tố S aureus

Tạo enterotoxin chịu nhiệt tốt: Chúng là những chuỗi protein có khối lượng phân

tử thấp khoảng 25000 - 29000 Da Có 6 loại enterotoxin là A, B, C, D, E, F trong đó độc tố B thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng Về miễn dịch

6 loại này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có kháng nguyên chéo Về cơ chế gây bệnh độc tố enterotoxin kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II Xác định enterotoxin bằng các kỹ thuật miễn dịch

Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc (Toxic shock syndromme toxin - TSST): Độc tố gây shock nhiễm độc thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông

dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương Độc tố này khó phân biệt với enterotoxin F của tụ cầu vàng TSST kích thích giải phóng TNF (Tumor Necrosis Factor) yếu tố hoại tử u và các interleukin I, II Cơ chế gây shock của nó tương tự như của nội độc tố

Exfoliatin toxin hay epidermolytic toxin: Đây là một ngoại độc tố Nó gây nên

hội chứng phỏng rộp và chốc lở da (Scaded Skin Syndrome) ở trẻ em Hội chứng này đã được biết khá lâu, nhưng mãi đến năm 1971 người ta mới biết đến exfoliatin Độc tố này được tạo bởi gen của 85% các chủng tụ cầu vàng thuộc loại phage nhóm II

Alphatoxin: Độc tố này gây tan các bạch cầu có nhân đa hình và tiểu cầu, từ đó

gây ra các ổ áp xe, gây ra hoại tử da và tan máu Alphatoxin là một protein trọng lượng phân tử 33000 - 36000 Dalton Nó gắn trên màng tế bào và thể hiện các thuộc tính hoạt động bề mặt Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không

có tác dụng chống nhiễm khuẩn

Độc tố bạch cầu (Leucocidin): Mặc dù một số staphylosyn chứa độc tố bạch

cầu, nhưng chỉ một độc tố tụ cầu thực sự độc với bạch cầu và được coi là leucocidin Độc tố này gây độc cho bạch cầu người và thỏ và không gây độc cho bạch cầu các loại động vật khác Nó cũng có tác dụng hoại tử da thỏ Leucocidin bao gồm 2 mảnh

F và S và có thể tách rời bằng sắc ký in, trọng lượng phân tử là 32000 và 38000

Dalton Nếu tách rời 2 mảng này thì mất tác dụng gây độc

Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): Vào 1979, Schlivent và cộng sự

đã tách biệt được một độc tố từ tụ cầu vàng Về nhiều phương diện, độc tố này tương

tự độc tố sinh mủ của liên cầu Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyt, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm về một số phương diện đối với nội độc tố như gây shock và hoại tử gan và cơ tim Sau đó, người ta đã phân biệt được 3 loại ngoại độc tố sinh mủ, ký kiệu là A, B, C Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử (theo thứ tự: 1200, 1800 và 22000 Dalton) về tính đặc hiệu kháng nguyên nhưng giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào

Dung huyết tố (hemolysin còn gọi là staphylokysin): Tụ cầu vàng sinh ra 4

loại hemlysin có các tính chất khác nhau

Bảng 2.4 Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng

Loại hồng cầu

nhạy cảm

Loại bạch cầu nhạy cảm

Nguồn gốc vi khuẩn

Tác động trên động vật

thí nghiệm

Gây hoại tử da thỏ, gây chết chuột và thỏ, gây độc tế bào nuôi cấy

từng đám tế bào nuôi cấy Thỏ, người, cừu,

Sinh enzyme gây độc cho người: Catalase chuyển hydrogen peroxit thành nước

và oxy, coagulase làm đông huyết tương, hyaluronase làm tan acid hyaluroic giúp vi khuẩn vào cơ thể

2.4.1.4 Bệnh do S aureus

Staphylococcus aureus thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hóa

Có khoảng 40 - 50% người có Staphylococcus aureus ở trong khoang mũi, ngoài ra còn thấy chúng ở quần áo, đồ vật Khi Staphylococcus aureus tiết ra coagulase sẽ làm

thương tổn tạo ra mụn nhọt, làm đông sợi huyết Từ ổ nhiễm chúng có thể xâm nhập vào các nơi khác qua đường máu và có thể gây viêm phổi, viêm màng não, viêm cơ tim, viêm thận, viên tủy xương [13] Do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ áp xe, eczema, hậu bối…Mức

độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn huyết nhất Do chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là các nhiễm khuẩn ngoài da, từ đấy vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết Đây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn huyết,

tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên ổ áp xe (gan, phôi, não, tủy xương ) hoặc viêm nội tâm mạc Có thể gây nên các vêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm trùng khu trú này trở thành viêm mạn tính như viêm xương, Viêm phổi do tụ cầu vàng thường ít gặp Nó chỉ xảy ra sau viêm đường hô hấp do virus (như cúm) hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng, ở trẻ em hoặc những người suy yếu Tỷ lệ tử vong của bệnh này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nặng Ngộ độc thức ăn do phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú

ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn bình thường của đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng thường rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 đến 8 (giờ), bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và điện giải có thể dẫn tới shock

Nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra do tụ cầu khuẩn Đây là trường hợp rất thường gặp nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng…từ đó dẫn tới nhiễm khuẩn huyết Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải dùng tới vancomycin Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao

2.4.1.5 Cách phòng ngừa

Phòng bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu chủ yếu là vệ sinh môi trường, quần áo và thân thể vì tụ cầu có rất nhiều ở những nơi này Đặc biệt là vệ sinh môi trường bệnh viện

để chống nhiễm khuẩn bệnh viện

Rửa tay: Rửa tay đúng cách là một trong những biện pháp phòng ngừa thường hay sử dụng để chống lại các vi trùng

Vết cắt, vết trầy phải luôn được giữ sạch sẽ và được băng kín, khô cho đến khi lành Mủ từ vết loét bị nhiễm trùng có thể chứa vi khuẩn cầu vàng và việc che vết thương sẽ giúp ngăn vi khuẩn lây lan

Giặt quần áo và ga giường bằng nước nóng: Vi khuẩn tụ cầu khuẩn có thể tồn tại trên quần áo và ga giường không được rửa sạch đúng cách

Tránh tiêm thuốc bừa bãi, không theo chỉ định của bác sĩ: Người dùng thuốc tiêm tĩnh mạch có nguy cơ rất cao mắc nhiều loại bệnh nhiễm trùng nguy hiểm bao gồm nhiễm khuẩn do vi khuẩn tụ cầu vàng

Tránh dùng chung vật dụng cá nhân như khăn tắm, khăn trải giường, dao cạo, quần áo và dụng cụ thể thao Nhiễm tụ cầu khuẩn có thể lây lan qua các vật dụng,

vi khuẩn nói chung và tụ cầu vàng nói riêng, không nên tự mua thuốc kháng sinh để điều trị khi chưa có chỉ định của bác sĩ

Đối với đội ngũ bác sĩ khám chữa bệnh cần tuân thủ đúng các quy định sử dụng kháng sinh hợp lý của Bộ Y tế đề ra

Vệ sinh cá nhân thật tốt bằng cách tắm rửa hàng ngày với nước sạch, nhất là trẻ nhỏ bụ bẫm có nhiều nếp kẽ, nếp gấp chứa đựng nhiều mồ hôi, bã nhờn

Cần vệ sinh họng, miệng hàng ngày bằng cách đánh răng và súc họng nước muối nhạt trước khi đi ngủ và sau khi ngủ dậy