Bài báo này trình bày kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 phục vụ tạo dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn.. Các mẫu biến nạp được tái sinh in v[r]
Trang 1NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12
Phạm Thị Thanh Nhàn * , Phạm Minh Hảo, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Chu Hoàng Mậu
Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên
TÓM TẮT
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, đây là cây mẫn
cảm với điều kiện ngoại cảnh và chịu hạn kém Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là tính trạng đa gen, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn hoặc có chức năng điều hòa nhóm gen chịu hạn Gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương có chức năng kích hoạt sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn, lạnh và mặn Bài báo này trình bày kết quả
chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 phục vụ tạo dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn Cấu trúc pBI121-GmDREB2 đã được biến nạp thành công vào giống đậu tương ĐT12 qua mô nách lá mầm thông qua chủng A tumefaciens Các mẫu biến nạp được tái sinh
in vitro, chọn lọc bằng kháng sinh và tạo cây đậu tương chuyển gen Kết quả có 203/300 mẫu biến
nạp tạo đa chồi, 197 chồi chọn lọc trong môi trường kéo dài chồi và số chồi được cho ra rễ là 60
Số cây chuyển gen trồng trên giá thể là 20 cây và có 5 cây sống sót ở điều kiện nhà lưới, hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn này là 1,67% (5/300) Trong số 5 dòng cây chuyển gen ở thế hệ T0, 4 cây chuyển gen dương tính với PCR, hiệu suất chuyển gen đạt 1,33% (4/300).
Keywords: Hạn, Glycine max (L.) Merrill, GmDREB2, A tumefaciens, hiệu suất chuyển gen
ĐẶT VẤN ĐỀ*
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một
cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao
Ở Việt Nam, việc trồng đậu tương có ba mục
đích là giải quyết vấn đề thiếu protein cho con
người và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất
Tuy nhiên, đây là cây mẫn cảm với điều kiện
ngoại cảnh và chịu hạn kém nên sản lượng
còn thấp, chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu
dùng Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là
tính trạng đa gen, sản phẩm của các gen này
liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc
tính chịu hạn hoặc có chức năng điều hòa
nhóm gen chịu hạn Để chống lại điều kiện
bất lợi của ngoại cảnh, đặc biệt là hạn hán, cơ
thể thực vật đã sản xuất ra nhiều loại protein,
trong đó có DREB (Dehydration- Responsive
Element Binding) DREB có vai trò kích hoạt
nhóm gen chịu hạn phiên mã Họ protein này
có chứa vùng bảo thủ duy nhất để gắn với
trình tự DNA đặc hiệu là
APETALA2/Ethylene Responsive Factor
(AP2/ERF), cho phép chúng tương tác với
một loạt các gen phía sau theo hình thức
không phụ thuộc axit abscisic Các miền
AP2/ERF có khoảng 60 amino acid [50], [6],
*
Tel: 0989 516346; Email: ptnhansptn@gmail.com
[7] Phân họ gen DREB có 10 thành viên
được xác định trong hệ gen cây đậu tương
(GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc,
GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7) [10]
Mỗi gen trong họ DREB có trình tự, độ dài
khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều
khi cây gặp hạn Nhóm DREB1 điều khiển
tính chịu hạn, mặn và lạnh, trong khi nhóm
DREB2 điều khiển tính chịu hạn
Phân nhóm DREB2 gồm 8 thành viên trong cây
Arabidopsis [11] và 5 thành viên trong lúa gạo
[8] Chen và cộng sự (2007) [6] đã phân lập
gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A-5 trong phân họ DREB Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen
thể hiện ở sự tích lũy hàm lượng proline cao
Sản phẩm biểu hiện của gen GmDREB2 được
tìm thấy khi cây đậu tương gặp hạn, lạnh và mặn [6], [8] Bài báo này trình bày kết quả
chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào
giống đậu tương ĐT12 phục vụ tạo dòng cây đậu tương chuyển gen chịu hạn
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu và hóa chất
Hạt giống đậu tương ĐT12 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ cung cấp
Trang 2Chủng A tumefaciens chứa cấu trúc pBI121-GmDREB2 do Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo
dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp Cấu trúc vector chuyển gen được trình bày ở hình 1
Hình 1 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen GmDREB2 (pBI121-GmDREB2) (LB: Bờ trái
của T-DNA; RB: Bờ phải của T-DNA; KanR: trình tự kháng kanamycin; 35S: Promoter 35S; GmDREB2: Trình tự gen GmDREB2; Cmyc: Trình tự nucleotide mã hóa kháng nguyên Cmyc; NOS (Nos ter): Nopaline
synthase terminator (đoạn kết thúc)
Các hóa chất được sản xuất bởi các hãng
Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma,
Amersham Pharmacia Biotech, như: Yeast
extract, trypton, tris HCl, EDTA, glycerol,
kanamycin, rifamicine, cefotaxime
Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu gồm
có: Máy PCR System 9700 (Appied
Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300
(Bio-Rad, Mỹ), máy xung điện Gen Plulser
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá
mầm nhờ A.tumefaciens được tiến hành dựa
trên nghiên cứu của Olhoft và cộng sự (2006)
[9] và Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) [2]
Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng
nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang
chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng
25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các
mẫu lá non được thực hiện theo phương pháp
của Saghai Maroof và cộng sự (1984) [12]
Phương pháp PCR xác định sự có mặt của
gen chuyển GmDREB2 bằng cặp mồi
GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI (sản phẩm dự
kiến có kích thước 543 bp), và vector
pBI121-GmDREB2 bằng cặp mồi 35S-F/35S-R (sản
phẩm dự kiến có kích thước 314 bp) trong cây
đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 Trình tự
nucleotide của cặp mồi
GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI và 35S-F/35S-R như sau:
CGGATCCGATGGAAGAAGCGGGTTTA
GG – 3’
CACGACACACTTGTCTAC – 3’
TCACATCAATCCACTTGCT – 3’
Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 94oC trong 3 phút; (94oC trong 1 phút;
56oC trong 1 phút; 72oC trong 1 phút) lặp lại 30 chu kỳ; 72oC trong 10 phút; bảo quản ở 4oC KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương chuyển gen
Hạt đậu tương nảy mầm trên môi trường GM, sau khoảng 5 ngày, kích thước mầm đạt khoảng 5 cm và lá mầm xanh (Hình 2A) Các mảnh lá mầm được thu, gây tổn thương ở nách lá mầm để sử dụng làm mẫu biến nạp (Hình 2B) Lá mầm đã gây tổn thương được ngâm trong dịch huyền phù chứa
A.tumefaciens mang cấu trúc chứa gen
30 phút (Hình 2C) Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM ở 25o
C trong tối 5 ngày (Hình 2D)
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được rửa khuẩn ngoại vi bằng cefotaxim 500 mg/l, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng Cắt lấy các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung cefotaxim 500 mg/l Sau 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l và kháng sinh thích hợp Hình 3 trình bày kết quả cảm ứng tạo đa chồi trên môi trường SIM bổ sung BAP 2 mg/l và kanamycine (Hình 3A và 3B), sau đó chuyển
Trang 3A B
Nách lá mầm
Hình 2 Hình ảnh gây tổn thương nách lá mầm và
biến nạp A: Hạt đậu tương ĐT12 nảy mầm trên
môi trường GM; B: Gây tổn thương nách lá mầm;
C: Mảnh lá mầm được nhiễm khuẩn; D: Mẫu biến
nạp chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM
Hình 3 Hình ảnh đa chồi và kéo dài chồi A:
Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM bổ sung BAP 2
mg/l và kanamycine trong 1 tuần; B: Cảm ứng
tạo đa chồi trên SIM bổ sung BAP 2 mg/l và
kanamycine trong 2 tuần; C: Kéo dài chồi SEM
(bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l +
kanamycine 50 mg/l) trong 1 tuần; D: Kéo dài
chồi SEM (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l
+ kanamycine 50 mg/l) trong 2 tuần
Hình 4 Giai đoạn ra rễ và trồng cây đậu tương
chuyển gen ĐT12 trên giá thể
Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5
cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ
(RM) có bổ sung cefotaxim 250 mg/l để tạo
cây hoàn chỉnh (Hình 4)
Thí nghiệm biến nạp cấu trúc chứa gen
A.tumefaciens được thực hiện lặp lại 3 lần
Kết quả thí nghiệm chuyển gen và đối chứng được trình bày ở bảng 1 Trong 300 mẫu được
biến nạp cấu trúc chứa gen GmDREB2, 203
mẫu tạo được đa chồi, trong đó có 393 chồi sống sót, 197 chồi được kéo dài Số chồi ra rễ
là 60, số cây được trồng trên giá thể là 20 cây
và có 5 cây sống sót Đối với lô đối chứng ĐC0, với 30 mẫu biến nạp và kết quả không
có chồi nào được tạo thành, vì thế cũng không
có chồi được kéo dài, ra rễ và ra giá thể Đối với lô đối chứng ĐC1, 20 mẫu được tạo đa chồi, 35 chồi sống sót, 20 chồi được kéo dài
và 15 chồi được chuyển vào môi trường ra rễ
Số cây được đưa ra giá thể là 15 cây, trong đó
có 10 cây sống sót Như vậy ở giai đoạn tái sinh
và chọn lọc in vitro, chúng tôi thu được 5 cây
đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0 (ký hiệu là 01, 02, 03,
ĐT12-04, ĐT12-05) Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn chọn lọc bằng kháng sinh là 1,67% (5/300)
Cũng theo phương pháp chuyển gen này, Lò
Thị Mai Thu (2014) [4] chuyển cấu trúc CPi (SMV- BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008 có hiệu suất lần lượt là 4,32% và 3,76%; Lò Thanh Sơn (2015) [3]
chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào
giống đậu tương DT84 với hiệu suất 2,37%;
Nguyễn Thu Hiền (2011) [1] chuyển gen HA1
vào giống đậu tương ĐT12 với hiệu suất 2,37%; Nguyễn Thúy Hường (2011) [2] chuyển gen vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất là 2,22% Như vậy, hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn này của chúng tôi thấp hơn hiệu suất chuyển gen của các tác giả trước
Lá non của cây đậu tương không chuyển gen
và 5 cây đậu tương chuyển gen sống sót trên giá thể ở thế hệ T0 được thu nhận để tách chiết DNA tổng số, kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen chuyển
pBI121-GmDREB2
Trang 4Bảng 1 Kết quả biến nạp gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12
Lô đối chứng và
thí nghiệm biến nạp Số mẫu Số mẫu tạo đa chồi sống sót Số chồi Số chồi kéo dài
Số chồi
ra rễ Số cây trồng trên giá thể sống sót Số cây
Ghi chú: ĐC0*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh
Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0
PCR là phương pháp nhanh, chính xác để đánh giá cây chuyển gen Do vậy, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 35S-F/35S-R để kiểm tra sự có mặt của promoter 35S trong cấu trúc
vector pBI121- GmDREB2 ở cây đậu tương chuyển gen Sản phẩm của phản ứng có kích thước
theo dự tính 314 bp (Hình 5A)
(A) (B)
Hình 5 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của đoạn promoter 35S (A) và gen chuyển
GmDREB2 (B) trong các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 M: Thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm PCR các cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05; (+): Sản phẩm PCR từ vector
pBI121-GmDREB2; (-): Sản phẩm PCR của cây không chuyển gen.
Hình 5A cho thấy, băng DNA có kích thước
khoảng 0,3 kb xuất hiện ở đối chứng dương
(+) và bốn cây chuyển gen, trong khi đối
chứng âm (-) không có Như vậy, cấu trúc
pBI121-GmDREB2 đã có mặt ở 4 cây chuyển
gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05
ở thế hệ T0
Kết quả kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR
nhân gen GmDREB2 ở hình 5B cho thấy đối
chứng dương và các cây chuyển gen
ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 tồn tại băng
DNA có kích thước khoảng 0,55 kb Theo
tính toán lý thuyết, đoạn gen GmDREB2 được
nhân bản dài 498 bp, đoạn Cmyc và KDEL
dài 45 bp và dự tính sản phẩm của PCR với
GmDREB2-BamHI/GmDREB2-Cmyc-SacI sẽ nhân bản được đoạn DNA có
kích thước là 543 bp Như vậy, kết quả PCR
thu được đoạn DNA có kích thước phù hợp
thành công vào giống đậu tương ĐT12 Cả hai thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR nhân
bản đoạn promoter 35S và gen GmDREB2
đều cho kết quả dương tính ở 4 cây đậu tương chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 ở thế hệ T0 Như vậy, hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn kiểm tra gen chuyển bằng PCR là 4/300 (hay 1,33%) Trong kết quả nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014) [4], hiệu suất chuyển gen đạt 1,35% (với giống ĐT12), 2,24% (với giống DT2008); của Lò Thanh Sơn (2015) [3], hiệu suất chuyển gen đạt 0,27%; của Nguyễn Thu Hiền (2011) [1], hiệu suất là 1,23%; của Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) [2], hiệu suất chuyển gen đạt 0,23%
Như vậy, hiệu suất chuyển gen ở đậu tương thấp, cần tìm kiếm các biện pháp tăng cường hiệu quả chuyển gen ở đối tượng này Nguyên nhân có thể do hóa chất, thời vụ, kĩ thuật thao tác… Đối với cây đậu tương, thời điểm ra cây
Trang 5KẾT LUẬN
Cấu trúc pBI121-GmDREB2 đã được biến
nạp thành công vào giống đậu tương ĐT12 qua
nách lá mầm thông qua chủng A tumefaciens
Các mẫu biến nạp được tái sinh in vitro, chọn
lọc bằng kháng sinh và tạo cây đậu tương
chuyển gen Kết quả có 203/300 mẫu biến
nạp tạo đa chồi, 393 chồi sống sót, có 197
chồi chọn lọc trong môi trường kéo dài chồi
và số chồi được cho ra rễ là 60 Số cây
chuyển gen trồng trên giá thể là 20 cây và có
5 cây sống sót ở điều kiện nhà lưới, hiệu suất
chuyển gen ở giai đoạn này là 1,67% (5/300)
Phân tích sự có mặt của gen chuyển
được 4 cây chuyển gen dương tính với PCR,
hiệu suất chuyển gen đạt 1,33% (4/300)
LỜI CẢM ƠN: Nghiên cứu này được hỗ trợ
và trong khuôn khổ của Đề tài cấp Bộ Giáo
dục & Đào tạo, mã số B2017-TNA-38 do
GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Thu Hiền (2011), Nghiên cứu chuyển
gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào
cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật,
Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên
2 Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập,
tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính
chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu
tương Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại
học Thái Nguyên
3 Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm và
chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển
bộ rễ của cây đậu tương, Luận án tiến sĩ Sinh học,
Đại học Thái Nguyên
4 Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP
từ Soybean mosaic virus và phát triển vector
chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây
đậu tương chuyển gen kháng bệnh, Luận án tiến sĩ
Sinh học, Đại học Thái Nguyên
5 Chen F., Chen S Y and Liu Q (2002),
“Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like
protein induced by stresses”, GenBank, Accession
AY064403
6 Chen M., Wang Q Y., Xu Z S., Li L C., Ye X G., Xia L Q., Ma Y Z (2007), “GmDREB2, a soybean DRE – binding transcription factor, conferred droungt anh high – salt tolerance in
transgenic plants”, Biochem Biophys Res Commun., 353(2), pp 299 – 305
7 Huang B., Jin L and Liu J (2007), “Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from
cotton”, Sci China Life Sci., 50 (1), pp 7-14
8 Matsukura S., Mizoi J., Yoshida T., Todaka D., Ito Y., Maruyama K., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2010), “Comprehensive analysis of
rice DREB2-type genes that encode transcription
factors involved in the expression of abiotic
stress-responsive genes”, Mol Genet Genomics, 283,
pp 185–196
9 Olhoft P M., Somers D A (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotyledonarynode cells”,
Plant Cell Rep., 20, pp 706-711
10 Ratcliffe O J., Riechmann J L (2002),
“Arabidopsis transcription factors and the regulation
of flowering time: a genomic perspective”, Curr Issues Mol Biol., 4, pp 77–91
11 Riechmann J L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C Z., Keddie J., Adam L., Pineda O., Ratcliffe O J., Samaha R R., Crelman R., Pilgrim M., Broun P., Zhang J Z., Ghandehari D.,
Sherman B K., Yu G L (2000), “Arabidopsis
transcription factors: Genome-wide comparative
analysis among eukaryotes”, Science, 290, pp
2105–2110
12 Saghai M M A., Soliman K M., Jorgensen R A., Allard R W (1984), “Ribosomal DNA spacer
- length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population
dymnamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81, pp
8014-8018
Trang 6SUMMARY
STUDYING ON TRANSFERRING A CONSTRUCTION CONTAINING
GmDREB2 GENE INTO ĐT12 SOYBEAN CULTIVAR
Pham Thi Thanh Nhan * , Pham Minh Hao, Nguyen Thi Ngoc Lan, Chu Hoang Mau
TNU - University of Education Soybean (Glycine max (L.) Merrill) is one of the most important crop plants with a high economic
value However, this is also the plant sensitive to different stresses in the environment and has the low drought ability Their property is a multigene trait whose products directly involve in the drought
tolerance or regulate the expression of resistant genes The GmDREB2 gene in soybean plant is
considered as a necessary factor to activate the transcription of resistant genes in drought, cold and salt conditions This paper presents the results of studying on transformation a construction
containing GmDREB2 gene into ĐT12 soybean cultivar in order to produce transgenic soybean plants with high drought resistant ability The structure pBI121-GmDREB2 was successfully transferred into ĐT12 soybean cultivar by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation via cotyledonary axillary nodes All infected samples were regenerated in vitro and selected by
antibiotic to creat the transgenic soybean plants Consequently, from 300 samples, 203 shoots were induced on shoot elongation medium supplemented with kanamycin, in which 197 shoots were prolonged and 60 elongated shoots were rooted All 20 rooted plantlets were planted on the pots, among which 5 plantlets survived in the greenhouse condition at the T0 generation, thus, the transgenic efficiency at this stage was 1.67% (5/300) From them, there were four transgenic soybean plantlets with the possitive PCR results, the transgenic efficiency at this stage was 1.33% (4/300)
Keywords: Drought, Glycine max (L.) Merrill, GmDREB2, A tumefaciens, transgenic efficiency
Ngày nhận bài: 28/02/2018; Ngày phản biện: 18/3/2018; Ngày duyệt đăng: 27/4/2018
