NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN SALMONELLA SPP. GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

trong mẫu thực phẩm, kỹ thuật PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau phát hiện trình tự gen độc tố (enterotoxin) và nồng độ tối ưu của 2 yếu tố ảnh hưởng đến PCR là dNTPs, Taq[r]

34

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN

NHANH VI KHUẨN SALMONELLA SPP GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

Trần Hoàng Ngâu, Nguyễn Bá Thọ, Phạm Văn Quan

Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM

Ngày gửi bài: 09/5/2016 Ngày chấp nhận đăng: 30/5/2016 TÓM TẮT

Salmonella spp là vi khuẩn có khả năng nhiễm vào bất cứ công đoạn nào của quá trình chế biến và bảo

quản thực phẩm, nhất là thực phẩm tươi sống Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu một số yếu tố ảnh

hưởng đến phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm phát hiện nhanh Salmonella spp so với các kỹ thuật sinh hóa truyền thống Bộ genome của Salmonell spp được thu nhận từ phương pháp dung dịch tách chiết (I, II, III, IV) Trình tự gen độc tố (enterotoxin) được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu

khác nhau như UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12 Nồng độ tối ưu của thành phần tham gia trong phản ứng PCR

là dNTPs và enzyme Taq Polymerase đều là 0.1mM để cho band DNA rõ nhất Kết quả này giúp hoàn thiện bước đầu việc nghiên cứu sản xuất bộ kit PCR thương mại phát hiện nhanh Salmonella spp trong khoảng thời

gian 3-5 giờ có ý nghĩa trong an toàn thực phẩm

Từ khóa: Gen độc tố, Salmonella spp., InvA gene, bộ kit PCR

STUDY OF INFLUENTIAL ELEMENTS IN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TO

DIAGNOGIS SALMONELLA SPP FROM FOODING POISONING

ABSTRACT

Salmonella spp bacteria is able to infect at any stage of processing and preserving food, especially fresh

food In this study, we invesgated influential elements in PCR test in order to identify fast Salmonella spp compared to traditionally biochemistry techniques Salmonella genome is extracted from isolation chemical compounds set (I, II, III, IV) Enterotoxin genes isolated from its are amplified by PCR technique with many

differently specifical primers, such as: UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12 Optimal concentration of dNTPs and

Taq Polymerase is 0.1mM to discover clear and bright DNA bands This study helping to produce PCR kits

market is important to diagnosis poising bacteria from food safety

Key words: Enterotoxin gene, Salmonella spp., InvA gene, PCR kit

1 Đặt vấn đề

Dựa theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7926 – 2008) vi sinh vật trong thực phẩm yêu

cầu lượng Salmonella trong 25g là 0 Vì vậy, hiện nay có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện nhóm vi khuẩn này Các phương pháp để phân tích Salmonella trong thực phẩm đa

phần là sử dụng các phản ứng sinh hóa và ELISA nhưng các phương pháp này tốn thời gian từ 5-7 ngày và rất tốn kém tiền bạc Do đó, nhu cầu sử dụng các phương pháp phát hiện

Salmonella nhanh, nhạy và chính xác rất cao

Hiện nay những tiến bộ của sinh học phân tử đã được áp dụng nhiều trong các lĩnh vực nghiên cứu khoa học Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những tiến bộ

có thể phát hiện các dòng vi khuẩn thông qua việc khuyếch đại các đoạn DNA bằng các cặp mồi đặc hiệu PCR có thể phát hiện ra một lượng nhỏ DNA bị trộn lẫn trong hỗn hợp các

DNA khác nhau Nhiều kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện Salmonella như PCR đơn

mồi hoặc đa mồi Với mục đích sản xuất thương mại hóa bộ kit PCR để phát hiện nhanh

Salmonella spp trong thực phẩm tại cơ sở, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa các

thành phần tham gia trong phản ứng PCR đơn mồi với lần lượt các cặp mồi UNI và InvA Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát một số cặp mồi đặc hiệu và xác định nồng độ tối

ứu của dNTPs, Taq Polymerase nhằm xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp

Trong bài báo, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu quy trình tách chiết tối ưu thu nhận

35

DNA genome của Salmonella spp trong mẫu thực phẩm, kỹ thuật PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau phát hiện trình tự gen độc tố (enterotoxin) và nồng độ tối ưu của 2 yếu tố ảnh hưởng đến PCR là dNTPs, Taq Polymerase

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu

Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Salmonella spp phân lập trong mẫu thực phẩm tự nhiên và

cung cấp từ Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh và Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát phân lập và định danh Salmonella spp từ các nguồn thực phẩm tự nhiên

Mẫu thu nhận gồm lòng đỏ và trắng của trứng vịt (DT), vỏ trứng vịt (VT), thịt gà (TG),

cà chua (CC), thịt heo (TH), sò (S1), sữa (S2), tôm (T), ruột gà (RG), thịt bò (TB) Mẫu được tăng sinh trên môi trường BHI, sau đó cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở 370

C trong 18-24h Quan sát khuẩn lạc tròn, màu hồng, trong suốt, có tâm đen Tiến hành các thử nghiệm định danh bằng các phản ứng sinh hóa như nhuộm Gram, H2S, LDC, Urea, Sorbitol, Indol, Vosges Proskauer (VP) (Trần Hoàng Ngâu, 2015)

2.2.2 Khảo sát phương pháp tách chiết DNA genome tối ưu của Salmonella spp

Thí nghiệm được khảo sát trên các mẫu Salmonella spp dương tính Chọn lọc 3 phương

pháp để khảo sát quy trình tách chiết và thu nhận DNA genome tối ưu là: đệm TE và nhiệt độ, Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol (25:24:1), bằng dung dịch tách chiết (I, II, III, IV) (Trần Hoàng Ngâu, 2015)

2.2.3 Khảo sát phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau

Tổng thể tích của phản ứng PCR là 50µl Các thao tác đều thực hiện trên đá Chu kỳ phản ứng PCR gồm: (1) biến tính 950

C, 5 phút; (2) bắt cặp, 720C, 30 giây; (3) kéo dài 720C, 1 phút,

35 chu kỳ Tiến hành khuếch đại trình tự DNA thu nhận bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu có trình tự nucleotide là:

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi đặc hiệu

Ký hiệu

Kích thước sản phẩm

PCR (bp)

ACGGGCGGTGTGTACAA

CCATTGTAGCACGTGTGT

TCATCGCACCGTCAAAGGAACC

AACAGCTGCGTCATGATATTCC

2.2.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dNTPs và Taq Polymerase đến phản ứng PCR

Tiến hành khảo sát sự biến thiên của nồng độ khác nhau dNTPs (0.1mM ÷ 0.6mM) và

của enzyme Taq polymerase (0.1µl ÷ 0.6µl) để xác định vạch band DNA sáng nhất (Trần

Hoàng Ngâu, 2015)

2.3 Điều kiện thí nghiệm

Hóa chất và môi trường sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Bioline (www.Bioline.com) và Macrogen (www.Macrogen.com) và bảo quản trong điều kiện nhiệt độ

36

là -40C Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh

2.4 Phương pháp định tính và định lượng DNA thu nhận

Kết quả DNA thu nhận được định tính bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 1.2%, thời gian là 21phút, hiệu điện thế là 100V và định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang

ở hai bước sóng là 260nm và 280nm

2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Các nghiệm thức được bố trí một cách hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) và số liệu thu nhận được xử lý thống kê phần mềm Statgraphics centurion

3 Kết quả nghiên cứu và bàn luận

3.1 Khảo sát phân lập và định danh Salmonella spp từ các nguồn thực phẩm tự nhiên

Tiến hành phân lập chủng lấy ở mẫu thực phẩm quanh khu vực chợ Sơn Kỳ quận Tân Phú, Tp.HCM trên môi trường XLD, xuất hiện khuẩn lạc có tâm đen và màu môi trường thay đổi Từ đó, thu được 2 mẫu có biểu hiện đúng trên 10 mẫu

Bảng 3.1: Kết quả phân lập trên môi trường XLD

Chú thích: (+) vi khuẩn có tâm đen và màu môi trường XLD thay đổi; (-) vi khuẩn không có tâm đen và lam thay đổi màu môi trường

Kết quả nhuộm Gram cho thấy 2 mẫu thịt heo (TH) và thịt gà (TG) là vi khuẩn Gram âm,

dạng hình que ngắn đặc trưng cho Salmonella Chọn chủng TH làm đại diện để tiến hành định

danh mẫu TH đến cấp loài Mẫu được giữ trên đĩa petri nuôi cấy trên môi trường XLD gửi đến Phòng Xét nghiệm Nam Khoa-Biotek (793/58 Trần Xuân Soạn, P Tân Hưng, Q.7, TP

HCM) để định danh khoa học đến cấp loài Kết quả mẫu TH là vi khuẩn Salmonella spp

3.2 Khảo sát phương pháp tách chiết DNA genome tối ưu của Salmonella spp

Theo kết quả định lượng ở biểu đồ 3.1, khi tách chiết bằng 3 phương pháp là phương pháp shock nhiệt, phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch tách chiết thì phương pháp tách bằng dung dịch tách chiết (I, II, III, IV) đạt kết quả tốt nhất là 1.811 Thông thường tỉ số O260/O280 nằm trong khoảng từ 1,8 – 2,0 thì sản phẩm DNA tinh sạch, không lẫn

37

protein và các tạp chất khác Vậy sản phẩm DNA genome thu nhận được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Biểu đồ 3.1: So sánh kết quả đo mật độ quang của Samonella spp bằng phương pháp shock nhiệt, phenol:

chloroform: isoamyl alcohol, dung dịch tách chiết DNA

Theo kết quả định tính ở hình 3.1, giếng số 1 là kết quả tách theo dung dịch tách chiết (I,

II, III, IV) có nồng độ DNA cao, band DNA rõ và đậm nhưng còn nhiễm tạp chất Do đó,

DNA genome của Salmonella spp trong các nghiệm thức được thu nhận từ phương pháp tách

chiết của hỗn hợp các dung dịch (I, II, III, IV)

3.3 Khảo sát phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau

 Kết quả PCR với mồi UNI_O

Ở hình 3.2 cho thấy giếng 1(TG), giếng 2(TH), sản phẩm DNA khuyếch đại có kích

thước là 709bp So sánh với mẫu đối chứng dương, chứng tỏ cặp mồi UNI_O đã được thiết kế đặc hiệu cho phản ứng PCR

 Kết quả PCR với mồi UNI_I

0.047

0.411

0.285

0.038

0.227

0.173

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

λ=260nm λ=280nm

Shock nhiệt Dung dịch Phenol

tách chiết Chloroform:

DNA Isoamyl alcohol

Nồng độ DNA

Hình 3.1: Định tính DNA genome của vi khuẩn Samonella spp Trong đó: M là thang DNA chuẩn có kích thước 1kb

Giếng 1 là mẫu DNA tách bằng dung dịch tách chiết DNA Giếng 2 là mẫu DNA tách bằng phương pháp phenol: chloroform: isoamyl alcohol Giếng 3: mẫu DNA tách bằng shock nhiệt

Hình 3.2: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp mồi Uni_O Trong đó: T

là thang DNA chuẩn 1kb Giếng 1: là mẫu TG Giếng 2: là mẫu TH Giếng 3,4:

là mẫu đối chứng dương Giếng 5: Đối chứng âm

38

Ở hình 3.3 cho thấy các giếng 1(TG), giếng 2 (TH) , giếng 3 và 4 (đối chứng dương) đều cho ra kết quả bằng nhau, đối chiếu với thang DNA chuẩn có kích thước là 287bp Như vậy, cặp mồi UNI_I được thiết kế đặc hiệu để khuyếch đại trình tự đoạn gen trong PCR

 Kết quả PCR với mồi InvA_fr

Ở hình 3.4 cho thấy các giếng 1(TG), giếng 2 (TH) , giếng 3 và 4 (đối chứng dương) đều

cho ra kết quả bằng nhau, đối chiếu với thang DNA chuẩn có kết quả là 600bp Chứng tỏ cặp

mồi InvA_fr thiết kế đặc hiệu cho trình tự đoạn gen InvA (600bp) của vi khuẩn Salmonella

spp

So sánh với nghiên cứu của Galan (1991), trình tự gen InvA đặc trưng để phát hiện vi

khuẩn Salmonella, không thấy xuất hiện ở các nhóm vi khuẩn khác Kết quả nghiên cứu của

chúng tôi của cũng thu nhận được sản phẩm PCR có kích thước tương tự (600bp)

 Kết quả PCR DNA với mồi InvA_12

Kết quả PCR với mồi InvA_12 ở hình 3.5 cho thấy các giếng 1(TG), giếng 2 (TH), giếng 3 và 4 (đối chứng dương) đều cho ra kết quả bằng nhau, đối chiếu với thang DNA

Hình 3.3: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp mồi Uni_I Trong đó:

T là thang DNA chuẩn 1kb Giếng 1: là mẫu TG Giếng 2: là mẫu TH Giếng

3, 4: đối chứng dương Giếng 5: đối chứng âm

Hình 3.4: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp mồi InvA_fr Trong đó: T là thang DNA chuẩn 1kb

Giếng 1: là mẫu TG Giếng 2: là mẫu TH Giếng 3,4: là đối chứng dương Giếng 5: Đối chứng âm

Hình 3.6: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp mồi Uni_O Trong đó: T là thang DNA 1kb Giếng 1:

dNTPs ở 0.1mM Giếng 2: dNTPs ở 0.2mM Giếng 3: dNTPs ở 0.3mM Giếng 4: dNTPs ở 0.4mM Giếng 5: dNTPs ở 0.5mM Giếng 6: dNTPs ở 0.6mM

39

chuẩn có kích thước là 284bp Chứng tỏ, cặp mồi InvA_12 khuyếch đại được trình tự InvA (284 bp)

Từ kết quả khảo sát nồng độ dNTPs trên cặp mồi InvA so sánh với nghiên cứu của nhóm tác giả Trần Thị Xuân Mai (2011), ta thấy nồng độ tối ưu của dNTPs sử dụng là ít hơn

và tiết kiệm hơn

3.4 Kết quả khảo sát nồng độ dNTPs

Kết quả khảo sát dNTPs trên mồi UNI_O thể hiện trên hình 3.6 cho thấy tất cả các giếng đều có sản phẩm PCR với kích thước theo thang chuẩn là 709bp, trong đó giếng số 1 cho band DNA đậm màu, rõ nét và sáng nhất Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nồng độ dNTPs ở

0,1mM là nồng độ tối ưu nhất để phát hiện Salmonella spp

Kết quả khảo sát dNTPs trên mồi UNI_I thể hiện trên hình 3.7 cho thấy tất cả các giếng từ 1 đến 6 đều có sản phẩm PCR với kích thước theo thang chuẩn là 287bp Các sản phẩm PCR đều sáng và rõ, nên ở các nồng độ dNTPs khác nhau, mồi UNI_I đều cho ra kết quả giống nhau Do đó, nồng độ dNTPs tối ưu cũng là 0,1mM cho cặp mồi UNI_I

3.4 Kết quả khảo sát nồng độ enzyme Taq polymerase

Ở hình 3.8 cho thấy ở mồi UNI_O giếng 1 và giếng 2 (tương ứng Taq polymerase 0.1mM, 0.2nM) không cho sản phẩm PCR, các giếng 3,4,5, 6 với nồng độ Taq polymerase là

0.3mM, 0.4mM, 0.5mM, 0.6mM đều cho ra kết quả PCR là 709bp Ở mồi UNI_I, các giếng

7, 8, 9, 10, 11, 12 đều cho ra sản phẩm đều nhau và rõ với kích thước thang DNA chuẩn là

287bp Như vậy, nồng độ Taq polymerase tối ưu lựa chọn là 0,1mM phù hợp cho cả 2 cặp

mồi UNI_O và UNI_I

Hình 3.5: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp

mồi InvA_12 Trong đó: T là thang DNA chuẩn 1kb

Giếng 1: là mẫu TG Giếng 2: là mẫu TH Giếng 3, 4: đối chứng dương Giếng 5: Đối chứng âm

Hình 3.7: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp mồi

UNI_I Trong đó: Giếng 1: dNTPs ở 0.1mM Giếng 2: dNTPs ở

0.2mM Giếng 3: dNTPs ở 0.3mM Giếng 4: dNTPs ở 0.4mM

Giếng 5: dNTPs ở 0.5mM Giếng 6: dNTPs ở 0.6mM

40

4 Kết luận

Thông qua các nội dung khảo sát, ta thấy rằng việc sử dụng các cặp mồi như UNI_O,

UNI_I, InvA_fr và Inv_12 thiết kế phát hiện được nhóm vi khuẩn Salmonella spp bằng PCR

Việc chuẩn hóa các nồng độ dNTPs (0.1mM) và Taq polymerase (0.1 mM) giúp phát hiện

DNA genome của Salmonella spp với các cặp mồi đặc hiệu tốt hơn Như vậy, so sánh với các kết quả về kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, chúng tôi đã tiến hành chuẩn hóa nồng độ của

hai yếu tố là dNTPs và Taq polymerase Nghiên cứu này đã tạo tiền đề cho việc chuẩn đoán các thông số khác trong PCR đơn mồi như nồng độ tối ưu MgCl2, nồng độ mồi, DNA khuôn

mẫu Từ đó, tạo cơ sở để sản xuất bộ kit PCR thương mại hóa phát hiện Salmonella trong

thực phẩm có thể cạnh tranh về mặt giá cả trên thị trường

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Laval A (2000) Dịch tễ Salmonellosis, Báo cáo tại hội thảo về bệnh lợn tại Viện Thú y –

Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch của Trần Thị Hạnh – Viện Thú y

[2] Trần Thị Hanh, Lưu Quỳnh Hương, Trương Thị Quí Dương, Phạm Thị Ngọc,Nguyễn

Tiến Thành, Ngô Chung Thủy, Trương Thị Hương Giang (2011) Kết quả nghiên cứu tỉ lệ nhiễm Salmonella ở gà thịt giết mổ theo 2 hình thức công nghiệp và thủ công Viện thú y Hà

Nội

[3] Trần Hoàng Ngâu (2015), Nghiên cứu xây dựng bộ kit phát hiện nhanh vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (Salmonella spp và Staphylococcus aureus), Đề tài cấp trường, Đại Học

Công nghiệp Thực Phẩm, Tp Hồ Chí Minh

[4] Trần Linh Thước (2012), Phương pháp phân tích Vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam

[5] Trần Linh Thước (2010), Xây dựng quy trình và chế tạo các bộ KIT PCR (Polymerase chain reaction) để xét nghiệm các vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm, NXB Đại học

quốc gia, TP Hồ Chí Minh

[6] Trần Thị Xuân Mai et.al (2011), Phát hiện nhanh Salmonella spp., Salmonella enterica hiện diện trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR đa mồi, Đại học Cần Thơ, Tạp chí Khoa học [7] Galan JE and Curtiss R (1991), Distribution of the InA, B, C and D genes of Salmonella typhimurium among other Salmonella serovars: InA mutants of Salmonella typhi are deficient for entry into mammalian cells, Infect Immun 59(9), 2901-2908

Hình 3.8: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp với cặp mồi UNI_O và UNI_I Giếng 1,7: Taq polymerase ở

0,1mM Giếng 2, 8: Taq polymerase ở 0,2mM Giếng 3, 9: Taq polymerase ở 0,3mM Giếng 4, 10: Taq polymerase ở 0,4mM Giếng 5, 11: Taq polymerase ở 0,5mM Giếng 6, 12: Taq polymerase ở 0,6mM

41

[8] Kaniga K., Trollinger D., Galan J E (1995), Identification of two targets of the type II protein secretion system encoded by the Inv and Spa loci of Salmonella typhimurium that have homology to the Shigella IpaD and IpaA proteins, J.Bacteriol., Vol 177, No 24,

7078-7085

[9] Malmarugan Shanmugasamy*, Thenmozhi Velayutham, Johnson Rajeswar (2011), InvA gene specific PCR for detection of Salmonella from broilers Veterinary College and Research

Institute,Tamilnadu Veterinary & Animal Sciences University

[10] Shea E.J et.al (1996), Identification of a virulence locus encoding a second type III secretion system in Salmonella typhimurium, Proc Natl., Academic Science, USA, Vol 93,

pp 2593-2597