NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU CÁC KHÁNG NGUYÊN CỦA Listeria monocytogenes CỦA MỘT SỐ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG NHẰM SỬ DỤNG TRONG TẠO QUE THỬ NHANH

Nguyễn Thị Trung - Nghiên cứu khả năng nhận biết đặc hiệu các kháng nguyên của Listeria monocytogenes của một số kháng thể đơn dòng nhằm sử dụng trong tạo que thử nhanh 215... Nguyễn T[r]

Tập 164, số 04, 2017

T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ

CHUYÊN SAN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP - LÂM NGHIỆP - Y DƯỢC

Nguyễn Thế Hùng, Nguyễn Thị Lân - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cây trồng xen đến sinh trưởng và

năng suất của giống dong riềng DR3 tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 3

Nguyễn Viết Hưng, Lê Thị Kiều Oanh, Hoàng Kim Diệu, Nguyễn Thị Trang - Nghiên cứu khả năng sinh

trưởng, phát triển của một số giống bí đỏ tại Thái Nguyên năm 2015 9

Lê Thị Kiều Oanh, Trần Văn Điền, Trần Đình Hà, Trần Trung Kiên - Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát

triển của một số giống đậu xanh trong vụ Hè Thu năm 2015 tại Thái Nguyên 15

Hà Đình Nghiêm, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thị Huệ - Quản lý cây trinh nữ móc (Mimosa

diplotricha) bằng mô hình dự đoán phân bố, mức độ xâm lấn và sử dụng sinh khối để trồng nấm 21

Nguyễn Thị Lân, Nguyễn Thế Hùng - So sánh, lựa chọn giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt cho vụ mùa tại

Nguyễn Thị Tuyên, Nguyễn Việt Hưng - Phương pháp phòng trừ mối hại gỗ trong các công trình xây dựng

Nguyễn Hải Hòa, Trần Thị Phương Thúy, Dương Trung Hiếu, Nguyễn Thị Thu Hiền - Sử dụng ảnh SPOT 6

xây dựng bản đồ sinh khối và trữ lượng các bon rừng trồng thông thuần loài tại xã Nguyên Bình, huyện Tĩnh Gia,

Nguyễn Việt Hưng, Nguyễn Thị Tuyên - Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ lá xoan trong bảo quản gỗ 47

Đặng Minh Tơn, Đặng Văn Minh, Nguyễn Văn Toàn - Các loại đất chính, phân bố và tính chất trên địa bàn

Nông Thị Huyền Chanh, Hoàng Hữu Chiến - Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt động khai thác cát sỏi đến biến

động sử dụng đất nông nghiệp trên địa bàn xã Hợp Thịnh, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang 61

Triệu Mùi Chản, Chu Văn Trung , Đỗ Sơn Tùng, Nguyễn Đình Thi, Nguyễn Thảo Yến, Bùi Thị Hường,

Hoàng Đông Quang - Xây dựng hệ thống lập quy hoạch kế hoạch sử dụng đất bán tự động 67

Nguyễn Văn Lợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi chất lượng của quả vải thiều sau thu hoạch 75

Phạm Thị Phương, Nguyễn Thị Đoàn, Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Thị Nhung, Lưu Hồng Sơn - Nghiên cứu hiệu

quả bảo quản của compozit của chitosan khối lương phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản đào Pháp 81

Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân, Nguyễn Văn Quang, Phan Thị Hồng Phúc, Lê Minh, Phạm Diệu

Thùy, Trần Nhật Thắng, Dương Thị Hồng Duyên - Xác định serotype, độc lực và tính kháng kháng sinh của 3

loại vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh 87

Nguyễn Thị Thúy Mỵ, Trần Thanh Vân, Đỗ Thị Kiều Duyên - Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm Mfeed+

đến sức sản xuất thịt của gà F 1 (ri x Lương Phượng) nuôi nhốt tại Thái Nguyên 97

Từ Trung Kiên, Trần Thị Hoan, Nguyễn Văn Sơn- Ảnh hưởng của bổ sung dầu hạt lanh vào khẩu phần đến

Trương Hữu Dũng, Nguyễn Thị Hằng, Phùng Đức Hoàn - Đánh giá khả năng sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn

của 3 tổ hợp lợn lai thương phẩm (DP x CA); (PD x CA) VÀ (LP x CA) giai đoạn sơ sinh đến 56 ngày tuổi 109

Sử Thanh Long, Nguyễn Công Toản, Trần Văn Vũ - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian mang

thai của bò sữa nuôi tại xí nghiệp bò Phù Đổng, Hà Nội 115 Trần Thị Hoan, Từ Trung Kiên, Nguyễn Thị Hiền - Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay thế thức ăn viên

hỗn hợp bằng cỏ Ghinê (panicum maximum) trong khẩu phần đến hiệu quả sử dụng thức ăn và năng suất của

Hoàng Đình Hòa, Nguyễn Văn Lợi - Xác định các cấu tử hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây kinh

Journal of Science and Technology

164 (04)

N¨m 2017

Vũ Khánh Linh, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Lâm, Lương Hùng Tiến - Phân lập và tuyển chọn một

số chủng vi sinh vật phân giải cellulose hướng tới tạo ra chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 133

Vũ Hoài Nam, Dương Văn Cường - Tăng cường sinh tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli tái tổ hợp được

Nguyễn Thị Thu Ngà, Sỹ Danh Thường, Cao Thị Phương Thảo - Sử dụng mã vạch DNA để định loại loài Màn

Trịnh Đình Khá, Lý A Hù, Đặng Duy Phong, Nguyễn Hữu Quyền, Hoàng Thị Thiên Hương - Tổng hợp nano

bạc bằng dịch chiết lá đào Prunus persica và hoạt tính kháng khuẩn của nó 153

Nguyễn Thị Thu Hà, Chu Thị Na, Cao Thị Phương Thảo - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu một số

loài cây cảnh hạn sinh thuộc họ thuốc bỏng (Crassulaceae) 157

Phạm Thị Mỹ, Hoàng Thị Mai, Vi Đại Lâm, Dương Mạnh Cường - Thử nghiệm điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn phân giải nitơ phân lập từ một số mẫu nước tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 165 Hoàng Thị Lan Anh, Dương Thị Minh Hòa - Nghiên cứu ứng dụng mô hình lọc tái tuần hoàn nước thải khu ký

túc xá Trường Đại học Nông Lâm bằng sét Kabenlis 3 171

Dương Hữu Lộc, Nguyễn Xuân Vũ, Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm - Đặc điểm nông sinh học và mối

quan hệ di truyền của một số giống quýt (Citrus Recutilata Blanco) tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 177

Đinh Thị Huyền Chuyên, Sỹ Danh Thường, Trịnh Đình Khá, NguyễnThị Yến - Nghiên cứu đặc điểm hình

thái và hoạt tính kháng khuẩn của loài màn màn vàng thu thập ở tỉnh Thái Nguyên 183

La Việt Hồng, Trần Hồng Thu, Phạm Thị Quy, Đinh Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Ngọc Khánh

- Xác định chỉ thị phân tử và tái sinh chồi in vitro của loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll ex

Nguyễn Hải Linh, Ma Diệu Quỳnh, Ma Thị Thu Lệ, Bùi Thị Thu Thủy, Vũ Thị Minh Hồng, Nguyễn Thị Hồng

Hạnh - Cao cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.) có tác dụng hỗ trợ điều trị béo phì trên chuột nhắt trắng 195

Lê Phong Thu, Nguyễn Thu Thủy, Tạ Văn Tờ - Tổng quan đáp ứng mô bệnh học ung thư vú sau điều trị hóa

Hà Trọng Quỳnh - Lượng giá thiệt hại sức khỏe cộng đồng do ô nhiễm không khí tại phường Tân Long, thành

Nguyễn Thị Trung - Nghiên cứu khả năng nhận biết đặc hiệu các kháng nguyên của Listeria monocytogenes của

một số kháng thể đơn dòng nhằm sử dụng trong tạo que thử nhanh 215

Nguyễn Thị Trung Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 215 - 220

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU CÁC KHÁNG NGUYÊN

CỦA Listeria monocytogenes CỦA MỘT SỐ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

NHẰM SỬ DỤNG TRONG TẠO QUE THỬ NHANH

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

TÓM TẮT

Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ngộ độc thực phẩm Vi khuẩn này có thể phát hiện

được bằng nuôi cấy trong môi trường chọn lọc, phương pháp sinh học phân tử hoặc phương pháp miễn dịch học Công trình này công bố kết quả sàng lọc kháng thể để gắn lên màng trong phương

biết được các kháng nguyên của L monocytogenes gồm protein tổng số, protein tan và protein

protein màng ngoài của L monocytogenes mà không nhận biết protein màng ngoài của E coli

hoặc Salmonella được sử dụng làm kháng thể phát hiện Cặp kháng thể này đã được sử dụng tạo que nhúng, kết quả là que nhúng đã hoạt động được Kết quả ban đầu này hứa hẹn sẽ mở ra việc

sản xuất được các que thử nhanh để phát hiện L monocytogenes trong thực phẩm.

Từ khóa: Listeria monocytogenese, kháng thể đơn dòng, protein màng ngoài, tế bào nguyên vẹn,

ngộ độc thực phẩm

Mặc dù L monocytogenes không phải là một

bệnh phổ biến trong cộng đồng nhưng nó là

một tác nhân gây bệnh quan trọng ở những

bệnh nhân mang thai, trẻ sơ sinh, người già và

những người bị suy giảm miễn dịch Đó là

một loại vi sinh vật gây bệnh ngộ độc thực

phẩm điển hình Listeria còn là một tác nhân

Có thể phân lập được Listeria trong đất, nước

monocytogenes có thể phát hiện được bằng

phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương

pháp miễn dịch học, cảm biến sinh học hoặc

các phương pháp sinh học phân tử [4], [11]

Các phương pháp nuôi cấy truyền thống là

phương pháp đáng tin cậy, chính xác và vẫn

được sử dụng mặc dù chúng tiêu tốn thời gian

và công sức [4] Các phương pháp dựa vào

thông tin di truyền như PCR, giải trình tự gen

hoặc lai DNA cần khoảng 48 giờ để đọc kết

quả [11] Các phương pháp miễn dịch học

như ELISA, EFLA cần khoảng 2 giờ để có

kết quả, tuy nhanh hơn phương pháp nuôi cấy

truyền thống nhưng độ tin cậy của chúng còn

phụ thuộc vào các kháng nguyên và các

kháng thể được sử dụng [13]

*Tel: 0936 270978; Email: trungnguyen@vast.vn

Kháng nguyên của L monocytogenes khá đơn

giản, các kháng thể đặc hiệu của chúng đã được nghiên cứu và chúng không phản ứng chéo với các kháng thể của các loài khác Do vậy, chúng ta có thể sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên để tạo các bộ sinh phẩm chẩn

đoán L moneocytognes Hiện nay, có khá nhiều kháng thể đơn dòng kháng L

monocytogenes đã được sản xuất Kháng thể

đơn dòng kháng protein p60 của L

monocytogenes (dòng P6007) đã được sản

xuất bởi công ty Millipore Kháng thể này

nhận diện protein màng ngoài của L

monocytogenes [7] Công ty Meridian sản

xuất một số loại kháng thể đơn dòng kháng L

monocytogenes như C86020M, C86030M,

C86713M, C86503M Các kháng thể này đặc hiệu với protein màng ngoài hoặc là tế bào còn nguyên vẹn Hoặc kháng thể đơn dòng C86032M, C86909M chỉ nhận biết protein

màng ngoài của L monocytogenes [6] Công

ty USBio sản xuất kháng thể đơn dòng

L2650-02P kháng protein P60 của L

monocytogenes [8]

Sinh phẩm phát hiện nhanh dựa trên cơ sở phản ứng kháng nguyên-kháng thể trên màng

Nguyễn Thị Trung Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 215 - 220

216

mỏng còn được gọi là sắc ký miễn dịch có thể

là dạng thử nhanh hoặc là dạng que nhúng

đơn giản Chúng được phát triển dựa trên

nguyên lý của phản ứng kết dính đặc hiệu của

kháng nguyên - kháng thể trên một màng

nitrocellulose [13] Để sản xuất một que thử

nhanh chẩn đoán L monocytogenes chúng ta

cần phải có hai loại kháng thể đơn dòng cùng

nhận biết L monocytogenes nhưng không

nhận biết nhau Một kháng thể gọi là kháng

thể bẫy bắt được cố định tại của sổ nhận mẫu

Một kháng thể gọi là kháng thể phát hiện

được cố định trên vạch kiểm tra Việc lựa

chọn được hai kháng thể này là một việc làm

tốn khá nhiều thời gian Trong nghiên cứu

này chúng tôi trình bày các kết quả nghiên

cứu về việc tìm kiếm cặp kháng thể đơn

dòng thương mại phù hợp để tạo que thử

nhanh phát hiện L monocytogenes Kết quả

là cặp kháng thể C86020M, C86030M đã

được lựa chọn để tạo que thử nhanh phát

hiện L monocytogenes Que thử tạo ra đã

được thử nghiệm đối với protein màng ngoài

của L monocytogenes cho kết quả tốt Cả hai

vạch đối chứng và vạch kiểm tra đã xuất

hiện băng màu chứng tỏ chúng đảm bảo

được tính kháng thể trong thí nghiệm tạo que

thử thử nghiệm

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu và môi trường nuôi cấy

Kháng thể: Kháng thể đơn dòng kháng L

monocytogenes (IgM) sản xuất từ chuột -

C86020M; kháng thể đơn dòng kháng L

monocytogenes (IgG1) sản xuất từ chuột -

C86030M (Meridian Life Science, Mỹ); kháng

thể kháng chuột (IgM) cộng hợp alkaline

phosphatase A9688-1ML (Sigma, Mỹ)

Chủng vi sinh vật: E coli ATTC11105, S

enteritidis ATTC13076 chủng thử nghiệm lưu

trữ tại Viện Công nghệ Sinh học; L

monocytogenes do nhóm nghiên cứu của

GS.TS Nguyễn Thùy Châu, Viện Bảo quản

sau thu hoạch phân lập tại Việt Nam cung cấp

Các vật liệu khác: Bộ kít hiện màu dùng cho

alkaline phosphatase - 170-6432, màng nitrocellulose (Bio-Rad, Mỹ)

Môi trường nuôi cấy: LB (5,0 g cao nấm men;

5,0g prptone, 10,0 g NaCl, nước cất đủ 1000 ml); LBA: 1000 ml môi trường LB bổ sung 15

g bột thạch; BHIB - 299070 (BD): 7,7 g Calf Brains, 9,8 g Beef Heart, 10,0g peptone, 5,0g NaCl, 2,0 g Dextrose, 2,5 g Na2HPO4, nước cất đủ 1000 ml; BHIA - 241830 (BD): thành phần tương tự môi trường BHIB, bổ sung 15

g bột thạch cho mỗi 1000 ml; tất cả các môi

quản ở 4oC và dùng trong một tuần

Phương pháp nghiên cứu

Nuôi cấy vi khuẩn

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng:

Chuyển một khuẩn lạc từ đĩa môi trường thạch vào môi trường lỏng phù hợp, lắc 200 vòng/phút từ 12-16 giờ ở nhiệt độ thích hợp

Tách các loại protein

Phương pháp tách các loại protein được thực hiện theo phương pháp của Quan và đồng tác giả năm 2013 có cải tiến [10]

Chuẩn bị mẫu vi sinh: Các vi khuẩn thí

nghiệm được nuôi cấy trong môi trường lỏng thích hợp qua đêm ở nhiệt độ thích hợp từng loài Ly tâm 6000 vòng/phút trong 7 phút để thu tế bào Tế bào được rửa 3 lần bằng dung dịch 50 mM Tris pH7,5 Bảo quản tế bào ở

4oC đến khi sử dụng

Phá vỡ tế bào bằng siêu âm: Hòa tế bào thu từ

50 ml dịch nuôi cấy vào 5 ml dung dịch 50

mM Tris-HCl pH7,5, siêu âm 3 phút với chu

kì 10 giây hoạt động, 10 giây nghỉ

Thu protein tổng số: Dịch tế bào đã siêu âm

được ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút Phần dịch nổi chứa protein tổng số của tế bào được thu lại

Thu protein tan: Dịch protein tổng số được ly

tâm 13000 vòng/phút trong 60 phút Phần dịch nổi chứa các protein tan của tế bào được thu lại

Nguyễn Thị Trung Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 215 - 220

Thu protein màng ngoài: Phần cặn thu được

sau khi phân tách protein tan được rửa nhiều

lần bằng dung dịch 50 mM Tris-HCl pH 7,5

Cặn được hòa vào dung dịch 0,1% saccosyl

trong 50 mM Tris-HCl pH7,5, lắc 60 phút 200

vòng/phút trong 60 phút, loại bỏ phần dịch

nổi chứa các protein màng trong, thu phần

cặn chứa protein màng ngoài

Thí nghiệm dot-ELISA

Thí nghiệm dot-ELISA được tiến hành theo

mô tả của Donald và đồng tác giả năm 2000

có cải tiến [2]:

Gắn protein lên màng: 5 l dung dịch protein

được nhỏ trực tiếp lên một vị trí trên màng

nitrocellulose 60 phút sau, chuyển màng sang

dung dịch 5% sữa không béo trong dung dịch

TBS (1000 ml: 25 ml 1 M Tris.HCl pH 7,5,

10 ml 5 M NaCl), lắc ở 4oC qua đêm Rửa

màng bằng dung dịch TBS, 10 phút; sau đó

rửa bằng dung dịch TTBS (1000 ml TBS +

250 l Tween 20), 5 phút; lặp lại 3 lần

Nhuộm kháng thể: Nhuộm màng trong dung

dịch kháng thể kháng Listeria sản xuất từ tế

bào chuột, độ pha loãng thích hợp trong dung

dịch TBS ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Rửa

màng bằng TBS và TTBS như mô tả ở trên

Sau đó, màng được nhuộm tiếp với dung dịch

kháng thể kháng chuột cộng hợp alkaline

phosphatase trong 3 giờ ở 37oC Rửa màng

bằng TBS và TTBS như trên

Hiện màu: Màng được nhuộm trong dung

dịch hiện màu đến khi quan sát thấy các chấm

màu hiện lên rõ ràng, dừng phản ứng bằng

cách rửa màng nhiều lần với nước, quan sát

và chụp ảnh

Điện di protein trên SDS-PAGE

Điện di được tiến hành theo phương pháp của

Laemmli [9]

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tách các loại protein

Thực hiện tách chiết các loại protein theo

phương pháp của Quan và đồng tác giả [10]

như chúng tôi mô tả chi tiết trong phần phương pháp Kết quả ở Hình 1 cho thấy đã thu được các loại protein tổng số, protein tan, protein màng ngoài của vi khuẩn theo quy trình mô tả ở phần phương pháp Các protein màng tách được rất nhiều đối với các vi khuẩn gram âm (đường chạy 4-9) Nhưng

protein màng thu được ở vi khuẩn L

monocytogenes khá ít, đặc biệt là protein

màng ngoài Điều này hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đây về sự khác biệt của lớp

vỏ tế bào giữa vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương Các vi khuẩn gram âm có lớp vỏ

tế bào dày, bao quanh là một lớp màng ngoài, trong khi vi khuẩn gram dương có lớp vỏ mỏng, không có lớp màng ngoài bao quanh

[1] Vì thế protein màng ngoài tách chiết từ L

monocytogenes rất ít (đường chạy 3)

Hình 1 Phân tích các phân đoạn protein tách từ

vi khuẩn bằng điện di trên SDS-PAGE

Đường chạy 1-3: protein tổng số, protein tan và

protein màng ngoài của L monocytogenes, tương

ứng; 4-6: protein tổng số, protein tan và protein

màng ngoài của S enteritidis ATCC13076, tương

ứng; 7-9: protein tổng số, protein tan và protein

màng ngoài của E coli ATCC11105, tương ứng;

M: thang protein chuẩn

Thí nghiệm dot ELISA

Kháng thể C86030M nhận biết tất cả các loại

kháng nguyên của L monocytogenes đem

kiểm tra gồm protein tổng số, protein tan và protein màng ngoài (Hình 2) Kháng thể này không nhận biết protein màng ngoài của các

vi khuẩn Gram âm cùng gây bệnh ngộ độc

1 2 3 M 4 5 6 M 7 8 9

Nguyễn Thị Trung Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 215 - 220

218

thực phẩm như S enteritidis ATCC13076, E

coli ATCC11105 Điều này khá phù hợp với

khuyến cáo của nhà sản xuất rằng kháng thể

C86030M nhận biết phân đoạn protein màng

ngoài của L monocytogenes hoặc tế bào L

monocytogenes nguyên vẹn Kháng thể này

không phản ứng chéo với E coli, Salmonella

[5] Qua kết quả thí nghiệm này, kháng thể

C86030M được chọn làm kháng thể bẫy bắt

khi gắn lên màng que nhúng phát hiện L

monocytogenes Bằng cách này tất cả các

kháng nguyên của L monocytogenes được bắt

lại khi di chuyển qua vị trí gắn kháng thể

1 2 3

Protein tan

Protein màng ngoài

Protein tổng số

Hình 2 Sự nhận biết của kháng thể C86030M

đối với các protein bằng dot ELISA

Đường chạy 1: protein của E coli ATCC1115; 3:

protein của S enteritidis ATCC13076; 3: protein

của L monocytogenes

1 2 3

Protein tan

Protein màng ngoài Protein tổng số

Hình 3 Sự nhận biết của kháng thể C86020M đối

với các loại protein được kiểm tra bằng dot ELISA

Đường chạy 1: các loại protein của L

monocytogenes; 2: các loại protein của E coli

ATCC1115; 3: các loại protein của S enteritidis

ATCC13076

Kết quả ở Hình 3 cho thấy kháng thể C86020M

chỉ nhận biết protein màng ngoài của L

monocytogenes Nhưng kháng thể này nhận biết

protein tan và protein tổng số của tất cả các mẫu

kiểm tra gồm E coli và Salmonella Nếu L

monocytogenes đem kiểm tra tồn tại ở trạng thái

nguyên vẹn hoặc chỉ sử dụng protein màng ngoài cho các thử nghiệm miễn dịch thì sẽ thu được kết quả đặc hiệu Kháng thể C86020M được dùng làm kháng thể phát hiện Kháng thể này được gắn với hạt nano vàng để làm chất chỉ thị màu trên que thử

Thử nghiệm que nhúng dùng kháng thể bẫy bắt C86030M và kháng thể phát hiện C86020M

Quy trình tạo que nhúng không được trình bày chi tiết trong công trình này Trong đó, kháng thể C86030M sử dụng làm kháng thể bẫy bắt được gắn tại vạch kiểm tra; kháng thể C86020M cộng hợp hạt nano vàng sử dụng làm kháng thể phát hiện được gắn tại vị trí nhận mẫu; kháng thể kháng chuột được gắn tại vạch đối chứng

Hình 4 Que nhúng gắn cặp kháng thể C86030M

và C86020M thử nghiệm với protein màng ngoài

của L monocytogenes

Kết quả nhận được cho thấy có 2 vạch mầu xuất hiện tại cửa sổ đọc kết quả Điều này chứng tỏ kháng thể C86020M (IgM) cộng hợp hạt nano vàng đã kết hợp được với kháng

nguyên màng ngoài của L monocytogenes và

phức hợp này đã di chuyển đến vị trí gắn kháng thể C86030M (IgG1) Tại đây kháng thể C86030M (IgG1) liên kết với protein

màng ngoài của L monocytogenes trong phức

C86020M (IgM)-kháng nguyên và bị giữ lại tạo thành băng màu Những kháng thể C86020M (IgM) không gắn kháng nguyên hoặc phức C86020M (IgM)-kháng nguyên không bị giữ lại ở vị trí kiểm tra sẽ tiếp tục di

Vạch kiểm tra Vạch đối chứng

Vùng nhận mẫu

Nguyễn Thị Trung Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 215 - 220

chuyển đến vị trí gắn kháng thể kháng chuột

(IgM) Tại đây kháng thể C86020M (IgM) sẽ

liên kết với kháng thể kháng chuột (IgM) và

tạo thành băng màu Bước đầu cho thấy que

nhúng hoạt động tốt đối với kháng nguyên

màng ngoài của L monocytogenes Kết quả

ban đầu này cần tiếp tục được kiểm chứng,

đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, khả năng phát

hiện được L monocytogenes ở dạng tế bào,

trong hỗn hợp mẫu và trong mẫu thực phẩm

KẾT LUẬN

Qua các kết quả đạt được chúng tôi rút ra kết

luận rằng có thể sử dụng cặp kháng thể

C86030M, C86020M để tạo que nhúng phát

hiện L monocytogenes Trong đó, kháng thể

C86030M được sử dụng làm kháng thể bẫy

bắt và kháng thể C86020M được sử dụng làm

kháng thể phát hiện Cặp kháng thể này đã

được sử dụng để tạo que nhúng và phát hiện

được protein màng ngoài của vi khuẩn L

monocytogenes

Lời cảm ơn: Nghiên cứu được thực hiện tại

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam và sự trợ giúp từ Học viện Quân Y

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Brown L., Julie M W., Prados-Rosales R.,

Casadevall A (2015), “Through the wall:

extracellular vesicles in Gram-positive bacteria,

mycobacteria and fungi”, Nature Reviews

Microbiology, 13, pp 620-630

2 Donald G G., Christopher J F., Goodhart S

A (2000), “The dot blot ELISA: A rapid and

simple experiment to demonstrate

antibody-antigen interactions”, The American Biology

Teacher, 62 (8), pp 583-587

3 Gasanov U., Denise H., Philip M H (2005),

“Methods for the isolation and identification of

Listeria spp and Listeria monocytogenes: a

review”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp

851-875

4 Guillet C., Join-Lambert O., Le Monnier A., Leclercq A., Mechai F., Mamzer-Bruneel M B., Bielecka M K., Scortti M., Disson O., Berche P., Vazquez-Boland J., Lortholary O., Lecuit M

(2010), “Human listeriosis caused by Listeria

ivanovii”, Emerging Infectious Diseases 16(1), pp

136-138

5 Hoorfar J., Cook N (2003), “Critical aspects in

standardization of PCR” In: Sachse, K and Frey,

J (Eds.) Methods in Molecular Biology: PCR detection of microbial pathogens, Humana Press,

Totowa, USA, pp 51-64

6 http://www.meridianlifescience.com

7 http://www.milipore.com

8 http://www.usbio.net

9 Laemmli U K (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4”, Nature 227, pp 680-685

10 Quan S., Annie H., Jean-François C., James C

A B (2013), “Isolation of bacteria envelope proteins Anne H Delcour (ed.), Bacterial cell

surfaces: Methods and Protocols”, Methods in

Molecular Biology, 966, pp 359-366

11 Rodriguez-Lazaro D., Hernandez M (2006),

“Molecular methodology in food microbiology diagnostics: trends and current challenges”,

IUFoST World Congress 13 th World Congress of Food Science and Technology, pp 1085-1099

12 Salimnia H., Patel D., Lephart P R., Fairfax

M R., Chandrasekar P H (2010), “Listeria grayi:

vancomycin-resistant, gram-positive rod causing bacteremia in a stem cell transplant recipient”,

Transplant Infectious Disease, 12(6), pp 526-528

13 Singer J M., Plotz C M (1956), “The latex fixation test I Application to the serologic

diagnosis of rheumatoid arthritis”, American

Journal of Medicine, 21, pp 888-892

Nguyễn Thị Trung Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 215 - 220

220

SUMMARY

STUDY ON THE ABILITY OF SPECIFICITY RECOGNIZING LISTERIA

MONOCYTOGENES’ ANTIGENS OF SOME MONOCLONAL ANTIBODIES

FOR USE IN PRODUCING THE QUIKSTICK TEST

Institute of Biotechnology, Vietnamese Academy of Science and Technology

detected by culture in a selective medium, molecular biology or immunology methods In this

study, the results of screening antibodies for use attached to the membrane of immune

chromatography is published Accordingly, the monoclonal antibody named C86030M which is

recognized antigens of L monocytogenes including total, soluble and outer membrane proteins,

are severed as a capture antibody And the monoclonal antibodies named C86020M, which is only

recognized the outer protein membrane of L monocytogenes without E coli or Salmonella is used

as a detection antibody Two monoclonal antibodies were used to create dipsticks and the dipsticks

is already well-done This initial results promise to open up the production of the test strips to

detect L monocytogenes in food

Keywords: Listeria monocytogenese, monoclonal antibody, outer membrane protein, intact cell,

food-poisoning

Ngày nhận bài: 06/01/2017; Ngày phản biện: 09/02/2017; Ngày duyệt đăng: 27/4/2017

*Tel: 0936 270978; Email: trungnguyen@vast.vn