– các thao tác tế bào liên quan đến việc tạo tế bào lai

– cô lập đoạn gen cần nghiên cứu ra khỏi tập hợp gen chung để có thể nghiên cứu chức năng và thực hiện các thao tác biến đổi9. – Sản xuất lượng lớn gen đích.[r]

Công nghệ gen

TS Trần Cát Đông

Mục tiêu

Định nghĩa

tạo ra các cá thể có sự tổ hợp mới về đặc điểm

di truyền.

tử ADN tái tổ hợp nhân tạo, đưa chúng vào vector và chuyển nó vào tế bào chủ

chung để có thể nghiên cứu chức năng và thực hiện các thao tác biến đổi

Đoạn gen

gen đích

Dòng tế bào mang gen đích

Nuôi cấy Chiết tách

Tạo dòng

Nghiên cứu chức năng

Thực hiện biến đổi Đưa trở lại

tế bào

Các công cụ cơ bản

– Chủng duy trì: mang các đột biến cho phép nhận và

ổn định ADN ngoại lai như DH5α, JM103, …– Chủng biểu hiện: mang các đột biến giúp biểu hiện gen ngoại lai và ổn định protein tái tổ hợp như

BL21(DE3), BL21(DE3)plysS, …

vector sử dụng

Vector tạo dòng - Plasmid

bào chủ bằng cách biến nạp hay thẩm điện

Plasmid

Các vector từ phage lambda

được đóng gói in vitro rất đơn giản và cần ít

ADN đích

mẫu dò, khuếch đại và bảo quản trong một thời gian dài

Vector cosmid

và có được các ưu thế của cả hai dạng vector

plasmid

Vector từ phage dạng sợi - M13

dòng.

trình tự hoặc làm khuôn mẫu để gây đột biến đặc hiệu điểm

Các enzym biến đổi acid nucleic

– Cắt ADN tại vị trí xác định – Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù– Lưu ý tính tương thích khi cắt nối

– ADN polymerase phụ thuộc ADN – Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) – ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu – ARN polymerase phụ thuộc ADN

– Nối hai đoạn ADN

Tạo đoạn ADN đích

Polymerase

PCR

– Trong điều kiện có sẵn nucleotid– Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống

– biến tính dsADN thành các sợi đơn, – ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN,

– enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với các ssADN mẫu

3’-OH

5’-P

nucleotid

Gắn mồi Kéo dài Biến tính và gắn mồi

Kéo dài

3’ 3’

Đoạn đích quay lại

Đoạn đích quay lại

Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20-40 chu kỳ

Tổ chức vật liệu di truyền

Operon Gen 1 Gen 2

Protein ARNt

ADN

NST

Phiên mã Dịch mã

ADN NST

exon intron exon intron exon

P CAP

Tính tương thích của phản ứng cắt nối

Tạo dòng đoạn ADN nhỏ

 Tạo đoạn ADN đích

 Cắt ADN đích và vector

 Nối ADN đích và vector

 Biến nạp vào tế bào

 Kiểm tra dòng tế bào

Vị trí cắt bằng BamHI

ADN đích Plasmid vector

Các mảnh ADN

Biến nạp vào

E coli

Trãi E coli lên

môi trường chọn lọc

Các dòng kháng Ampicillin

In khóm Tetracyclin Ampicillin

Các khóm nhạy Tet

và kháng Amp mang dòng tái tổ hợp

Quá lớn không đóng được

Quá nhỏ không đóng chính xác được Đóng vỏ thành phage

Tóm tắt các bước tạo dòng

Cắt với enzym giới hạn với đầu cắt tương thích với đầu cắt của nhiễm sắc thể

Cắt với enzym giới hạn như với plasmid

Cắt một phần với enzym giới hạn hoặc PCR

Tách ADN theo kích thước

Cosmid Plasmid

Biến nạp / Thẩm điện vào

E coli

Sàng lọc khóm

Đóng vỏ in vitro Tải nạp vào E coli

Đóng vỏ in vitro Tải nạp vào E coli

– Dựa vào hoạt tính đặc hiệu – Protein phải biểu hiện được

Biểu hiện gen tái tổ hợp

– Theo protein đích– Năng suất

– Giá thành – An toàn

Tối ưu hóa sự biểu hiện

– Promoter – Cảm ứng

– rbs, – codon khởi đầu, – sử dụng mã hợp lý – Protein dung hợp

– In vivo– In vitro

Sản xuất protein tái tổ hợp

– Hàm lượng rất thấp – Qui trình sản xuất khó khăn và tốn kém – Giá thành sản xuất rất cao

– Protein từ động vật lại không hoàn toàn giống ở người – Nguy cơ nhiễm mầm virus hay prion

– Gen của người được tạo dòng và sản xuất nhờ vi sinh vật tái tổ hợp

– Sản phẩm có nguồn gốc từ người (gen của người) – Các nồi lên men ở qui mô công nghiệp 2000-5000 lít

 Protein: nguyên thủy: 193 aa, hoạt động: 165 aa

 Protein bị glycosyl hóa mạnh

– Dòng tế bào BHK và 2 – Nuôi cấy bề mặt trên khay nhựa– Thu dịch nuôi cấy để chiết sản phẩm

Mức tinh chế (lần) Dịch nuôi cấy

Interferon

dịch để đáp ứng với virus, ký sinh trùng và tế bào u

Preproinsulin

Đoạn nối Đoạn xuất

Vận chuyển qua màng Thành lập cầu disulfit

Proinsulin Insulin

P

T

Chuỗi A β-gal

P

T

Chuỗi B β-gal

A

B

T Đoạn xuất

Tế bào chất

Met

Xuất ra vùng chu chất Cắt bỏ đoạn xuất bởi protease

Somatotropin hoạt tính

Met

Thu hGH khi phá vỡ tế bào bằng áp suất thẩm thấu Tinh chế hGH từ

dịch ly giải tế bào

Gen HBsAg

Promoter cảm ứng của nấm men Điểm ori nấm men

Leu 2

Điểm ori vi khuẩn Tet R

Terminator

Biến nạp vào nấm men

Lên men trong điều kiện thiếu leucin

Chiết tách kháng nguyên HBsAg Vaccin

Cơ chất Alkaline phosphatase

Phát quang

Đoạn dò được đánh dấu biotin ADN đích Màng