Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp: “Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LÂM THỊ HẢI YẾN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG TĂNG HUYẾT ÁP VÀ KHÁNG KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

THỦY PHÂN PROTEASE TỪ BÃ NẤM MEN BIA

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS.TS ĐẶNG THỊ THU

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

đã tận tình trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trương Quốc Phong - Trưởng phòng Proteomics, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thu Hiền- Nghiên cứu

viên Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Hà Nội đã hỗ trợ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này

Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Viện đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu

Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Học Viên

Lâm Thị Hải Yến

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp: “Nghiên cứu thu nhận peptide có

hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia” là kết quả nghiên cứu nhánh thuộc nhóm nghiên cứu

đề tài “Nghiên cứu công nghệ thủy phân protein từ bã nấm men bia thu một số peptide thấp phân tử có hoạt tính sinh học để ứng dụng làm thực phẩm chức năng”,

được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS TS Đặng Thị Thu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hiền cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập

và làm việc tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACEI Angiotensin-converting enzyme (ACE)

polyacrylamide gel electrophoresis

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.2 Biều đồ các hoạt tính sinh học của peptide được quan tâm

nghiên cứu

8

Hình 1.3 Hệ thống Renin – angiotensin - aldosterone 10

Hình 1.4 : Minh họa cơ chế kháng nấm của peptide có hoạt tính sinh

Hình 1.6 Đồ thị thể hiện số lượng các peptide được đưa vào nghiên

cứu trung bình mỗi thập kỉ

22

Hình 1.7 Hình dạng tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae 28

Hình 3.1 (A) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến khả năng tạo

peptide sinh học (B) Điện di đồ sản phẩm thủy phân ở các nồng độ

E/S khác nhau

46

Hình 3.2 (A) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới khả năng tạo

peptide (B) Điện di đồ sản phẩm peptide ở điều kiện nồng độ cơ chất

khác nhau

47

Hình 3.3 (A) Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo peptide.(B) Điện di

đồ của sản phẩm thủy phân ở các điểm pH khác nhau

48

Hình 3.4 (A) Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo peptide, (B)

Điện di đồ sản phẩm peptide ở điều kiện nhiệt độ khác nhau

49

Hình 3.5 (A) Ảnh hưởng của thời gian khả năng tạo peptide và Điện di

đồ sản phẩm peptide ở thời điểm thủy phân khác nhau

50

Hình 3.6 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để thủy phân bã men bia 55

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Hình 3.7 Sơ đồ mô tả qui trình thu nhận peptide sinh học từ bã nấm

Hình 3.9 Hình ảnh khuẩn lạc Salmolena Typhi sau 24h nuôi cấy so

với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide

61

Hình 3.10 Ảnh khuẩn lạc Listeria monocytogenes sau 24h nuôi cấy so

với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide

62

Hình 3.11 Phản ứng của dịch peptide làm giảm màu của thuốc thử

DPPH

63

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần chất khô của men bia 29

Bảng 1.2 Thành phần các amino acid thiết yếu trong nấm men bia 29

Bảng 3.1 Kết quả lựa chọn enzym thủy phân 45

Bảng 3.2 Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố và hàm lượng peptide

thu được trong các điều kiện thủy phân khác nhau

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH iv

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về peptide có hoạt tính sinh học 4

1.1.1 Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học 4

1.1.2 Hoạt tính sinh học của peptid 5

1.1.2.1 Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory) 5 1.1.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virut 7

1.1.2.3 Peptide có hoạt tính chống oxy hóa 10

1.1.2.4 Peptide có hoạt tính chống ung thư 11

1.1.2.5 Các hoạt tính sinh học khác 12

1.1.3 Các nghiên cứu về peptide sinh học từ bã nấm men bia 13

1.1.3.1 Xu hướng nghiên cứu, sản xuất và sử dụng peptide có hoạt tính sinh học 17

1.1.4 Các phương pháp tách, tinh sạch peptide có hoạt tính sinh học 19

1.2 Tổng quan về protease 21

1.2.1 Khái niệm 21

1.2.2 Giới thiệu một số chế phẩm Protease thương mại 21

1.3 Tổng quan về bã nấm men bia 22

1.3.1 Giới thiệu về nấm men Saccharomyces 22

1.3.2 Thành phần hóa học bã nấm men bia 23

1.3.3 Sản lượng bã nấm men bia và hiện trạng sử dụng tại Việt Nam 25

1.3.4 Một số ứng dụng của bã nấm men bia trên thế giới và ở Việt Nam 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1 Bã nấm men Saccharomyces cerevisiae 31

2.1.2 Hóa chất 31

2.1.3 Thiết bị 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

2.2.1 Thủy phân bã nấm men bia và tinh sạch peptide 33

2.2.2 Phương pháp điện di trên gel Polyacrylamide (SDS- PAGE) 33

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng peptide tổng OPA 34

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE 34

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH 35

2.2.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 36

2.2.7 Tối ưu hóa quá trình thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) 36

3.1 Kết quả nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân 38

3.2 Khảo sát nồng độ enzym 39

3.3 Ảnh ưởng của nồng độ cơ chất tới quá trình thuỷ phân 39

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 40

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân 41

3.6 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân bã nấm men bia 42

3.7 Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch bậc 2 Box-Behnken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 43

3.8 Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn bã nấm men bia bằng protease thu peptide có hoạt tính sinh học 48

3.9 Nghiên cứu hoạt tính kìm hãm ACE ( chống tăng huyết áp) 50

3.10 Khảo sát hoạt tính ức chế với vi khuẩn Salmolena Typhi và Listeria monocytogenes 52

3.11 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của dịch peptide 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

MỞ ĐẦU

Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là những peptide ngoài giá trị dinh dưỡng còn có khả năng tác động tới chức năng sinh lý của cơ thể, giúp tăng cường và nâng cao sức khỏe của con người như khả năng chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, tác dụng kìm hãm enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) chống tăng huyết áp [26], ngoài ra còn có khả năng điều hòa miễn dịch, chống đông máu [31] Peptide có hoạt tính sinh học có thể tách chiết từ các nguồn tự nhiên (động vật, thực vật), hoặc lên men bởi vi sinh vật, hoặc thủy phân giới hạn protein từ các nguồn khác nhau bởi protease Các nghiên cứu về peptide có hoạt tính sinh học ở nước ta mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và khai thác chủ yếu trên đối tượng nguyên liệu từ sữa, đậu tương Trong khi nguồn bã men bia ở nước ta rất rồi dào, chứa hàm lượng protein cao, giàu vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B và các khoáng chất, sẽ trở thành nguồn nguyên liệu tốt cho quá trình sản xuất peptide Thủy phân giới hạn bã nấm men bia tạo peptide có hoạt tính sinh học bổ sung vào thực phẩm chức năng không những tận dụng được nguồn nguyên liệu bã thải, tạo sản phẩm có chất lượng cao mà còn giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường gây

ra do lượng lớn bã men bia thải ra hàng năm

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận

peptide có hoạt tính chống tăng huyết áp và kháng khuẩn bằng phương pháp thủy phân protease từ bã nấm men bia”

Nội dung chính bao gồm:

- Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất) để thu peptide thấp phân tử

- Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân

- Xây dựng quy trình thu peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia

- Khảo sát một số hoạt tính sinh học: chống tăng huyết áp, kháng khuẩn và chống oxi hóa của peptide sinh học từ bã nấm men bia

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về peptide có hoạt tính sinh học

1.1.1 Khái niệm peptide có hoạt tính sinh học

Năm 1950, Mellander là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein (protein sữa) hoạt động như chất mang các chất khoáng

Những nghiên cứu về peptide đã có những bước tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây Cho đến nay đã có gần 2000 peptide có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ các nguồn khác nhau Những hoạt tính sinh học của peptide được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong hai thập niên gần đây chủ yếu là có hoạt tính

ức chế ACE, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, chống oxy hóa và chống ung thư Mức độ nghiên cứu và sản xuất các peptide sinh học được thể hiện ở hình 1.2 sau

Hình 1.2 Biều đồ các hoạt tính sinh học của peptide được quan tâm nghiên cứu

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là những peptide ngoài giá trị dinh dưỡng còn có khả năng tác động tới chức năng sinh lý của cơ thể, giúp tăng cường và nâng cao sức khỏe của con người [27] như khả năng chống oxi hóa, kháng

vi sinh vật, chống tăng huyết áp, chống đông máu, khả năng điều hòa miễn dịch…

1.1.2 Hoạt tính sinh học của peptid [34]

1.1.2.1 Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory) Bệnh cao huyết áp hiện nay là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong, nhất là

ở những người lớn tuổi Lý do của sự gia tăng huyết áp này là do hoạt động của ACE trong hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS) và hệ thống Kalikein-kinin Trong RAAS, ACE giữ một vai trò quan trọng – nó làm tăng huyết áp máu bằng cách cắt dipeptide đầu C tận cùng của angiotensin I chuyển thành angiotensin

II – nhân tố gây co mạch và ức chế bradykinin – nhân tố gây giãn mạch Sự ức chế ACE được coi là một liệu pháp hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp

Rất nhiều chất ức chế ACE được tổng hợp bằng con đường hóa học để giảm cao huyết áp như captopril, enalapril, alacepril và lisinopril Tuy nhiên, các loại thuốc này thường gây ra các tác dụng phụ như: ho, rối loạn vị giác và mẩn da Vì vậy, trong khoảng hai thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sản xuất nhiều loại peptide ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên (thực vật, động vật và vi sinh vật) giúp giảm huyết áp mà ít gây các tác dụng phụ như trên

Angiotensin I-converting enzyme (ACE, EC 3.4.15.1) có hai đồng dạng của ở động vật có vú: Soma ACE (sACE) tồn tại trong các mô soma và bao gồm hai vùng (vùng N và một vùng C), và tACE, được tìm thấy ở tinh hoàn người lớn Cả hai đồng dạng được mã hóa bởi cùng một gen, nhưng RNA (mRNA) phiên mã bắt đầu tại các vị trí khác nhau Hai đồng dạng có tính đặc hiệu cao trong miền C, nhưng sACE chứa một chuỗi 36- axit amin ở có vùng cuối N [4] Một số nghiên cứu đã chỉ

ra rằng miền C là quan trọng hơn cho việc điều chỉnh huyết áp và hoàn toàn chiếm vai trò quan trọng cho quá trình giảm huyết áp của sACE Miền C có hằng số xúc

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học tác cao hơn cho angiotensin I và các cơ chất không có hoạt tính sinh học, hippuryl histidyl-leucine (HHL) [3]

Cơ chế tăng huyết áp: Những peptide có khả năng kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin có trong hệ thống điều hòa huyết áp của cơ thể người và cơ chế điều hòa được thông qua hệ thống renin – angiotensin như sau: Khi thể tích máu trong cơ thể người hạ thấp khiến huyết áp giảm, thận sẽ bài tiết enzym có tên là renin Renin kích thích sự sản sinh angiotensin Tiếp đến Angiotensin gây co mạch máu dẫn đến việc tăng huyết áp Angiotensin cũng kích thích sự tiết hormon aldosterone từ lớp cầu vỏ thượng thận Aldosterone làm tăng tái hấp thu nước và ion Na+ ở các tế bào biểu mô ống thận Điều đó sẽ dẫn tới việc tăng lượng nước trong cơ thể, phục hồi huyết áp [5,7]

Hệ thống này có thể được hoạt hóa khi có sự giảm thiểu thể tích máu hay sụt giảm huyết áp (như xuất huyết) Nếu lưu lượng nước qua các tế bào cận tiểu cầu nằm trong phức hợp cận tiểu cầu ở thận giảm xuống, sau đó các tế bào cận tiểu cầu giải phóng enzyme renin Renin sẽ tác động lên một protein trong huyết tương là angiotensinogen vốn đang ở dạng bất hoạt bằng cách cắt một đoạn zymogen, chuyển nó thành angiotensin I Angiotensin I sau đó được chuyển đổi thành angiotensin II bởi enzyme chuyển đổi angiotensin được tìm thấy chủ yếu ở mao mạch phổi [4] Angiotensin II là chất có tác dụng sinh học cao của hệ renin-angiotensin, sẽ gắn lên các thụ thể nằm trên màng tế bào nội mô mao mạch, làm cho các tế bào này co thắt và mạch máu quanh chúng dẫn đến sự giải phóng aldosterone

từ vùng cung ở thượng thận vỏ Angiotensin II hoạt động như là hormon nội tiết, tự tiết, cận tiết, và kích thích tố nội bào [7]

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Hình 1.3 Hệ thống Renin – angiotensin - aldosterone

Chất ức chế ACE đầu tiên được phát hiện trong nọc rắn Bothrops jararaca vào năm 1970 Trong nọc rắn có các peptide ức chế ACE có từ 5-13 gốc amino acid trong phân tử, trong số đó có peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-pro-pro là có hoạt tính cao nhất in vivo Một peptide khác là bradykinin-potentiating peptide 5a (BPP5a) Glu-Lys-Trp-Ala-Pro có thứ tự 3 amino acid cuối ở đầu C rất phù hợp cho việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE, tuy nhiên peptide này lại dễ bị phân hủy trong điều kiện in vivo Do đó, người ta đã thay thế gốc Trp trong phân tử bằng gốc Phe để có được phân tử peptide bền hơn nhưng vẫn có hoạt tính ức chế ACE mạnh

Và cũng từ đó, hầu hết các thuốc ức chế ACE được sử dụng đều có cấu trúc tương

tự hay liên quan đến tripeptide Phe-Ala-Pro.[6]

ACEIP đã được sản xuất từ nguồn nguyên liệu thực vật như: gạo, ngô, đậu tương, lúa mạch, lúa mì bằng cách dùng enzyme thủy phân hay lên men truyền thống (Matsui, Miguel) Những enzyme dùng để thủy phân từ những nguồn thực vật này thường là các protease như alcalase, trypsin, chymotrypsin.[6, 9, 12,]

1.1.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virut [34,36]

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

 Kháng khuẩn

Cơ chế : Chúng thực hiện bằng cách kích thích sự tăng trưởng của vi sinh vật

có lợi trong đường ruột có khả năng sinh tổng hợp các axit mạch ngắn (axit lactic, axit acetic) làm ức chế vi khuẩn gây hại, mặt khác hỗ trợ ức chế sự hoạt động của vi khuẩn gây bệnh bằng cách tấn công màng cytoplasmic của vi khuẩn làm phá vỡ liên kết màng hoặc ngăn cản quá trình hấp thu dinh dưỡng như: Lactoferrin, Haptocorrin, Immunoglobulins

Các peptide kháng khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu có cấu trúc vòng Peptide kháng khuẩn bacitracin được tách từ Bacillus subtilis vào năm 1945 bởi B A Johnson và cộng sự Peptide này được tìm thấy có phổ kháng khuẩn rộng và được

sử dụng trong lâm sàng như một tác nhân hạn chế trong lâm sàng Cấu trúc của nó sau đó đã được Craig tìm ra Một decapeptide vòng khác là Gramicidin S cũng được tách chiết từ Bacillus brevis Cấu trúc của nó được mô tả vào năm 1945 bởi A H Gordon và cộng sự Quá trình tổng hợp nó đạt được vào năm 1970 với công trình của G Losse và cộng sự Loại thuốc này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt trong việc chống lại cả các vi khuẩn Gram âm và dương Vào năm 1953, Schulman và

cộng sự đã tách chiết được Polymyxin B từ Bacillus polymyxa và sau đó là các biến

thể của nó là B1 và B2 bởi Hausmann và cộng sự vào năm 1954 Công thức cấu tạo của Polymyxin B cũng đã được tìm ra bởi Vogler vào năm 1994 Polymyxin B được

sử dụng chủ yếu để điều trị bệnh liên quan đến vi khuẩn Gram âm bao gồm các tác

nhân lây nhiễm đường tiêu hóa P enteritis hay Shigella và các nhiễm khuẩn khu

biệt tại các vết thương hoặc vết bỏng

Evolidine, một heptapeptide vòng được tách chiết từ là cây Evodia xonthoxyloid và được mô tả các đặc điểm bởi Eastwood và cộng sự vào năm 1955 Cấu trúc của nó được làm sáng tỏ bởi Kopple vào năm 1971 và cấu trúc tinh thể cũng như các nghiên cứu khác cũng đã có trong các báo cáo của Drake vào năm

1991 Peptide này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt Atinomycin

được khám phá bởi A.A.Waksman và cộng sự vào năm 1940 từ Actinomyces antibioticus Các nghiên cứu chính để xác định cấu trúc và tổng hợp toàn bộ hợp

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

chất này đã được W Brockmann hoàn thành vào năm 1960 Actinomycin D hay Dactinomycin thể hiện hoạt tính mạnh chống lại các vi khuẩn Gram dương Tyrocidine-A, một kháng sinh decapeptide vòng, hợp thành bởi tyrothricin đã được

phân lập từ Bacillus brevis

Kháng nấm

Sự hình thành nhiều các chủng nấm gây bệnh bắt nguồn từ thực phẩm Vì thế nhu cầu tạo ra được các chất có khả năng kháng nấm đang rất được quan tâm và peptide chức năng được đang trở thành xu hướng thay thế các chất tổng hợp hóa học Ban đầu, hoạt động kìm hãm nấm được mô tả là một quá trình phân giải tế bào nấm hoặc làm rối loạn quá trình tổng hợp lên thành tế bào Tuy nhiên, hàng loạt các nghiên cứu trong thập kỷ qua đã đưa ra những cơ chế tác động mới bao gồm: Quá trình phân giải tế bào, liên kết ergosterol/cholesterol trong màng tế bào, sự tấn công của ty thể hoặc cơ quan nội bào khác và biến dạng của cấu trúc màng tế bào [26] Theo De Lucca và Walsh (1999), peptide kháng nấm có thể được phân thành

2 loại dựa vào cơ chế hoạt động của chúng gồm: peptide tấn công qua thành tế bào Peptid qua màng tế bào nấm và tấn công vào các mục tiêu bên trong tế bào và tạo thành lỗ hổng Peptide hoạt động bằng cách phân giải tế bào Các peptide này được đặc trưng bởi bản chất amphipathic của chúng, là phân tử có 2 phần, một tích điện dương, trung hòa và kỵ nước.[26, 27, 35]

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Hình 1.4 : Minh họa cơ chế kháng nấm của peptide có hoạt tính sinh học[26]

1.1.2.3 Peptide có hoạt tính chống oxy hóa

Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, người ta nói đến nhiều tác hại của chất oxy hoá, phản ứng oxy hoá và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất chống oxy hoá để bảo vệ, duy trì sức khỏe

Chất chống oxy hóa được tìm thấy nhiều trong các loại trái cây và rau quả, thảo dược, trứng, sữa Nhiều nghiên cứu đã chứng minh lợi ích của chúng đối với sức khỏe trên nhiều mặt:

Gốc tự do (chất oxy hóa) luôn luôn được sinh ra trong cơ thể con người và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể (có thể nói ta không thể sống được nếu trong

cơ thể hoàn toàn thiếu vắng gốc tự do) Oxy (dưỡng khí) mà ta hít thở hàng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng trở thành gốc tự do (khi đó gọi là oxy đơn bội) Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virut bị tế bào bạch cầu tiêu diệt trong

cơ thể, hoặc hiện tượng hô hấp trong tế bào, hoặc cơ chế giải độc ở gan đều là các hoạt động làm sinh ra gốc tự do

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Điều quan trọng là trong cơ thể khoẻ mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không quá thừa để gây hại Bởi vì bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hoá "nội sinh" (tức có sẵn trong cơ thể) cân bằng lại, vô hiệu hoá các gốc

tự do có hại Hệ thống các chất chống oxy này gồm các enzym như glutathione peroxidase, superroxid dismutase đặc biệt là vitamin C, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A), khoáng chất selen "nội sinh" có sẵn trong cơ thể, xúc tác các phản ứng khử để vô hiệu hoá gốc tự do (còn gọi là "bẫy" gốc tự do) giúp cơ thể khoẻ mạnh

Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống "chất oxy hoá nội sinh" không đủ sức cân bằng để vô hiệu hoá, các nhà khoa học đặt vấn

đề dùng các "chất chống oxy hóa ngoại sinh" với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, chống lão hóa Các chất chống oxy hóa ngoại sinh đó đã được xác định,

đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol, peptide Một số peptide có hoạt tính sinh học có khả năng ức chế quá trình oxy hóa diễn ra trong cơ thể sống và chống quá trình hình thành các gốc tự do làm giảm chất lượng của thực phẩm và thời gian bảo quản Chúng có nhiều trong các loại thực phẩm như: Sữa, đậu tương, cám gạo, kiều mạch, protein lòng trắng trứng, protein trong một số loài thủy hải sản… Một số các tác giả đã tìm thấy của các peptide chống oxy hóa thường chứa các amino acid Tryptophan, lysine [32,34]

Peptide chống oxy hóa có thể được tách ra nhờ enzyme thủy phân protein trứng, sữa [21] và nhiều công trình được công bố về peptide vừa có khả năng ức chế ACE vừa chống oxy hóa từ các nguồn protein của đậu tương, lòng trắng trứng gà như: Chen HM et al., 1996 thu được từ protein đậu tương; Miguel et al.,2006 từ lòng trắng trứng, Zhipeng và cộng sự, 2011 đã thu được peptide từ protein của lòng trắng trứng gà (Arg-Val-Pro-Ser-Leu) có cả ba hoạt tính: chống tăng huyết áp, chống oxy hóa và chống đông tụ máu [36]

1.1.2.4 Peptide có hoạt tính chống ung thư

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách

vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn)

Phân chia tế bào (tăng sinh) là quá trình sinh lý xảy ra trong những điều kiện nhất định ở hầu hết các mô trong cơ thể sinh vật đa bào Bình thường sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào được điều hòa một cách chặt chẽ để đảm bảo cho tính toàn vẹn của cơ quan và mô Khi các tế bào xảy

ra những đột biến trong DNA, chúng có thể phá vỡ cơ chế điều khiển này và dẫn đến ung thư

Hiện nay có khoảng 200 loại ung thư Ngày nay, phương pháp điều trị ung thư

có các bước tiến bộ đáng kể, bệnh nhân được điều trị bằng hóa chất hoặc vật lý trị liệu Tuy nhiên, quá trình điều trị thường xảy ra hiện tượng kháng thuốc do có hiện tượng hàm lượng enzyme tăng trong tế bào giải độc cho quá trình chống ung thư, ngăn không cho quá trình vận chuyển thuốc điều trị chống lại khối u Những nghiên cứu gần đây đã lựa chọn peptide chức năng thay thế cho phương pháp điều trị thông thường Tuy nhiên, không phải peptide chức năng nào cũng có hoạt tính chống ung thư Năm 2008, Hoskin and Ramamoorthy đã phân loại peptide có hoạt tính chống ung thư thành hai nhóm chính: peptide có hoạt động chọn lọc và peptide có hoạt động không chọn lọc (có khả năng tấn công cả vi khuẩn, tế bào gây ung thư, tế bào khỏe mạnh) [8,13]

Các peptide có hoạt tính chống ung thư được tìm thấy ở nấm men, nọc rắn,

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

 Peptide độc

Thành phần quan trọng của nọc rắn là các chất độc thần kinh dạng polypeptide như là cobrotoxin, một chất độc chết người bởi khả năng làm tê liệt hệ thần kinh cơ Những peptide của nấm amanita như các loại antamanide nằm trong số các chất độc được biết đến nhiều nhất Ngoài ra còn có một số loại peptide độc được tách chiết từ các sinh vật biển cũng đang được nghiên cứu trong thập niên gần đây

 Peptide thần kinh

Có khoảng 50 peptide loại này đã được biết cấu trúc phân tử Một vài peptide gây nghiện nội sinh [endorphins, enkephalins, dynorphins, dermorphins, deltorphins, dermorphin gene associated peptide (DGAD)] đã được nghiên cứu khá

kĩ lưỡng Enkephalins (có nghĩa là tách chiết từ não), hai pentapeptides Gly-Phe-Met/Leu) đã được tìm thấy với hàm lượng lớn trong các vùng của hệ thống thần kinh Một lượng tương đối lớn các dạng tương đồng của những peptide này cũng đã được tổng hợp để xác định vai trò của chúng trong việc truyền tải cảm giác đau

(Tyr-Gly- Peptide Leukotrienne

Những peptide loại này gây ra sự co thắt các cơ trơn ở phế quản và chúng còn thực hiện vai trò quan trọng như một chất trung gian trong phản ứng dị ứng và viêm nhiễm

1.1.3 Các nghiên cứu về peptide sinh học từ bã nấm men bia

 Các nghiên cứu quốc tế

Năm 2001, Man-Jin In, Dong Chung Kim và Hee Jeong Chae đã nghiên cứu :

“Tác động của một số loại chế phẩm enzym ảnh hưởng tới quá trình thu hồi protein

và đặc điểm mùi vị “ trong nhánh nghiên cứu ứng dụng thực phẩm có bổ sung cao nấm men Nhóm tác giả đã thủy phân nấm men bia Saccharomyces sp bằng cách sử dụng kết hợp hai loại enzym Protamex và Flavouzym với nồng độ khảo sát từ 0.6- 2.0%, nồng độ cơ chất 20%, pH 6.5 thời gian thủy phân 12h Hiệu suất thủy phân

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học được xác định bằng cách tính tổng lượng Protein hòa tan trên tổng số protein trong dịch sau thủy phân Kết quả hiệu suất thủy phân đạt 55.1% với nồng độ enzym Protamex: Flavouzym là 0.6% : 0.6%[13]

Năm 2005, Man-Jin In, Dong Chung Kim và Hee Jeong Chae đã nghiên cứu

“Quy trình thu hồi sản phẩm chiết xuất từ nấm men sử dụng bằng phương pháp tự phân” Các tác giả đã đưa ra được quy trình xử lý nấm men bia bao gồm làm sạch, loại đắng và phản ứng Mailard Kết quả thu hồi được 50% nấm men thành cao nấm men.[28]

Năm 2005, nhóm nghiên cứu Nhật Bản đã tiến hành nghiên cứu “Một loại Peptide có hoạt tính sinh học cao trong nấm men bia có khả năng làm giảm áp lực máu ảnh hưởng tới quá trình tăng huyết áp” Nhóm đã tách chiết thành công đoạn Peptide KRF814 từ quá trình thủy phân nấm men bia BY-G bằng chế phẩm enzym Alcalase Hoạt tính sinh chống tăng huyết áp của KRF814 được thử nghiệm trên thỏ

và cho kết quả có ý nghĩa KRF814 bao gồm alanyl-phenylalanine và

glycin-phenylalanine cho kết quả chống tăng huyết áp 60% so với mẫu đối chứng là

captoril [32]

Năm 2007, Hasan Tanguler và Huseyin Erten đã nghiên cứu đề tài “Ảnh

hưởng của nhiệt độ tới khả năng tự phân của bã men bia” Tác giả đã tiến hành tự phân nấm men ở các mốc nhiệt độ 45, 50, 55 và 60oC với thời gian từ 8 đến 72 giờ Dựa trên các số liệu về hàm lượng amino acid và protein, tác giả đã kết luận nhiệt

độ và thời gian tối ưu cho việc tự phân bã men bia là 50oC trong 24 giờ.[20]

Dịch sau khi tự phân và diệt enzyme được tinh sạch Tinh sạch là quá trình thu nhận các phân đoạn peptide mong muốn cũng như loại bỏ các thành phần tạp như béo, khoáng, cặn không tan

 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, peptide có hoạt tính sinh học mới được quan tâm nghiên cứu trong một thập niên gần đây, chủ yếu các đề tài tập trung nghiên cứu từ nguồn

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

peptide của sữa, của đậu tương Đối với nguồn nguyên liệu từ bã men bia còn rất mới mẻ, chủ yếu các công trình nghiên cứu xử lý bã men bia sản xuất nước chấm lên men, chế biến men bổ sung vào quá trình lên men, sản xuất thức ăn cho gia súc gia cầm Dưới đây là một số công trình nghiên cứu về peptide sinh học đã được công bố trong những năm gần đây

Năm 2005, Đặng Ngọc Thùy Dương, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tận dụng bã nấm men bia để chế biến men chiết xuất dùng làm thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh” Kết quả

đã nghiên cứu điều kiện tự phân bã nấm men bia tạo dịch giàu dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật [38]

Năm 2006, Nguyễn Đại Nghĩa, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh,

đã thực hiện nghiên cứu: “Bước đầu tận dụng bã men bia để sản xuất nước chấm lên men” Kết quả thu được quy trình sản xuất nước chấm lên men tối ưu.[39]

Năm 2009, GS.TS Phan Văn Chi – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam nghiên cứu “Khảo sát, xác định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics” Tác giả đã khảo sát, xác định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics Trên

cơ sở các kết quả khảo sát, lựa chọn 1-2 peptide/protein có hoạt tính giảm đau thần kinh (conotoxin) để thiết kế biểu hiện Nghiên cứu các đặc tính và khả năng ứng dụng của 1-2 loại conotoxin tái tổ hợp và xác định được một số đặc tính khả năng ứng dụng.[40]

Năm 2009, PGS Quản Lê Hà – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nghiên cứu đề tài nhánh “Nghiên cứu ứng dụng enzyme vi sinh vật để tổng hợp và thu nhận peptide chức năng kìm hãm enzyme chuyển angiotensin từ sữa” Tác giả đã thành công trong việc tìm được điều kiện thích hợp để thu dịch thủy phân casein bằng chế phẩm enzyme Flavourzyme, lựa chọn phương pháp lọc dòng ngang phân đoạn qua màng có kích thước 10KDa cho hoạt tính kìm hãm ACE là 85,7%, xác định được trình tự của peptide ức chế

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học ACE đó và lựa chọn phương pháp sấy đông khô để tạo chế phẩm dạng bột cho sản phẩm Sơ đồ quy trình công nghệ được thể hiện dưới đây:

Hình 1.4 Sơ đồ thu nhận và tinh sạch ACEIPs từ dịch thủy phân casein

Năm 2010, Kỹ sư Nguyễn Thị Ngọc Ánh – Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Hà Nội đã nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất glutathione từ sinh khối nấm men và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm” Tác giả đã đưa ra được quy trình xử lý nấm men và công nghệ bào chế viên nang chứa glutathion

Nhìn chung các tác giả đều sử dụng các phương pháp thông dụng: thủy phân bằng chế phẩm enzyme thương phẩm, enzyme từ vi sinh vật và tinh sạch peptide

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học (phương pháp lọc dòng ngang, phương pháp lọc gel) Các quy trình thủy phân, tinh sạch và sản xuất thử nghiệm đều mới thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

Hiện tại chưa có công trình nào công bố ở Việt Nam nghiên cứu về peptide sinh học được thủy phân giới hạn bằng protease từ bã nấm men bia

1.1.3.1 Xu hướng nghiên cứu, sản xuất và sử dụng peptide có hoạt tính sinh học

Peptide đang ngày càng thu hút sự quan tâm trong lĩnh vực trị liệu Hiện tại,

có bốn sản phẩm đã được thương mại hóa trên toàn cầu với doanh số vượt mốc 1 tỉ USD: glatiramer acetate (Copaxone; 3.18 tỉ USD), leuprolide acetate (Lupron; 2.12

tỉ USD), goserelin acetate (Zoladex; 1.14 tỉ USD), và octreotide acetate (Sandostatin; 1.12 tỉ USD) Hơn nữa, exenatide (Byetta) và peptide tái tổ hợp teriparatide (Forteo) cũng gần cán mốc 1 tỉ USD với doanh thu toàn cầu năm 2008 lần lượt là 751 và 780 triệu USD Sự tăng trưởng ngày càng mạnh mẽ của công nghiệp dược phẩm trong việc sử dụng peptide như một loại thuốc điều trị xuất phát

từ sự chấp nhận ngày càng rộng rãi của các nhân viên y tế cũng như bệnh nhân Trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc Tufts hợp tác với Viện nghiên cứu Ferring (Mỹ) đã xuất bản cơ sở dữ liệu của tổng số 435 peptide đã được đưa vào các nghiên cứu lâm sàng do các công ty thương mại tài trợ Trong số đó có 334 peptide trị liệu đáng chú ý bao gồm 54 peptide vừa được phê chuẩn cho thương mại hóa,

149 vừa hoàn thành nghiên cứu và 131 vẫn đang được phát triển Các peptide đang trong quá trình phát triển bao gồm 41 đang ở pha 1,72 ở pha 2,16 ở pha 3 và 2 đã được xem xét Mặc dù các peptide đã được nghiên cứu để làm thuốc trong rất nhiều thập kỉ, tỉ lệ các nghiên cứu lâm sàng vẫn còn thấp trong giai đoạn 1980 Số lượng trung bình các peptide được đưa vào nghiên cứu hàng năm tăng đều đặn: 1.2 %/năm vào những năm 1970, 4.6 % /năm vào những năm 1980, 9.7 % /năm vào những năm

1990 và trên 16.8 % /năm trong những năm 2000

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Hình 1.5 Đồ thị thể hiện số lượng các peptide được đưa vào nghiên cứu trung bình mỗi thập kỉ

Nếu coi giai đoạn nghiên cứu peptide từ những năm 1940 đến năm 2008, tính theo từng thập kỷ thì những năm 1940-1970, lượng các peptide được nghiên cứu chưa nhiều, giao động từ 0.1 %/năm tới 1.2 % /năm Từ những năm 1980, peptide

đã được nghiên cứu để điều trị một loạt các triệu chứng bệnh Trong khoảng từ năm

2002 đến 2008, các peptide được nghiên cứu tập trung vào hướng điều trị ung thư

và rối loạn trao đổi chất (18% và 17%) Tỉ lệ peptide được được sử dụng trong điều trị gia tăng đáng kể từ trong những năm 1980 và 1990, khi lần lượt 4.6 % và 9.7 % quá trình trị liệu sử dụng peptide đã được nghiên cứu với các bệnh lí đặc trưng như

là tiểu đường, béo phì và loãng xương Trong khi đó, việc sử dụng peptide cho điều trị các rối loạn liên quan đến miễn dịch, dị ứng hay các bệnh lí tim mạch được báo cáo là giảm xuống

Các peptide chính được lựa chọn như các phân tử ngoại bào, chỉ khoảng 10% được biết là gắn với các đích nội bào Các phân tử đích ngoại bào được nhắm đến là các thụ thể kết cặp protein G (GPCRs) Họ thụ thể này bao gồm gần 100 protein xuyên màng có vai trò kích hoạt các đáp ứng ngoại bào GPCRs là đích tác động của phần lớn các loại thuốc bán trên thị trường, trong khi đó các ứng viên lâm sàng

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

cũng được dự định dùng để điều trị cho một loạt các bệnh lý Các peptide mới được đưa vào các nghiên cứu lâm sàng vào các giai đoạn 1980, 1990, 2000-2008, lần lượt 69%, 75% và 60% có đích tác động là GPCRs và hầu hết đều có hoạt tính kích thích đáp ứng chủ động.[32,36]

1.1.4 Các phương pháp tách, tinh sạch peptide có hoạt tính sinh học [4]

Nhiều phương pháp được phát triển nhằm tinh sạch và xác định đặc tính của các peptide có hoạt tính sinh học sau quá trình thủy phân Đầu tiên, peptide sẽ được tách sơ bộ bằng các phương pháp như kết tủa, sắc ký loại trừ, siêu lọc hoặc tách pha rắn một cách có chọn lọc Sau đó được tinh sạch hoàn toàn dựa trên sắc ký lọc gel hoặc sắc ký đảo pha (RP-HPLC) Và phương pháp xác định cấu trúc các loại peptide bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) [Leonli et al.,2000]

Kết tủa thường áp dụng cho các peptide hoặc protein có kích thước lớn, sử dụng dung dịch hữu cơ (methanol, ethanol hoặc aceton) hay acid (acid trichloracetic), hoặc muối có nồng độ cao (amoni sulphat) hoặc bằng cách điều chỉnh pH tới điểm đẳng điện

Phương pháp màng siêu lọc là phương pháp đơn giản nhằm phân đoạn peptide dựa theo kích thước phân tử của chúng Phương pháp lọc màng có thuận lợi là sự phân bố khối lượng phân tử của những peptide có tính năng mong muốn có thể được kiểm soát bằng cách dùng màng siêu lọc thích hợp Phương pháp lọc màng an toàn, dễ dàng lắp đặt, bảo tồn được cấu trúc phân tử và đòi hỏi năng lượng vừa phải

Ưu điểm chính của phương pháp lọc màng là làm cho sản phẩm có tính đồng nhất cao thông qua khả năng kiểm soát được khối lượng phân tử của các phân đoạn peptide trong hydrolysate Ngoài ra, để đạt được những peptide sinh học mong muốn có thể dùng nhiều enzyme để thủy phân bằng cách dùng kết hợp hệ thống phản ứng với hệ thống lọc màng nhiều bước Do vậy lọc màng là phương pháp triển vọng để sản xuất các peptide sinh học Ngoài ra, nó còn có một số ứng dụng khác nữa là cải thiện giá trị cảm quan, làm trong hoặc loại màu và cô đặc dịch thủy phân

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Năm 2012, He Ni, Lin Li và cộng sự đã công bố công trình nghiên cứu “Tách chiết và tinh sạch peptide ức chế ACE từ nấm men Sacharomyces cerevisiae” Nhóm tác giả đã Sử dụng ethanol 95%, thời gian 3 giờ, ở nhiệt độ 40o C để kết tủa acid nucleic và polysaccharide, sau đó ly tâm ở 11088 x g trong 15 phút, ở nhiệt độ

400C để loại bỏ tủa Dịch sau khi kết tủa loại tạp sử dụng phương pháp siêu lọc để thu peptide ức chế ACE ở 3 phân đoạn với kích thước màng 100kDa, 30kDa, 10kDa Thu được hexapeptide có khả năng ức chế ACE

 Phương pháp sắc ký sắc ký lọc gel

Sắc ký lọc gel (hay còn gọi là loại trừ kích thước) phân tách các peptide dựa theo kích thước và khối lượng phân tử, những chất có khối lượng phân tử lớn đi len lỏi bên ngoài ra trước những chất có khối lượng phân tử nhỏ chui qua lỗ gel ra sau, người ta thu các chất ở từng phân đoạn khác nhau Ưu điểm của sắc ký lọc gel là điều kiện có thể thay đổi thích hợp, tùy theo loại mẫu hoặc yêu cầu cụ thể cho các quá trình tinh sạch, phân tích và bảo quản sau này mà không làm ảnh hưởng đến quá trình phân tách He Ni et al., 2012 đã sử dụng sắc ký lọc gel trên gel shephadex G-10 (15x400 mm, 50ml, GE healthcare, USD để phân tách peptide ức chế ACE từ nấm men Tác giả Jian Fan et al., 2012 sử dụng sắc ký lọc gel trên gel shepadex G-

25 (Sigma Co.USD) để tách peptide chống oxy hóa từ protein của cá rô phi Dịch thủy phân cá tráp biển được tinh sạch với sự kết hợp các phương pháp sắc ký lọc gel trên cột Shephadex LH-20 (Ammersham Pharmasia biotech, Tokyo), cột trao đổi ion thu được peptide có hoạt tính sinh học cao nhất

Sắc ký đảo pha dựa trên nguyên lý hydrophobicity- không ưa nước của các phân tử Sự phân tách trong sắc ký ngược pha là dựa trên đặc điểm liên kết khác nhau của các chất tan có mặt trong mẫu như là kết quả về sự khác biệt về tính kỵ nước của chúng Các phân tử có mức độ kỵ nước khác nhau như protein, peptide, acid nucleic phân tách được nhờ sắc ký ngược pha có thể dễ dàng hồi tính và hòa tan trở lại Pha động trong sắc ký đảo pha thường là các dung môi phân cực có thể

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

là nước, metanol, axetonitril… Tuy nhiên, người ta thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi để có một pha động có độ phân cực phù hợp với phép phân tích

1.2 Tổng quan về protease

1.2.1 Khái niệm

Protease là các enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân protein tạo thành các peptide phân tử thấp, amino acid [4]

1.2.2 Giới thiệu một số chế phẩm Protease thương mại

Enzym protease khá phổ biến ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật

 Protease động vật: Các enzym có trong các cơ quan và mô cơ của động vật như: pepsin, trypsin, chymotrypsin, renin [4]

- Trypsin: là enzym từ tụy tạng lợn, kiềm tính (pH 8.0-8.5), phù hợp để thuỷ

phân protein thực phẩm Nó là một serine proteinase và thuỷ phân mối liên kết peptide giữa lysine và arginine

- Chymotrypsin: được tìm thấy ở dịch tuỵ tạng lợn , kiềm tính (pH 8.0-8.5), nó

đặc hiệu với mối liên kết peptide có các nhóm cacboxyl của các aminoacid thơm như phenylalanine, tryrosine hoặc tryptophan

- Pepsin: là một proteinase axit, hoạt động thích hợp ở pH = 1.3 – 2.2 Thu

được từ dạ dày lợn Enzym này thuỷ phân mối liên kết peptit giữa hai amino acid ưa béo Được sử dụng trong quá trình làm lạnh bia và mục đích tiêu hoá

- Renin: là protease axit tính (pH 2-2.5) thu từ ngăn thứ 4 dạ dày bê Thường

được ứng dụng làm đông tụ sữa trong sản xuất pho mát

 Protease từ vi sinh vật

 Alcalase: là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch được sản xuất bằng cách lên men chìm chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis Alcalase là một endo - protease của các loại serine Nó có

tính đặc hiệu cơ chất rất rộng Nói cách khác , nó có thể thủy phân hầu hết các liên kết peptit trong một phân tử protein.Alcalase hoạt động giữa pH 7.5

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

và 9.0, tối ưu ở 8.5 Nhiệt độ hoạt động tối ưu 45 và 65 ° C với hoạt tính mạnh nhất vào khoảng 60 ° C , nếu nhiệt độ lớn hơn hoạt tính giảm nhanh

 Neutrase : là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan

mạch, được sản xuất nhờ quá trình lên men chìm chủng Bacillus amyloliquefaciens thường được dùng để phá vỡ liên kết peptide, là 1

protease trung tính hoạt động tối ưu trong khoảng pH: 5.5-7; nhiệt độ tối ưu : 45-55ºC Neutrase bị vô hoạt ở 850C trong 2 phút Sự ổn định của neutrase

ở nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất

 Flavouzyme : được sản xuất bởi Novozymes (Đan Mạch) Đây là enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc Aspergillus oryzae Flavouzyme ở dạng bột và có cả

tính exopeptidase và endoprotease.Nhiệt độ hoạt động tối ưu pH tối ưu 5,0 – 7,0 Bảo quản ở 5oC cho đến khi sử dụng

1.3 Tổng quan về bã nấm men bia

1.3.1 Giới thiệu về nấm men Saccharomyces

Saccharomyces là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, thuộc giới nấm, sinh sản

bằng cách nảy chồi (từ một tế bào “ nảy chồi” và phát triển thành tế bào mới Nấm men là một cá thể sống đơn bào có cấu tạo tương đối phức tạp và không có khả năng quang hợp So với vi khuẩn thì chúng có kích thước lớn hơn gấp nhiều lần Thức ăn chủ yếu là cacbohydrat (đường, mạch nha, cao đường…), tế bào nấm

men Saccharomyces cerevisiae rất giàu dinh dưỡng, nhất là axit nucleotic (đạm, hay

còn gọi là protein) Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối

tế bào Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng khác nhau Ngay trong cùng một loài, hình dạng tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện sống và tuổi đời Trong môi trường đặc biệt thì nấm men có hình dạng rất ổn định Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn Nấm men có hình tròn, hình trứng

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii Kích thước tương đối lớn 2.5-10 µm , chiều dài khoảng 4.5-21 µm Khối

lượng nguyên tử khoảng 1.055-1.060 kDa

Hình 1.6 Hình dạng tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae

So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt

từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ,…), ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như: Ti thể, lục lạp,…

1.3.2 Thành phần hóa học bã nấm men bia

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc vào chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Brazil với kết quả đã được công bố trên tạp chí J Agric Food Chemistry năm 2005, thành phần hóa học của nấm men bia bao gồm:

Bảng 1.1 Thành phần chất khô của men bia [17]

Thành phần Hàm lượng (%)

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

Chất xơ hòa tan 30.3 Chất xơ không tan 1.1

Bên cạnh đó, bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, nhóm tác giả đã đưa ra kết quả về thành phần những amino acid thiết yếu, được trình bày theo bảng sau :

Bảng 1.2 : Thành phần các amino acid thiết yếu trong nấm men bia [17]

Amino acid thiết yếu Hàm lượng

tố hormone, tiền vitamine D (ecgosterin) và các chất sinh trưởng ( biot I, biot II ) Hàm lượng vitamin trong tế bào nấm men như sau (μg/g chất khô): Inozit

6000 – 15000; biotin (vitamin H) 0.6 ÷ 0.7; riboflavin (vitamin B2) 30 ÷ 60; axit

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

pantotenic (vitamin B3) 2.0 ÷ 19.0; thiamin (vitamin B1) 24 ÷ 50; pyridoxine (vitamin B6) 14 ÷ 39; nicotinamit (vitamin B5) 370 ÷ 750

Chất khoáng chiếm khoảng 5-11%, có vai trò quan trọng trong hoạt động của tế bào nấm men, đặc biệt là phospho có trong thành phần photphatide, nucleorotein Ngoài ra trong tế bào nấm men còn có chứa các ion kali, magie, sắt, lưu huỳnh và acid silic chúng tham gia vào thành phần của nhiều enzyme, vitamin

và nhiều hợp chất khác nữa trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm của tế bào Như vậy, protein là thành phần chủ yếu trong chất khô tế bào nấm men Nếu ta tận dụng thuỷ phân nguồn thứ phẩm thải ra từ các nhà máy bia sẽ thu được dịch thuỷ phân protein nấm men có giá trị dinh dưỡng cao Vì thế nó sẽ là nguồn nguyên liệu lý tưởng được khai thác trong tương lai

Nghiên cứu với bã nấm men bia được thu từ nhà máy bia Sabeco cho thấy, mẫu chứa 38% Protein so với khối lượng bã bia tươi

1.3.3 Sản lượng bã nấm men bia và hiện trạng sử dụng tại Việt Nam

Một vài con số tiêu biểu cho tình hình tiêu thụ bia tại Việt Nam tính đến 2015 lượng bia tiêu thụ tăng trung bình 12% giai đoạn 2006-2010, tăng 13% giai đoạn 2011-2015 Năm 2013, Việt Nam tiêu thụ 3 tỉ lít bia, tương đương khoảng 3 tỉ USD Trung bình, mỗi người Việt tiêu thụ khoảng 32 lít bia/năm Sản lượng bia tiêu thụ trong nước tăng đều hằng năm, từ 1,29 tỉ lít năm 2003 tăng lên 2,8 tỉ lít năm 2012

và 3 tỉ lít năm 2013 Năm 2014, Việt Nam đã sản xuất và tiêu thụ trên 3,14 tỷ lít.Dự báo, khả năng sản lượng bia Việt Nam có thể đạt 4,2-4,5 tỉ lít vào năm 2015 Hiện

cả nước có hơn 400 nhà máy bia Thị trường bia Việt Nam đã hiện diện gần đủ các thương hiệu bia hàng đầu thế giới và khu vực với khoảng 30 thương hiệu bia quốc

tế đang có mặt[41,42] Theo số liệu thực tế của một nhà máy bia cho biết, mỗi tháng

để sản xuất được nhà máy lại thải bỏ 4,5 tấn bã men bia Trung bình, mỗi 100 lít bia thành phẩm sẽ thải bỏ 1.3 - 1.5 kg bã nấm men bia Như vậy, với 4,2 - 4,5 tỉ lít bia hàng năm sẽ thải bỏ khoảng 67.5 nghìn tấn bã Trong số đó, một phần lớn được

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học đem chế biến thành thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm, cá… một phần được ứng dụng làm phân bón, số ít được ứng dụng trong các nghiên cứu khoa học như ứng dụng bã nấm men bia tạo nguồn dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật, hoặc thủy phân tạo các axit amin giàu dưỡng chất bổ sung vào nguồn thực phẩm Tuy nhiên, việc ứng dụng bã nấm men bia còn chưa được thực hiện một cách triệt để hoàn toàn mà còn nhỏ lẻ Chính vì vậy mà lượng bã nấm men bị thải bỏ ra ngoài môi trường cũng rất đáng kể Là một nguồn cơ chất giàu protein, nếu không được xử lý hợp lý,bã nấm men bia sẽ là một nguồn gây ô nhiễm nặng ảnh hưởng tới môi trường sống

1.3.4 Một số ứng dụng của bã nấm men bia trên thế giới và ở Việt Nam

 Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Bã nấm men bia không những là nguồn cung cấp dinh dưỡng dồi dào mà còn chứa nhiều hợp chất kích thích miễn dịch như β-glucan, các axit nucleic cũng như là mannan oligosaccharite [22] Bã nấm men bia có thể thay thế 50% protein thường dùng cung cấp vào nguồn thức ăn hàng ngày cho cá mà không có ảnh hưởng bất lợi nào tới sự phát triển của chúng [22] Tuy nhiên, chỉ có khoảng 30% bã nấm men bia được sử dụng cho mục đích này Một trong những nguyên nhân là do sự cản trở tiêu hóa bã nấm men bia với một số loại tôm, cá Từ các nghiên cứu cho thấy, thành tế bào nấm men đã ngăn cản sự tiêu hóa protein bên trong nhân [22] Phá vỡ thành tế bào nấm men sẽ làm tăng sự phân giải protein đồng thời làm tăng lượng dinh dưỡng cung cấp vào thức ăn cho tôm, cá [22] Một số ứng dụng nổi trội của nguồn thức ăn cho tôm, cá : Năm 2003, Ricci và cộng sự đã nghiên cứu công thức bổ sung nấm

men bia vào môi trường nước giúp nuôi dưỡng Panagrellus redivivus (một loại sinh

vật là thức ăn của tôm cá và một số loại giáp xác trong nước) Nghiên cứu này đã đem lại ứng dụng có ý nghĩa, làm giảm giá thành sản xuất thức ăn chăn nuôi nhờ làm tăng sinh các nguồn thức ăn tự nhiên cho tôm, cá và giáp xác Năm 2005, Li và Gatlin đã đưa ra công thức chuẩn cho chế phẩm hỗn hợp prebiotic và nấm men GroBiotic có khả năng kích thích miễn dịch và tăng cường kháng Mycobacterium marinum (gây bệnh “lao cá” hoại tử trên bề mặt thân tôm, cá) và Streptococcus

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

công thức chế phẩm Grobiotic-A như một chất bổ sung vào thức ăn chăn nuôi với hàm lượng từ 2- 5% giúp nâng cao sức sống của tôm

Ở Việt Nam, việc ứng dụng bã nấm men bia làm nguồn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi đã được thực hiện từ lâu, tuy nhiên vẫn còn bị hạn chế Việc nghiên cứu

sử dụng chưa nhiều, quy trình công nghệ còn thô sơ Thực tế ở một nhà máy cho thấy, sau khi quá trình sản xuất, bã nấm men được sấy khô cùng bã malt bia, bổ sung một số chất phụ gia tạo thành thức ăn chăn nuôi gia súc với hệ số sử dụng thấp Một phần được bán cho các phân xưởng hoặc nông dân xử lý làm phân bón, chăn nuôi gia súc, gia cầm Lượng còn lại sau khi được xử lý được thải bỏ ra ngoài môi trường Vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng của bã nấm men bia là hết sức cần thiết, tuy nhiên hiện nay chỉ có một số ít đề tài nghiên cứu ứng dụng đối với đối tượng là vật nuôi hoặc cho vi sinh vật, hầu như chưa có nghiên cứu ứng dụng nào từ

bã nấm men bia cho con người

Các nghiên cứu cụ thể trong nước được đánh giá cao như: Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Thạc sĩ Nguyễn Văn Nguyện, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch TPHCM (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II) đã nghiên cứu thành công việc tận dụng bã men bia tạo chế phẩm (có phối trộn thêm một số chất phụ gia) bổ sung vào thức ăn nuôi tôm sú Nhóm nghiên cứu của Th.S Nguyện đã tiến hành thực hiện thành công quy trình thủy phân bã men bia để thu chế phẩm sinh học beta-glucan (dạng bột) sau đó kết hợp phối trộn giữa beta-glucan với chế phẩm OG (oligoglucosamin, được chiết tách từ vỏ tôm có tác dụng tăng sức đề kháng cho con tôm đối với các loại virus, vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tôm) và chất phụ gia

là đường lactose Thử nghiệm trong thực tế nhóm nghiên cứu cũng xác định được tỷ

lệ chế phẩm bổ sung vào thức ăn cho tôm đạt hiệu quả cao là từ 3-5g/kg thức ăn Kết quả bước đầu khi ứng dụng thử nghiệm từ các ao nuôi tôm rất khả quan, tôm tăng trưởng nhanh, ít bệnh, tỷ lệ sống cao Ước tính năng suất tăng khoảng 33,6% Tỷ lệ tôm sống mạnh khỏe (ít bệnh) tăng khoảng 10,6% Mức tiêu tốn thức

ăn cũng giảm.[43]

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học Năm 2014, PGS.TS Phạm Việt Cường, Viện trưởng Viện nghiên cứu khoa học miền Trung cùng các nhà nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm

KH &CN Việt Nam) đã thu hồi Beta – glucan từ thành tế bào của nấm men bia Qua quá trình tách chiết, thủy phân dịch tế bào khiến protein trở thành amino acid có tác dụng tăng cường miễn dịch, kháng khối u, kháng tế bào ung thư, giúp cơ thể tăng cường sinh lực, tăng cường quá trình trao đổi chất, tạo tế bào mới Sau đó, các nhà nghiên cứu đã kết hợp một số vi sinh vật với axit amin và Beta - glucan, cho ra đời hai chế phẩm: ImunoFood (là loại thực phẩm chức năng cho người) và NeoPolynut (để bổ sung vào thức ăn cho thủy sản và gia súc gia cầm)

Kết quả khảo nghiệm cho thấy sản phẩm ImunoFood - thực phẩm chức năng

có chứa Beta - glucan, axit amin tự do chiết xuất từ nấm men do TS Cường cùng đồng nghiệp nghiên cứu và sản xuất, giúp tăng cường hệ miễn dịch cho con người

Sử dụng sản phẩm NeoPolynut với tôm nuôi, các kết quả so sánh cho thấy, khi được

ăn thực phẩm chứa Beta - glucan, vật nuôi sẽ lớn nhanh hơn, tăng khả năng chịu rét

và kháng bệnh Với các loại gia cầm như gà, ngan, vịt, các loại vật nuôi được ăn thêm Beta - glucan đều lớn nhanh và chất lượng tốt hơn nuôi thông thường Tuy nhiên, NeoPolynut vẫn chưa được sản xuất đại trà do vướng mắc về quy mô sản xuất

 Bã nấm men bia sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật

Nhờ có hàm lượng cao các chất dinh dưỡng, protein, các vitamin nhóm B và khoáng chất mà bã nấm men bia sau khi tự phân và thủy phân được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật như Champane và cộng sự (2003) đã sử dụng cao nấm men bổ sung vào môi trường nuôi cấy Lactobacillus casei EQ28 ( Lactobacillus acidophilus EQ57, Pediococcus acidilactici MA18/5-M được xem như là các probiotic tiêu hóa tiềm năng Năm 2007, Rakin và cộng sự đã nghiên cứu công thức phối trộn giữa nước ép

củ cà-rốt với dịch tự phân bã nấm men bia tạo môi trường cho chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus phát triển hiệu quả làm tăng hàm lượng khoáng chất trong nước ép cà rốt và nâng cao khả năng tạo thành acid lactic Năm 2009, Jiang và cs đã

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

sử dụng dịch tự phân và thủy phân bã nấm men bia để nuôi cấy Actinobacillus succinogenes NJ113 để thu nhận enzyme thủy phân cơ chất tạo acid succinic cho nghiên cứu phân hủy sinh học các polymer Ở Việt Nam, hiện có một số nghiên cứu

cụ thể như đề tài “ Nghiên cứu tận dụng bã nấm men bia để chế biến men chiết xuất dùng làm thành phần để bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh” được thực hiện tại bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh (2005), đề tài đã nghiên cứu quy trình thủy phân bã nấm men biaở nhiệt độ 100oC, trong 8 giờ với hàm lượng HCl 6% thu được 8.07g/l Protein gồm 17 loại axit amin Tuy nhiên đề tài trên mới dừng lại ở mức độ nghiên cứu và chưa có những ứng dụng thực tế

Việc ứng dụng bã nấm men bia bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

đã và đang được ứng dụng hàng ngày, tuy nhiên chúng ta vẫn phải nhập khẩu nguồn dinh dưỡng này từ các nhà cung cấp ngoài nước trong khi lượng bã nấm men bia dồi dào trong nước lại đang bị “bỏ ngỏ”

 Bổ sung vào thực phẩm

Ngoài việc tận dụng nguồn dinh dưỡng từ bã nấm men bia làm thức ăn chăn nuôi và nuôi cấy vi sinh vật thì việc ứng dụng nguồn nguyên liệu giàu protein này vào thực phẩm cho con người cũng là một hướng đi đầy hứa hẹn Ví dụ, bột chiết từ nấm men khô khi cho vào thực phẩm có thể tạo hương, tăng cường mùi hương của sản phẩm Khi được bổ dung vào các sản phẩm từ thịt, nước chấm và nước sốt, súp, các loại snack và bánh quy, chúng cũng làm tăng mùi vị thơm ngon hơn (Chae, Joo

& In., 2001)

β -Glucan được thu nhận từ nấm men bia cũng được sử dụng bằng cách bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm như ở dạng cô đặc, dạng nước, … Nấm men bia được tự phân sau đó tiến hành đồng hóa, chiết bằng alkali trước, sau đó được tách bằng axit rồi sấy khô (Thammakiti, Suphantharika., 2004)

Một số loại vi sinh vật prebiotic trong đường ruột được kích thích phát triển khi con người bổ sung thực phẩm có chứa protein từ nấm men bia, bên cạnh đó một

số nghiên cứu cũng hướng đến khả năng kháng sinh học của nguồn chất dinh dưỡng

Luận văn thạc sỹ Công nghệ sinh học

này Tuy nhiên, việc sử dụng như nào để có hiệu suất cao nhất thì cần được nghiên

cứu sâu và kỹ càng hơn

 Xu hướng ứng dụng trong tương lai

Với nhiều lợi thế về nguồn nguyên liệu dồi dào cả về số lượng và chất lượng , giá thành rẻ… bã nấm men bia hứa hẹn một tương lai nghiên cứu và ứng dụng rộng

mở Ví dụ, các nhà khoa học đã nghiên cứu tách chiết enzyme pectinase từ Saccharomyces cerevisiae để thủy phân một số loại quả, ứng dụng trong thực phẩm Một số ứng dụng đang được hướng đến từ việc sử dụng nấm men bia như một chất hấp thụ sinh học có thể hấp thụ các kim loại nặng, thuốc nhuộm để loại bỏ ra khỏi nguồn nước…

Một nhóm chuyên gia về khí đốt sinh học của Đức, Bengel cho rằng bã bia cũng có thể tạo ra ra điện để cấp cho dây chuyền sản xuất bia Bã ngũ cốc ướt và nước thải được đưa vào một bể chứa men và vi khuẩn Các hợp chất hữu cơ sẽ bị vi khuẩn phân hủy để tạo ra khí metan Khí này và phần bã khô từ bể được đốt cháy để đun nước và tạo ra dòng hơi nước áp suất cao Hơi nước sẽ làm quay turbine để tạo

ra điện “Với quá trình đó một nhà máy bia hiện đại có thể tự sản xuất tới 60% nhu cầu điện”, Bengel khẳng định

Tóm lại, bã nấm men bia là một nguồn sinh khối giàu có về cả chất lượng lẫn

số lượng với tiềm năng ứng dụng vô cùng lớn lao với nhiều lĩnh vực khác nhau Tuy nhiên, vẫn còn một số mặt hạn chế trong quá trình xử lý Một số nghiên cứu đã được ứng dụng vào thực tế sản xuất, tuy nhiên vẫn ở quy mô nhỏ Để có thể nhân rộng mô hình sản xuất các sản phẩm từ bã nấm men bia cần có sự quan tâm đầu tư, nghiên cứu của nhiều đơn vị hơn nữa