Bài báo này giới thiệu phương pháp phát hiện, định lượng dexamethasone trong một số thực phẩm chức năng sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng khối phổ hai lần đạt[r]
Trang 1NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DEXAMETHASONE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG
SIÊU HIỆU NĂNG HAI LẦN KHỐI PHỔ
Nguyễn Kiều Hưng 1 , Nguyễn Thanh Hải 2
1 Cục Cảnh sát phòng, chống tội phạm về môi trường - Bộ Công an
TÓM TẮT
Bài báo này giới thiệu phương pháp xác định dexamethasone sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS) đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh Mẫu được chiết bằng dung môi MeOH:H 2 O (9:1), pha động sử dụng nước và acetonitril (80:20), khoảng tuyến tính của dexamethasone dao động trong khoảng 0,5 - 5,0 mg/kg, hệ số tương quan R2 > 0,99, hiệu suất thu hồi dao động trong khoảng 73,33% - 103,4% với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) từ 2,56 - 4,22% tương ứng Khẳng định chất nghiên cứu bằng 4 ion đặc trưng, đáp ứng yêu cầu của quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu Phương pháp phù hợp cho việc xác định và định lượng dexamethasone trong thực phẩm chức năng
Từ khóa: Dexamethasone; Glucocorticoid; UPLC/MS/MS; thực phẩm chức năng; Y tế
ĐẶT VẤN ĐỀ*
Dexamethasone là một loại thuốc nhóm
glucocorticoid được sử dụng trong ngành y tế
với tác dụng chống viêm dị ứng, điều trị bệnh
Bên cạnh đó, dexamethasone có khá nhiều
phản ứng có hại, một trong những tác dụng
phụ của nó là giữ muối, giữ nước, làm cho da
đỏ hồng gây cảm giác béo giả tạo đối với
người sử dụng Lợi dụng tác dụng này, một số
thầy lang hoặc nhà sản xuất đã cho thuốc này
vào các thang thuốc hoặc thực phẩm chức
năng để đánh lừa người dùng là thuốc làm béo,
ăn ngon, tăng cân Việc cho thuốc
dexamethasone vào sản phẩm dùng cho trẻ em
càng nguy hiểm gấp bội vì thuốc sẽ gây ra
những tác hại khó lường đối với sự phát triển
của trẻ, thậm chí tử vong Ngoài tác dụng
không mong muốn là gây rối loạn chuyển hóa
dẫn đến tăng cân, dexamethasone còn có một
loạt các nguy cơ khác như cao huyết áp, loãng
xương, can xi không hấp thu vào xương, dễ
gãy xương,…nếu dùng liều cao có thể gây rối
loạn tâm thần Những người bệnh phải sử dụng
nhiều dexamethasone cũng bị tăng nguy cơ
nhiễm trùng vì nó làm giảm miễn dịch, giảm
sức đề kháng của cơ thể
Nghiên cứu phát hiện và định lượng
dexamethasone đã và đang thu hút được nhiều
*
tác giả nghiên cứu, mỗi kỹ thuật mà các tác giả đưa ra khác nhau, trên nhiều đối tượng mẫu khác nhau [1], [2], [3] Dexamethasone
là chất cấm sử dụng trong thực phẩm, theo quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu [4], kết quả phân tích chỉ được chấp nhận khi thực hiện trên kỹ thuật LC/MS/MS Ở Việt Nam, hiện tại chưa có công trình công bố nào nghiên cứu định lượng dexamethasone bằng kỹ thuật UPLC/MS/MS Bài báo này giới thiệu phương pháp phát hiện, định lượng dexamethasone trong một số thực phẩm chức năng sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu năng khối phổ hai lần đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh Mẫu được chiết bằng hỗn hợp dung dịch MeOH:H2O (9:1), không cần làm sạch mẫu bằng chiết pha rắn, định lượng trên UPLC/MS/MS Khẳng định chất nghiên cứu bằng 2 ion đặc trưng, phương pháp được thẩm định theo quyết định 657/2002/EC của Cộng đồng chung Châu Âu
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hoá chất
Acetonitril (ACN), metanol (MeOH), loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); Nước tinh khiết dùng cho HPLC (Merck, Đức); Chuẩn dexamethasone 99,6% (Viện kiểm nghiệm
Trang 2thuốc Trung ương); Dung dịch chuẩn gốc có
nồng độ 100 mg/l được pha trong MeOH, bảo
quản -20o C, sử dụng trong 3 tháng Dung
dịch chuẩn làm việc được pha từ chuẩn gốc
hỗn hợp tại các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và
5,0 mg/l bằng MeOH, pha trước khi sử dụng
Pha động A là ACN, pha động B là nước
Thiết bị
Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ UPLC-MS/MS
(Waters, Mỹ), gồm các bộ phận chính như
bơm, bộ tiêm mẫu tự động, bộ điều nhiệt cột,
bộ khử khí, bộ ghép nối khối phổ Waters
Acquity TQ Detector và phần mềm xử lý
Masslynx 4.1 Cột sắc ký Acquity
UPLC(R)BEH C18 2.1x100 mm, 1,7 µm,
(Waters, Mỹ) Chương trình pha động bắt đầu
20% A, giữ trong 2 phút, tăng lên 80% A tại
2,5 phút và kết thúc tại điều kiện ban đầu,
tổng thời gian chạy là 5 phút, tốc độ dòng 0,4
ml/phút, thể tích tiêm 10 µl Nhiệt độ cột 30
oC Chế độ phân tích đa kênh MRM, kiểu ion
hóa dương, nhiệt độ nguồn 150 oC, nhiệt độ
khử dung môi 400 oC, dòng khử khí 800L/Hr
Điện thế mao quản 4,0 kV, điện thế cone
39V, áp suất chân không 3,60.e-3 mbar Thời
gian lưu của dexamethasone là 3,64 phút
(hình 1) Năng lượng phân mảnh các ion đặc
trưng được trình bày trong bảng 1
Hình 1 Sắc ký đồ ion định lượng và ion xác nhận
của dexamethasone trong dung dịch chuẩn nồng
độ 0,5mg/l
Quy trình xử lý mẫu
Cân chính xác 2,0 g phần mẫu thử đã được đồng nhất cho vào ống ly tâm 50 ml Thêm chính xác 10 ml MeOH:H2O (9:1), vortex 10 phút cho đều mẫu, giữ trong bể siêu âm đúng
30 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút (to phòng), sau đó gạn lấy phần dịch trong Tiếp tục chiết lặp lại lần nữa, gộp toàn bộ dịch chiết, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, gạn lấy phần dịch trong, định mức chính xác đến 20 ml bằng dung môi pha động, hút 1ml lọc qua màng lọc 0,22 µm, khử khí và tiến hành đo trên máy UPLC/MS/MS
Bảng 1 Năng lượng phân mảnh của Dexamethasone
Tên chất Ion sơ cấp
(m/z)
Ion thứ cấp (m/z)
Thời gian Dwell (s)
Điện thế Cone (V)
Năng lượng Cone (eV)
(a) ion định lượng
Collision Energy / eV
%
0
100
1.608e+006 m/z 393.16 -> 355.07
14
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
%
0
Hình 2 Collision Energy Optimization (m/z 393,16 -> 355,07)
Trang 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Đánh giá tính đặc hiệu, chọn lọc
Kỹ thuật LC/MS/MS luôn có tính đặc hiệu
cao, sự có mặt của chất phân tích đều được
khẳng định chắc chắn thông qua ion phân tử
và hai ion sản phẩm Theo quyết định
657/2002/EC của Châu Âu, tính đặc hiệu
được đánh giá thông qua số điểm nhận dạng
(IP) và tỷ lệ các ion xác nhận và định lượng,
số điểm IP cần phải đạt là 4 điểm, trong đó
mỗi ion mẹ được tính là 1 điểm, mỗi ion con
được tính 1,5 điểm Tỷ lệ ion trên mẫu thử so
với tỷ lệ ion trên chuẩn cũng đã được sử dụng
để đánh giá tính đặc hiệu phương pháp, kết
quả bảng 1, bảng 2 cho thấy phương pháp có
tính đặc hiệu tốt, đáp ứng các yêu cầu của
Châu Âu
Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích
Trong phân tích LC/MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hưởng rất lớn đến độ chính xác của kết quả phân tích, từ giai đoạn chuẩn bị mẫu đến giai đoạn định lượng trên đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion) Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng nền mẫu trong quá trình phân tích là rất quan trọng Kết quả bảng 2 cho thấy các diện tích píc của mỗi ion lần lượt trong dung dịch chuẩn và dung dịch thêm chuẩn vào nền mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều này chứng
tỏ không có hiệu ứng nền trong giai đoạn tạo ion ở đầu dò khối phổ Khoảng dao động ion của dexamethasone trong dung dịch mẫu đều nằm trong khoảng cho phép, phù hợp với quyết định 657/2002/EC của Châu Âu
Bảng 2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu và cường độ dao động ion
Chất phân tích Nồng độ (mg/l) 1,0 2,0 5,0 Khoảng dao động ion (%)
Dexamethasone
Dung dịch chuẩn A355
A237
2145
1037
4962
2441
13642
6780 0,47 - 0,50 Thêm vào mẫu sau xử lý A355
A 237
2403
1203
4863
2375
15428
7640 0,48 - 0,50
Khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Đường chuẩn được thực hiện trên nền mẫu trắng thêm chuẩn (phương pháp thêm chuẩn) tại các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 5,0 mg/kg Kết quả cho thấy đường chuẩn dexamethasone tuyến tính trong khoảng từ 0,5 - 5,0 mg/kg, R2
> 0,99, độ thu hồi ở các điểm chuẩn đều thỏa mãn yêu cầu (
≤ 10%)
Hình 3 Đường chuẩn định lượng dexamethasone
Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ thu hồi
Độ thu hồi được đánh giá dựa vào mẫu thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ là thấp (0,7 mg/kg); trung bình (1,0 mg/kg) và cao (2,0 mg/kg) Sử dụng đường chuẩn để tính toán Tại mỗi nồng độ, thực hiện chiết độc lập, mỗi nồng độ phân tích 3 lần, trong 3 ngày khác nhau Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi dexamethasone khá cao, dao động trong khoảng 73,33% đến 103,4% (RSD% dao động trong khoảng 2,56 đến 4,22) đáp ứng được yêu cầu của Quyết định 2002/657/EC
Trang 4Bảng 3 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi
Hình 4a Sắc đồ mẫu thực phát hiện dexamethasone
Hình 4b Sắc đồ mẫu thực không phát hiện dexamethasone
KẾT LUẬN
Đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng phương
pháp xác định dexamethasone trong một số
dạng thực phẩm chức năng sử dụng kỹ thuật
sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC/MS/MS đạt
độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết
mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh
Phương pháp đã được thẩm định theo quyết
định 657/2002/EC của Cộng đồng chung
Châu Âu Phương pháp đã được áp dụng phân
tích 20 mẫu thực tế trên khu vực miền Bắc
Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Garcia C V., Breier A R., Steppe M.,
Schapoval E E S., Oppe T P (2003),
“Determination of dexamethasone acetate in
cream by HPLC”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, (31), pp 597-600
2 Christianson C D., Laine D F., Zimmer J S., Johnson C J., Sheaff C N., Carpenter A., Needham S R (2010), “Development and validation of an HPLC-MS/MS method for the analysis of dexamethasone from pig synovial fluid
using dried matrix spotting”, Bioanalysis, Vol 2,
No 11, pp 1829-1837
3 Yuan Y., Zhou X., Li J., Ye S., Ji X., Li L., Zhou T., Lu W (2015), “Development and validation of a highly sensitive LC-MS/MS method for the determination of dexamethasone in nude mice plasma and its application to a
pharmacokinetic study”, Biomed Chromatogr, (4),
pp 578-83
4 Commission Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results
Trang 5SUMMARY
A SIMPLE METHOD OF DERTERMINATION OF DEXAMETHASONE IN
FUNCTIONAL FOODS USING ULTRA PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS SPECTROMETRY
Nguyen Kieu Hung 1* , Nguyen Thanh Hai 2
1
Environment Police Department - Ministry of Public Security,
2
University of Agriculture and Forestry - TNU
A method based on ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC/MS/MS) as development for simply and rapid determination of the residues
of dexamethasone in functional foods The sample was extracted by MeOH: H2O (9:1) and then analyzed in multiple reaction monitoring (MRM) mode Mobile phase was ultrapure water and acetonitrile (80:20) Under the optimized detection conditions, the linear range for dexamethasone
is 0.5 - 5.0 mg/L, the linear correlation coefficients are more than 0.99 The recoveries of dexamethasone range from 73.33% - 103.4% with relative standard deviations (RSD) of 2.56 - 4.22% This method is simply, effective, sensitive, which is suitable for the determination and confirmation of dexamethasone in functional foods
Keyword: Dexamethasone; Glucocorticoid; UPLC/MS/MS; functional food; Functional foods;
Medical
Ngày nhận bài:17/4/2017; Ngày phản biện:04/5/2017; Ngày duyệt đăng: 31/7/2017
*
