hoàn toàn miễn phí cập nhật nhanh chóng chính xác chất lượng hiệu quả đáng tin cậy

Human Genome Projet. 1.4.[r]

Trang 1

Công ngh ệ DNA tái t ổ h ợ p

Nguy ễ n V ũ Phong

• 1972 – 1973:DNA tái tổhợpin vitro từ3 nguồn vật liệu di truyền khác nhau (Berg, Boyer và Cohen)

• 1973 – 1974: DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học (Cohen, Henlinski, Boyer)

Tên gọi:

• Kỹthuật DNA tái tổhợp (DNA recombinant technology)

• Kỹthuật gene (Gene engineering) hay công nghệgene (Genetic technology)

• Thao tác gene (Gene manipulation)

• Tạo dòng phân tử(Molecular cloning)

• Kỹthuật di truyền(Genetic engineering): thao tác với những phần

lớn hơn của bộgene

QUY TRÌNH TIẾN HÀNH

• Bước 1: Nuôi tếbào chủvà tếbào cho

• Bước 2: Tách DNA plasmid và DNA tế

bào cho

• Bước 3: Cắt DNA plasmid và DNA mục

tiêu bằng 1 loại enzyme cắt giới hạn

• Bước 4: Trộn và nối 2 loại DNA bằng

enzyme nối tạo DNA tái tổhợp hoàn

chỉnh

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổhợp vào tế

bào nhận (E coli, nấm men)

• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng tếbào

mang gene tái tổhợp

• Bước 7: Nghiên cứuđiều kiệnđểgene

biểu hiện ra sản phẩm

1 Enzyme

1.1 Enzyme c ắ t gi ớ i h ạ n (Restriction endonuclease enzyme, RE)

- 1962: hạn chếsựsinh sản của phage trong tếbào vi khuẩn

- Hệthống hạn chế- biếnđổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ

tếbào khỏi sựxâm nhập của DNA lạ

Restriction enzyme.swf

1 Enzyme

1.1 Restriction endonuclease enzyme (RE)

- Trình tựnhận biết: gồm 4-6 cặp nuđố i x ứ ng đả o ng ượ c(palindrom)

- Cắt tạo thànhđầu so le (sticky end) hayđầu bằng (cohesive end)

- Khoảng 3000 RE với 230 trình tựnhận biết khác nhau

- EcoRI: Escherichia coliR: dòng vi khuẩnI: thứtựtìm ra (I:đầu tiên)

1 Enzyme

1.2 Enzyme nối (Ligase) Hình thành cầu phosphodiester

gắn các nucleotid kề cận hay chụm cầu với nhau

Trang 2

1 Enzyme

1.3 Enzyme phiên mã ngược

(reverse transcriptase)

• Tổng hợp ợi DNA bổsung

c-DNA (complementary

DNA) từ một sợi mRNA

hoặc từ polyribonucleotide

tổng hợp

• c-DNA có thể tổng hợp

thành c-DNA kép (c-DNA

polymerase c-DNA kép

được dùng trong việc tạo

dòng c-DNA

cDNA.swf

1.4 Các enzyme khác

DNaseI Phân hủy DNA mạch kép bằng phảnứng thủy

phân nội liên kết phosphodiester (Endonuclease) Nuclase BAL31 Phân hủy 2 đầu mút 3’ và 5’ của DNA (Exon

nuclease) S1 nuclease Cắt DNA mạchđơn

Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính exonuclease

3’-5’

Taq polymerase DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn

Thermophilus aquaticus

1 Enzyme

2 Các vector chuy ể n gene

Plasmid:

- DNA vòng tròn

- Sao chép độc lập trong tế bào

- Có khả năng mang một số gene

có khả năng biểu hiện thành

protein

Vector:

- Phân tử DNA có khả năng tự tái bản

- Tồn tại độc lập trong tế bào

- Mang được gene mong muốn

Yêu cầu tối thiểu đối với vector chuyển gene

- Có trình tựkhởiđầu sao chép (ori)

đểtựsao chép mà tồn tạiđộc lập

- Trình tựnhận biết cho RE tạo vết

cắtđểchèn gene lạ

- Trình tự điều hòa (promoter) tạo

điều kiện thuận lợi phiên mã gene

lạ

- Đảm bảo sự di truyền bền vững

của DNA tái tổhợp

- Có geneđánh dấu (marker)đểdễ

dàng nhận biết các gene lạ

Các loại vector chuyển gene

Vector Đặ c đ i ể m Kh ả n ă ng

chèn

Ứ ng d ụ ng

Plasmid Dạng vòng 0,1 – 10kb Procaryote

Phageλ Tự động xâm nhiễm và sinh

sản trong TB vi khuẩn

15 – 23 Kb Lập ngân hàng gene

Cosmid Plasmid + đoạn cos của

phage λ

45kb Lập thưviện gene Phage

M13

DNA mạchđơn Xácđịnh trình tựnu

Sản xuất mẫu dò Gâyđột biếnđiểm

định hướng BAC NST nhân tạo vi khuẩn 50 – 300kb

YAC Vòng tròn 2 micrometre cải

tiến

100-2000kb MAC NST nhân tạođộng vật có vú >2000kb

Ứng dụng của vector chuyển gene

- Tạo dòng và khuyếchđại trình tựDNA (nhiều bản sao)

- Nghiên cứu sựbiểu hiện củađoạn DNA

- Chuyển gene

- Sản xuất RNA

- Sản xuất protein từgeneđược tạo dòng

Hệthống vector chuyển genđược hoàn thiện không ngừng

Trang 3

Plasmid Ti

- 200Kb

- Agrobacterium tumefaciens

- Chuyển gen ở thực vật

- Chuyển và gắn ngẫu nhiên vào bộ gene của tế bào

(Host)

Mục đích:

- Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng

- Biểu hiện gene, đặc biệt ở Eukaryote

- Sản xuất protein tái tổ hợp

3.1 Escherichia coli (E.coli)

- Dễ nuôi cấy và nhân dòng

- Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau

- Vi khuẩn Gram-, hình que,

- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3 H ệ th ố ng t ế bào ch ủ

(Host)

3.2 Saccharomyces cerevisiae

- Eukaryoteđơn bào

- Dễdàng nuôi cấy và thu sinh khối

- Phân lậpđược nhiều promotor hoạtđộng mạnh

- Thực hiện biếnđổi sau dịch mã tạo protein có

đủhoạt tính sinh học

- Sản xuất protein tái tổhợp dễdàng

- Sinh vật an toàn

3.3 Hệ thống tế bào thực vật 3.4 Hệ thống tế bào động vật

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)

- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)

- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney

- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)

- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người

- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

3 H ệ th ố ng t ế bào ch ủ

(Host)

1 Lai nucleic acid

Đặc tínhbi ế n tínhvàh ồ i tínhcó thểlai giữa DNA-DNA, DNA-RNA,

RNA-RNA

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

Southern Blot.swf

2 Thu nh ậ n gene

- Thu nhận DNA từbộ gene

* Shotgun: toàn bộ

DNA của sinh vật

được cắt đoạn nhỏ

bằng cơhọc hay RE

và gắn vào vector tạo dòng

*Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene

(Bank/Library of genomic DNA)

Trang 4

2 Thu nh ậ n gene

- Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học

2 Thu nh ậ n gene

- Lậpngân hàng c-DNA

* Tạo gene từ các mRNA thông tin nhờenzyme phiên

mã ngược

Ư u đ i ể m

- Chứa trình tựmã hóa liên

tục của một gene (không

chứađoạn intron)

3 T ạ o plasmid tái t ổ h ợ p

a) Dùng đầu so le

a) Dùng đầu so le b) Dùng cácđoạn nối (linkers)

a) Dùng đầu so le

b) Dùng cácđoạn nối (linkers)

c) Dùng enzyme terminal transferase

4 Bi ế n n ạ p DNA tái t ổ h ợ p vào t ế bào

a) Hóa bi ế n n ạ p

Trang 5

b) Đ i ệ n bi ế n n ạ p

c) Vi tiêm

d) B ắ n gene

DNA coated golden particles

Gene gun

Cell division

A plant cell with

the new gene

Transgenic plant

Plant cell Cell’s DNA

T ạ o cây chuy ể n gene

5 Ch ọ n l ọ c, t ạ o dòng và s ự bi ể u hi ệ n gene

a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

K ỹ thu ậ t và ph ươ ng pháp c ă n b ả n

Screening.swf

5 Ch ọ n l ọ c, t ạ o dòng và s ự bi ể u hi ệ n gene

b) Sự biểu hiện của gene thành protein

K ỹ thu ậ t và ph ươ ng pháp c ă n b ả n

Trang 6

Ph ả n ứ ng t ạ o chu ỗ i nucleotide

( Polymerase Chain Reaction, PCR)

1985, Kary Mullis

1 Nguyên tắc

PCR.swf

PCR dựa trên 3 bướcởnhiệtđộkhác nhau

1 Biến tính: tạo dâyđơn DNA với nhiệtđộ94oC

2 Bắt cặp: lai giữa primers và DNAđơn Nhiệtđộkhoảng 50oC

3 Kéo dài : tạo dây DNA bổsung với tácđộng của polymerase và dNTPs: 72oC

Lặp lại chu kỳkhoảng 30-40 lần sẽtạo ra sốlượng DNA cần khuếchđạiđủquan sát trên gel qua quá trìnhđiện di

Polymerase Chain Reaction, PCR

2 Thành phần phản ứng

- Primer

- Polymerase chịu nhiệt

- dNTP

- Dung dịch đệm

- Mẫu

- Dung dịch đệm

Sequencing

1 Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert

Sequencing

1 Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert

2 Phương pháp didesoxy của F Sanger

Ứ ng d ụ ng công ngh ệ gene

1 Khai thác DNA các bộ gene

1.1 Genomics:

- Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng

- Phát hiện, bảo tồn sựđa dạng sinh học, sử dụng chúng

1.2 Proteomics

- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến

đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng

(function)

- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh

1.3 Human Genome Projet

1.4 Các ngành học khác

- Cellomics

- Metabolomics

- Ionomics

2 Công nghệ protein tái tổ hợp

-Sản xuất r-protein

th ư ,

2002

4 Hormon t ă ng t ưở ng ng ườ i Thi ể u n ă ng t ă ng tr ưở ng 2003

6 T-PA (tissu plasminogen activator)

COLONY Stimulating Factor

Chemotherapy-induced neutropenia

2006

Trang 7

3 Chẩn đoán phân tử

- Dựa trên phương pháp lai DNA: đặc hiệu, nhạy, chính xác, đơn giản

- DNA marker: chuỗi DNA dùng để phân biệt giữa 2 cá thể, 2 dòng

hoặc 2 giống khác nhau

- Biomarker: dấu chuẩn sinh học

- DNA fingerprinting: dấu vân tay di truyền

- Microarray và Biochips:

4 Vi sinh vật chuyển gene

- Genomics vi sinh vật: giải trình tự hơn 200 loài vsv

- Sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp

- Công nghệ bề mặt tế bào nấm men

5 Thực vật chuyển gene

- Cải thiện giống cây trồng: kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh,

- Tạo giống chống chịu điều kiện khí hậu bất lợi, già hóa

- Tạo sắc tốở các thực vật chuyển gene

- Biến đổi chất lượng thực phẩm cây trồng

- Thực vật sản xuất vaccine, protein trị liệu

- Sản xuất dầu nhờn công nghiệp

- Sản xuất plastid

6 Động vật chuyển gene

- Động vật mang gene người làm mô hình thí nghiệm (bệnh di truyền, ung thư,, thoái hóa cơ, viêm khớp,…)

- Sản xuất protein tái tổ hợp

- Chăn nuôi gene (gene farming)

7 Công nghệ gene đối với sức khỏe con người

Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân

* Nhận dạng từng nhóm bệnh, xác định phương thức điều trị

Pharmacogenomics: (Dược học bộ gene)

Cung cấp cách chữa bệnh an toàn và hiệu quả cho từng cá nhân

Gene therapy:

* Chuyển gen lành thay thế gene sai hỏng

* Thay thế gene

Định dạng
Số trang	7
Dung lượng	1,62 MB