ứng dụng kỹ thuật real time pcr để xác định kiểu gen, lượng virus trong máu và đặc điểm kháng thuốc điều trị của virus viêm gan b trên người bệnh của bệnh viện đa khoa tỉnh đồng tháp và chuyển giao kĩ thuật

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Báo cáo tổng kết ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, LƯỢNG VIRUS TRONG MÁU VÀ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC ĐIỀU

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Báo cáo tổng kết

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, LƯỢNG VIRUS TRONG MÁU VÀ ĐẶC ĐIỂM KHÁNG THUỐC ĐIỀU TRỊ CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN NGƯỜI BỆNH CỦA BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH ĐỒNG THÁP

VÀ CHUYỂN GIAO KĨ THUẬT

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy Thành viên: BS Mai Ngọc Lành

ThS Trương Kim Phượng

CN Hồ Thị Thanh Thủy

TP HỒ CHÍ MINH – 2014

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Tính cấp thiết của đề tài 2

Mục tiêu của đề tài 2

TỔNG QUAN 4

1.1 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới 5

1.2 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B ở Việt Nam 6

1.3 Một số đặc điểm sinh học của virus viêm gan B 7

1.4 Chẩn đoán phân tử trong phát hiện nhiễm HBV 8

1.5 Giới thiệu về phương pháp Real-time PCR 9

1.6 Các thuốc điều trị, hiện tượng kháng thuốc và cách phát hiện 13

1.7 Vấn đề về kiểu gen của HBV 19

VẬT LIỆU –PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 25

2.2 Phương pháp 25

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 27

3.1 Mô tả đặc điểm mẫu nghiên cứu 28

3.2 Xác định mối tương quan giữa các yếu tố lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh 36

3.2.1 Giữa kiểu gen và các yếu tố lâm sàng 37

3.2.2 Giữa tải lượng virus và các yếu tố lâm sàng 37

3.2.3 Giữa đột biến kháng thuốc và các yếu tố lâm sàng 37

3.3 Xác định mối tương quan giữa các yếu tố cận lâm sàng của bệnh với nhau 39

3.3.1 Tác động của kiểu gen lên các yếu tố khác 39

3.3.2 Tác động của đột biến kháng thuốc lên các yếu tố khác 43

3.3.3 Tác động giữa tải lượng virus và chỉ số HbeAg 45

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 50

4.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADV: Adefovir dipivoxil

ALT: Alanine aminotranferase

cccDNA: Covalently closed circular DNA - DNA “vòng đóng cộng hóa trị”

Ct: Threshold cycle - Chu kỳ ngưỡng

HCC: Hepatocellular carcinoma - ung thư biểu mô tế bào gan

LAM: Lamivudine

LDT: Telbivudine

NRTI: Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor - chất ức chế phiên mã ngược nucleoside

NUCs: nucleos(t)ide analogs – chất tương tự nucleos(t)ide

OR: odds ratio - tỷ số chênh

PCR: Polymerase Chain Reaction - phản ứng dây chuyền nhờ polymerase

SPSS: Statistical Package for the Social Sciences

TDF: Tenofovir

VGSVB: Viêm gan siêu vi B

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Đặc điểm lâm sàng 28

Bảng 2 Đặc điểm cận lâm sàng 28

Bảng 3 Mối liên quan giữa kiểu gen và tuổi 36

Bảng 4 Mối liên quan giữa kiểu gen và giới tính 37

Bảng 5 Mối liên quan giữa tải lượng virus và tuổi 37

Bảng 6 Mối liên quan giữa tải lượng virus và giới tính 37

Bảng 7 Mối liên quan giữa đột biến kháng LAM và tuổi 38

Bảng 8 Mối liên quan giữa đột biến kháng LAM và giới tính 38

Bảng 9 Mối liên quan giữa đột biến kháng ADV và tuổi 38

Bảng 10 Mối liên quan giữa đột biến kháng ADV và giới tính 38

Bảng 11 Mối liên quan giữa kiểu gen và HbeAg 39

Bảng 12 Mối liên quan giữa kiểu gen và ALT 39

Bảng 13 Mối liên quan giữa kiểu gen và tải lượng virus 39

Bảng 14 Mối liên quan giữa kiểu gen và tính kháng LAM 40

Bảng 15 Mối liên quan giữa kiểu gen và tính kháng ADV 40

Bảng 16 Mối liên quan giữa đột biến kháng LAM và HbeAg 43

Bảng 17 Mối liên quan giữa đột biến kháng ADV và HbeAg 43

Bảng 18 Mối liên quan giữa đột biến kháng LAM và ALT 44

Bảng 19 Mối liên quan giữa đột biến kháng ADV và ALT 44

Bảng 20 Mối liên quan giữa đột biến kháng LAM và tải lượng virus 44

Bảng 21 Mối liên quan giữa đột biến kháng ADV và tải lượng virus 45

Bảng 22 Mối liên quan giữa tải lượng virus và HbeAg 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính trên toàn thế giới 5

Hình 2: Cấu trúc của virus viêm gan B 7

Hình 3: Cấu trúc bộ gen của HBV 8

Hình 4 Đồ thị khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang 11

Hình 5: Đồ thị minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít VA.A02-001D 13

Hình 6 Cấu tạo phân tử Lamivudine 15

Hình 7 Mô hình tương tác của LAM với polymerase của HBV hoang dại và HBV đột biến L180M+M204V 16

Hình 8 Cấu tạo phân tử Adefovir dipivoxil 17

Hình 9 Mô hình liên kết của rtN236 với ADV-DP và của rtN236 với dATP ở chủng HBV hoang dại và đột biến rt236T 18

Hình 10: Đồ thị minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít VA.A02-001H 19

Hình 11: Đồ thị minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít VA.A02-001F 23

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết của đề tài

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 2 tỷ người nhiễm HBV trên toàn thế giới, trong đó khoảng 6% có viêm gan siêu vi B cấp tính và 5 – 10% trong số này sẽ chuyển sang mạn tính ở người lớn, riêng đối với trẻ em tỷ lệ này lên đến 90% Tỷ lệ tử vong trong giai đoạn cấp tính là 1% Biến chứng của viêm gan siêu

vi B cấp là viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát, dẫn đến tử vong vào khoảng một triệu người mỗi năm

Một số kết quả điều tra cho thấy các nước ở Đông Nam Á, Trung Quốc và Châu Phi

là những nơi có tỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới Tại Việt Nam có 15 - 20% người nhiễm HBV, trong 80 - 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV

Bệnh viêm gan siêu vi B là bệnh phổ biến ở tỉnh Đồng Tháp, ước tính khoảng trên 10% trên tổng số xét nghiệm HbsAg Việc triển khai điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Đồng Tháp hiện nay chưa thực hiện được do chưa đủ các phương tiện chẩn đoán và theo dõi điều trị

Chẩn đoán nhiễm HBV bao gồm các phương pháp huyết thanh học như: khuếch tán miễn dịch, kết dính hồng cầu, hoặc các phương pháp có độ nhạy cao hơn như miễn dịch enzyme (EIA) và miễn dịch phóng xạ (RIA) Gần đây đã có thêm kỹ thuật phân tử gồm: kỹ thuật lai phân tử (molecular hybridization) và PCR (Polymerase Chain Reaction), trong đó real-time PCR có ưu thế với độ nhạy, độ đặc hiệu cao, và khả năng phân tích kết quả ngay trong quá trình thực hiện phản ứng khuếch đại, không qua bước điện di nên tránh được khả năng ngoại nhiễm

Việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán y khoa nói chung và nhiễm virus HBV nói riêng đã được triển khai tại nhiều bệnh viện lớn, tập trung ở TP Hồ Chí Minh và Hà nội Đề tài này được thực hiện, sẽ là khởi đầu cho việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến này trong chẩn đoán nhiễm HBV tại Đồng Tháp Đề tài sẽ cung cấp số liệu về tải lượng virus HBV trong máu, kiểu gen, và các kiểu đột biến kháng thuốc, đây sẽ là những dữ liệu ban đầu về các đặc trưng của nhiễm HBV, tạo cơ sở cho việc theo dõi, điều trị bệnh viêm gan siêu vi B

Mục tiêu cụ thể của đề tài:

- Xác định đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của người bệnh nhiễm HBV (chỉ tiêu xác định: HBsAg dương tính, 100 ca)

- Định lượng virus HBV trong máu, xác định tỉ lệ kiểu gen và tần số đột biến kháng thuốc Lamivudine và Adefovir của HBV

- Xác định mối liên quan giữa các đặc trưng sinh học phân tử của HBV với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của người bệnh

- Chuyển giao kỹ thuật

TỔNG QUAN

Viêm gan siêu vi B (VGSVB) do Hepatitis B virus (HBV) gây ra, là căn bệnh nghiêm trọng và thường gặp trên thế giới Mặc dù, vacine tiêm ngừa HBV đã có từ hơn 20 năm qua, nhưng bệnh này vẫn tiếp tục lan rộng

1.1 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2 tỷ người (chiếm 1/3 dân số) bị nhiễm HBV, trong đó có hơn 350 triệu người bị nhiễm HBV mạn tính và khoảng 25 - 40% số người

bị nhiễm HBV mạn tính này sẽ phát triển thành xơ gan, suy gan hoặc ung thư biểu mô

tế bào gan (Hepatocellular carcinoma - HCC) HCC là một trong các loại ung thư phổ biến trên thế giới và HBV chịu trách nhiệm cho loại ung thư này trong hơn 75% trường hợp Mỗi năm trên thế giới có gần một triệu người chết vì bệnh VGSVB [1] Khả năng nhiễm HBV trở thành mạn tính phụ thuộc vào độ tuổi, đối với trẻ sơ sinh

và trẻ nhỏ dưới 1 tuổi thì nguy cơ nhiễm trở thành mạn tính là 90%, với trẻ em bị nhiễm từ 1 - 5 tuổi là 30 - 50% và đối với người trưởng thành là 5% [1] Người nhiễm HBV mạn không thể hiện triệu chứng rõ rệt, một số báo cáo gần đây cho biết có

khoảng 30 - 50% người lớn là có triệu chứng, và ở trẻ nhỏ tỷ lệ này dưới 10%

Tỷ lệ nhiễm HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý khác nhau trên thế giới, cũng như trong các phân bố dân cư khác nhau Trong số 350 triệu người trên toàn thế giới nhiễm HBV mạn tính thì có khoảng 75 - 80% là người Châu Á và Tây Thái Bình Dương Nhìn chung, khoảng 45% dân số thế giới sống trong các khu vực có tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính cao, 43% trong vùng dịch trung bình và 12% trong vùng dịch thấp [1]

Hình 2 Tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính trên toàn thế giới [1]

Dựa vào tỷ lệ người mang HBsAg (+), người ta chia thành 3 khu vực lưu hành HBV:

Vùng dịch lưu hành cao: vùng này có hơn 8% dân số nhiễm HBV mạn tính và trong

huyết thanh của đa số người lớn (> 70%) đã chứng tỏ có nhiễm HBV trước đó Vùng này gồm đa số các quốc gia Châu Á, trong đó có Việt Nam (ngoại trừ Nhật Bản và Ấn Độ), Châu Phi, các đảo Thái Bình Dương, hầu hết các bộ phận của Trung Đông và trong lưu vực sông Amazon Đặc điểm dịch tễ học của các vùng này là sự nhiễm HBV chủ yếu xảy ra theo chiều dọc từ mẹ lây sang con, thường gặp ở các nước Châu Á, cho nên tuổi bị nhiễm thường rất sớm như ở trẻ sơ sinh [1]

Vùng dịch lưu hành trung bình: là vùng có tỷ lệ người nhiễm HBV mạn tính chiếm

từ 2 - 7% và 20 - 50% người lớn đã nhiễm trước đó Vùng này gồm các quốc gia như:

Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật, Đông Nam Châu Âu và hầu hết miền Trung và Nam Mỹ Cách truyền bệnh ở các vùng này phức tạp hơn và truyền nhiễm xảy ra ở tất cả các nhóm tuổi, nhưng thời kỳ nhiễm bệnh chủ yếu xảy ra ở trẻ nhỏ, tuổi thiếu niên và thanh niên [1]

Vùng dịch lưu hành thấp: có tỷ lệ người nhiễm HBV mạn tính dưới 2% và tần suất

người lớn đã từng nhiễm virus là dưới 20% Những quốc gia có tần suất lưu hành dịch thấp như: Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc và New Zealand Ở các nước này đa số nhiễm virus xảy ra ở người lớn (80 - 85%)[1]

1.2 Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B ở Việt Nam

Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng lưu hành dịch cao với tần suất người mang HBsAg trong cộng đồng dân cư dao động từ 8 - 25%, trung bình vào khoảng 11% và tần suất người mang HBV mạn là 9% [1]

Theo một báo cáo mới của Hội Gan mật Việt Nam, hàng năm có khoảng 48.000 người chết vì các chứng bệnh liên quan đến VGSVB như xơ gan, viêm gan mạn tính

và ung thư gan Trong đó, có đến 50% trẻ em từ 6 - 14 tuổi bị nhiễm HBV, 10% các trường hợp nhiễm HBV sẽ chuyển sang mạn tính và 40% trong số này sẽ tử vong vì ung thư gan

Ở nước ta, tuy chưa có các công trình nghiên cứu thực sự quy mô về dịch tễ học của HBV, nhưng các số liệu thu thập được từ các báo cáo riêng lẻ với những tiêu chuẩn chưa thống nhất phần nào cũng đánh giá được tình hình nhiễm HBV như: tại Hà Nội, theo Hoàng Thủy Nguyên và cộng sự, Trần Thị Chính và cộng sự, Phan Thị Phi Phi và

13.9% Tại TP Hồ Chí Minh, theo Trần Văn Bé và Bửu Mật, thì tỷ lệ này là 9.7% Trương Thị Xuân Liên với tỷ lệ 11,3%, chia ra các nhóm tuổi như sau: < 15 tuổi, 7.8%; 16 - 25 tuổi, 12.9%; 26 - 35 tuổi, 13%; 36 - 45, 13.6%; và lớn hơn 46 tuổi là 7.4% Ngoài ra, một số địa phương khác cũng có các báo cáo về tỷ lệ mang HBsAg (+) như: Tiền Giang là 21.28%, Lâm Đồng 16.74%, Bình Thuận 17.68% và Nha Trang là 30.25% [2, 3]

Sự lây truyền từ mẹ sang con là phương thức lây quan trọng ở Việt Nam Một số nghiên cứu gần đây ở TP Hồ Chí Minh, Nha Trang, Thanh Hóa, Hải Phòng và Hà Tĩnh cho thấy có đến 12 - 17% phụ nữ mang thai bị nhiễm viêm gan B Khả năng lây nhiễm khi sinh từ 10% đến 90%, đây là đường lây nhiễm nguy hiểm nhất Trẻ sơ sinh

bị nhiễm HBV từ mẹ có nguy cơ chuyển sang mạn tính đến 90% và có thể 25% sẽ chết

vì ung thư gan và xơ gan vào lứa tuổi 30 - 50 tuổi [2, 3]

1.3 Một số đặc điểm sinh học của virus viêm gan B [1]

Virus viêm gan B (HBV) thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus hướng gan (hepatotropic) có cấu trúc DNA (Hình 2) Virion hoàn chỉnh (hạt tử Dane): tiểu thể hình cầu có đường kính 42-47 nm, bao gồm vỏ bọc bên ngoài là kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và phần lõi bên trong là một nucleocapside được cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg) Trong lõi có cấu trúc DNA xoắn kép và một số enzyme quan trọng như DNA polymerase, protein kinase

Hình 2: Cấu trúc của virus viêm gan B

Cấu trúc bộ máy di truyền: Bộ máy di truyền của HBV được cấu tạo từ một phân tử DNA xoắn kép, có trọng lượng phân tử 2x106 dalton, gồm 3200 nucleotide DNA này bao gồm 2 chuỗi có chiều dài khác nhau:

- Chuỗi dài nằm ngoài, có cực âm (-), tạo nên một vòng tròn liên tục và mã hóa cho các thông tin di truyền của HBV

- Chuỗi ngắn nằm trong, có cực dương (+), chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của bộ gen, liên kết các phân tử DNA polymerase

Chỉ có sợi DNA (-) mới được mã hoá Trên sợi DNA này có bốn đoạn gen tương ứng với bốn khung đọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hoá để tổng hợp các protein của HBV: gen S, C, P và X (Hình 3) Quá trình đọc mã được bắt đầu từ bộ

ba nucleotide AUG được gọi là codon khởi đầu (start codon) và chấm dứt bằng codon kết thúc (stop codon) Protein HBV polymerase là một enzyme có vai trò tái tạo giống virus

Hình 3: Cấu trúc bộ gen của HBV

1.4 Chẩn đoán phân tử trong phát hiện nhiễm HBV:

VGSVB có diễn tiến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mạn tính cao, thường dẫn tới xơ gan hay ung thư gan

Biểu hiện lâm sàng và các xét nghiệm sinh hóa thông thường không giúp phân biệt VGSVB với viêm gan do các tác nhân khác Chỉ có 30% bệnh nhân VGSVB cấp có triệu chứng lâm sàng, còn phần lớn bệnh nhân VGSVB mạn không có biểu hiện lâm sàng, thường phát hiện được bệnh là do tình cờ Các phương pháp cận lâm sàng như các xét nghiệm sinh học về gan hay công thức máu cũng không cho độ tin cậy cao,

Tình trạng nhiễm VGSVB cấp tính đặc trưng bởi sự hiện diện của HbsAg và IgM anti-HBc trong huyết thanh Các phương pháp huyết thanh học cho phép phát hiện các thành phần vừa nêu có thể kể đến: phương pháp khuếch tán miễn dịch, thử nghiệm kết dính hồng cầu, hoặc phương pháp có độ nhạy cao hơn như miễn dịch enzyme (EIA) và miễn dịch phóng xạ (RIA) có thể phát hiện đến mức < 0.5 ng HbsAg/ml huyết thanh Những tiến bộ mới trong chẩn đoán và điều trị viêm gan virus B đã góp phần đáng

kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh Trước hết phải kể đến việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử đã góp phần không nhỏ vào công tác chẩn đoán, theo dõi điều trị Việc xác định nhanh, chính xác định tính hay định lượng hàm lượng HBV hiện diện trong máu bệnh nhân đã hỗ trợ rất nhiều cho các biện pháp chẩn đoán huyết thanh học Có thể tóm lược các kiểu chẩn đoán phân tử trong hai nhóm phương pháp: (1) dựa trên kĩ thuật lai phân tử (molecular hybridization) và (2) dựa trên kĩ thuật PCR Các chẩn đoán thuộc nhóm 1 có độ nhạy cao dựa trên kỹ thuật lai phẩn tử qua khe (slot) hoặc điểm (dot) blot cho phép phát hiện hàm lượng DNA HBV < 0.1 pg DNA HBV trong huyết thanh (tương ứng 2.8x104 bộ gen) Hãng Abbott thương mại hóa kít lai trong pha lỏng sử dụng mẫu dò đánh dấu 125I, phát hiện được 0.3pg DNA HBV, hay kit bDNA (Bayer HealthCare verson 3.0) với ngưỡng phát hiện khoảng 2000 bản sao/ml DNA HBV

Các chẩn đoán thuộc nhóm 2 dựa trên PCR có độ nhạy cao hơn nhóm 1 Không chỉ riêng đối với VGSVB, mà đối với hầu hết các bệnh nhiễm virus hay vi khuẩn khó nuôi cấy khác, chẩn đoán phân tử dựa trên PCR đã phát triển mạnh mẽ trên thế giới Trong

số các kĩ thuật chẩn đoán dựa trên PCR đó, Real-time PCR tỏ ra có ưu thế vượt trội, không chỉ cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao, mà chính vì khả năng phân tích kết quả ngay trong quá trình thực hiện phản ứng khuếch đại (thời gian thực), không qua bước điện

di, nên tránh được khả năng ngoại nhiễm (yếu điểm của các PCR thông thường khác),

và chính vì thế nó được ứng dụng rất nhiều trong chẩn đoán

1.5 Giới thiệu về phương pháp Real-time PCR

Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện bằng cách điện di DNA trên gel agrose khi phản ứng kết thúc Ngược lại, Real-time-PCR cho phép phát hiện sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra, đó là ý nghĩa của cụm từ “Real - time”

Khả năng này được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với DNA mạch khuôn gọi là mẫu dò (probe) Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phận phát hiện huỳnh quang được sử dụng để kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra Tín hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ

Ưu điểm chính của Real-time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhạy cao trong phạm

vi biến thiên rộng Kết quả Real-time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA) Real-time PCR sử dụng để định lượng DNA được gọi là PCR định lượng Ngược lại, PCR truyền thống chỉ được xem là bán định lượng Thêm vào đó, dữ liệu Real-time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và tăng số lượng thí nghiệm thực hiện Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại

- Cơ chế hoạt động Real-time PCR

Để hiểu cơ chế hoạt động Real-time PCR, hãy xem đồ thị khuếch đại DNA mẫu (Hình 4), trong đó, số chu kỳ PCR được thể hiện trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang

từ phản ứng, tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống, được thể hiện trên trục y (Hình 4)

Ban đầu, tín hiệu còn ở mức tín hiệu nền, và ta không thể phát hiện (chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tăng theo hàm mũ Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại

đã được tạo ra đủ để tính hiệu huỳnh quang có thể được phát hiện Và chu kỳ mà tại đó điều này xảy ra được gọi là chu kỳ ngưỡng (Cycle of Threshold-CT) Do chu kỳ ngưỡng được đo lường trong giai đoạn hàm mũ khi các thành phần phản ứng chưa cạn kiệt, Real-time PCR có thể được sử dụng để tính toán một cách chính xác và tin cậy lượng ban đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng

0.3 Pha hàm mũ

Giai đoạn bão hòa

0.2

Giá trị ngưỡng

0.1 Đường ngưỡng

Hình 4 Đồ thị khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang

Đồ thị khuếch đại thể hiện hai giai đoạn, giai đoạn một theo hàm mũ và giai đoạn hai bão hòa không theo hàm mũ Trong giai đoạn hàm mũ, lượng sản phẩm PCR gần như được gấp đôi sau mỗi chu kỳ Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng được sử dụng và sau cùng, một hay nhiều thành phần trở nên cạn kiệt Từ thời điểm này, phản ứng chậm lại và bước vào giai đoạn bảo hòa (chu kỳ 28-40)

Chu kỳ ngưỡng của một phản ứng được xác định chủ yếu bởi lượng khuôn mẫu hiện diện lúc phản ứng khuếch đại ban đầu Nếu lượng ban đầu của mẫu lớn, chỉ sau một chu kỳ, sản phẩm khuếch đại đã tích lũy đủ cho tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền Vì vậy, phản ứng sẽ trễ hay có chu kỳ ngưỡng cao Mối quan hệ này là tiền

đề cơ bản cho việc định lượng của phương pháp Real-time PCR

- Phản ứng Real-time PCR sử dụng mẫu dò thủy giải - Taqman probe

Cấu tạo của TaqMan probe gồm một đoạn oligonucleotide thẳng có đánh dấu ở đầu

5’ bằng nhóm “phát” huỳnh quang (report dye), và ở đầu 3’ bằng nhóm “dập” huỳnh quang (quencher dye) Mẫu dò này có vai trò bắt bổ sung một cách chính xác với vùng nào đó trong trình tự nucleotide mà chúng ta cần khuếch đại Khi ở trạng thái tự do

hoặc bắt vào trình tự (nhưng enzyme Taq polymerase chưa hoạt động) thì chất dập

huỳnh quang ở đầu này sẽ dập tắt khả năng phát huỳnh quang của đầu kia Khi enzyme

Taq polymerase tiến hành kéo dài đến một lúc nào đó thì nó sẽ chạm vào đoạn mẫu dò

đang bắt bổ sung với một mạch DNA Khi đó hoạt tính 5’exonuclease của Taq

polymerase sẽ được sử dụng và phân cắt toàn bộ mẫu dò cũng như giải phóng chất huỳnh quang đang bị kìm nén Chất huỳnh quang này sẽ phát sáng và được đọc bởi máy Real-time PCR Chính vì nguyên tắc trên mà số lượng bản sao khuếch đại càng

nhiều thì cường độ huỳnh quang càng lớn Từ đó, ta suy ra được hàm lượng DNA tương ứng với cường độ huỳnh quang mà máy đã đo

Trong các công trình nghiên cứu sử dụng Real-time PCR phát hiện HBV, các tác giả sử dụng các cách định lượng khác nhau, có thể là tác nhân gắn với DNA mạch đôi như SYBr Green của Chopra & cộng sự, 2005 [4] hay tác nhân đặc hiệu – mẫu dò thủy giải Taqman probe của Abe & cộng sự, 1999; Pas & cộng sự, 2000, Garcon & cộng sự, 2005 [5, 6, 7], mẫu dò dạng “kẹp tóc” (molecular beacon) của Sum & cộng sự,

2004 [8] Các bộ kít thương mại hóa theo khuynh hướng này áp dụng cho trường hợp VGSVB cũng vì thế mà rất đa dạng, có thể kể đến: Real-time PCR sử dụng mẫu dò thủy giải của Roche COBAS Taqman HBV test hay Artus RealArt HBV PCR, mẫu dò lai (dạng phức hợp) của Roche Diagnostics, mẫu dò dạng “kẹp tóc” của RealArt kit – Cobett Research

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để xác định mức

độ nhiễm bằng định lượng virus trong máu bằng bộ kít do công ty Việt Á cung cấp, hiện có trên thị trường và đang được sử dụng trong chẩn đoán tại một số bệnh viện ở Việt Nam để khảo sát Bộ kít sử dụng trong nghiên cứu này là một sản phẩm ứng dụng

và cải tiến từ đề tài, dự án nghiên cứu cấp thành phố, cấp bộ trước đó mà cụ thể là hai nghiên cứu: (1) Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán một số bệnh thường gặp ở Việt Nam (sốt xuất huyết Dengue, viêm gan siêu vi B và C, nhiễm Human papillomavirus) Đề tài cấp Bộ (2001-2003); (2) Xây dựng quy trình định lượng virus viêm gan B (HBV) trong máu bệnh nhân bằng kỹ thuật real-time PCR Đề tài cấp Bộ (2006-2007) Độ đặc hiệu của các kit là 100%, độ nhạy của phản ứng định lượng và định type là từ 5-10 copies/phản ứng [9, 10, 11]

Các hình ảnh sau đây (Hình 5) minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV

bằng kít LightPower iVA HBV qPCR Kit (VA.A02-001D):

Hình 5: Đồ thị minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít

VA.A02-001D

1.6 Các thuốc điều trị, hiện tượng kháng thuốc và cách phát hiện

Đã có nhiều tiến bộ trong lĩnh vực điều trị HBV, trước năm 2005 chỉ có 3 loại thuốc điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan Quản lý Thuốc

và Thực phẩm Mỹ) công nhận là Interferon, Lamivudine và Adefovir; đến năm 2008 có thêm 4 loại thuốc mới được đưa vào danh sách là Pegylated Interferon, Entecavir, Telbivudine và Tenofovir Các hướng dẫn điều trị dựa trên các bằng chứng hiện nay

D

Cách chia nhóm mẫu dương mạnh, dương yếu

D: Vị trí baseline chia kết quả thành 2 nhóm khác nhau

xem Tenofovir và Entecavir là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên, và Interferon vẫn là thuốc ưu tiên cho những bệnh nhân chưa có xơ gan

Chỉ định điều trị căn cứ vào tình trạng kháng nguyên HbeAg, lượng virus trong máu

và ALT (Alanine transaminase), sinh thiết gan nếu có sẽ hỗ trợ thêm trong việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ gan Các hướng dẫn điều trị khuyến cáo mạnh việc dùng real-time PCR trong chẩn đoán và theo dõi điều trị HBV, và chỉ dùng một phương pháp cho một bệnh nhân

Điều trị khởi đầu được khuyến cáo vẫn là đơn trị liệu, các điều trị phối hợp nhiều loại thuốc không chứng tỏ hiệu quả cao hơn, mặc dù việc phối hợp thuốc vẫn có ích trong các trường hợp kháng thuốc được đoán trước hoặc đã xuất hiện, cũng như trong các trường hợp có suy gan hoặc sau ghép gan Việc lựa chọn thuốc điều trị tùy thuộc vào điều kiện y tế và từng bệnh nhân, cũng như tỉ lệ đáp ứng thuốc và kháng thuốc Nhóm Interferon có nhược điểm là dùng đường tiêm và có nhiều tác dụng phụ, nhưng không gây hiện tượng kháng thuốc Trong các thuốc dùng đường uống, Lamivudine và Telbivudine liên quan với sự xuất hiện đột biến YMDD của HBV DNA polymerase domain C và đột biến bù đắp ở domain A và B; Adefovir và Tenofovir liên quan với đột biến ở polymerase domain B và D Việc sử dụng Lamivudine và Adefovir bị hạn chế do tỉ lệ virus kháng thuốc khá cao và tăng dần theo thời gian điều trị Telbivudine cũng bị kháng và có đề kháng chéo với Lamivudine Hiện tượng kháng đối với Entecavir và Tenofovir rất ít gặp, xác định kiểu kháng đối với hai thuốc này cần dùng kỹ thuật giải trình tự (sequencing) Việc xác định kháng thuốc trước khi điều trị sẽ giúp lựa chọn thuốc hợp lý, giảm tỉ lệ thất bại trong điều trị

Lamivudine (2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine, tên thường gọi 3TC – LAM), là chất

tương tự nucleoside (Hình 6) với chức năng hoạt động như một chất ức chế enzyme phiên mã ngược virus (nucleoside analog reverse transcriptase inhibitor - nRTI) Cụ thể, do là chất tương tự nucleoside (nguyên liệu của quá trình tổng hợp DNA), LAM (được phosphoryl hóa thành triphosphat hoạt động) có khả năng tham gia vào quá trình tổng hợp DNA của HBV và ngăn cản quá trình tổng hợp DNA của HBV: việc thiếu mất gốc 3'-OH của LAM làm ngăn cản sự tạo thành liên kết 5’-3’ phosphodiester

và hệ quả là kết thúc quá trình kéo dài mạch DNA trong quá trình tổng hợp mạch mới [12, 13]

Hình 6 Cấu tạo phân tử Lamivudine

Hiện tượng kháng LAM

LAM đã được sử dụng rộng rãi để điều trị VGSVB mạn Tuy nhiên quá trình điều trị lâu dài đã dẫn đến sự bùng nổ tính kháng LAM của virus HBV, mà chủ yếu là xuất hiện kiểu gen HBV kháng thuốc YMDD Kiểu kháng Lamivudine YMDD ở HBV lần đầu tiên được công bố phát hiện trên gen mã hóa cho enzyme phiên mã ngược của virus Enzyme này có chiều dài 344 amino acid và định vị từ codon thứ 349 đến 692 trên bộ gen virus Đột biến đã được thống kê qua rất nhiều nghiên cứu và thông tin thường xuyên được cập nhật chính là M204V/I/S tại http://hivdb.stanford.edu/index.html hay Stanford University Drug Resistance

Database [14] Sự thay đổi trình tự amino acid từ YMDD thành YIDD làm giảm tốc

độ mắc lỗi của enzyme phiên mã ngược (hay nói cách khác là giảm hiệu quả sử dụng thuốc LAM) ít nhất là 3.2 lần, và tạo điều kiện cho virus nhân lên dễ dàng Một vài đột biến khác cũng đã được tìm thấy tuy với xác suất thấp hơn là L80V/I, V173L and L180M [15]

Vị trí đột biến kháng LAM xảy ra trên vùng C (Domain C) của đoạn gen sao chép ngược (Reverse Transcriptase – RT) của HBV chủ yếu là kiểu YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), ở đó Methionine sẽ được thay bằng Valine, Isoleucine

và hiếm khi là Serine (đột biến rtM204V/I/S) Những đột biến khác cũng liên quan đến kháng LAM như đột biến thay Leucine thành Methionine ở vùng B (Domain B) là đột

biến rtL180M [16] Các nghiên cứu in vitro cho thấy khả năng ức chế của LAM giảm

hơn 100 lần đối với đột biến L180M + M204V, M204I và L180M + M204I; 153 lần đối với M204V và 18 lần đối với L180M [1, 15, 16]

Tương tự như enzyme reverse transcriptase của HIV, DNA polymerase của virus viêm gan B được chia thành các vùng chức năng sau: ngón tay, lòng bàn tay và ngón tay cái Trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme polymerase được qui định bởi ba acid

amin: aspartate (vị trí 431), aspartate (vị trí 553) và aspartate (vị trí 554) Trong đó, acid amin aspartate tại vị trí 553 và 554 nằm hoàn toàn trong vùng YMDD (Tyrosine-Methionine-Aspartate- Aspartate) của cấu trúc lòng bàn tay và do đó vùng YMDD là vùng qui định hoạt tính xúc tác của enzyme polymerase Những thay đổi acid amin trong vùng YMDD làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động, do đó dẫn đến hiện tượng kháng LAM của virus viêm gan B Ở dạng hoang dại (không có sự thay đổi acid amin của trung tâm hoạt động) không có sự thay đổi cấu hình không gian của trung tâm hoạt động YMDD Vì vậy, LAM cạnh tranh với các nucleotide tự nhiên (dNTP) gắn xen vào chuỗi DNA đang hình thành, dẫn đến kết thúc chuỗi DNA đang tổng hợp Ở dạng đột biến (dạng có thay đổi acid amin ở trung tâm hoạt động): xuất hiện nhóm methyl tại trung tâm hoạt động YMDD Nhóm methyl này gây ra cản trở về mặt không gian của trung tâm hoạt động, ngăn cản sự gắn xen của LAM vào chuỗi DNA đang hình thành Vì vậy quá trình tổng hợp DNA vẫn tiếp diễn, do đó làm mất tác dụng của LAM [17]

Hình 7 Mô hình tương tác của LAM với polymerase của HBV hoang dại và

HBV đột biến L180M+M204V

Adefovir dipivoxil (ADV), tên gọi thường xuyên bis-POM PMEA, một chất tương

tự của nucleoside (Hình 8) và chức năng hoạt động cũng như một chất ức chế enzyme phiên mã ngược virus nRTI

Hình 8 Cấu tạo phân tử Adefovir dipivoxil

Tương tự như LAM, khi điều trị kéo dài, ADV cũng xuất hiện hiện tượng kháng thuốc Tuy nhiên, sự kháng ADV xuất hiện ít hơn so với kháng LAM và diễn ra tương đối chậm [18] Nhưng những phân tích gần đây cho thấy tỉ lệ kháng ADV chiếm khoảng 3% sau 2 năm điều trị, 11% vào năm 3, 18% vào năm 4 và 29% vào năm 5 [19] Các đột biến chính gây hiện tượng kháng ADV cũng đã được xác định bao gồm rtA181V/I (đột biến thay thế alanine bằng valine hoặc threonine tại codon 181), rtN236T (thay thế asparagin bằng threonine tại codon) và rtI233V (thay thế isoleucine bằng valine tại codon 233) được tìm thấy trong vùng chức năng B và D của gen mã hóa enzyme reverse transcriptase của virus HBV [16, 19], các đột biến này có thể xảy

ra đơn lẻ hay cũng có thể kết hợp với nhau và cũng có thể xuất hiện cùng với các đột biến bổ sung như rtI233V, rtP237H, rtN238T/D, rtV84M, rtS85A,… Những đột biến

bổ sung này được cho là giúp chủng kháng thích ứng cao hơn trong việc nhân lên [16] Sự kháng ADV được giải thích thông qua mô hình phân tử của các đột biến trong vùng A và D của HBV polymerase, rtN236T là một đột biến nằm ngoài vị trí xúc tác, nhưng hai vùng A và D được cho là có liên quan đến sự liên kết với dATP [16] Ở polymerase HBV hoang dại, qua mô hình (Hình 9c, d) cho thấy tại rtN236 có thể tạo liên kết hydro với Ser85 và tương tác trực tiếp với ɤ-phosphate của diphosphate adefovir (ADV-DP) Đột biến rtN236T phá vỡ liên kết hydro giữa rtN236 và Ser85 và giữa rtN236 và adefovir diphosphate, qua đó làm giảm ái lực liên kết của ADV [16] Trong khi đó, dù xảy ra đột biến rtN236T cũng không làm thay đổi đáng kể sự liên kết của rtN236 với các chất nội sinh (dATP) (Hình 9a, b) do sự mất một liên kết hydro ở Ser85 và sự thêm một liên kết hydrogen khác ở Thr236 Do đó, ái lực của dATP thay đổi không đáng kể nên dATP có thể cạnh trạnh với ADV-DP để gắn xen vào chuỗi DNA đang hình thành Vì vậy, quá trình tổng hợp mạch mới vẫn được tiếp tục, dẫn đến giảm tác dụng của ADV [16]

Hình 9 Mô hình liên kết của rtN236 với ADV-DP và của rtN236 với dATP ở

chủng HBV hoang dại và đột biến rt236T

Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột biến kháng thuốc của HBV như PCR kết hợp giải trình tự chuỗi, PCR kết hợp sử dụng enzyme cắt hạn chế (PCR-RFLP) hay lai phân tử Tương tự như trong trường hợp lựa chọn kỹ thuật nhằm định lượng virus, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để xác định loại và tỉ lệ đột biến kháng LAM, ADV và phân tích chúng trong mối tương quan với từng kiểu gen Các kết quả trước đây về việc xây dựng quy trình của nhóm cũng được chúng tôi công bố trên các tạp chí hay hội thảo khoa học chuyên ngành [9, 10]

Các hình ảnh sau đây minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít

LightPower IVA HBV LamR rPCR Kit (VA.A02-001H):

Vị trí 204rtV dương tính rõ, các vị trí khác âm tính Kết luận:

“Mẫu đột biến kháng Lamivudine tại vị trí 240rtV” D: Chứng

âm

204rtV

D 180rt 204rtI

Vị trí 204rtV dương tính rõ, 180rt âm, 204rtI dương tính khoảng

chu kỳ 36 nhưng tín hiệu không rõ ràng Kết luận: “Mẫu đột

biến kháng Lamivudine tại vị trí 240rtV”

204rtV

D 180rt 204rtI

Hình 10: Đồ thị minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít

VA.A02-001H

1.7 Vấn đề về kiểu gen của HBV

Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV genotype) Khác với kiểu gen virus viêm gan C (HCV) có vai trò quan trọng trong việc đánh giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa được rõ ràng lắm Sự phân bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ có các kiểu gen vượt trội khác nhau Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự nucleotide, người ta xếp các HBV vào 8 kiểu gen (genotype) khác nhau (kí hiệu từ A đến H) với sự khác nhau trên 8% của toàn bộ bộ gen HBV và sự phân bố của các kiểu gen này cũng phụ thuộc vào địa dư [20] Kiểu gen A thường xuất hiện ở các nước ở tây bắc châu Âu, phía nam Sahara, Ấn độ và Mỹ, trong khi kiểu gen B và C thường gặp ở các

Vị trí 204rtV-204rtI dương tính rõ, vị trí 180rt dương tính

khoảng chu kỳ 36 nhưng tín hiệu không rõ ràng

Kết luận: “Mẫu đột biến kháng Lamivudine tại vị trí 240rtV,

204rtI” D: Chứng âm

204rtV

D 180rt 204rtI

Vị trí 204rtV-204rtI dương tính rõ, vị trí 180rt dương tính sau

chu kỳ 36 Kết luận: “Mẫu đột biến kháng Lamivudine tại vị

trí 240rtV, 204rtI” D: Chứng âm

204rtV

D 180rt 204rtI

Vị trí 204rtV dương tính rõ, 180rt âm, 204rtI dương tính sau chu

kỳ 36 Kết luận: “Mẫu đột biến kháng Lamivudine tại vị trí

240rtV” D: Chứng âm

204rtV

D 180rt 204rtI

Vị trí 204rtV-204rtI dương tính rõ, vị trí 180rt âm tính Kết luận:

“Mẫu đột biến kháng Lamivudine tại vị trí 240rtV, 204rtI” D:

Chứng âm

204rtV

D 180rt 204rtI

gặp ở các nước vùng Địa trung hải, kiểu gen E thường gặp ở một số nước tại châu Phi

và kiểu gen F thường được ghi nhận tại một số nước ở trung và nam châu Mỹ [14].Trên thế giới, trong những năm gần đây đã có nhiều công bố về kiểu gen và mối

tương quan giữa kiểu gen với mức độ trầm trọng của bệnh Kiểu gen nhiễm được cho

là gắn mật thiết với tình trạng âm ỉ của bệnh (thông qua việc đánh giá hai chỉ tiêu HBcAg, HBeAg); quá trình bệnh sinh của gan, sự trốn thoát của virus HBV khỏi hệ thống miễn dịch, sự đáp ứng thuốc điều trị và kháng thuốc điều trị virus [14-16, 20, 21-26].Mức độ nặng của bệnh cũng như sự tiến triển sang viêm gan B mạn tính trong các nghiên cứu trên cho thấy có sự giống nhau ở kiểu gen B và C Theo tác giả Akuta

N và cộng sự [27] thì sự tiến triển sang xơ gan và ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV chiếm tỉ lệ 63% đối với kiểu gen C và 16% ở kiểu gen D và cũng theo tác giả này thì tại Tokyo trong 57 trường hợp viêm gan B cấp kiểu gen A chiếm 22.8%, B chiếm 14% và C là 43.9% , D và F chỉ chiếm 1,8%, trong đó có 15,8% không xác định được kiểu gen; còn trong 1077 trường hợp viêm gan B mạn tính kiểu gen C chiếm một

tỉ lệ rất cao là 87.7% tiếp theo là B với 9,4% còn A là 1.9%, kiểu gen D và F chỉ chiếm 0.2%, có 0.6% không xác định được kiểu gen Cũng theo tác giả này thì biến chứng nặng trên các bệnh nhân viêm gan mạn thường hay gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen B và C, đặc biệt xơ gan và ung thư gan gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen C hơn kiểu gen B Một nghiên cứu khác của Xin Ding tại Trung quốc thì kiểu gen C chiếm tỉ lệ cao nhất lên đến 80% các kiểu gen còn lại lần lượt là: kiểu gen A (3%) kiểu gen B (5.5%), kiểu gen D (0.5%) và kiểu gen B + C là 4.4% còn 3.3 % không xác định được kiểu gen [28]

Một nghiên cứu khác ở Nhật Bản thực hiện trên 585 bệnh nhân viêm gan mạn cũng chỉ ra rằng những người nhiễm kiểu gen B có sự tiến triển sang xơ gan chậm hơn kiểu gen C [29] Ba nghiên cứu khác thực hiện trên 490 người Trung Quốc và 155 người Nhật cũng đánh giá kiểu gen C phổ biến ở bệnh nhân xơ gan hơn kiểu gen B [20, 29, 30] Nghiên cứu ở Mỹ cũng cho thấy xơ gan ở những người nhiễm kiểu gen B diễn ra chậm Ung thư gan cũng diễn ra chậm hơn với kiểu gen B; bệnh nhân có kiểu gen B phát triển thành ung thư gan ở độ tuổi già hơn Giả thuyết được đặt ra để lý giải cho các ghi nhận này là kiểu gen B cần một thời gian ngắn hơn để tái bản ở mức độ cao, chính vì vậy mà hệ quả là tính chất gây viêm sau đó đối với tế bào gan cũng kém hơn

những công bố trước Nghiên cứu này chỉ ra rằng kiểu gen B xuất hiện thường xuyên hơn các kiểu gen khác ở những bệnh nhân ung thư gan trước 50 tuổi [20]

Ở Ấn Độ, nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân cho thấy kháng nguyên HBeAg dương tính và kháng thể anti-HBeAg âm tính ở độ tuổi trên 25, và thường xuyên chuyển xơ gan ở những người nhiễm kiểu gen A hơn kiểu gen D [21] Một nghiên cứu khác ở Tây Ban Nha cho thấy (kiểu gen A chiếm 52%, D 35% và F 7%) mức lưu hành của HBcAg trong huyết thanh là tương tự giữa kiểu gen A và D Tuy nhiên, sự lưu hành của HBeAg, khả năng duy trì họat tính sinh hóa của gan và đáp ứng virus học thường kém hơn với bệnh nhân nhiễm kiểu gen A HBsAg cũng sụt giảm ở mức cao ở những bệnh nhân nhiễm kiểu gen A này [31] Nghiên cứu ở Thụy Sĩ thì lại chứng minh rằng kiểu gen A có mức độ chuyển từ thể cấp sang mạn nhanh chóng hơn kiểu gen D, cũng như khả năng phục hồi sau giai đoạn cấp của những kiểu gen là khác nhau [32] Mặc dù dữ liệu về sự lưu hành HBeAg trong huyết thanh, bệnh lý của gan, tốc

độ chuyển sang xơ gan và ung thư gan giữa tám kiểu gen là chưa thực sự đầy đủ, nhưng một nghiên cứu trên 694 bệnh nhân ở Mỹ đã thống kê kiểu gen A liên quan với sự tồn tại của HBeAg hơn kiểu gen B và D, kiểu gen A, C và D liên quan đến tình trạng phân hủy tế bào gan hơn kiểu gen B [31]

Mối liên quan giữa nồng độ HBV DNA và kiểu gen ở các nghiên cứu khác nhau cũng cho thấy có các kết qua trái ngược nhau Một nghiên cứu chỉ ra rằng nồng độ HBV DNA trong máu cao ở người nhiễm kiểu gen C hơn B [21] Một nghiên cứu khác trên 694 bệnh nhân giai đoạn III điều trị bằng adefovir dipivoxil cho thấy nồng

độ HBV DNA cao hơn ở những người nhiễm kiểu gen C (lúc này chỉ số HBeAg dương tính) Ngược lại, ở những bệnh nhân HBeAg âm tính, nồng độ HBV DNA ở những người nhiễm kiểu gen D cao hơn [23] Ngược lại, một số hồi cứu [33, 34] thì lại thất bại trong việc chứng minh sự tương quan giữa nồng độ HBV DNA và các kiểu gen nhiễm Nghiên cứu trên 694 bệnh nhân ở Mỹ cũng không cho thấy có sự khác biệt nào giữa nồng độ HBV DNA và các kiểu gen A, B, C và D [34]

Ở châu Á, sự lưu hành của HBeAg ở những người nhiễm kiểu gen C cao hơn kiểu gen B [33-36] Các nghiên cứu này cũng chỉ ra sự lưu hành HBeAg trong huyết thanh xảy ra sớm và ở mức cao đối với bệnh nhân nhiễm kiểu gen B

Trong nước, có một vài công bố về tình hình nhiễm HBV và sự phân bố kiểu gen: tác giả Đông T H A và cộng sự (2003) phân tích kịểu gen HBV bằng kĩ thuật

Multiplex PCR Nghiên cứu này được thực hiện trên những bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mạn [37] Ngoài ra, tác giả Hồ T Đ và cộng sự (2005) (trích từ nguồn http://www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html) công bố xác định kiểu gen trên 122 trường hợp nhiễm HBV mạn tính Kĩ thuật xác định kiểu gen mà các tác giả sử dụng là PCR kết hợp giải trình tự Tác giả Đỗ T T D và cộng sự (2010) [38] đã sử dụng bộ kít xác định kiểu gen HBV bằng kĩ thuật Real – time PCR Điểm đặc trưng của bộ kít này là: trình tự gen mục tiêu cho phản ứng Real-time PCR là vùng gen S trên bộ gen HBV Cặp mồi sử dụng cho phép nhân bản mọi kiểu gen đã xác định của virus (mồi bảo tồn – consensus primer) và mẫu dò (TaqMan probe) Probe A, B, C bắt đặc hiệu cho lần lượt từng kiểu gen A, B và C được thiết kế bên trong đoạn trình tự nằm giữa hai mồi Chất đánh dấu huỳnh quang là FAM và chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang (quencher) là BHQ1 Mỗi kiểu gen A, B, C được phát hiện riêng biệt trong từng microtube khác nhau (phản ứng singleplex Real-time PCR) Nghiên cứu thực hiện trên

100 bệnh nhân nhiễm HBV tại khu vực tỉnh Đắk lắk ghi nhận tỉ lệ nhiễm của các kiểu gen HBV là 63 mẫu nhiễm kiểu gen B, 21 mẫu nhiễm kiểu gen C và 16 mẫu nhiễm đồng thời kiểu gen B và C

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn kĩ thuật Real-time PCR nhằm xác định kiểu gen virus HBV Các kết quả trước đây về việc xây dựng quy trình của nhóm cũng được chúng tôi công bố trên các tạp chí hay hội thảo khoa học chuyên ngành [11] Các hình ảnh sau đây minh họa một số kết quả xác định kiểu gen DNA HBV bằng

kít LightPower IVA HBV Genotype rPCR Kit (VA.A02-001F):

Genotype B dương tính rõ, các genotype khác âm tính Kết luận:

“Mẫu nhiễm genotype B”

A, B, C: Genotype A, B, C D: Chứng âm

B

D

A C

Genotype B dương tính rõ, genotype A âm, genotype C dương

tính khoảng chu kỳ 36 nhưng tín hiệu không rõ ràng Kết luận:

“Mẫu nhiễm genotype B”

Hình 11: Đồ thị minh họa một số kết quả định lượng DNA HBV bằng kít

VA.A02-001F

Genotype B-C dương tính rõ, genotype A dương tính khoảng chu kỳ

36 nhưng tín hiệu không rõ ràng

Kết luận: “Mẫu đồng nhiễm genotype B, C”

Genotype B-C dương tính rõ, genotype A dương tính sau chu kỳ 36

Kết luận: “Mẫu đồng nhiễm genotype B, C”

Genotype B-C dương tính rõ, genotype A âm tính

Kết luận: “Mẫu đồng nhiễm genotype B, C”

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP