NGUYỄN THỊ THỦY NGHIÊN cứu tác DỤNG của CAO TOÀN PHẦN bẹ cây móc TRÊN một số mô HÌNH gây rối LOẠN cầm máu KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 1 Hình 1.1 Giai đoạn co mạch và giai đoạn hình thành nút tiểu cầu 3 2 Hình 1.2 Sơ đồ quá trình đông máu 4 3 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao bẹ Móc theo phương

RỐI LOẠN CẦM MÁU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CAO TOÀN PHẦN BẸ CÂY MÓC TRÊN MỘT SỐ MÔ HÌNH GÂY

RỐI LOẠN CẦM MÁU

LỜI CẢM ƠN

Thời gian trôi đi thật là nhanh, đã hơn 15 năm gắn bó với mái trường đại học Dược thân yêu, 4 năm là sinh viên của lớp C1K51 là quãng thời gian tuy không dài nhưng cũng đủ để bản thân tôi cảm nhận được sự chỉ bảo tận tâm và giảng dạy nhiệt tình các Thầy cô giáo, tôi đã nhận được rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong cuộc sống

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

PGS.TS Đào Thị Vui, người thầy đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo tôi

từ những bước đầu nghiên cứu cho tới khi hoàn thành khóa luận này

Với lòng biết ơn và cảm động nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Th.S Trần Hồng

Linh, người thầy mà như người chị, đã luôn bên tôi mọi lúc dõi theo, chỉ bảo,

hướng dẫn, động viên tôi những lúc khó khăn để tôi hoàn thành khóa luận này Tôi xin kính gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, các phòng ban chức năng, cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà nội đã giúp tôi được lĩnh hội các kiến thức quý báu và hoàn thành chương trình đào tạo Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô giáo và DS Đinh Đại Độ, DS Đinh Thị Kiều Giang, bộ môn Dược lực đã quan tâm, nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành được khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè

đã luôn luôn ủng hộ, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc, học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống hàng ngày

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày… tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Thủy

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aPTT Thời gian Thromboplastin hoạt hóa từng phần

(Activated Partial Thromboplastin Time)

PT Thời gian Prothrombin (Prothrombin Time)

TT Thời gian Thrombin (Thrombin Time)

ADP Adenosin diphosphat

40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Giai đoạn co mạch và giai đoạn hình thành nút tiểu cầu 3

2 Hình 1.2 Sơ đồ quá trình đông máu 4

3 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao bẹ Móc theo phương pháp chiết

4 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao bẹ Móc theo phương pháp chiết

5 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23

6 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng cầm máu của cao toàn phần

bẹ Móc trên chuột bình thường 25

7 Hình 2.5

Sơ đồ nghiên cứu tác dụng cầm máu của cao toàn phần

bẹ Móc trên chuột gây rối loạn cầm máu bằng aspirin 26

8 Hình 2.6

Sơ đồ nghiên cứu tác dụng cầm máu của cao toàn phần

bẹ Móc trên chuột gây rối loạn cầm máu bằng acenocoumarol

28

9 Hình 2.7

Sơ đồ nghiên cứu tác dụng cầm máu của cao toàn phần

bẹ Móc trên chuột gây rối loạn cầm máu bằng heparin 29

10 Hình 3.1

Tác dụng của cao toàn phần bẹ Móc đến thời gian chảy máu trên chuột bình thường so với lô chứng 33

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Quá trình cầm máu và các rối loạn liên quan đến quá trình cầm máu 2

1.1.1 Giai đoạn co mạch tại chỗ 2

1.1.2 Giai đoạn tạo nút tiểu cầu 2

1.1.3 Giai đoạn tạo cục máu đông 4

1.1.4 Giai đoạn co cục máu đông và tan cục máu đông 5

1.2 Các xét nghiệm cầm máu cơ bản 6

1.2.1 Xét nghiệm của giai đoạn cầm máu ban đầu 6

1.2.1.1 Thời gian chảy máu 7

1.2.1.2 Xét nghiệm số lượng tiểu cầu 7

1.2.1.3 Xét nghiệm chức năng tiểu cầu 7

1.2.2 Xét nghiệm đông máu 7

1.2.2.1 Thời gian đông máu 8

1.2.2.2 Thời gian thrombin 8

1.2.2.3 Thời gian prothrombin 8

1.2.2.4 Thời gian thromboplastin hoạt hóa từng phần 9

1.2.2.5 Định lượng fibrinogen 9

1.2.3 Xét nghiệm giai đoạn phân hủy fibrin 9

1.3 Các mô hình nghiên cứu tác dụng cầm máu của thuốc trên động vật thực nghiệm 10

1.3.1 Mô hình gây chảy máu bằng cách gây tổn thương 10

1.3.2 Mô hình gây rối loạn tiểu cầu 11

1.3.3 Mô hình gây gây giảm các yếu tố đông máu 13

1.3.3.1 Mô hình gây giảm các yếu tố đông máu bằng heparin 13

1.3.3.2 Mô hình giảm các yếu tố đông máu bằng thuốc kháng vitamin K 14

1.4 Tổng quan về cây Móc 15

1.4.1 Vài nét về cây Móc 15

1.4.2 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Móc 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng ngiên cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Động vật nghiên cứu 21

2.1.3 Hóa chất và trang thiết bị 21

2.1.3.1 Hóa chất 21

2.1.3.2 Trang thiết bị, dụng cụ 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.2.1 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bình thường 22

2.2.2 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột gây rối loạn cầm máu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Đánh giá tác dụng cầm máu của các cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bình thường 24

2.3.2 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu 25

2.3.2.1 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu bằng aspirin 25

2.3.2.3 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu bằng heparin 28

2.4 Cách xác định các thông số nghiên cứu 30

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Kết quả nghiên cứu 32

3.1.1 Tác dụng cầm máu của các cao bẹ Móc trên chuột bình thường 32

3.1.2 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu 33

3.1.2.1 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu bằng aspirin 34

3.1.2.2 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu bằng acenocoumarol 36

3.1.2.3 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn đông máu bằng heparin 38

3.2 Bàn luận 40

3.2.1 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bình thường 40

3.2.2 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn đông máu 42

3.2.2.1 Tác dụng cầm máu của bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn đông máu bằng aspirin 42

3.2.2.2 Tác dụng cầm máu của bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn đông máu bằng acenocoumarol 43

3.2.2.3 Tác dụng cầm máu của bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu bằng heparin 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

1 Kết luận 47

1.2 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu 47

1.2.1 Tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ Móc trên chuột bị gây rối loạn cầm máu bằng aspirin 471.2.3 Tác dụng cầm máu trên chuột bị gây rối loạn đông máu bằng heparin 48

2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bình thường, máu lưu thông trong hệ tuần hoàn, đảm bảo việc vận chuyển oxy, các chất dinh dưỡng đến mọi cơ quan qua đó duy trì các hoạt động chức năng sống của cơ thể Tuy nhiên vì một nguyên nhân nào đó, máu thoát được từ trong lòng mạch ra ngoài,

đó là hiện tượng chảy máu Chảy máu có thể gặp dưới nhiều hình thức khác nhau như chảy máu cam, chảy máu chân răng, chảy máu dưới da và niêm mạc, chảy máu các tạng, chảy máu não Nguyên nhân dẫn đến chảy máu cũng rất đa dạng: do tổn thương thành mạch, do giảm số lượng, chức năng tiểu cầu, do sử dụng các thuốc chống đông, do nhiễm khuẩn cho dù bất kỳ nguyên nhân nào thì hậu quả cũng tương đối nặng nề, thậm chí việc mất máu nhiều có thể dẫn đến tử vong Do vậy, việc xử lí cầm máu khi có chảy máu là một vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết, trong đó không thể không nhắc đến vai trò của các thuốc cầm máu Các thuốc tân dược có tác dụng cầm máu không nhiều, hơn nữa việc phát triển các thuốc này còn chưa được quan tâm đúng mức Bởi vậy việc nghiên cứu phát triển các thuốc cầm máu đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu vừa có hiệu quả và ít tác dụng không mong muốn trong giai đoạn hiện nay là vô cùng cần thiết

Việt Nam là quốc gia có nguồn dược liệu vô cùng phong phú, trong đó có rất nhiều dược liệu có tác dụng cầm máu Bẹ Móc là một vị thuốc cầm máu được nhân dân ta sử dụng từ lâu và cho kết quả tốt [8],[9] Tuy nhiên việc sử dụng này đơn giản chỉ là theo kinh nghiệm dân gian chưa có một nghiên cứu khoa học nào để kiểm chứng nên phạm

vi áp dụng còn hạn chế Để phát triển dược liệu này thành chế phẩm thuốc cầm máu được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng thì cần phải có các nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng cầm máu của nó Từ thực trạng này nhóm nghiên cứu đã tiến hành các thực nghiệm và cho kết quả rất khả quan [1], [10], [13] Trên cơ sở đó, để tiếp nối các thành quả trên và định hướng nghiên cứu phát triển sản phẩm cầm máu từ bẹ Móc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của cao toàn phần bẹ cây Móc trên một số

mô hình gây rối loạn cầm máu” với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ cây Móc trên chuột bình thường

2 Đánh giá tác dụng cầm máu của cao toàn phần bẹ cây Móc trên chuột

đã bị gây rối loạn cầm máu

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Quá trình cầm máu và các rối loạn liên quan đến quá trình cầm máu

Cầm máu là một quá trình diễn ra nhằm hạn chế hoặc ngăn cản máu chảy ra khỏi mạch khi mạch bị tổn thương Quá trình cầm máu được thực hiện qua các giai đoạn: co mạch, hình thành nút tiểu cầu, đông máu, co cục máu đông và tan cục máu đông Sau khi quá trình cầm máu hoàn thành, tại nơi tổn thương, mô xơ phát triển thành sẹo làm liền tổn thương mạch máu [5]

1.1.1 Giai đoạn co mạch tại chỗ

Ngay sau khi thành mạch bị tổn thương, mạch máu sẽ co lại để hạn chế lượng máu thoát ra ngoài Co mạch còn có tác dụng làm tốc độ lưu chuyển máu chậm lại, tạo điều kiện cho việc hình thành nút tiểu cầu và cục máu đông Cơ chế của

co mạch là do những xung động đau từ nơi mạch bị tổn thương sẽ hoạt hóa thần kinh giao cảm gây phản xạ co mạch Ngoài ra tại vị trí tổn thương sẽ xuất hiện điện thế hoạt động, điện thế này sẽ lan truyền dọc theo thành mạch gây co mạch Serotonin và thromboxan A2 được bài tiết từ tiểu cầu cũng gây tác dụng co mạch Tổn thương càng lớn thì mức độ co mạch càng mạnh Co mạch có thể kéo dài hàng phút thậm chí hàng giờ để tạo điều kiện cho tiểu cầu kết dính và kết tụ vào nơi tổn thương [5]

Thành mạch đóng vai trò rất quan trọng trong việc cầm máu, khi thành mạch máu bị tổn thương sẽ dễ gây chảy máu và thời gian chảy máu kéo dài như: hội chứng xuất huyết do dị ứng, thành mạch dễ vỡ gây chảy máu do thiếu vitamin C, chảy máu do thể tạng có mạch máu dễ vỡ [2]

1.1.2 Giai đoạn tạo nút tiểu cầu

Bình thường tế bào nội mô mạch máu bài tiết prostacyclin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu Khi thành mạch bị tổn thương sẽ làm rách lớp nội mô, để lộ ra lớp collagen tích điện (+) ở bên dưới Do tích điện âm và có receptor với collagen nên tiểu cầu có thể dễ dàng kết dính với thành mạch bị tổn thương Bản thân tế bào nội mô bị tổn thương còn giải phóng ra yếu tố hoạt hóa tiểu cầu, yếu tố Willebrand cần cho sự kết dính tiểu cầu Sau khi kết dính vào nơi có tổn thương,

3

tiểu cầu được hoạt hóa, bề mặt trở nên xù xì đồng thời bài tiết yếu tố hoạt hóa tiểu cầu, ADP và thromboxan A2 (thromboxan A2 được tổng hợp từ phospholipid của màng tiểu cầu) Các chất này sẽ làm các tiểu cầu khác lưu động trong máu kết tụ với tiểu cầu vừa bị kết dính Các tiểu cầu mới kết tụ tiếp tục được hoạt hóa bài tiết các chất hóa học làm cho càng có thêm nhiều tiểu cầu kết tụ hình thành nút tiểu cầu Trong nút tiểu cầu, các phân tử fibrinogen cũng có mặt với vai trò tạo ra cầu nối giữa các tiểu cầu được kết tụ [5]

Hình 1.1 Giai đoạn co mạch và giai đoạn hình thành nút tiểu cầu

Sự hình thành nút tiểu cầu có ý nghĩa đặc biệt quan trọng với cơ thể vì nó có thể bịt kín tổn thương làm cho máu ngừng chảy nếu tổn thương ở mạch nhỏ, đặc biệt là thường ngày vẫn xảy ra hàng trăm, hàng ngàn vết thương nhỏ của thành mạch Thời gian hình thành nút tiểu cầu (thời gian chảy máu) khoảng 2- 4 phút (tính từ khi máu chảy ra khỏi những mạch máu nhỏ cho đến lúc máu ngừng chảy) Khi số lượng hoặc chất lượng tiểu cầu giảm thì sẽ làm cho thời gian chảy máu kéo dài, xuất hiện nhiều nốt xuất huyết dưới da và niêm mạc, bệnh nhân dễ chảy máu khi sang chấn nhẹ và thời gian chảy máu kéo dài trên 6 phút Chảy máu nặng xảy

ra khi số lượng tiểu cầu giảm dưới 50 G/l, nếu số lượng tiểu cầu chỉ còn 10 G/l thì bệnh nhân sẽ tử vong do không cầm máu được [5]

4

Các bệnh chảy máu do tiểu cầu như xuất huyết giảm tiểu cầu tự miễn, giảm tiểu cầu thứ phát, tăng tiểu cầu tiên phát hoặc là bệnh suy nhược tiểu cầu đều có chung triệu chứng là xuất huyết da và niêm mạc, xuất huyết tiêu hóa và xuất huyết não sẽ rất nguy hiểm nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời [2]

1.1.3 Giai đoạn tạo cục máu đông

Đông máu là quá trình máu chuyển từ thể lỏng sang thể đặc, do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan và các sợi fibrin này sẽ trùng hợp tạo mạng lưới fibrin giam giữ các thành phần của máu và máu đông lại

Đông máu là một chuỗi các phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu có trong huyết tương, các mô tổn thương và tiểu cầu và gồm có 3 giai đoạn (hình 1.2):

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình đông máu

 Giai đoạn tạo prothrombinase (Thromboplastin hoạt động)

Đây là giai đoạn phức tạp nhất và kéo dài nhất của quá trình đông máu được xảy ra theo 2 con đường: nội sinh và ngoại sinh

- Con đường ngoại sinh

Con đường đông máu ngoại sinh được bắt đầu bằng sự giải phóng ra thromboplastin của mô (yếu tố III) từ mạch máu hoặc mô bị tổn thương Yếu tố III sẽ hoạt hóa yếu tố VII, phức hợp yếu tố III- yếu tố VII hoạt hóa và ion Ca++ sẽ hoạt hóa yếu tố X Yếu tố X hoạt hóa kết hợp với phospholipid tiểu cầu, ion Ca++

và yếu tố V hoạt hóa (yếu tố V được hoạt hóa nhờ tác dụng của thrombin) tạo ra phức hợp prothrombinase Quá trình này diễn ra rất nhanh

- Con đường nội sinh

Khác với con đường ngoại sinh, quá trình đông máu nội sinh được hoạt hóa khi bản thân máu bị tổn thương hoặc tiếp xúc với bề mặt lạ (thành mạch bị tổn

Phức hợp prothrombinase (Giai đoạn 1)

Prothrombin

Fibrinogen

Thrombin (Giai đoạn 2)

Fibrin (Giai đoạn 3)

5

thương, thành ống nghiệm) Yếu tố đông máu đầu tiên được hoạt hóa là yếu tố XII Sau đó các yếu tố đông máu khác (XI, IX) sẽ được hoạt hóa theo kiểu dây chuyền Sự hoạt hóa yếu tố X trong cơ chế nội sinh thì cần có mặt của phospholipid được giải phóng từ tiểu cầu, ion Ca++ và yếu tố VIII Sau khi hình thành yếu tố X hoạt hóa, sự hình thành phức hợp enzym prothrombinase cũng giống như cơ chế ngoại sinh [5]

 Giai đoạn chuyển prothrombinase thành thrombin

Prothrombin là một globulin có trong huyết tương và do gan sản xuất Nó là tiền chất không hoạt động của một enzym tiêu protein rất mạnh là thrombin Phức hợp enzym prothrombinase được tạo thành cùng với ion Ca++ xúc tác cho quá trình chuyển prothrombin thành thrombin Phản ứng này xảy ra trong vài giây [5]

 Giai đoạn chuyển fibrinogen thành fibrin

Dưới tác dụng của thrombin các phân tử fibrinogen bình thường hòa tan sẽ biến thành fibirin đơn phân Các fibirin đơn phân này sẽ trùng hợp để tạo thành sợi fibrin trong vài giây Các sợi fibrin này nối với nhau bằng cầu nối hydro lỏng lẻo nên không bền Dưới tác dụng của yếu tố ổn định fibrin - yếu tố XIIIh (do thrombin hoạt hóa), các cầu nối hydro này được thay thế bởi cầu nối đồng hóa trị, tạo ra mạng fibrin bền vững Cục máu đông hình thành có tác dụng bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc [5]

Như vậy có 13 yếu tố tham gia vào quá trình cầm máu, chúng vô cùng quan trọng cho giai đoạn hình thành cục máu đông Một số bệnh gây giảm số lượng và chức năng của các yếu tố này sẽ gây chảy máu ví dụ như: bệnh Hemophilia, bệnh chảy máu do thiếu yếu tố phụ thuộc vitamin K, bệnh thiếu fiibrin máu bẩm sinh, chảy máu do thiếu yếu tố II, VII, chảy máu do các chất ức chế các chất kháng thromboplastin [2]

1.1.4 Giai đoạn co cục máu đông và tan cục máu đông

 Giai đoạn co cục máu đông

Sau khi máu đông khoảng từ 1- 2 giờ, cục máu đông co lại và giải phóng ra toàn bộ dịch của nó gọi là huyết thanh Hiện tượng co cục máu đông có tác dụng

6

làm mép vết thương khép lại gần nhau hơn để tạo điều kiện cho sự hóa sẹo Cơ chế co cục máu đông tuy còn nhiều điểm chưa sáng tỏ nhưng nhiều tác giả cho rằng là do các thrombosthenin, actin và myosin trong tiểu cầu có tác dụng làm tiểu cầu co lại Chính các protein này sẽ kéo những gai tiểu cầu đang gắn vào fibrin khiến cho cục máu đông bị ép lại Khi số lượng hoặc chất lượng tiểu cầu giảm sẽ làm cho thời gian co cục máu đông sẽ dài hơn và cục máu đông co không hoàn toàn Sự co cục máu đông được hoạt hóa bởi thrombin và ion Ca++ Do vậy, thiếu ion Ca++ cũng làm cục máu đông co không hoàn toàn [5]

 Giai đoạn tan cục máu đông

Là hiện tượng cục máu đông tan ra dưới tác dụng của plasmin được hoạt hóa

từ plasminogen Plasmin là một enzym có khả năng phân hủy fibrin mạnh, do đó làm tan cục máu đông Những yếu tố có thể hoạt hóa plasminogen là: yếu tố hoạt hóa plasminogen của mô (tissue plasminogen activator- tPA), thrombin, yếu tố XII hoạt hóa, các enzym của lysosom từ mô tổn thương, urokinase trong nước tiểu, độc tố streptokinase của vi khuẩn

Tan cục máu đông là một trong những cơ chế chống đông của chính cơ thể khi có xuất hiện cục máu đông để ngăn ngừa tắc mạch và tạo điều kiện cho quá trình liền sẹo [5]

1.2 Các xét nghiệm cầm máu cơ bản

Các xét nghiệm cơ bản để đánh giá quá trình cầm máu, được dùng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh liên quan tới chảy máu bao gồm: xét nghiệm giai đoạn cầm máu ban đầu, xét nghiệm đông máu, xét nghiệm giai đoạn phân hủy fibrin

1.2.1 Xét nghiệm của giai đoạn cầm máu ban đầu

Sau khi có tổn thương của thành mạch, tiểu cầu được hoạt hóa, kết dính và kết

tụ vào thành mạch bị tổn thương, tạo nút tiểu cầu (đinh cầm máu) và tham gia vào quá trình đông máu Khi thiếu hụt về số lượng hoặc suy giảm chức năng tiểu cầu

sẽ làm thời gian chảy máu kéo dài

7

1.2.1.1 Thời gian chảy máu

Thời gian chảy máu: là thời gian từ khi dòng máu bắt đầu chảy ra khỏi thành mạch cho đến khi ngừng chảy [15] Khi mạch bị tổn thương, máu sẽ thoát ra ngoài, đồng thời một chuỗi các phản ứng diễn ra, quá trình cầm máu diễn ra Đo thời gian chảy máu là tạo ra tổn thương mạch máu và đo thời gian từ lúc máu chảy đến lúc ngừng chảy

Đây là một xét nghiệm cơ bản nhất, dễ tiến hành nhất để đánh giá giai đoạn đầu cầm máu, thời gian chảy máu bình thường từ 3 đến 9 phút Thời gian chảy máu có thể được xác định theo phương pháp Ivy hoặc là phương pháp Duke, thời gian chảy máu tăng do giảm số lượng hoặc chất lượng của tiểu cầu, giảm fibrinogen hoặc bệnh lý thành mạch [11], [14]

1.2.1.2 Xét nghiệm số lượng tiểu cầu

Xét nghiệm số lượng tiểu cầu: là một xét nghiệm có ý nghĩa để phát hiện các rối loạn của quá trình cầm máu [4], [11] Cũng như số lượng hồng cầu, bạch cầu,

số lượng tiểu cầu hiện nay sử dụng máy đếm cho kết quả rất chính xác

Số lượng tiểu cầu bình thường là 150 - 350 G/l, các rối loạn về số lượng tiểu cầu như giảm trong các bệnh sốt xuất huyết, suy tủy, đông máu nội mạc rải rác… tăng trong các trường hợp như tăng tiểu cầu tiên phát, hội chứng tăng sinh tủy…[11],[14]

1.2.1.3 Xét nghiệm chức năng tiểu cầu

Xét nghiệm chức năng tiểu cầu: là kiểm tra đáp ứng của tiểu cầu với các chất gây ngưng tập tiểu cầu như colagen, ADP… cho nên thường để phát hiện rối loạn cầm máu do chức năng của tiểu cầu, dựa vào các đặc tính chính của tiểu cầu là khả năng kết tụ, khả năng ngưng tập mà sử dụng sử dụng xét nghiệm là đo độ dính

và đo độ ngưng tập của tiểu cầu để có thể đánh giá chức năng tiểu cầu [11], [14]

1.2.2 Xét nghiệm đông máu:

Đông máu là quá trình chuyển từ thể lỏng thành thể đặc do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hoà tan, thông qua một chuỗi các phản ứng hóa học với sự tham gia của các yếu tố đông máu có trong huyết tương, các mô tổn thương

8

và tiểu cầu Các xét nghiệm được sử dụng để đánh giá quá trình đông máu bao gồm:

1.2.2.1 Thời gian đông máu

Thời gian đông máu: là thời gian tính từ khi máu ra khỏi cơ thể (không dùng chống đông) đến khi máu đông hoàn toàn Thời gian đông máu là một xét nghiệm phổ biến nhằm đánh giá chức năng đông máu của cơ thể Thông số này cũng dùng

để đánh giá và giám sát tác dụng của thuốc chống đông

Các kỹ thuật để xác định thời gian đông máu:

- Kỹ thuật trên lam kính: thời gian đông máu là khoảng thời gain từ khi lấy giọt máu ra lam kính đến khi giọt máu đông lại hoàn toàn – tức là giọt máu không thay đổi hình dạng khi nghiêng trên lam kính [15]

- Kỹ thuật mao quản: thời gian đông máu được tính được xác định là thời gian

từ khi máu chảy vào mao quản đến khi hình thành cấu trúc dạng sợi trong mao quản [19] Ngoài ra còn có kỹ thuật khác như kỹ thuật trong ống nghiệm… Thời gian đông máu bình thường 5-10 phút, thời gian đông máu kéo dài thể hiện các bất thường về quá trình cầm máu [11], [14]

1.2.2.2 Thời gian thrombin (Thrombin Time: TT)

Thời gian thrombin là thời gian đông máu khi cho thrombin vào huyết tương Bình thường, thời gian TT là 15-18 giây

Xác định TT nhằm đánh giá sự chuyển dạng fibrinogen sang fibrin bởi hệ thống nội sinh và ngoại sinh khi có thrombin trong hệ thống thử Đánh giá giai đoạn cuối của quá trình đông máu, TT kéo dài trong các trường hợp: giảm fibrinogen máu, rối loạn fibrinogen máu [11], [14]

1.2.2.3 Thời gian prothrombin (Prothrombin Time: PT)

PT là thời gian đông huyết tương đã được chống đông bằng natri citrat hoặc oxalat, nay được phục hồi canxi và thêm yếu tố của tổ chức (thromboplastin) Bình thường, thời gian PT=10-14 giây, tương ứng với tỷ lệ prothrombin 80- 100%

9

Thời gian PT phản ánh hoạt tính các yếu tố đông máu theo con đường ngoại sinh (các yếu tố II, V, VII, X)

Điều trị bằng heparin có thể gây kéo dài PT [11], [14]

1.2.2.4 Thời gian thromboplastin hoạt hóa từng phần (aPTT)

aPTT là thời gian phục hồi canxi của huyết tương citrat hóa sau khi ủ với một lượng thừa kaolin (hoạt hóa yếu tố tiếp xúc) và cephalin (thay thế yếu tố III tiểu cầu) [11], [14]

Bình thường, aPTT từ 30- 40 giây, xác định aPTT nhằm đánh giá con đường đông máu nội sinh, khi thời gian này kéo dài trên 60 giây được coi là suy giảm con đường nội sinh [11], [14]

là một xét nghiệm quan trọng để đánh giá toàn bộ quá trình cầm máu

Bình thường, hàm lượng fibrinogen là 2- 4g/l [5], [14]

1.2.3 Xét nghiệm giai đoạn phân hủy fibrin

 Sản phẩm phân hủy fibrin (FDP)

Khi fibrin bị phân giải bằng plasmin hoạt động thì những mảnh vỡ được giải phóng tạo FDP Chất này đo được trong huyết đương bằng phương pháp miễn dịch

Bình thường, FDP huyết tương <10μg/ml Tăng FDP trong các trường hợp sau hậu phẫu, chấn thương, suy thận, nhiễm khuẩn, huyết khối tĩnh mạch [11], [14]

 Thời gian phân giải euglobulin

Xét nghiệm thời gian phân giải euglobulin nhằm đánh giá sự có mặt của yếu

tố hoạt hóa plasminogen

Bình thường, thời gian này >3 giờ

Thời gian này ngắn lại khi có sự phân hủy fibrin hệ thống [11], [14]

- Mô hình gây chảy máu bằng tổn thương

- Mô hình gây rối loạn thành mạch

- Mô hình gây rối loạn tiểu cầu

- Mô hình gây rối loạn các yếu tố đông máu

- Mô hình gây rối loạn tiêu fibrin

Các mô hình này có thể tiến hành trên động vật bình thường hay động vật có bệnh lý về rối loạn quá trình cầm máu, tuy nhiên chảy máu tự phát là rất hiếm gặp,

do vậy trong tất cả các mô hình, gây tổn thương là phương pháp duy nhất để kiểm tra hoạt động cầm máu của cơ thể Trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi xin trình bày một số mô hình tiêu biểu sau:

1.3.1 Mô hình gây chảy máu bằng cách gây tổn thương

Trên lâm sàng, quá trình chảy máu, mất máu thường do một số nguyên nhân như; chấn thương, phẫu thuật, do tai biến xuất huyết…Do đó để mô phỏng các tình huống này, trên thực nghiệm có thể gây chảy máu bằng cách gây tổn thương các cơ quan, tạng, cắt đuôi hoặc chi của con vật Sau đó, đánh giá tác dụng của thuốc thông qua 2 thông số chính là thời gian chảy máu và khối lượng máu chảy Nếu thuốc mà rút ngắn được thời gian chảy máu thì thuốc đó được coi là có tiềm năng trong cầm máu khi có tổn thương

 Mô hình cắt đuôi chuột

- Nguyên tắc:

Một thông số chẩn đoán khuyết tật của hệ thống cầm máu là khoảng thời gian

mà máu bắt đầu chảy đến khi ngừng chảy từ một vết rạch tiêu chuẩn, được gọi là

11

thời gian chảy máu Mô hình cắt đuôi chuột gây tổn thương cả động mạch và tĩnh mạch là thích hợp nhất để đánh giá tác dụng của thuốc lên toàn bộ quá trình cầm máu thông qua thông số này Mô hình cắt đuôi chuột được đưa ra bởi Dóttl và Ripke (1936) thường được sử dụng phổ biến trong thực nghiệm [27]

- Thông số đánh giá:

+ Thời gian chảy máu: thời gian từ khi cắt đuôi cho đến khi ngừng chảy máu, đối với mô hình cắt đuôi quan sát trong 600 giây (10 phút) [27] Lui Y và cộng sự theo dõi trong 20 phút kể cả khi máu ngừng chảy, nếu chảy máu tái phát sau một khoảng ngừng chảy máu, thời gian chảy máu được xác định là tổng thời gian chảy máu trong 20 phút theo dõi [23]

+ Thời gian đông máu: đâm thủng cấu trúc sau hốc mắt, thu thập máu vào ống mao dẫn, bấm đồng hồ ngay lập tức cho đến khi quan sát thấy máu hình thành cấu trúc dạng sợi thì ngừng [19], hoặc lấy một giọt máu từ vết thương nhỏ lên mặt kính và xác định thời gian cho đến khi máu bắt đầu đông [12]

 Ngoài ra còn có mô hình gây tổn thương các tạng, gây chấn thương não, gây tổn thương các mạch máu hoặc là gây tổn thương da và niêm mạc…

Nói chung, mô hình này rất hữu ích cho nghiên cứu các thuốc có tác dụng cầm máu, đánh giá được tác dụng của thuốc lên toàn thân, trên tổng thể quá trình cầm máu đưa ra các đánh giá ban đầu về tác dụng của thuốc Đây là mô hình được sử dụng nhiều nhất trong thực nghiệm vì rất dễ thực hiện, nguyên tắc đơn giản (đo bằng đồng hồ bấm giây, quan sát được bằng mắt thường…) nhanh, các đo lường

cụ thể, cho số liệu chính xác khách quan và lặp lại, có thể chuẩn hóa được kỹ thuật như độ dài, diện tích vết cắt đuôi Hơn nữa, mô hình này thuận lợi, kinh tế, động vật thí nghiệm không phải trải qua giai đoạn gây bệnh Tuy nhiên mô hình này cũng có những khó khăn như nếu chảy máu quá mức sẽ khiến động vật tử vong, sai số do quan sát nếu nhiều người cùng làm thí nghiệm…

1.3.2 Mô hình gây rối loạn tiểu cầu

Tiểu cầu có vai trò tạo nút tiểu cầu (đinh cầm máu) và tham gia vào các giai đoạn của quá trình đông máu Vì vậy giảm số lượng tiểu cầu hoặc giảm chức năng

 Mô hình gây giảm số lượng tiểu cầu

Giảm tiểu cầu có thể gây ra bởi nhiều phương pháp như tiêm huyết thanh và chiếu xạ, sử dụng các chất hoạt hóa tiểu cầu đánh giá các thông số: thời gian chảy máu, thời gian đông máu, đếm số lượng tiểu cầu và các xét nghiệm đông máu khác như: aPTT, PT, TT, đo độ kết dính tiểu cầu…

 Mô hình gây giảm chức năng tiểu cầu

Gây giảm chức năng tiểu cầu bằng các phương pháp: sử dụng các thuốc kháng

tiểu cầu, đột biến gen làm giảm yếu tố von-Willebrand hoặc làm giảm các hạt

trong tiểu cầu…dưới đây là mô hình gây giảm chức năng tiểu cầu bằng các thuốc kháng tiểu cầu

-Nguyên tắc:

Bình thường tiểu cầu không bám dính được vào thành mạch và không kết tập được Khi thành mạch bị tổn thương, tiểu cầu nhanh chóng được hoạt hóa, dính vào colagen bị lộ ra ở lớp dưới nội mạc, đồng thời bài tiết yếu tố hoạt hóa tiểu cầu, ADP và thromboxan A2, các chất này sẽ làm cho các tiểu cầu khác lưu động trong máu kết tụ với các tiểu cầu vừa bị kết dính để tạo thành nút tiểu cầu và tham gia vào đông máu

Aspirin là thuốc có tác dụng chống kết tập tiểu cầu do ức chế enzym thromboxan synthetase và làm mất hoạt tính của enzym cyclooxygenase, dẫn đến giảm tổng hợp thromboxan A2 của tiểu cầu Ngoài ra aspirin còn có ái lực với receptor ở màng tiểu cầu giúp ổn định màng, làm cho ADP không giải phóng ra được và không tham gia vào kết tập tiểu cầu Như vậy, aspirin gây giảm chức năng tiểu cầu thông qua làm giảm khả năng ức chế kết tập tiểu cầu, có tác dụng chống đông máu, được dùng làm mô hình gây rối loạn đông máu cho thuốc nghiên cứu [3]

13

- Thông số đánh giá:

+ Thời gian máu chảy và khối lượng máu chảy: tiến hành đo thời gian chảy máu theo phương pháp cắt đuôi chuột, như đã trình bày ở mục 1.3.1 Lượng máu chảy được thu lại và đo hemoglobin bằng cách đo độ hấp thụ [21]

+ Tính phần trăm khối lượng máu chảy ở lô được điều trị so với lô không được điều trị

+ Ngoài ra, sau khi gây giảm tiểu cầu, tùy thuộc vào yêu cầu của mỗi nghiên cứu mà có thể đánh giá các thông số sau: hoạt tính enzym cycloxygenase, định lượng thromboxan A2, đo độ kết dính tiểu cầu

Nói chung, mô hình này đã bắt chước được các bệnh lý di truyền như: von –Willebran…hay các trường hợp quá liều thuốc chống đông trên người Đây là mô hình hữu ích, tính khả thi cao, cho các thuốc cầm máu tác động lên tiểu cầu Tuy nhiên mô hình cũng gặp phải một số khó khăn như: mức độ gây tổn thương phụ thuộc vào tác nhân sử dụng, nếu tác nhân được lựa chọn không phù hợp thì mô hình sẽ thất bại, các thông số đánh giá khác thì cần có trang thiết bị máy móc hiện đại…

1.3.3 Mô hình gây gây giảm các yếu tố đông máu

Khi các yếu tố đông máu được hoạt hóa, chúng sẽ tham gia vào các giai đoạn của quá trình đông máu để hình thành cục máu đông bịt kín vết thương Vì vậy gây thiếu hụt hoặc suy giảm các yếu tố đông máu sẽ dẫn đến giảm hiệu quả quá trình cầm máu Dựa vào nguyên tắc này, các nghiên cứu gây thiếu hụt một hoặc nhiều yếu tố đông máu để đánh giá tác dụng thuốc cầm máu

1.3.3.1 Mô hình gây giảm các yếu tố đông máu bằng heparin

- Nguyên tắc:

Heparin có tác dụng chống đông máu nhanh cả in vivo Bình thường trong máu antithrombin III có tác dụng chống đông máu do làm mất hiệu lực của thrombin III và các yếu tố đông máu IX, X, XI, XII hoạt hóa Khi có mặt heparin thì nó sẽ tạo phức với antithrombin III làm tăng tác dụng của antithrombin III lên

14

1000 lần, dó đó, các yếu tố đông máu và thrombin mất nhanh hiệu lực làm máu không đông được [3], [14]

Heparin trọng lượng phân tử thấp (LMWHs) không ức chế thrombin mà chỉ

ức chế yếu tố X hoạt hóa, do đó, trong các xét nghiệm đông máu, LMWHs không làm thay đổi nhiều Aptt mà chỉ làm thay đổi hoạt tính của anti Xa [14]

Dựa vào nguyên tắc trên, các nghiên cứu đã sử dụng heparin cả dạng không phân đoạn (UFH) và LMWHs tạo ra các mô hình thiếu hụt các yếu tố đông máu,

sử dụng để nghiên cứu tác dụng của thuốc

Các mô hình khác: Sogut và cộng sự (2015) cũng gây giảm các yếu tố đông máu bằng heparin liều 640IU/ Kg, tiêm màng bụng 3 lần một ngày, trong 3 ngày liên tiếp [26], Racanelli và FareedJ (1992) dùng heparin liều 1mg/kg hoặc Fraxiparin R liều 1mg/kg [25]

1.3.3.2 Mô hình giảm các yếu tố đông máu bằng thuốc kháng vitamin K

Vitamin K có tác dụng làm đông máu bằng cách: carboxyl hóa gốc glutamat trong cấu trúc hóa học của các yếu tố II, VII, IX, X để chuyển chúng thành các yếu tố đông máu có hoạt tính [3] Giảm vitamin K sẽ làm giảm các yếu tố đông máu hoạt hóa, gây chảy máu kéo dài Do đó, có thể gây mô hình thiếu vitamin K trên thực nghiệm bằng cách: cho dùng thuốc kháng vitamin K

15

nghiên cứu tác dụng của các thuốc cầm máu trên động vật giảm vitamin K[28] Illanes (2010), Schlunk (2012), Zhou (2011) cũng sử dụng mô hình này trong nghiên cứu

Như vậy: Số lượng các yếu tố đông máu trong huyết tương tham gia vào quá trình cầm máu là tương đối lớn, do vậy mà các mô hình gây giảm các yếu tố đông máu đã mô phỏng được các bệnh lý thường gặp trên lâm sàng: sử dụng thuốc chống đông, bệnh gan, các bệnh di truyền, vì vậy các mô hình này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu Thông số được sử dụng để đánh giá con đường đông máu bao gồm: thời gian chảy máu, các giá trị PT, aPTT, TT Giá trị PT dùng

để nghiên cứu tác dụng của thuốc lên con đường đông máu ngoại sinh, trong khi aPTT lại thăm dò quá trình đông máu nội sinh Sử dụng cả 2 thông số này có thể đánh giá và khu trú các yếu tố trong quá trình đông máu mà thuốc tác động vào Tuy nhiên các mô hình này cũng gặp phải các khó khăn như: các con vật đã gây rối loạn các yếu tố đông máu thì thông số thời gian chảy máu sẽ khó xác định: chảy máu xen kẽ giữa các đợt chấm dứt chảy máu, chảy máu rỉ rả…, để giải quyết vấn đề này nhiều nhà nghiên cứu lấy kết quả là thời gian tính đến khi máu ngừng chảy lần đầu tiên hoặc là sử dụng thời gian tích lũy (tổng thời gian máu chảy)

1.4 Tổng quan về cây Móc

1.4.1 Vài nét về cây Móc

- Đặc điểm

16

Cây Móc Caryota mitis L có thân hình trụ, mọc thành bụi, do đâm chồi từ

gốc Thân do nhiều bẹ lá tạo thành Lá kép lông chim hai lần, dài 1 - 2m, gồm nhiều lá chét mọc so le Phiến lá hình tam giác lệch, gốc nhọn, bìa trên có răng cưa nhỏ, dài 15 – 20 cm, gân lá xếp như nan quạt, phiến lá dài Cụm hoa gồm 5 -

6 bông mo, mỗi bông mo dài 30 – 40 cm, mang hoa dày đặc Hoa đơn tính cùng

gốc, mỗi hoa cái có kèm 2 hoa đực Mỗi chùm hoa gọi là buồng Buồng hoa mọc

từ thân ra, trên trước, dưới sau, do đó quả của buồng trên trưởng thành trước quả buồng dưới Quả hình cầu, đường kính 1 - 1,5 cm, vỏ nhẵn màu đen, mỗi quả có

1 hạt [8], [9], [16]

- Phân bố, sinh thái

Caryota mitis L là một chi lớn gồm các loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

Nam Á và Đông – Nam Á Ở Việt Nam có 6 loài, đều là cây mọc tự nhiên

Móc là loại cây nhiệt đới tương đối điển hình Cây phân bố rải rác khắp các nước Ấn Độ, Xrilanca đến Malayxia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Indonesia và Việt Nam Ở Việt nam cây cũng phân bố rải rác ở các tỉnh từ vùng núi thấp (dưới 1000m) đến vùng trung du và đồng bằng, tập trung nhiều nhất ở Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Bắc Giang, Tuyên Quang và các tỉnh khu 4 cũ Cây thường mọc rải rác ở ven rừng thứ sinh, trong các lùm bụi gần khu dân cư Còn được trồng ở nhiều nơi làm cảnh [8], [9], [16]

17

dụng làm sít ruột, tan hòn cục: liều dùng: 20g đốt tồn tính tán bột uống hoặc sắc thuốc Quả Móc vị cay, tính mát, có tác dụng giải khát, chống mệt mỏi Nhân quả giã nát đắp chữa đau nửa đầu Rượu Móc có tác dụng nhuận tràng [8], [9], [16]

- Một số bài thuốc có bẹ Móc :

+ Chữa băng huyết: bẹ Móc phơi khô, phối hợp xơ mướp, lượng bằng nhau, đốt tranh tro Mỗi lần uống 6g với ít rượu hoặc nước muối vào lúc đói

+ Chữa rong huyết có đau bụng: bẹ Móc 80g, kinh giới 80g, hương phụ 40g

Bẹ Móc đốt tồn tính, kinh giới sao đen, hương phụ tử chế Tất cả tán nhỏ, rây lấy bột mịn Mỗi lần uống 8-16g, ngày uống 2-3 lần [8], [16]

+ Chữa động thai: rễ Móc , rễ chuối rừng, rễ chuối hột, lượng bằng nhau, sao vàng sắc uống

+ Chữa ho ra máu: bẹ Móc đốt tồn tính 10g, quả lâu nhân 12g, sắc uống + Chữa đái ra máu, tiểu tiện không thông: bẹ Móc tươi 20g sắc uống [9], [16]

1.4.2 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Móc

 Một số nghiên cứu về chi Móc ( Caryota L.) trên thế giới

Chi Móc (Caryota L.) trong y văn là cây được các thày thuốc địa phương ở

một số nước Châu Á như Ấn độ, Srilanca, Malaysia… dùng chữa các bệnh như sưng viêm khớp, chống loét dạ dày, đau nửa đầu, trị rắn cắn, các bệnh răng miệng,

thuốc kích thích mọc tóc… các nghiên cứu về cây này của các tác giả quốc tế còn

ít và mới tập chung chủ yếu vào nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và một số ít nghiên cứu về tác dụng dược lý như: tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, tăng cường thể lực và độc tính cấp [18], [20]

 Nghiên cứu về cây Móc tại Việt Nam

Từ lâu trong dân gian đã sử dụng cây Móc như là một dược liệu quý chữa bệnh, vài năm gần đây đã có một số các nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Móc thu được các kết quả rất khả quan, cụ thể như sau:

- Nhóm tác giả Vũ Đức Cảnh (2004) đã nghiên cứu tác dụng và độc tính của

loài Caryota urens L., cho kết quả:

18

+ Đã thử tác dụng tăng lực của tua Móc (Caryota urens L.) trên nghiệm pháp

bơi cho thấy, kéo dài thời gian bơi của chuột 87,22%

+ Đã thử độc tính cấp của tua Móc (Caryota urens L.) với liều 150g/kg không

thấy có chuột nào có biểu hiện độc trong thời gian theo dõi 72 giờ [7]

- Cũng theo kết quả của nhóm tác giả Phạm Thị Nhật Trinh (2017) dịch chiết

quả của loài Caryota mitis có tác dụng tăng phát triển tế bào sụn in vitro [24]

- Trong các nghiên cứu dược lý sơ bộ, nhóm nghiên cứu đã đánh giá tác dụng cầm máu của bẹ Móc cho kết quả khả quan:

+ Tác dụng cầm máu của cao nước bẹ Móc và cao nước rễ cây Móc :

Bẹ Móc ở mức liều 3g/kg và 6g/kg chuột nhắt đều có tác dụng làm giảm thời gian chảy máu so với lô chứng

Bẹ Móc và rễ cây Móc liều 6g/kg chuột đều làm giảm thời gian chảy máu( tương đương nhau) Tuy nhiên, các nghiên cứu về sau sử dụng nguyên liệu

là bẹ Móc do dễ thu hái và bảo tồn được nguồn dược liệu [10]:

+ Tác dụng của dịch chiết nước bẹ Móc lên thành mạch [13]:

Dung dịch bẹ Móc ở các nồng độ tăng dần bắt đầu từ 0.08% đến 1% đã làm giảm số giọt chảy ra từ rìa tĩnh mạch tai thỏ so với ban đầu

+ Tác dụng cầm máu đường uống và tại chỗ của các cao chiết khác nhau theo phương pháp ngâm nóng từ bẹ cây Móc : cao nước, cao cồn 30º, cồn 60º, cồn 80º, cồn tuyệt đối và methanol đều làm giảm thời gian chảy máu, trong đó cao methanol làm giảm mạnh nhất, sau đó đến cao cồn 80º

+ Tác dụng giảm tính thấm thành mạch của bẹ Móc: trừ cao chiết cồn 30º, tất

cả các cao chiết còn lại đều tác dụng ức chế phù bàn chân chuột

+ Tác dụng co mạch của bẹ Móc trên hệ mạch tai thỏ cô lập: kết quả cho thấy cao methanol thể hiện tác dụng co mạch mạnh hơn rất nhiều so với cao nước [13] Tóm lại: các nghiên cứu trước đây cho thấy bẹ Móc có tác dụng cầm máu rõ rệt [1], [10], [13] Điều này mở ra hướng phát triển các chế phẩm cầm máu từ bẹ Móc , để từng bước tối ưu hóa phương pháp chiết và để định hướng cơ chế tác dụng của bẹ Móc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này

19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng ngiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Bẹ cây Móc được thu hái tại xã Thụy Hương - huyện Chương Mỹ - Hà nội vào tháng 11 năm 2018 Mẫu dược liệu được PGS.TS Hoàng Quỳnh Hoa, Bộ môn

Thực vật - Đại học Dược Hà Nội thẩm định tên khoa học là Caryota mitis Lour.,

Arecaceae và tiêu bản được lưu tại bộ môn Thực vật (phụ lục 1) Dược liệu sau khi thu hái được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô, xay nhỏ và được đóng vào túi ni lông

để bảo quản Tiến hành chiết xuất dược liệu bẹ Móc thành cao toàn phần theo Dược điển Việt Nam V bằng 2 phương pháp: chiết nóng và chiết lạnh [6]

 Phương pháp chiết nóng:

Quy trình chiết xuất được mô tả tóm tắt như sau: Cân 2000 gam mẫu nguyên liệu, thêm 20 lít dung môi ethanol 80o, để yên 15 phút, lắp vào hệ thống chiết hồi lưu đã đặt ở nhiệt độ 80o, chiết trong 1,5 giờ, lọc gạn lấy dịch lọc, dịch chiết được tiến hành cất quay chân không thu hồi dung môi và làm khô thu được sản phẩm cao toàn phần Qui trình được mô tả theo sơ đồ tại hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao bẹ Móc theo phương pháp chiết nóng

Dược liệu (2000g)

Cao toàn phần

Dịch chiết

+20 lít ethanol 80o, chiết ở 80°C trong 1,5h, gạn lọc dịch chiết

Cô, thu hồi dung môi, sau đó làm khô cao

Cân, xác định độ ẩm của cao

20

 Phương pháp chiết lạnh:

Qui trình chiết được tóm tắt như sau: cân 2000 gam mẫu nguyên liệu, đong dung môi với tỷ lệ là 1/10 Ngâm 2 lần, mỗi lần 48 giờ, thỉnh thoảng khuấy trộn Sau đó gạn dịch chiết, ép bã, lọc qua giấy lọc/vải lọc thu được dịch chiết Dịch chiết được tiến hành cất quay chân không thu hồi dung môi và làm khô thu được sản phẩm cao toàn phần Qui trình được mô tả theo sơ đồ tại hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao bẹ Móc theo phương pháp chiết lạnh

Hiệu suất chiết và hàm ẩm của các cao được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hiệu suất chiết và hàm ẩm của các cao chiết bẹ Móc

Hàm ẩm (%)

Hiệu suất chiết (%)

Chiết nóng 2000 253 14,2 12,7

Chiết lạnh 2000 126 14,5 6,3

 Chuẩn bị chế phẩm cho chuột uống

Từ cao toàn phần tiến hành phân tán đều với với nước cất tạo hỗn dịch có

nồng độ thích hợp tương ứng với các liều thử như sau:

- Cao toàn phần bẹ Móc chiết theo phương pháp chiết nóng:

Liều 1 (BMCN-1): 400mg cao/kg chuột

Liều 2 (BMCN-2): 600mg cao/kg chuột

Dược liệu (2000g)

Cao toàn phần

Dịch chiết

+20 lít ethanol 80o , ngâm 48h, gạn lọc dịch chiết

Cô, thu hồi dung môi, sau đó làm khô cao

Cân, xác định độ ẩm của cao

21

- Cao toàn phần bẹ Móc chiết theo phương pháp chiết lạnh:

Liều 1 (BMCL-1): 400mg cao/kg chuột

Liều 2 (BMCL-2): 600mg cao/kg chuột

2.1.2 Động vật nghiên cứu

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, cân nặng từ 18- 20g,

do viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

- Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được nuôi 3 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm tại bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà nội, thức ăn đạt chuẩn

do viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.3 Hóa chất và trang thiết bị

2.1.3.1 Hóa chất

- Ethanol 80o đạt tiêu chuẩn phân tích (Việt Nam)

- Carbazochrom dihydrat 10mg, (Adrenoxyl 10mg - Sanofi Việt Nam), số lô

- Heparin natri (Heparin 5000IU/ml lọ 5ml - Rotexmedica - Đức)

- Vitamin K (CPDP DANAPHA - Việt Nam), SĐK: VD 18908-13, số lô SX: