Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các kiểu huyết thanh A.. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến.[r]
Trang 1TÁCH DÒNG, PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ APX IA
TỪ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
Hoàng Thị Huyền Trang 1 , Nguyễn Thị Thu Ngà 2 , Dương Văn Cường 1 , Phạm Bằng Phương 3
1 Viện Khoa học Sự sống - ĐH Thái Nguyên, 2 Trường Đại học Sư phạm – ĐH Thái Nguyên,
3 Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
ApxIA là đoạn gen mã hóa protein quy định cấu trúc ngoại độc tố ApxIA gây ra bệnh viêm màng phổi ở lợn Nghiên cứu này đã tiến hành tách dòng và xác định trình tự đoạn gen ApxIA từ A.pleuropneumoniae Kết quả cho thấy, đoạn gen được phân lập và có kích thước 801 bp mã hóa
cho 120 amino acid vùng peptidase_M10_C và 147 amino acid thuộc vùng RTX C-terminal
domain của protein ApxIA Khi so sánh với trình tự gen ApxIA (mã số GQ369732.1) trên Genbank
cho thấy trình tự đoạn gen ApxIA từ A pleuropneumoniae phân lập được có ba vị trí nucleotide sai
khác so với gen ApxIA (mã số GQ369732.1) Tuy nhiên, sự sai khác này không ảnh hưởng đến trình tự amino acid thuộc vùng RTX C-terminal domain Plasmid mang đoạn gen ApxIA được sử
dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về thiết kế vector biểu hiện và tinh sạch protein ApxIA
Từ khóa: Actinobacillus pleuropneumoniae, gen ApxIA, ngoại độc tố, protein ApxIA ,viêm màng phổi
MỞ ĐẦU*
Viêm màng phổi ở lợn do A
pleuropneumoniae gây ra là một bệnh truyền
nhiễm, có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất
của đàn lợn [4] Bệnh này được đặc trưng bởi
thương tích xuất huyết, tơ huyết, hoại tử phổi
dẫn đến tử vong cao ở những con lợn bị
nhiễm nặng hoặc những tổn thương phổi nhỏ
cục bộ ở những lợn bị bệnh mạn tính
Cho đến nay, 15 kiểu huyết thanh của A
pleuropneumoniae đã được mô tả dựa trên sự
khác nhau của vỏ polysaccharide (CPS) và
của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào, tất
cả các serotype đều có khả năng gây bệnh, tuy
nhiên mức độ biểu hiện độc tính khác nhau
[3] Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ
độc lực khác nhau của các kiểu huyết thanh A
pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến
ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn này
Độc tố Apx của A pleuropneumoniae được
xếp vào nhóm RTX-toxin, bao gồm bốn loại
protein ApxI, ApxII, ApxIII và Apx IV [5]
Trong đó, các chủng sản sinh ra độc tố ApxI
thường có độc lực cao ApxI là một protein
có trọng lượng phân tử từ 105 -110 kDa, có
*
Tel: 01652 030019, Email: tranghoanghuyendhsptn@gmail.com
độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính Trước đây, ApxI được đặt tên là haemolysin I (HlyI) hay
cytolysin I (ClyI) [6] ApxI được tiết ra bởi A
pleuropneumoniae serotype 1; 5; 9; 10; 11; 14
[2] Operon mã hóa cho ApxI được xác định
là gen apxI gồm 4 cistron được sắp xếp theo thứ tự là apxIC, apxIA, apxIB, và apxID,
trong đó C là gen hoạt hóa, A là gen quy định cấu trúc độc tố, B và D là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan đến sự tiết độc tố qua cả hai màng [4]
Theo Inzana và đồng tác giả (1991) [1], A
pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 thể đột
biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm Điều này cho thấy độc tố là yếu tố
quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A
pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 Đồng
thời chủng A pleuropneumoniae này được
dùng làm giống gốc sản xuất vaccine và cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết
để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả
năng gây bệnh của các chủng A
pleuropneumoniae serotype 5
Trang 2Shin Min-Kyoung và đồng tác giả (2011) [7]
đã chứng minh được tính kháng nguyên của
vùng RTX C-terminal domain thuộc ApxIA
trên 320 lợn thí nghiệm
Trong nghiên cứu này, đoạn gen ApxIA mã
hóa vùng RTX C-terminal domain thuộc
ApxIA được tách dòng và xác định trình tự
với mục đích tạo nguồn nguyên liệu ban đầu
cho việc tạo vaccine đa giá thể phòng bệnh
viêm màng phổi ở lợn
VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Mẫu A pleuropneumoniae serotype 5 do
Công ty cổ phần thuốc thú y Đức Hạnh
Marphavet cung cấp
Các hóa chất chính được sử dụng gồm:
GenJET Genomic DNA Purfication Kit của
Thermo, pGEM®-T Easy Vector system II
của Promega, GeneJET Plasmid miniprep Kit
của Thermo
Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên trình tự gene ApxIA được công bố
trên Genbank (mã số GQ369732.1) Cặp mồi
đặc hiệu để phân lập đoạn gene ApxIA (có
kích thước dự đoán 801 bp) được thiết kế và
bổ sung thêm điểm cắt của enzyme giới hạn
BamHI, HindIII
ApxIAF:5’GCGGATCCGGAGACGACGG
TAATGATGTA3’
ApxIAR:5’GCAAGCTTTTAAGCAGATTG
TGTTAAATAATTACT 3’
Tách chiết DNA tổng số từ A
pleuropneumoniae serotype 5 theo hướng dẫn
của GenJET Genomic DNA Purfication kit
Gen ApxIA được phân lập từ DNA tổng số
bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có
chu trình như sau: 94ºC/3 phút; 30 chu kì:
94ºC/30 giây, 55ºC/30 giây, 72ºC/1 phút 30
giây; 72ºC/10 phút Thành phần phản ứng
PCR bao gồm: Buffer -7,5 μl, dNTPs – 0,3 μl,
mồi xuôi (10 pmol/μl) - 0,5 μl, mồi ngược (10
pmol/μl) - 0,5 μl, DNA khuôn - 0,5 μl, dH2O
-5,7 μl.Tổng thể tích 15 μl
Đoạn gene ApxIA sau khi phân lập được gắn
vào vector tách dòng pGEM Sản phẩm tách
dòng được biến nạp vào vi khuẩn E.coli JM109 Plasmid có chứa gene ApxIA tách
chiết từ các khuẩn lạc sinh trưởng trên môi trường kháng sinh chọn lọc Trình tự gen được xác định trên máy ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) Phân tích trình tự gen bằng chương trình BLAST trên NCBI và phần
mềm BioEdit
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tách dòng đoạn gen mã hóa độc tố ApxIA
Kết quả phân lập đoạn gen ApxIA bằng kỹ
thuật PCR thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1 kb, tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết Sản phẩm PCR thu được
là một băng đặc hiệu, vì vậy được tinh sạch trực tiếp và sử dụng để tách dòng gen.
Hình 1 Kết quả nhân gen ApxIA từ A
pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 (M: Thang DNA chuẩn 1 kb)
Đoạn gen ApxIA sau tinh sạch được gắn vào
vector tách dòng pGEM – 3015 bp Sản phẩm
gắn nối được biến nạp vào vi khuẩn E coli
JM109 Khuẩn lạc chứa plamid mang gen
ApxIA được chọn lọc trên môi trường LB
chứa kháng sinh ampicilin, cơ chất X-Gal và chất cảm ứng IPTG Các khuẩn lạc trắng mang vector được nuôi tăng sinh và tách chiết
plasmid Vector tách dòng pGEM-ApxIA
được cắt bằng hai loại enzyme hạn chế là
BamHI và HindIII cho hai phân đoạn DNA có
kích cỡ khoảng 3 kb và xấp xỉ 0,9 kb (Hình 2) Trong đó, phân đoạn DNA xấp xỉ 0,9 kb
M
0,75 kb
Trang 3chính là đoạn gen đích (ApxIA) cần thu nhận
Sản phẩm cắt hạn chế có kích thước khoảng xấp
xỉ 0,9 kb (Hình 2) được thôi gel để thu nhận gen
ApxIA phục vụ cho phân tích trình tự gen ApxIA
và thiết kế vector biểu hiện
Hình 2. Kết quả cắt vector pGEM- ApxIA bằng
enzyme BamHI và HindIII
(M: Thang DNA chuẩn 1 kb)
Phân tích trình tự gen ApxIA
Gen ApxIA (GQ369732.1) dài 3066 bp, mã
hóa cho 1022 amino acid Từ vị trí amino acid
8 đến 652 tạo nên vùng RTX N-terminal
domain, từ acid amin 729 đến 845 là vùng
gắn Ca2+
(Ca2+-binding protein), từ amino
acid 739 đến 749 là vùng peptidase_M10_C,
từ amino acid 874 đến 1020 là vùng RTX
C-terminal domain [2] Đoạn gen ApxIA của A
pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 tách
dòng được có kích thước 801 bp Kết quả so
sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ApxIA
tách dòng được và ApxIA (GQ369732.1) bằng
chương trình BLAST trên NCBI cho thấy
mức độ tương đồng giữa 2 gen là 99% Sự
tương đồng giữa 2 gen bắt đầu từ vị trí
nucleotide tương ứng với vị trí nucleotide
2288 đến 3069 bp của gen ApxIA có mã số
GQ369732.1 (Hình 3)
Trình tự acid amin suy diễn của đoạn gen trên
mã hóa cho 267 amino acid, tương ứng từ vị
trí amino acid 756 đến 1022 của protein
ApxIA do gen ApxIA (GQ369732.1) mã hóa
Phân tích trình tự nucleotide tương đồng giữa
2 gen cho thấy, có 3 vị trí sai khác được thể
hiện trong bảng 1 Sự sai khác nucleotide ở vị
trí nucleotide 2318 trên gen ApxIA
(GQ369732.1) không dẫn đến sự thay đổi amino aicd, sự sai khác ở vị trí nucleotide
2321 và 2322 dẫn đến sự thay đổi amino acid Gln thành Pro Tuy nhiên amino acid bị thay đổi là amino acid 774 không nằm trong vùng RTX C-terminal domain.
Hình 3 Kết quả so sánh trình tự nucleotide ApxIA
của A pleuropneumoniae kiểu huyết thanh 5 phân lập được và ApxIA (GQ369732.1) trên
Genbank
Bảng 1.Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide (Nu) của gen ApxIA của A pleuropneumoniae serotype 5 và ApxIA (GQ369732.1)
S T
T
Vị trí
Nu
Nu
ApxI
A
Nu GQ3697
32.1
Amino acid tạo thành
Amino acid bị thay đổi
Như vậy, đoạn gen phân lập được có thể mã hóa 120 amino acid thuộc vùng peptidase_M10_C và trọn vẹn 147 amino acid thuộc vùng RTX C-terminal domain của protein ApxIA, đủ điều kiện để tiến hành các
nghiên cứu tiếp theo
3 kb
1 kb
M
Trang 4KẾT LUẬN
Phân lập được đoạn gen ApxIA từ
Actinobacillus pleuropneumoniae có kích
thước 801 bp mã hóa cho 120 amino acid
vùng peptidase_M10_C và 147 amino acid
thuộc vùng RTX C-terminal domain của
protein ApxIA
Plasmidmang gen ApxIA được sử dụng để
thiết kế vector biểu hiện mang đoạn gen mã
hóa độc tố ApxIA
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Inzana T J., Todd J., Ma J., & Veit H (1991),
“Characterization of a non-hemolytic mutant of
Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role
of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and
immunoprotection”, Microbial pathogenesis,
10(4), pp 281-296
2 Lee Ki-Eun, Hwan W C., Ha H K., Jae Y S.,
Dong K Y (2015), "Prevalence and
characterization of Actinobacillus
pleuropneumoniae isolated from Korean pigs",
Journal of Bacteriology and Virology, 45(1), pp
19-25
3 Moon J Y., Kang J Y., Seo J W., Kim W K., Choi Y H., Choi M S., Hur J (2017), “Efficacy Evaluation of Combination Vaccine of Recombinant C-Terminal Fragments of ApxIA,
ApxIIA and ApxIIIA in Piglets”, Sains Malaysiana, 146(2), pp 217-221
4 Ramjeet M., Deslandes V., Gouré J., & Jacques
M (2008), “Actinobacillus pleuropneumoniae vaccines: from bacterins to new insights into
vaccination strategies”, Animal Health Research Reviews, 9(1), pp 25-45
5 Sadilkova L., Nepereny J., Vrzal V., Sebo P., Osicka R (2012), “Type IV fimbrial subunit protein ApfA contributes to protection against
research, 43, pp 2
6 Shin M K., Kang M L., Cha S B., Lee W J., Sung J H., & Yoo H S (2011), “An immunosorbent assay based on the recombinant ApxIa, ApxIIa, and ApxIIIa toxins of Actinobacillus pleuropneumoniae and its
application to field sera”, Journal of veterinary diagnostic investigation, 23(4), pp 736-742
SUMMARY
CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF GENE CODING FOR APXIA
EXOTOXIN IN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE
Hoang Thi Huyen Trang 1* , Nguyen Thi Thu Nga 2 ,
Duong Van Cuong 1 , Pham Bang Puong 3
1
TNU - Institute of Life Sciences, 2 TNU - University of Education,
3
TNU - University of Agriculture and Forestry ApxIA is a gene coding for the structural regulation of ApxIA exotoxin that causes pleurisy in pigs This study conducted the isolation and sequencing of the ApxIA gene from Actinobacillus pleuropneumoniae Results showed that the gene was isolated and 801 bp encoded for 120 amino
acid tin the peptidase_M10_C and 147 amino acids in the RTX C-terminal domain of the ApxIA protein When compared to the ApxIA gene sequence (code GQ369732.1) on Genbank, the ApxIA gene sequence from Actinobacillus pleuropneumoniae isolated from three different nucleotide positions was different from the ApxIA gene (GQ369732.1) However, this difference does not affect the amino acid sequence of the RTX C-terminal domain Plasmid carrying the ApxIA gene are used as the basis for further studies on the expression vector design and purification of the ApxIA protein
Keywords: Actinobacillus pleuropneumoniae, ApxIA gene, Apx IA protein, exotoxin, porcine
pleuropneumoniae
Ngày nhận bài: 06/3/2018; Ngày phản biện: 18/4/2018; Ngày duyệt đăng: 27/4/2018
*
Tel: 01652 030019, Email: tranghoanghuyendhsptn@gmail.com