Phạm Thị Mỹ, Hoàng Thị Mai, Vi Đại Lâm, Dương Mạnh Cường - Thử nghiệm điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn phân giải nitơ phân lập từ một số mẫu nướ[r]
Trang 1Tập 164, số 04, 2017
Trang 2T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ
CHUYÊN SAN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP - LÂM NGHIỆP - Y DƯỢC
Nguyễn Thế Hùng, Nguyễn Thị Lân - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cây trồng xen đến sinh trưởng và
năng suất của giống dong riềng DR3 tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 3
Nguyễn Viết Hưng, Lê Thị Kiều Oanh, Hoàng Kim Diệu, Nguyễn Thị Trang - Nghiên cứu khả năng sinh
trưởng, phát triển của một số giống bí đỏ tại Thái Nguyên năm 2015 9
Lê Thị Kiều Oanh, Trần Văn Điền, Trần Đình Hà, Trần Trung Kiên - Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát
triển của một số giống đậu xanh trong vụ Hè Thu năm 2015 tại Thái Nguyên 15
Hà Đình Nghiêm, Nguyễn Thanh Hải, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thị Huệ - Quản lý cây trinh nữ móc (Mimosa
diplotricha) bằng mô hình dự đoán phân bố, mức độ xâm lấn và sử dụng sinh khối để trồng nấm 21
Nguyễn Thị Lân, Nguyễn Thế Hùng - So sánh, lựa chọn giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt cho vụ mùa tại
Nguyễn Thị Tuyên, Nguyễn Việt Hưng - Phương pháp phòng trừ mối hại gỗ trong các công trình xây dựng
Nguyễn Hải Hòa, Trần Thị Phương Thúy, Dương Trung Hiếu, Nguyễn Thị Thu Hiền - Sử dụng ảnh SPOT 6
xây dựng bản đồ sinh khối và trữ lượng các bon rừng trồng thông thuần loài tại xã Nguyên Bình, huyện Tĩnh Gia,
Nguyễn Việt Hưng, Nguyễn Thị Tuyên - Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ lá xoan trong bảo quản gỗ 47
Đặng Minh Tơn, Đặng Văn Minh, Nguyễn Văn Toàn - Các loại đất chính, phân bố và tính chất trên địa bàn
Nông Thị Huyền Chanh, Hoàng Hữu Chiến - Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt động khai thác cát sỏi đến biến
động sử dụng đất nông nghiệp trên địa bàn xã Hợp Thịnh, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang 61
Triệu Mùi Chản, Chu Văn Trung , Đỗ Sơn Tùng, Nguyễn Đình Thi, Nguyễn Thảo Yến, Bùi Thị Hường,
Hoàng Đông Quang - Xây dựng hệ thống lập quy hoạch kế hoạch sử dụng đất bán tự động 67
Nguyễn Văn Lợi - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biến đổi chất lượng của quả vải thiều sau thu hoạch 75
Phạm Thị Phương, Nguyễn Thị Đoàn, Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Thị Nhung, Lưu Hồng Sơn - Nghiên cứu hiệu
quả bảo quản của compozit của chitosan khối lương phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản đào Pháp 81
Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Ngân, Nguyễn Văn Quang, Phan Thị Hồng Phúc, Lê Minh, Phạm Diệu
Thùy, Trần Nhật Thắng, Dương Thị Hồng Duyên - Xác định serotype, độc lực và tính kháng kháng sinh của 3
loại vi khuẩn gây viêm phổi ở lợn tại tỉnh Bắc Ninh 87
Nguyễn Thị Thúy Mỵ, Trần Thanh Vân, Đỗ Thị Kiều Duyên - Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm Mfeed+
đến sức sản xuất thịt của gà F 1 (ri x Lương Phượng) nuôi nhốt tại Thái Nguyên 97
Từ Trung Kiên, Trần Thị Hoan, Nguyễn Văn Sơn- Ảnh hưởng của bổ sung dầu hạt lanh vào khẩu phần đến
năng suất và chất lượng trứng gà Isa shaver 103 Trương Hữu Dũng, Nguyễn Thị Hằng, Phùng Đức Hoàn - Đánh giá khả năng sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn
của 3 tổ hợp lợn lai thương phẩm (DP x CA); (PD x CA) VÀ (LP x CA) giai đoạn sơ sinh đến 56 ngày tuổi 109
Sử Thanh Long, Nguyễn Công Toản, Trần Văn Vũ - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới thời gian mang
thai của bò sữa nuôi tại xí nghiệp bò Phù Đổng, Hà Nội 115 Trần Thị Hoan, Từ Trung Kiên, Nguyễn Thị Hiền - Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thay thế thức ăn viên
hỗn hợp bằng cỏ Ghinê (panicum maximum) trong khẩu phần đến hiệu quả sử dụng thức ăn và năng suất của
Hoàng Đình Hòa, Nguyễn Văn Lợi - Xác định các cấu tử hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây kinh
Journal of Science and Technology
164(04)
Trang 3Vũ Khánh Linh, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Thị Quỳnh Lâm, Lương Hùng Tiến - Phân lập và tuyển chọn một
số chủng vi sinh vật phân giải cellulose hướng tới tạo ra chế phẩm xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 133
Vũ Hoài Nam, Dương Văn Cường - Tăng cường sinh tổng hợp β-carotene trong Escherichia coli tái tổ hợp được
bổ sung một phần con đường mevalonate 141
Nguyễn Thị Thu Ngà, Sỹ Danh Thường, Cao Thị Phương Thảo - Sử dụng mã vạch DNA để định loại loài Màn
màn vàng (Cleome viscosa L.) ở Việt Nam 147
Trịnh Đình Khá, Lý A Hù, Đặng Duy Phong, Nguyễn Hữu Quyền, Hoàng Thị Thiên Hương - Tổng hợp nano
bạc bằng dịch chiết lá đào Prunus persica và hoạt tính kháng khuẩn của nó 153
Nguyễn Thị Thu Hà, Chu Thị Na, Cao Thị Phương Thảo - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu một số
loài cây cảnh hạn sinh thuộc họ thuốc bỏng (Crassulaceae) 157
Phạm Thị Mỹ, Hoàng Thị Mai, Vi Đại Lâm, Dương Mạnh Cường - Thử nghiệm điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của dòng vi khuẩn phân giải nitơ phân lập từ một số mẫu nước tại Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên 165 Hoàng Thị Lan Anh, Dương Thị Minh Hòa - Nghiên cứu ứng dụng mô hình lọc tái tuần hoàn nước thải khu ký
túc xá Trường Đại học Nông Lâm bằng sét Kabenlis 3 171
Dương Hữu Lộc, Nguyễn Xuân Vũ, Vũ Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm - Đặc điểm nông sinh học và mối
quan hệ di truyền của một số giống quýt (Citrus Recutilata Blanco) tại khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam 177
Đinh Thị Huyền Chuyên, Sỹ Danh Thường, Trịnh Đình Khá, NguyễnThị Yến - Nghiên cứu đặc điểm hình
thái và hoạt tính kháng khuẩn của loài màn màn vàng thu thập ở tỉnh Thái Nguyên 183
La Việt Hồng, Trần Hồng Thu, Phạm Thị Quy, Đinh Phương Thảo, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Ngọc Khánh
- Xác định chỉ thị phân tử và tái sinh chồi in vitro của loài Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll ex
Nguyễn Hải Linh, Ma Diệu Quỳnh, Ma Thị Thu Lệ, Bùi Thị Thu Thủy, Vũ Thị Minh Hồng, Nguyễn Thị Hồng
Hạnh - Cao cây sương sáo (Mesona chinensis Benth.) có tác dụng hỗ trợ điều trị béo phì trên chuột nhắt trắng 195
Lê Phong Thu, Nguyễn Thu Thủy, Tạ Văn Tờ - Tổng quan đáp ứng mô bệnh học ung thư vú sau điều trị hóa
Hà Trọng Quỳnh - Lượng giá thiệt hại sức khỏe cộng đồng do ô nhiễm không khí tại phường Tân Long, thành
Nguyễn Thị Trung - Nghiên cứu khả năng nhận biết đặc hiệu các kháng nguyên của Listeria monocytogenes của
một số kháng thể đơn dòng nhằm sử dụng trong tạo que thử nhanh 215
Trang 4Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146
TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP β-caroteneTRONG Escherichia coli
TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC BỔ SUNG MỘT PHẦN CON ĐƯỜNG MEVALONATE
1 Viện Khoa học sự sống - ĐH Thái Nguyên
2 Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
β-carotene là một sắc tố thuộc nhóm carotenoid có giá trị thương mại Với mục đích tăng cường sinh
tổng hợp β-carotenetrong E coli tái tổ hợp, một phần con đường mevalonate được bổ sung thêm để
tăng cường nguồn tiền chất IPP.Ba genemvaK1, mvaK2 và mvaD được tách dòng từ Enterococcus faecium phân lập tại Việt Nam và đưa vào vector biểu hiện pET28 tạo nên vector
pET28-mvaK1K2D Vector biểu hiện tái tổ hợp này sau đó được biến nạp vào dòng E coli BL21(DE3) tái
tổ hợp đã mang sẵn vector pRSET-iEIBY mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp β-carotene từ tiền chất IPP Hai hệ vector được biểu hiện đồng thời tạo ra khuẩn lạc màu vàng đặc trưng củaβ-carotene
Đánh giá sơ bộ cho thấy dòng E coli được bổ sung thêm một phần con đường mevalonate có khả
năng sinh tổng hợp β-carotene mạnh hơn so với dòng không được bổ sung
Từ khóa: β-carotene, mvaK1, mvaK2, mvaD, mevalonate pathway
ĐẶT VẤN ĐỀ *
β-carotene là một chất thuộc nhóm
carotenoid, được tìm thấy chủ yếu ở một số
loại thực vật như cà rốt, bí ngô, đậu Hà
Lan,… [4] β-caroteneđược biết đến với vai
trò là tiền chất để tổng hợp vitamin A – một
loại vitamin rất cần thiết cho mắt Theo một
số nghiên cứu chỉ ra rằng, β-carotenecó khả
năng làm chậm quá trình thoái hóa điểm
vàng, từ đó giảm nguy cơ mù lòa [6], [9] Bên
cạnh đó, β-carotene được chứng minh là có
khả năng chống oxi hóa mạnh, vì vậy có tác
dụng ngăn ngừa bệnh ung thư và một số bệnh
về tim mạch [2]
Do đó, β-carotene được sử dụng rộng rãi trong
sản xuất công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và
thực phẩm [7] Hiện nay, hơn 90% β-carotene
thương mại được sản xuất bằng tổng hợp hóa
học [10], tuy nhiên do mối lo ngại an toàn thực
phẩm việc sử dụng β-carotene tổng hợp hóa
học làm chất phụ gia đã bị kiểm soát chặt chẽ
trong những năm gần đây Trong khi đó việc
khai thác β carotene từ nguồn sẵn có trong tự
nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ,
phức tạp trong xây dựng và quản lý vùng
nguyên liệu Điều này dẫn tới nhu cầu tìm
*Tel: 0913 804 003; Email: duongvancuong1980@yahoo.com
kiếm nguồn β-carotene tự nhiên bằng lên men
vi sinh vật Trong đó, kỹ thuật điều hướng trao đổi chất β-carotene trong các vi sinh vật không
có khả năng sản sinh carotenoid đang được
quan tâm hiện nay [8] Đặc biệt, E coli là một
vật chủ thích hợp cho sản sinh β-carotene vì tốc độ chuyển hóa và tăng trưởng nhanh và nó
đã được sử dụng thành công trong sản xuất các loại carotenoid khác như lycopene, astaxanthin
và zeaxanthin [1], [3]
Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất carotenoid được chia thành 2 giai đoạn Giai đoạn thứ nhất là sự tổng hợp Isopentenyl diphosphate (IPP) - đơn vị cấu thành cơ bản của tất cả các hợp chất carotenoid Hai con đường sinh tổng hợp IPP là mevalonate (MEV) và non-mevolonate (MEP) Giai đoạn thứ hai là dây chuyền tạo thành các
carotenoid từ IPP Trong E coli chỉ tồn tại
con đường MEP mà không tồn tại con đường MEV và E.coli thiếu các enzyme chuyển hóa
từ IPP đến carotenoid Để tăng khả năng sản
xuất β-carotene trong E coli, một phần con đường MEV không có trong E.coli tự nhiên
có thể được bổ sung vào chủng E coli biểu
hiện β-carotene để tăng cường nguồn tiền chất IPP nhằm đảm bảo cân bằng trao đổi chất cho vật chủ, nâng cao và ổn định khả năng sản xuất β-carotene
Trang 5Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146
142
Xuất phát từ những luận điểm trên chúng tôi
tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm các gene
mva mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp
tiền chất IPP vào trong vi khuẩn E coli với
mục đích tăng cường khả năng sinh tổng hợp
β-carotene
VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Vi khuẩn Enterococcus faeciumcung cấp bở
Vietnam Type Culture Collection Vi khuẩn
E coli DH5α tại Viện Khoa học Sự sống –
Đại học Thái Nguyên
- Vi khuẩn E coli BL21(DE3) mang vector
pR-iEIBY là vector biểu hiện pRSET-A mang
policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY
mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá
trình xúc tác sinh tổng hợp β-carotene đã
được thiết kế thành công trước đó
- Vector tách dòng pLUG (LifeTechnology)
- Cặp mồi khuếch đại các gene mva bao gồm:
mvaK1, mvaK2, mvaD được thiết kế dựa trên
trình tự gene đã công bố trên ngân hàng gene
NCBI mã sốAF290095.1 Khi thiết kế trình tự
mồi, trình tự các enzyme giới hạn được thêm
vào để thuận tiện cho việc thiết kế vector sau
này Trình tự cặp mồi được thể hiện trong
bảng 1
Bảng 1 Thông tin trình tự cặp mồi mva
Tên
K1-F CCATGGATGGCAAACTATGGCC
AAG
K1-R GAATTCTTAAACATAGGTATGTA
CTCCT
K2-F GAATTCATGATTGAAGTATCTGC
ACCA
K2-R GAGCTCTCATCGGTTTTCCTTTCT
TTGA
CACG
D-R GCGGCCGCTTATTCAATAATCGC
AATTCCTG
Phương pháp nghiên cứu
- Tách chiết DNA tổng số
DNAvi khuẩn Enterococcus faecium được
tách chiết bằng CTAB 2% dựa theo phương
pháp tách chiết của Doyle và cs [5] Sản phẩm DNA được dùng để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo
- PCR các gene mva Các gene mvaK1, mvaK2, mvaD được khuếch đại từ genome vi khuẩn E faecium nhờ cặp
mồi đặc hiệu (Bảng 1) Thành phần phản ứng bao gồm: 19.3 μl nước cất khử ion, 1 μl DNA, 2.5 μl buffer 10X, 0.1 μl enzyme Taq DNApolymerase, 0.5 μl dNTP 10 mM, 0.5 μl
primer mva-F (10 pm/l), 0.5 μl primer mva-R
(10 pm/μl) Chu trình nhiệt được thực hiện như sau: 95oC: 5 phút, 30 chu kỳ của (95oC: 45 giây; 55oC: 45 giây; 72oC: 1 phút), 72oC: 10 phút, bảo quản ở 4oC Sản phẩm PCR kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose 1%
- Gắn nối đoạn gene mong muốn lên vector
Đoạn gene mong muốn được gắn lên cấu trúc vector mở vòng nhờ enzyme T4 ligase, thành phần phản ứng gắn nối như sau: 3 μl buffer ligase 10X, 5 μl vector, 5 μl đoạn xen và 1 μl enzyme nối T4 ligase, 16 μl nước Ủ hỗn hợp phản ứng ở 220C trong 1 giờ Sản phẩm phản ứng gắn nối được biến nạp vào tế bào khả
biến E coli DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt 42oC trong 90 giây Sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ
sung kháng sinh chọn lọc
- Cảm ứng biểu hiện gene trong vi khuẩn
E coli
Vector biểu hiện được biến nạp vào vi khuẩn
tế bào khả biến E coli BL21(DE3) bằng
phương pháp sốc nhiệt, sau đó cấy trải trên môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch được nhặt nuôi riêng rẽ trong 5 ml LB lỏng có bổ sung ampicilin ở 37 oC qua đêm Cấy chuyển 5 μl mỗi dòng khuẩn nuôi trong 5 ml LB lỏng có
bổ sung ampicilin, nuôi lắc 37 oC sau 2 giờ rồi đo OD600 nm Đến khi OD đạt 0,3 đến 0,5
bổ sung IPTG đến nồng độ cuối là 0,5 mM, nuôi lắc ở 37oC trong 6 giờ
Trang 6Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả tách dòng và xác định trình tự
gene mvaK1, mvaK2, mvaD
Sản phẩm khuếch đại các gene mva được điện
di trên gel agarose (hình 1A), kết quả chỉ thu
được một băng duy nhất với kích thước xấp xỉ
1kb tương ứng độ dài các gene mva theo lý
thuyết (mvaK1: 945 bp, mvaK2: 1088 bp;
mvaD: 978 bp) Điều này cho thấy chúng tôi
đã khuếch đại thành công ba gene mva
Sản phẩm PCR sau đó được gắn vào vector
tách dòng pLUG và biến nạp vào vi khuẩn
E.coli DH5α, sau đó cấy trải trên môi trường
thạch LB có bổ sung ampicilin, X-gal và
IPTG Chọn các dòng khuẩn lạc trắng nuôi
tăng sinh trong LB lỏng để tách chiết plasmid
và kiểm tra kích thước vector Những dòng
khuẩn lạc có kích thước lớn hơn so với đối
chứng (dòng chưa có đoạn chèn) được tiếp
tục chọn lọc bằng enzyme giới hạn Kết quả
được thể hiện như trên hình 1B
A B
Hình 1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A),
sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp (B)
( A) L: Thang chuẩn DNA GeneRulerTM 1kb; đường chạy 1-3: tương ứng với sản phẩm PCR các gene mvaK1, mvaK2, mvaD
(B): L: Thang chuẩn DNA GeneRulerTM 1kb; đường chạy 1-3: tương ứng với sản phẩm cắt các gene mvaK1, mvaK2, mvaD
Kết quả cho thấy sản phẩm cắt các dòng nghi ngờ đều có hai băng: Một băng có kích thước
3 kb tương đương kích thước vetor pLUG và
1 băng kích thước xấp xỉ 1 kb tương đương
kích thuớc các gene mva
Tuy nhiên, để khẳng định chính xác hơn, đồng thời kiểm tra mức độ ổn định thông tin
di truyền, các dòng plasmid tái tổ hợp này được dùng để giải trình tự Sau khi giải trình
tự, chiều dài các gene được bảo toàn: mvaK1:
945 bp; mvaK2: 1088 bp; mvaD: 978 bp Sử
dụng công cụ NCBI BLAST, trình tự gene
mvaK1, mvaK2, mvaD tách dòng trong
nghiên cứu này có độ tương đồng 100% so
với trình tự gene mvaK1, mvaK2, mvaD của
vi khuẩn Enterococcus faecium (mã số
AF290095) đã được dùng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR
Kết quả dịch mã In-silicobằng công cụ trực tuyến EMBOSS Transeq cho thấy gene được dịch mã thành công, không xuất hiện các đột biến stop codon vô nghĩa (hình 2) Như vậy chúng tôi đã tách dòng thành công các gene
mvaK1, mvaK2, mvaD
“MANYGQGESSGKIILMGEHAVVYGEPAIAFPFYATKVTAFLEELDAMDDQLVSSYYSGNLAEAPHALKNIKKLFIHLK
KQHDIQKNLQLTIESTIPAERGMGSSAAVATAVTRAFYDYLAFPLSREILLENVQLSEKIAHGNPSGIDAAATSSLQPI YFTKGHPFDYFSLNIDAFLIVADTGIKGQTREAVKDVAHLFETQPHETGQMIQKLGYLTKQAKQAIIENSPETLAQTMD ESQSLLEKLTISNDFLNLLIQTAKDTGALGAKLTGGGRGGCMIALAQTKTKAQEISQALEDAGAAETWIQGLGVHTYV”
(A)
“MIEVSAPGKLYIAGEYAVVETGHPAVIAAVDQFVTVTVESARKVGSIQSAQYSGMPVRWTRRNGELVLDIRENPFHYI
LAAIRLTEKYAQEKNILLSFYDLKVTSELDSSNGRKYGLGSSGAVTVATVKALNVFYALNLSQLEIFKIAALANLAVQD NGSCGDIAASCYGGWIAFSTFDHPWLQEQETQHSISELLALDWPGLSIEPLIAPEDLRLLIGWTGSPASTSDLVDQVHR SREDKMVAYQLFLKNSTECVNEMIKGFKENNVTLIQQMIRKNRQLLHDLSAITGVVIETPALNKLCNLAEQYEGAAKSS GAGGGDCGIVIVDQKSGILPLMSAWEKAEITPLPLHVYSDQRKENR”
(B)
“MFKGKARAYTNIALIKYWGKKNEELILPMNNSLSLTLDAFYTETEVIFSDSYMVDEFYLDGTLQDEKATKKVSQFLDLFRK
EAGLSLKASVISQNFVPTAAGLASSASGLAALAGACNTALKLGLDDLSLSRFARRGSGSACRSIFGGFVEWEKGHDDLSSYA KPVPSDSFEDDLAMVFVLINDQKKEVSSRNGMRRTVETSNFYQGWLDSVEGDLYQLKQAIKTKDFQLLGETMERNGLKMHGT TLAAQPPFTYWSPNSLKAMDAVRQLRKQGIPCYFTMDAGPNVKVLVENSHLSEVQETFTKLFSKEQVITAHAGPGIAIIE”
(C)
Hình 2 Kết quả dịch mã In-silico gene mvaK1 (A), mvaK2 (B) và mvaD (C)
Trang 7Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146
144
Kết quả thiết kế vector biểu hiện
pET28-mvaK1K2D
Gắn gene mvaK1 vào vector biểu hiện
pET28 tạo vector tái tổ hợp pET28-mvaK1
Sau khi gắn nối đoạn gene mvaK1 vào vector
pET28 mở vòng và biến nạp vào vi khuẩn E
Coli DH5α Kết quả sàng lọc các dòng plasmid
tái tổ hợp được thể hiện như trên hình 3
Kết quả tách chiết plasmid cho thấy các dòng
khuẩn lạc thu được đều có kích thước cao hơn
so với đường chạy ĐC (vector pET28), nên
đây là những vector tái tổ hợp
Hình 3 Plasmid các dòng có khả năng mang gene
mvaK1
Đường chạy ĐC: plasmid pET28, Đường chạy
1-4: plasmid tái tổ hợp tách từ các dòng khuẩn lạc
trắng
Khi cắt các dòng khuẩn lạc này với enzyme
BamHI và EcoRI đều cho hai băng sáng: Một
băng kích thước xấp xỉ 5.3 kb tương đương
kích thước vector pET28 và một băng kích
thước xấp xỉ 1 kb tương đương kích thước
đoạn gene mvaK1 (hình 4) Như vậy đã gắn
thành công đoạn gene mvaK1 vào vector
pET28
Hình 4 Sản phẩm cắt các dòng có khả năng mang
gene mvaK1
L: Thang chuẩn DNA 1kb, Đường chạy 1, 2, 3, 4:
Các dòng plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzyme
BamHI và EcoRI
Gắn gene mvaK2 vào vector biểu hiện
mvaK1 tạo vector tái tổ hợp pET28-mvaK1K2
Đoạn gene mvaK2 và vector tái tổ hợp pET28-mvaK1 được cắt đồng thời bằng hai enzyme giới hạn là EcoRI và SacI với mục đích thu đoạn gene mvaK2 và mở vòng vector pET28-mvaK1
Gene mvaK2 sau đó được gắn nối vào vector pET28-mvaK1 và biến nạp vào tế bào khả biến
E coli DH5α Các khuẩn lạc được lựa chọn
ngẫu nhiên, tách chiết plasmid để sàng lọc các dòng có khả năng mang đoạn chèn Những dòng có kích thước băng plasmid cao hơn so
với đối chứng (plasmid vector pET28-mvaK1)
được tiếp tục sử dụng để kiểm tra sự có mặt của
gene mvaK2 bằng enzyme giới hạn (hình 5)
Hình 5 Sản phẩm cắt plasmid các dòng có khả
năng mang gene mvaK2
ĐC: Đối chứng vector pET28-mvaK1K2 không
cắt ; Đường chạy 1 -6 : sản phẩm cắt tương ứng với các dòng 1, 2, 3, 4, 5, 6 Đường chạy L: Thang
chuẩn DNA GeneRulerTM 1 kb
Kết quả thu được trên hình 5 cho thấy, tất cả các dòng nghi ngờ đều có một băng duy nhất với kích thước xấp xỉ7.4 kb (tương ứng với
tổng kích thước đoạn gene mvaK2 và vector pET28-mvaK1) Như vậy đoạn gene mvaK2
đã được gắn thành công vào vector
mvaK1 tạo vector tái tổ hợp pET28-mvaK1K2
Gắn gene mvaD vào vector biểu hiện
pET28-mvaK1K2 tạo vector tái tổ hợp pET28-mvaK1K2D
Đoạn gene mvaD được chèn vào vector pET28-mvaK1K2D, các vector tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α
Các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng so
Trang 8Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146
sánh kích thước vector và sản phẩm cắt bằng
enzyme giới hạn
(A) (B)
Hình 6 Plasmid các dòng có khả năng mang gene
mvaD (A); sản phẩm cắt chọn lọc các dòng mang
gene mvaK2 (B)
(A): Đường chạy ĐC: plasmid pET28-mvaK1K2,
Đường chạy 1-4: plasmid tái tổ hợp tách từ các
dòng khuẩn lạc trắng
(B) L: Thang chuẩn DNA 1kb, Đường chạy 1, 2, 3,
4: Các dòng plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzyme
Kết quả trên hình 6A cho thấy các dòng
khuẩn lạc được chọn đều có kích thước băng
plasmid lớn hơn so với đối chứng, đây có thể
là các dòng mang đoạn chèn Kết quả kiểm tra
bằng enzyme giới hạn cũng cho thấy các dòng
khuẩn lạc này đều có một băng duy nhất với
kích thước khoảng 8.3 kb, tương đương với
tổng kích thước của đoạn gene mvaD (978
bp) và vector tái tổ hợp pET28-mvaK1K2
(7401 bp) (hình 6B)
Từ những kết quả trên chứng tỏ việc thiết kế
vector biểu hiện mang policistron operon gồm
3 gene mvaK1-mvaK2-mvaD trên nền tảng
vector pET28 đã thành công
Biểu hiện hai hệ vector pRSET-iEIBY và
pET28-mvaK1K2D trong E coli BL21(DE3)
Để kiểm tra sự hoạt động của các gene mva
trên cấu trúc vector pET28, đồng thời đánh
giá sơ bộ ảnh hưởng của việc bổ sung một
phần con đường mevalonate đến khả năng
sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn E
coli, vector pET28-mvaK1K2D được biến nạp
vào vi khuẩn E coli BL21(DE3) tái tổ hợp đã
mang sẵn vector pRSET-iEIBY mã hóa cho
các enzyme sinh tổng hợp β-carotene từ tiền
chất IPP
Hình 7 Kết quả biểu hiện của hai hệ vector
pET28-mvaK1K2D và pRSET-iEIBYtrong E coli
BL21(DE3) (1) E coli BL21 (DE3) không mang vector (đối chứng); (2): E coli BL21 (DE3) mang vector pR-iEIBY (màu vàng nhạt); (3): E coli BL21 (DE3) mang đồng thời hai hệ vector vector vector pET28-mvaK1K2D và pRSET-iEIBY (màu vàng đậm – màu đặc trưng của β-carotene);
Kết quả biểu hiện cho thấy, ống 1 không có
sự biểu hiện màu sắc (cặn khuẩn màu trắng)
do chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) do
không có mang các gene mã hóa quá trình
sinh tổng hợp β-carotene Ống số 2 và 3 cho
cặn tế bào có màu vàng nhạt và vàng sậm là
màu đặc trưng của β-carotene, như vậy các gene được biến nạp vào vi khuẩn E coli đều hoạt động
Qua đánh giá bằng cảm quan màu sắc cho thấy ống số 3 (được tăng cường nguồn tiền
chất IPP bằng việc bổ sung các gene mva) có
sự sinh tổng hợp β-carotene mạnh hơn so với ống số 2 Như vậy việc bổ sung thêm một phần con đường mevalonatelàm tăng hàm lượng β-carotene
KẾT LUẬN
Đã tách dòng thành công 3 gene mvaK1,
mvaK2, mvaD có kích thước tương ứng lần
lượt là 945 bp, 1088 bp, 978 bp
Thiết kế thành công vector biểu hiện pET28-mvaK1K2D mang policistron gồm 3 genes
mvaK1, mvaK2, mvaD mã hoá cho các
enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp tiền
chất IPP
Cảm ứng biểu hiện hai hệ vector: Một hệ vector liên quan đến sinh tổng hợp tiền chất IPP, một hệ vector liên quan đến sinh tổng
hợp β-carotenetừ tiền chất IPP trong E coli
Trang 9Vũ Hoài Nam và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 164(04): 141 - 146
146
BL21(DE3) thu được cặn khuẩn có màu
vàng-màu đặc trưng của β-carotene Qua đánh
giá sơ bộ bằng cảm quan cho thấy việc bổ
sung thêm hệ vector liên quan đến sinh tổng
hợp tiền chất IPP trong E coli để sản xuất
β-carotene có hiệu quả cao hơn so với chỉ biểu
hiện một hệ vector
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Albrecht M., Misawa N., Sandmann G (1999),
“Metabolic engineering of the terpenoid
biosynthetic pathway of Escherichia coli for
production of the carotenoids β-carotene and
zeaxanthin”, BiotechnolLett, 21, pp 791–795
2 Britton, G (1995), "Structure and properties of
carotenoids in relation to function." Faseb J.,
9(15), pp 1551-1558
3 Cheng Q (2006), “Structural diversity and
functional novelty of new carotenoid biosynthesis
genes”, J Ind Microbiol Biotechnol., 33, pp 552
– 559
4 Desobry S A., Netto F M and Labuza T P
(1998), "Preservation of beta-carotene from carrots."
Crit Rev Food SciNutr., 38(5), pp 381 - 396
5 Doyle and Doyle, D a D., and Cullings (1987), “CTAB/Chloroform-Isoamyl Alcohol DNA Extraction Protocol”, Phytochemical Bulletin, 19, pp.11-15
6 Gordon J E and Schooff M (2002), "Can high-dose supplementation with vitamins C and E, beta carotene, and zinc slow the progression of
macular degeneration?", J Fam Pract., 51(2),
p.105
7 Mehta B J., Obraztsova I N., Cerdá-Olmedo
E (2003), “Mutants and intersexual heterokaryons
of Blakeslea trispora for production of β-carotene
and lycopene”, Appl Environ Microbiol., 7, pp
4043 - 4048
8 Misawa N., Shimada H (1998), “Metabolic engineering for the production of carotenoids in non-carotenogenic bacteria and yeasts”, J
Biotechnol., 59, pp 169–181
9 Wolf G (2001), "The discovery of the visual
function of vitamin A", J Nutr., 131(6), pp
1647-1650
10 Yoon S H., Lee S H., Das A., Ryu H K., Jang
H J., Kim J Y., Oh D K., Keasling J D., Kim S W (2009), “Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene
in E coli”, J Biotechnol., 140(3), pp 218-221
SUMMARY
ENHANCE BIOSYNTHESIS OF Β-CAROTENE IN RECOMBINANT
ESCHERICHIA COLI HARBORING A PART OF MEVALONATE PATHWAY
1 University Agriculture and Forestry - TNU
2 Institute of Life Sciences - TNU
β-carotene is a carotenoid pigment which has commercial value In order to improve the
biosynthesis of this compound in a recombinant E coli strain, a part of mevalonate partway was
introduced for enhancing metabolic flow to isopentenyl diphosphate, the building block of all carotenoids Three genes including mvaK1, mvaK2, and mvaDwere cloned from Enterococcus faecium isolated in Vietnam and introduced into pET28 vector forming pET28-mvaK1K2D
Subsequently, this recombinant expression vector was transfomed into a recombinant E coli BL21
(DE3) containing pRSET-iEIBY vector encodes for enzymes responsible for biosynthesis of β-carotene from IPP The two vectors were co-expressed, resulted in colonies in yellow – the color
of β-carotene Compared to the E coli clone with pRSET-iEIBY only, β-carotene was synthesized
stronger in the clone with the addition of a part of mevalonate pathway
Keywords: β-carotene, mvaK1, mvaK2, mvaD, mevalonate pathway
Ngày nhận bài: 28/3/2017; Ngày phản biện: 10/4/2017; Ngày duyệt đăng: 27/4/2017
*Tel: 0913 804 003; Email: duongvancuong1980@yahoo.com
