NGUYỄN THỊ HỒNG KHẢO sát dấu vân TAY hóa học của cốm PHƯƠNG THUỐC đởm đạo bài THẠCH BẰNG sắc ký lớp MỎNG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT chromatography C-CT Cốm vị thuốc Chỉ thực KL Khối lượng C-DH Cốm vị thuốc Đại hoàng KTT Kim tiền thảo C-KTT Cốm vị thuốc Kim tiền thảo LDL Low density

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG

KHẢO SÁT DẤU VÂN TAY HÓA HỌC

CỦA CỐM PHƯƠNG THUỐC ĐỞM ĐẠO BÀI THẠCH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG

Mã sinh viên: 1501190

KHẢO SÁT DẤU VÂN TAY HÓA HỌC

CỦA CỐM PHƯƠNG THUỐC ĐỞM ĐẠO BÀI THẠCH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường, người đã tận

tình hướng dẫn, luôn quan tâm, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cương và Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu và Công ty cổ phần thương mại dược phẩm quốc

tế WINSACOM đã cung cấp mẫu cốm thuốc, dược liệu chuẩn và hỗ trợ kinh phí cho

em thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộ môn Dược học cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về phương thuốc “Đởm đạo bài thạch” 2

1.1.1 Công thức 2

1.1.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc 2

1.1.3 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 3

1.2 Tổng quan về các vị thuốc trong phương thuốc Đởm đạo bài thạch 3

1.2.1 Kim tiền thảo 3

1.2.2 Nhân trần 5

1.2.3 Uất kim 6

1.2.4 Mộc hương 8

1.2.5 Chỉ thực 10

1.2.6 Đại hoàng 11

1.3 Vài nét về dấu vân tay hóa học 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị, máy móc 14

2.1.3 Hóa chất, dược liệu chuẩn 14

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 15

2.2.2 Chuẩn bị mẫu 16

2.2.3 Triển khai sắc ký 16

2.3 Xử lý kết quả 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18

3.1 Định tính vị thuốc Kim tiền thảo trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 18 3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết 18

3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 19

3.2 Định tính vị thuốc Nhân trần trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 21

3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết 21

3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 22

3.3 Định tính vị thuốc Uất kim trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 24

3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết 24

3.3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 25

3.4 Định tính vị thuốc Mộc hương trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 27

3.4.1 Khảo sát phương pháp chiết 27

3.4.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 28

3.5 Định tính vị thuốc Chỉ thực trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 30

3.5.1 Khảo sát phương pháp chiết 30

3.5.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 31

3.6 Định tính vị thuốc Đại hoàng trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 33

3.6.1 Khảo sát phương pháp chiết 33

3.6.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 36

4.1 Về khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu và điều kiện sắc ký 36

4.2 Về kết quả thực nghiệm định tính các vị thuốc trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch bằng sắc ký lớp mỏng 38

KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 40

1 Kết luận 40

2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

chromatography C-CT Cốm vị thuốc Chỉ thực KL Khối lượng

C-DH Cốm vị thuốc Đại hoàng KTT Kim tiền thảo

C-KTT Cốm vị thuốc Kim tiền thảo LDL Low density lipoprotein

cholesterol C-MH Cốm vị thuốc Mộc hương LH Lysimachia christinae

C-NT Cốm vị thuốc Nhân trần MH Mộc hương

DDBT Đởm đạo bài thạch P-CT Cốm placebo Chỉ thực DĐTQ Dược điển Trung Quốc P-DH Cốm placebo Đại hoàng DĐVN Dược điển Việt Nam P-KTT Cốm placebo Kim tiền thảo

DL-CT Dược liệu chuẩn Chỉ thực P-NT Cốm placebo Nhân trần DL-DH Dược liệu chuẩn Đại hoàng PT Cốm phương thuốc

DL-KTT Dược liệu chuẩn Kim tiền thảo P-UK Cốm placebo Uất kim DL-MH Dược liệu chuẩn Mộc hương SKĐ Sắc ký đồ

DL-NT Dược liệu chuẩn Nhân trần SKLM Sắc ký lớp mỏng

DL-UK Dược liệu chuẩn Uất kim TLC Thin layer chromatography

HDL High density lipoprotein

HP Helicobacter pylori

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Công thức bào chế của 1 gói cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 15 Bảng 2.2 Công thức bào chế cốm placebo của từng vị dược liệu (đơn vị: g) 16 Bảng 3.1 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Kim tiền thảo trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch khi soi UV ở bước sóng 366 nm 20 Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Nhân trần trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch sau khi hiện màu bằng TT vanillin 23 Bảng 3.3 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Uất kim trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch sau khi hiện màu bằng TT vanillin 26 Bảng 3.4 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Mộc hương trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch sau khi hiện màu bằng TT vanillin 29 Bảng 3.5 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Chỉ thực trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch sau khi hiện màu bằng TT vanillin 32 Bảng 3.6 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Đại hoàng trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch khi soi UV ở bước sóng 366 nm 35 Bảng 4.1 Kết quả khảo sát dấu vân tay hóa học của cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Kim tiền thảo 19

Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính Kim tiền thảo khi soi UV ở bước sóng 366 nm 20

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Nhân trần 22

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính Nhân trần sau khi hiện màu với TT vanillin 23

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Uất kim 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ định tính Uất kim sau khi hiện màu với TT vanillin 26

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Mộc hương 28

Hình 3.8 Sắc ký đồ định tính Mộc hương sau khi hiện màu với TT vanillin 29

Hình 3.9 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Chỉ thực 31

Hình 3.10 Sắc ký đồ định tính Chỉ thực sau khi hiện màu với TT vanillin 32

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Đại hoàng 34

Hình 3.12 Sắc ký đồ định tính Đại hoàng khi soi UV ở bước sóng 366 nm 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sỏi mật là bệnh khá phổ biến ở nước ta, là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn gan mật, nguyên nhân hay gặp của cấp cứu nội khoa và ngoại khoa [1] Sỏi mật nếu không điều trị kịp thời sẽ có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng: đau bụng

dữ dội, viêm đường mật, thủng túi mật, xuất huyết đường mật, áp xe gan, viêm tụy cấp,

và có thể dẫn đến tử vong … [1], [30] Dựa trên sự phát triển của y học hiện đại, bệnh sỏi mật ngày càng có nhiều lựa chọn điều trị khác nhau, từ phẫu thuật, nội soi cắt bỏ túi mật đến điều trị không phẫu thuật dưới dạng thuốc, các liệu pháp tán sỏi bằng laser, siêu

âm [1] Các phương pháp hiện đại tuy có hiệu quả cao nhưng đều chưa giải quyết được triệt để tình trạng sỏi, tỷ lệ tái phát cao, đồng thời việc phẫu thuật có thể gây ra nhiều nguy cơ và biến chứng cho bệnh nhân [5], [13] Vì các lý do trên, nhiều loại thảo dược hay các phương thuốc cổ truyền được đưa vào nghiên cứu để điều trị bệnh sỏi mật với

hy vọng rằng chúng an toàn, có thể thải sỏi mật hiệu quả và ngăn ngừa sự tái phát của tình trạng này [17], [30]

Phương thuốc Đởm đạo bài thạch với các thành phần là Kim tiền thảo, Nhân trần, Uất kim, Chỉ thực, Mộc hương, Đại hoàng có công năng thanh nhiệt lợi thấp, hành khí chỉ thống, lợi mật phá sỏi, chủ trị chứng sỏi mật [8] Tác dụng điều trị sỏi mật của cao lỏng phương thuốc đã được nghiên cứu và cho thấy có tác dụng làm mòn sỏi mật rất rõ rệt [7] Với mong muốn phát huy tính ưu việt của phương thuốc và tính tiện lợi khi sử dụng cho người bệnh, việc nghiên cứu bào chế và tiêu chuẩn hóa phương thuốc cổ truyền với các dạng bào chế hiện đại là vô cùng cần thiết, trong đó cốm thuốc là một dạng bào chế dễ sử dụng, hòa tan tốt, hấp thu nhanh và sử dụng được trên cả các đối tượng bệnh nhân gặp vấn đề về nuốt Hiện nay, cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch đã được bào chế từ cốm các vị thuốc trong phương thuốc Tuy vậy, vẫn chưa có nghiên cứu nào về tiêu chuẩn hóa dạng bào chế này nên việc xác định sự có mặt của các dược liệu trong phương thuốc là rất cần thiết

Từ những lý do trên, đề tài “Khảo sát dấu vân tay hóa học của cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch bằng sắc ký lớp mỏng” được thực hiện với mục tiêu: Định tính và

khảo sát tính đặc hiệu của các vị thuốc trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch bằng sắc ký lớp mỏng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về phương thuốc “Đởm đạo bài thạch”

- Xuất xứ phương thuốc: “Trung tây y kết hợp trị liệu cấp phúc chứng” [8]

1.1.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc

- Cách dùng: Ngày dùng 1 thang sắc lấy nước chia làm 2 lần uống trong ngày

Có thể sắc rồi cô đặc thành cao, làm thành viên hoàn, mỗi lần dùng 3g, ngày dùng 2-3 lần Mỗi đợt điều trị 1 tháng, nghỉ 1 tuần, rồi lại dùng tiếp đợt khác [7]

- Công năng: Thanh nhiệt lợi thấp, hành khí chỉ thống, lợi mật phá sỏi [8]

- Chủ trị: Chứng sỏi mật [8]

- Giải thích phương thuốc: Phương thuốc này dùng nhiều Kim tiền thảo để thanh lợi thấp nhiệt, lợi gan mật mà phá sỏi, làm quân dược; làm thần thì có Nhân trần tăng cường công hiệu thanh lợi thấp nhiệt, lợi mật, làm cho thấp nhiệt bị khử ra theo nước tiểu Bệnh sỏi mật liên quan đến thiếu dương và dương minh cho nên vừa dùng Uất kim hoạt huyết hành khí, giải uất, lợi mật, giảm đau, thoái hoàng; vừa lấy Đại hoàng, Chỉ thực, Mộc hương thông trệ tiêu tích, rửa sạch tràng vị, khiến thấp nhiệt thoát ra theo phân, cộng làm tá sứ Toàn bài thanh nhiệt lợi thấp, hành khí chỉ thống, lợi mật phá sỏi [8]

- Bàn luận: Điểm cốt yếu biện chứng bài thuốc là đau dưới sườn hoặc sốt ớn rét, sắc mật nhuộm vàng, đại tiện trắng xám Hay dùng điều trị sỏi mật, sỏi đường dẫn mật trong gan, sỏi hệ tiết niệu, viêm gan hoàng đản cấp tính Nếu đại tiện lỏng loãng thì khử

bỏ Đại hoàng, gia thêm Phục linh, đau kịch liệt thì gia thêm Sao xuyên luyện tử, Diên

hồ sách [8]

- Tác dụng dược lý: Phương thuốc này có thể nới lỏng co thắt đường dẫn mật của

chó, tăng cường tiết dịch mật, đồng thời có tác dụng ức chế Staphylococus aureus, các

trực khuẩn thương hàn, phó thương hàn A, B, C biến hình và sinh hơi [8]

Các tác giả Nguyễn Thị Dung, Nguyễn Văn Tường và Đỗ Trung Đàm (Viện

Dược liệu), đã nghiên cứu tác dụng làm mòn sỏi mật in vitro của bài thuốc “Đởm đạo

bài thạch thang” bằng cách sử dụng các viên sỏi mật được chia làm hai lô và đều cho

vào một dung dịch thử nghiệm Đối với lô thử, các tác giả đã thêm vào một lượng nước sắc của thang thuốc, còn đối với lô chứng sử dụng nước cất Các kết quả của thực nghiệm đều chứng tỏ rằng, nước sắc của thang thuốc Đởm đạo bài thạch thang có tác dụng làm mòn các viên sỏi mật rõ rệt Mức độ làm mòn cao hơn rất nhiều so với lô chứng [7]

1.1.3 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Cả DĐVN V và DĐTQ (2015) đều không có chuyên luận về phương thuốc Đởm đạo bài thạch [4], [29]

1.2 Tổng quan về các vị thuốc trong phương thuốc Đởm đạo bài thạch

1.2.1 Kim tiền thảo

1.2.1.1 Tên khoa học: Herba Desmodii styracifolii [4]

- Acid phenolic: Acid chlorogenic, acid ferulic, acid salicylic, acid vanillic, acid cimicifugic [35]

- Alcaloid: Desmodimin, desmodilacton [35]

- Terpenoid: Lupeol, lupenon, sophoradiol, soyasaponin I, soyasapogenol B, sitosterol, soyasapogenol E, β-sitosterol, daucosterol , stigmasterol [15], [35]

τ Tinh dầu: Tritriacontan, eiconsanoic acid, eiconsanoic acid ethyl ester, eicosyl ester, oxalic acid, tetradecanoic acid, pentadecanoic acid, isophytol, heptadecanoic acid, octadecanoic acid ethylester… [35]

- Bốn flavonoid cụ thể là schaftosid, isovitexin, luteolin và apigenin và một acid phenolic cụ thể là acid ferulic, là thành phần hóa học chính, có đóng góp quan trọng trong hiệu quả dược lý của Kim tiền thảo [25], [32]

- Kim tiền thảo ở Việt Nam có flavonoid 0,46% và saponin 3,1% [15]

1.2.1.4 Tác dụng sinh học

- Các thực vật thuộc chi Desmodium (Fabaceae) như Desmodium styracifolium

có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Trung Quốc Chất chiết từ các loài này

đã được nghiên cứu thực nghiệm cho các hoạt động chống viêm, gây độc tế bào, chống đái tháo đường, chống nhiễm trùng và kháng khuẩn [26]

- Tác dụng ngăn ngừa sỏi thận: Kim tiền thảo (KTT) liều trung bình và cao giúp ngăn ngừa hình thành sỏi thận theo cơ chế: Tăng bài tiết citrat qua nước tiểu làm giảm calci trong nước tiểu; tác dụng lợi tiểu làm giảm nồng độ calci oxalat và ức chế tạo sỏi; tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ các tế bào biểu mô thận, ức chế sự hình thành tinh thể

ở thận [27]

- Đối với gan mật: KTT có tác dụng tăng cường phân tiết dịch mật [15]

- Đối với tim mạch: Tiêm tĩnh mạch dịch chiết KTT trên chó gây mê làm tăng lưu lượng mạch vành 197 %, hạ huyết áp khoảng 30 %, làm tim đập chậm đồng thời giảm mức tiêu thụ oxy của cơ tim Trên tim cô lập chuột lang, KTT làm tăng sức co bóp

1.2.1.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, đắng, tính bình Quy các kinh can, đởm, thận, bàng quang [4]

- Công năng, chủ trị: Thanh thấp nhiệt, lợi niệu [4], [12], lợi mật, thanh nhiệt giải độc [12] Chủ trị: Nhiệt lâm, thạch lâm, phù thũng, hoàng đản [4] Dùng trị bệnh viêm thận, phù thũng, tiểu tiện bí, sỏi thận, sỏi mật, viêm gan, viêm túi mật, mụn nhọt, ung nhọt, bệnh phù sau khi đẻ [12], [15]

- Cách dùng, liều lượng: Ngày dùng từ 15-30g Dạng thuốc sắc, thường phối hợp với một số vị thuốc khác [4]

1.2.1.6 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, đối chiếu với dược liệu Kim tiền thảo chuẩn [4] (PL3.1)

Đây là loài Nhân trần Trung Quốc, hay gọi là Nhân trần cao Ở Việt Nam hay

dùng thay thế bằng loài Nhân trần (Adenosma caeruleum), Bồ bồ (Adenosma capitatum), Nhân trần tía (Adenosma bracteosum) họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae)

- Sesquiterpen lacton: Scoparanolid, estafiaton, preeupatundin, estafiatin, ludovicin B, 3β-hydroxycostunolid [18]

- Tinh dầu: Tinh dầu của A scoparia rất giàu camphor (11,0 %), 1,8-cineol (21,5 %), β-caryophyllen (6,8 %), trong khi tinh dầu A capillaris rất giàu pinen (9,4%),

caryophyllen (11,1%) và capillen (32,7%) [16]

1.2.2.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng trong điều trị các bệnh về gan: Nhân trần có hiệu quả dược lý đối với các bệnh gan khác nhau, từ nhiễm độc gan, bệnh gan nhiễm mỡ [39], bệnh xơ gan, tổn thương oxy hóa đến ung thư gan [20] Cơ chế bảo vệ gan dựa trên các tác dụng: Tăng tiết mật, chống oxy hóa, chống virus, chống viêm, chống ung thư [23]

- Tác dụng trên tim: Scoparon (một dẫn xuất coumarin) phân lập từ Nhân trần làm tăng lưu lượng mạch vành và nhịp tim [40]

- Tác dụng kháng khuẩn: Nhân trần có tác dụng ức chế đối với tụ cầu, một số vi khuẩn gây bệnh ngoài da và các vi khuẩn tại miệng [16]

- Tác dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường: Nhân trần có tác dụng hạ đường huyết, cải thiện sự chuyển hóa lipid máu [28], làm giảm glucose và lipid máu để cải thiện cấu trúc và chức năng thận của chuột bị đái tháo đường [19]

1.2.2.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị cay, đắng , tính vi hàn Quy vào các kinh tỳ, vị, can, đởm [29]

- Công năng, chủ trị: Thanh nhiệt lợi thấp, lợi mật, thoái hoàng Chủ trị: Vàng

da, viêm gan, gan nhiễm mỡ, sốt cao, tiểu ít [20], [29], [34] Ngoài ra Nhân trần được

sử dụng để điều trị tăng huyết áp, bệnh hô hấp, viêm cổ tử cung mãn tính và viêm gan [34]

- Cách dùng, liều lượng: Ngày dùng 6 g - 15 g, dạng thuốc sắc [29]

- Thành phần của Uất kim gồm: Tinh dầu, curcumin, nguyên tố vi lượng, polysaccarid và các thành phần khác [21]:

Tinh dầu: là thành phần hóa học chính của Uất kim gồm: zedoary diketon, caryophyllen, curzeren, germacron, α-pinen, 5-dien,5-dimethylbenzyliden-cyclic polyethylenepropylen-1, 8-isopropenyl-1, germacren D, β-elemen, humulus caryophyllen, δ-elemen, L-bornyl acetat, curcumol, turmeric diketon, furanodien, dihydrogen zedoary diketon, curdion…

1-Curcumin: là hoạt chất chính của Curcuma longa gồm: curcumin (curcumin I),

demethoxycurcumin (curcumin II), bisdemethoxycurcumin (curcumin III) Hàm lượng curcumin là khác nhau ở các dược liệu có nguồn gốc và phương pháp chế biến khác nhau

Nguyên tố vi lượng: As, Ag, Ni, Cd, Zn, Ti, Pb, Mn, Fe, Co, V, TI, Mo, Be Trong đó Ti, Mn và Fe có hàm lượng cao nhất và V, TI, Mo, Cd có hàm lượng thấp nhất

Polysaccarid và các thành phần khác: p-coumaroyl feruloylmethan, diferuloylmethan 2-p-feruloyl glycosid, β-sitosterol-3-O-D-glucosid, β-sitostreol

2-1.2.3.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng chống ung thư: Uất kim có tác dụng ức chế tốt tế bào ung thư dạ dày bằng cách đẩy nhanh quá trình apoptosis, ngăn chặn chu kỳ tế bào và ức chế sự phát triển của nó [21], [34]

- Tác dụng kháng khuẩn và chống viêm: Uất kim có thể đẩy nhanh quá trình viêm

và ức chế sự phát triển của viêm do HP gây ra Ngoài ra, nó có tác dụng ức chế tốt trên

các vi khuẩn: Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum, Bacillus subtilis, Dysentery bacillus, Shigella sonnei , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus [21], [34]

- Tác dụng hạ lipid máu: dịch chiết Uất kim được chứng minh là có tác dụng làm giảm hàm lượng LDL, triglyceride cũng như cholesterol toàn phần và làm tăng hàm lượng của HDL trong huyết thanh ở chuột [21]

- Tác dụng chống oxy hóa [21], [34]

- Tác dụng chống kết tập tiểu cầu và chống huyết khối [34], [38]

- Tác dụng kích thích tiết dịch mật [12]

- Tác dụng bảo vệ gan [38]

1.2.3.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị cay, đắng, tính hàn [12], [21], [34] Quy vào các kinh can, đởm, phế [12], can, tâm, phế [21], [34], [38]

- Công năng, chủ trị: Hành khí hành huyết, thư can lợi mật, trừ thấp nhiệt, lương huyết, an thần, hóa đàm giải uất [12], [34], phá ứ , giảm đau, thoái hoàng [21] Thuốc được sử dụng như một thuốc giảm đau, an thần và điều trị các rối loạn gan mật, trị các chứng: huyết trệ, ngực sườn đau tức, đầy chướng, đau bụng kinh; thần chí không minh mẫn ,suy giảm ý thức trong sốt, động kinh, điên giản, hưng cảm; viêm gan, xơ gan, viêm túi mật, sỏi mật, vàng da với nước tiểu sẫm màu [12], [34] Trên lâm sàng hay dùng Uất

kim trong các bệnh ung thư, nhiễm khuẩn, mỡ máu cao, sỏi mật và các bệnh về gan, gần đây Uất kim hay được dùng trong điều trị rối loạn trầm cảm [21], [38]

- Ngoài tác dụng hành huyết, Uất kim còn có tác dụng chỉ huyết, dùng chữa chảy máu cam, thổ huyết, hoặc các bệnh vừa ứ huyết, vừa xuất huyết [12]

- Tên gọi khác: Vân Mộc hương, Quảng Mộc hương

- Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Mộc hương, còn gọi là Vân Mộc hương, Quảng

Mộc hương [Saussurea lappa (DC) c B Clarke], họ Cúc (Asteraceae) [4]

- Phân biệt với thổ mộc hương (Inula helenium L ) cũng thuộc họ Cúc Asteraceae

(Compositae) [9]

1.2.4.3 Thành phần hóa học

- Rễ Mộc hương chứa tinh dầu, saussurin (alcaloid), betalin, stigmastcrol, inulin

và chất nhựa Thành phần chính của tinh dầu là sesquiterpen lacton gồm: Dehydrocostus lacton, costusolul, α,β-cyclocostunolul, alantolacton, isoalantolacton, dihydridehydrocostus lacton, cynaropicrin, methoxydihydrodehydrocostus lacton, phelandren, ionon, myrcen, cymen, linalol, humulen, cedren, aplotaxen, acid costus,α,β-costen, các sausureamin A,B,C,D,F, 5-aminosesquiterpen, saussureal, naropicrin, reynosin [9], [15]

- Rễ còn chứa 20 acid amin, cholamin [15]

trơn phế quản, làm dịu cơn hen và có tác dụng ức chế chung trên những cơ trơn khác [15]

- Tác dụng an thần: Tinh dầu có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, hiệp đồng kéo dài giấc ngủ gây bởi natri barbital [15]

- Tác dụng trên tiêu hóa: Mộc hương có tác dụng chống loét, lợi mật, trong đó costunolid có tác dụng mạnh nhất Ngoài ra còn có tác dụng kháng khuẩn, hiệu quả tốt trong tiêu chảy, lỵ, viêm đại tràng mạn, rối loạn tiêu hóa kéo dài [15]

- Tác dụng gây độc tế bào: Từ Mộc hương đã phân lập được một loại lappadilacton mới và bảy loại cocquiterpen, là các tác nhân gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư ở người [31]

- Các tác dụng khác: Lợi tiểu, giảm đau, chống viêm, chống loét, chống vi trùng, bảo vệ gan, lợi mật, làm mòn sỏi mật, điều hòa miễn dịch [15], [31]

1.2.4.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị cay, đắng, tính ấm Quy vào các kinh tỳ, vị, can, đại tràng [4], phế, can, tỳ [9], [12], [15]

- Cách dùng, liều lượng: Ngày dùng từ 6-12 g, dạng thuốc sắc, bột [4]

- Kiêng kỵ: Các chứng bệnh do khí hư, huyết hư mà táo thì không dùng [4]

1.2.4.6 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với bột dược liệu Mộc hương chuẩn [4] (PL3.4)

1.2.5 Chỉ thực

1.2.5.1 Tên khoa học: Fructus Aurantii immaturus [4]

1.2.5.2 Bộ phận dùng

- Quả non được bổ đôi hay để nguyên đã phơi hay sấy khô của cây Cam chua

(Citrus aurantium L.) hoặc cây Cam ngọt [Citrus sinensis (L.) Osbeck], họ Cam

- Tác dụng trên mạch máu, hệ tiết niệu, hô hấp: Thử trên chó thấy huyết áp tăng, dung tích thận giảm, lượng nước tiểu bài xuất giảm; trên tim ếch cô lập thấy ở nồng độ thấp làm tim tăng co bóp, nồng độ cao co bóp lại giảm; trên chuột thấy ức chế tim; trên

hệ mạch bụng ếch thấy gây co mạch; không có tác dụng gây co hay giãn khí quản của chuột cống trắng [9], [12], [14]

- Tác dụng kháng khuẩn: Hỗ trợ trong điều trị lỵ trực khuẩn [9], [14]

1.2.5.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị cay, đắng, chua, tính hàn Quy vào các kinh tỳ, vị [4]

- Công năng, chủ trị: Phá khí tiêu tích, hóa đờm tiêu bĩ, giảm đau [4], [12] Chủ trị: Thực tích, thực nhiệt tích ở đại tràng gây táo bón, ăn không tiêu, bụng đầy chướng,

ho nhiều đàm, đàm ngưng trệ ở lồng ngực gây đầy tức, khó thở [4], [12] Chỉ thực có tác dụng kích thích tiêu hóa, giảm đau tức, tiêu đờm, trừ thấp, lợi tiểu và làm săn se

Dùng chữa các bệnh: Bụng đầy chướng, ăn uống không tiêu, tiêu chảy, kiết lỵ, ngực đau, sa dạ dày, sa trực con [4]

- Cách dùng, liều lượng: Ngày dùng từ 3-9 g, phối hợp trong các bài thuốc [4]

- Kiêng ky: Phụ nữ có thai, tỳ vị hư hàn mà không đầy tích, người thể trạng yếu thì không nên dùng [4] [12]

- Anthranoid (chiếm 1-5%), tồn tại dưới nhiều dạng:

 Anthraquinon tự do: Aloe-emodin (C15H10O5), rhein (C15H8O6), emodin hay rheum emodin (C15H10O5), chrysophanol (C15H10O4), và physcion hay emodin-monomethyl ether (C16H12O5) [2], [10], [14], [36]

 Anthraquinon glucosid chiếm phần lớn gồm: Physcion monnoglycosid, emodin monnoglycosid, emodin monnoglycosid, chrysophanol monnoglycosid, rhein-8-monno-β-D-glycosid [2]

aloe- Anthron: Đại hoàng chứa một số anthron ở dạng dimer: Rheidin A, B, C, palmidin A, B, C Anthron glucosid ở dạng dimer: senosid A, B, C, D [14] Đại hoàng còn có dehydrodianthron như dirhein [2]

- Các chất khác: Calci oxalat, tinh bột, pectin, tinh dầu, acid hữu cơ, chất nhựa [14]

1.2.6.4 Tác dụng dược lý

- Tác dụng kháng khuẩn: Nước sắc Đại hoàng có tác dụng ức chế tụ cầu, liên cầu khuẩn làm tan máu, vi khuẩn viêm phổi, trực khuẩn kỵ, đại tràng, thương hàn, phó thương hàn, dịch hạch, trùng roi, amip, virus cúm [12]

- Tác dụng chống viêm: Chrysophanol trong Đại hoàng cho hiệu quả lâm sàng cao trong điều trị các bệnh viêm như viêm đại tràng [24]

- Tác dụng lợi niệu và ức chế Na+,K+ATPase của tủy thận thỏ: Emodin làm tăng thể tích nước tiểu lên 5,9 lần, tăng thải Na+ 4,4 lần và K+ lên 3 lần [14]

- Tác dụng độc tế bào: Anthranoid trong Đại hoàng có tác dụng gây độc vừa phải trên một số loại tế bào ung thư như ung thư vú, ung thư màng bụng [12], [14], [22]

- Tác dụng trên tiêu hóa: Anthranoid gây kích thích đại tràng, tăng nhu động ruột, giảm sự tái hấp thu của ruột già, gây tác dụng nhuận tẩy, tác dụng xuất hiện chậm sau uống 5-10 giờ Thành phần tanin có tác dụng làm săn se, cho nên sau khi gây đi ngoài, Đại hoàng còn gây bí đại tiện nếu uống nhiều Tanin làm giảm tính thấm của mao mạch, làm mao mạch bền vững và có tác dụng cầm máu Đại hoàng còn có tác dụng tăng bài tiết mật, trừ sỏi mật, tăng phân tiết dịch tiêu hóa, giảm lượng cholesterol trong máu [9],[12] [14]

- Trong đại hoàng có calci oxalat, tránh dùng dài ngày cho người sỏi thận [14]

1.2.6.5 Tác dụng và công dụng theo Y học cổ truyền

- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, tính hàn Quy các kinh tỳ, vị, đại tràng, can, tâm bào [4], [34]

- Công năng, chủ trị: Thanh trường thông tiện, tả hỏa giải độc, trục ứ thông kinh Chủ trị: Táo bón, đau bụng, hoàng đản, bế kinh, chấn thương tụ máu, sưng đau, nôn ra máu, chảy máu cam, nhọt độc sưng đau, màng kết hợp sung huyết, sung huyết não, lợi

bị phù [4], [12] Đại hoàng hay dùng để chữa: Đầy bụng, khó tiêu, kiết lỵ, xuất huyết tiêu hóa, táo bón, đau bụng, sốt, vàng da do thấp nhiệt, viêm gan, tắc mật, viêm ruột thừa, viêm răng lợi, nấm, chảy máu cam, đau mắt đỏ, đau họng, nhọt, lở loét, áp xe, vô kinh, ứ máu, đau do chấn thương, dùng ngoài có tác dụng chữa bỏng Tác dụng của Đại hoàng thay đổi theo liều dùng, liều thấp có tác dụng làm săn se, liều trung bình có tác dụng lợi mật, tiêu tích trệ, phá ứ; liều cao có tác dụng tẩy [34], [14], [9]

- Cách dùng, liều lượng: Nhuận tràng, tẩy, xổ: ngày dùng từ 3g-12g Dùng tả hạ không nên sắc lâu Dùng ngoài: lượng thích hợp, tán bột trộn dấm để bôi, đắp nơi đau [4]

- Kiêng kỵ: Không có uất nhiệt tích đọng thì không nên dùng Phụ nữ có thai, lúc

có kinh nguyệt không được dùng [4], [12]

1.2.6.6 Định tính

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn emodin hoặc bột dược liệu Đại hoàng chuẩn [4] (PL3.6)

1.3 Vài nét về dấu vân tay hóa học

- Khái niệm: Dấu vân tay hóa học là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị được ghi bằng các kĩ thuật phân tích hay còn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay [4]

- Hiện nay, phân tích sắc ký là một phương pháp nhận dạng thông thường và hiệu quả các loại thuốc truyền thống, thường bao gồm sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [37] Ưu điểm của các phương pháp là độ chọn lọc, độ nhạy và độ phân giải cao, thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu dùng để phân tích nhỏ Trong sắc ký đồ dấu vân tay được thiết lập, có pic của một hoặc nhiều chất đánh dấu hóa học hay các chất đặc trưng [4]

- Ứng dụng sắc ký đồ dấu vân tay trong quản lý chất lượng dược liệu: Dấu vân tay hóa học được ứng dụng trong định tính và đánh giá chất lượng ược liệu Phép định tính là đúng khi sắc ký đồ của mẫu phân tích có đầy đủ các pic đặc trưng có thời gian lưu tương đối nằm trong giới hạn cho phép tương ứng với các pic trong sắc ký đồ đối chiếu đã được quy định trong từng chuyên luận riêng [4]

- Về nguyên tắc, hai mẫu dược liệu của cùng một loài phải có sắc ký đồ đồng nhất Từ đó, có thể xác nhận được mẫu kiểm nghiệm có đúng hay không, có bị giả mạo hay pha tạp Trên thực tế, thành phần các chất trong các mẫu có thể có những sai biệt nhất định do các điều kiện di truyền (các chủng, dạng, thứ hay loài phụ, các loài lai, loài trồng trọt ) hay điều kiện phát triển (thổ nhưỡng, khí hậu), điều kiện thu hái (tuổi, mùa thu hái) v.v Tùy thuộc vào từng loài và yêu cầu sử dụng mà chấp nhận những sự khác biệt về thành phần đến một mức độ nào đó Nếu sự khác biệt quá lớn, đặc biệt là trên những thành phần chính, thường là do các biến thể dưới loài hay cây mọc ở các vùng có điều kiện rất cách biệt nhau thì có thể phải coi là những dược liệu riêng biệt [6]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cốm các vị thuốc trong phương thuốc: Kim tiền thảo, Nhân trần, Uất kim, Mộc hương, Chỉ thực, Đại hoàng được bào chế bằng phương pháp sắc với nước, cô, sấy khô, được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược phẩm VCP (117 Trần Duy Hưng, Cầu Giấy,

Hà Nội), đạt tiêu chuẩn cơ sở (phụ lục 5)

Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch (DDBT): bào chế bằng cách phối hợp cốm các vị thuốc theo đúng tỷ lệ trong công thức

- Cốm placebo tương ứng với mỗi vị thuốc: Bào chế bằng cách phối hợp cốm các

vị thuốc theo tỷ lệ trong công thức cốm phương thuốc DDBT mà không có cốm vị thuốc tương ứng

2.1.2 Thiết bị, máy móc

- Tủ sấy Memmert (Germany)

- Chày, cối

- Máy siêu âm

- Cân kỹ thuật Precisa (Switzeland)

- Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland) gồm: bộ chấm bản mỏng Linomat V, buồng triển khai đáy kép Camag, bộ chụp ảnh Camag TLC scanner III, bếp sấy bản mỏng Camag

- Bếp đun cách thuỷ

- Pipet chính xác các loại, và các dụng cụ thủy tinh khác: ống đong, bình nón,…

2.1.3 Hóa chất, dược liệu chuẩn

- Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 dốc Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: ethanol tuyệt đối, n-hexan, ethyl acetat, n-butanol, butyl acetat, acid formic, methanol, chloroform,…

- Bản sắc ký lớp mỏng silicagel 60 F254 của Merck

- Dược liệu chuẩn các vị thuốc: Kim tiền thảo, Nhân trần, Uất kim, Mộc hương, Chỉ thực, Đại hoàng được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược phẩm VCP (phụ lục 4)

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc phun thuốc thử tương ứng với từng vị dược liệu Thiết bị

sử dụng là hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzeland) của

bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội

- Các mẫu cốm placebo, cốm phương thuốc, cốm vị thuốc, dược liệu chuẩn sau khi khảo sát phương pháp chiết và hệ dung môi pha động sẽ tiến hành triển khai sắc ký

để xác định màu sắc và Rf các vết So sánh màu sắc và Rf các vết để định tính các thành phần và xác định tính đặc hiệu của từng vị thuốc trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

- Cốm các vị thuốc có trong phương thuốc

- Dược liệu chuẩn của các vị thuốc có trong phương thuốc

- Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch được bào chế bằng cách phối trộn các cốm vị thuốc theo tỷ lệ khối lượng các thành phần cho ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức bào chế của 1 gói cốm phương thuốc

Đởm đạo bài thạch (DDBT)

KL cốm/túi cốm DDBT (g) KL dược liệu tương ứng (g)

- Các mẫu cốm placebo được bào chế bằng cách phối trộn các cốm vị thuốc theo

tỷ lệ khối lượng các thành phần cho ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Công thức bào chế cốm placebo của từng vị dược liệu (đơn vị: g)

- Các mẫu cốm placebo, cốm phương thuốc, cốm vị thuốc, dược liệu chuẩn được chiết theo cùng một quy trình và điều kiện chiết xuất theo phương pháp đã chọn để thu được dịch chấm sắc ký

2.2.3 Triển khai sắc ký

Các mẫu cốm sau khi được chiết theo phương pháp đã chọn ở phần chuẩn bị mẫu

sẽ được tiến hành sắc ký để khảo sát và lựa chọn ra hệ pha động cho vết tách tốt, không kéo vết, có nhiều vết tương ứng giữa cốm phương thuốc, cốm vị thuốc và dược liệu chuẩn Xác định các màu sắc và Rf các vết trên sắc ký đồ, so sánh các vết để định tính

và xác định tính đặc hiệu của từng vị thuốc trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

Điều kiện sắc ký:

- Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck), hoạt hóa ở 110℃ trong 60 phút

- Pha động: Khảo sát các hệ dung môi khai triển khác nhau tùy từng dược liệu

- Phun mẫu: Phun các mẫu trên băng dài 6 mm, cách mép dưới bản mỏng 10 mm, cách mép bên 20 mm, thể tích phun tùy loại dịch chiết Sử dụng thiết bị phun mẫu bán

tự động Linomat 5 (Camag), tốc độ phun 100 nl/s

- Triển khai:

+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2

+ Kiểm soát độ ẩm: Dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút

+ Bão hòa bình triển khai (20x10 cm) trong 20 phút bằng 25 ml dung môi pha động + Thể tích dung môi khai triển: 10 ml

+ Khoảng cách triển khai là 85 mm kể từ mép dưới bản mỏng Bản mỏng sau triển khai được sấy khô trong 5 phút

- Hiện vết: + Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm

+ Nhúng thuốc thử vanillin 2,0 % trong ethanol và acid sulfuric, sấy

ở 105oC đến khi vết sắc ký hiện rõ Sử dụng thiết bị nhúng thuốc thử Camag, bếp sấy bản mỏng Camag

- Chụp ảnh sắc ký đồ: Bộ chụp ảnh Camag TLC scanner III

2.3 Xử lý kết quả

Ảnh chụp sắc ký đồ được xử lý bằng phần mềm Wincats và xác định Rf các vết bằng phần mềm Videoscan

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Định tính vị thuốc Kim tiền thảo trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

1.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Mẫu nghiên cứu:

Cốm placebo Kim tiền thảo: 4,625 g

Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 5,625 g

Cốm vị thuốc Kim tiền thảo: 1 g

- Các mẫu cốm được nghiền nhỏ và cân vào 3 bình nón riêng biệt, chiết trong cùng một điều kiện theo từng phương pháp chiết như sau:

 Phương pháp 1: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn bằng 2 ml methanol thu được dịch chấm

sắc ký

 Phương pháp 2: Cân các mẫu cốm đã vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm

trong 30 phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 20 ml nước cất rồi chuyển vào bình gạn Thêm 20ml chloroform, lắc kĩ, gạn bỏ lớp chloroform (lớp dưới), lớp nước được lắc 3 lần với n-butanol đã bão hòa nước, mỗi lần 20 ml Gộp các dịch chiết n-butanol, cô cạn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm sắc

ký

 Phương pháp 3: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm

trong 30 phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 20 ml nước cất rồi chuyển vào bình gạn Dịch nước được lắc 3 lần với ethyl acetat, mỗi lần 20ml Gộp các dịch chiết ethyl acetat, cô cạn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm sắc

ký

- Các mẫu dịch chiết cốm được triển khai trên cùng một bản mỏng qua hệ pha động: Toluen - ethyl acetat – acid formic (10:4:1) Quan sát vết ở bước sóng 366 nm

Kết quả:

- Kết quả khảo sát phương pháp chiết Kim tiền thảo được thể hiện ở hình 3.1

- Qua khảo sát chọn chiết cốm theo phương pháp 3: Trên SKĐ, cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch và cốm vị thuốc Kim tiền thảo cho kết quả tách vết tốt nhất, có nhiều vết tương ứng về màu sắc và Rf

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Kim tiền thảo

Ghi chú:

P-1/2/3: Cốm placebo Kim tiền thảo chiết theo phương pháp 1/2/3

PT-1/2/3: Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch chiết theo phương pháp 1/2/3

C-1/2/3: Cốm vị thuốc Kim tiền thảo chiết theo phương pháp 1/2/3

3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu:

Cốm placebo Kim tiền thảo: 4,625 g Cốm vị thuốc Kim tiền thảo: 1 g Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 5,625 g Dược liệu chuẩn Kim tiên thảo: 2 g Chuẩn bị mẫu:

Các mẫu cốm được cân và chiết theo phương pháp 3 ở mục 3.1.1

Dược liệu chuẩn KTT: Cân 2g cho vào bình nón có nút mài, thêm 20ml nước cất, đun sôi cách thủy 30 phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, thêm 20ml methanol và chiết tiếp theo phương pháp 3 mục 3.1.1

Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc ký theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau:

- Hệ 1: Ethyl acetat - acid formic - acid acetic - nước (100:11:11:26)

- Hệ 2: Ethyl acetat - butanol - acid formic (5:1:1)

- Hệ 3: Toluen - ethyl acetat - acid formic (8:4:1)

- Hệ 4: Toluen - ethyl acetat - acid formic (10:4:1)

- Hệ 5: Toluen - ethyl acetat - acid formic (12:4:1)

Thể tích phun mẫu:

Cốm placebo Kim tiền thảo: 5 µl Cốm vị thuốc Kim tiền thảo: 5 µl

Cốm phương thuốc Đởm đạo bài 5 µl Dược liệu chuẩn Kim tiên thảo: 7 µl

Kết quả: (Bảng 3.1 và hình 3.2)

 Chọn hệ 5: Toluen - ethyl acetat - acid formic (12:4:1), hình ảnh trên sắc ký

đồ cho vết đặc hiệu và tách vết tốt nhất

 Hiện vết: Quan sát ở bước sóng 366 nm

Bảng 3.1 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Kim

tiền thảo trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

khi soi UV ở bước sóng 366 nm

Ghi chú: (+): Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm

Vết R f

Màu sắc

Mẫu nghiên cứu P-

KTT DDBT C-KTT

KTT

P-KTT: Cốm placebo Kim tiền thảo

DDBT: Cốm thuốc Đởm đạo bài thạch

C-KTT: Cốm vị thuốc Kim tiền thảo DL-KTT: Dược liệu chuẩn Kim tiên thảo

- Cốm phương thuốc DDBT có 4 vết tương ứng với cốm vị thuốc Kim tiền thảo (Rf = 0,09; 0,22; 0,24; 0,60), 2 vết tương ứng với dược liệu chuẩn Kim tiền thảo (Rf = 0,09; 0,60), trong đó có 1 vết đặc hiệu mà cốm placebo không có (Rf = 0,60)

3.2 Định tính vị thuốc Nhân trần trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Mẫu nghiên cứu:

 Phương pháp 1: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn bằng 2 ml methanol thu được dịch chấm

sắc ký

 Phương pháp 2: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 20 ml nước cất rồi chuyển vào bình gạn Dịch nước được lắc 3 lần với ethyl acetat, mỗi lần 20 ml Gộp các dịch chiết

ethyl acetat, cô cạn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký

- Các mẫu dịch chiết cốm được triển khai trên cùng một bản mỏng qua hệ pha động: Toluen - ethyl acetat – acid formic (10:4:1) Phát hiện vết bằng phun TT vanillin 2,0 % trong ethanol và acid sulfuric

Kết quả:

- Kết quả khảo sát phương pháp chiết Nhân trần được thể hiện ở hình 3.3

- Qua khảo sát chọn chiết theo phương pháp 2: Trên SKĐ, cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch và cốm vị thuốc Nhân trần cho kết quả tách vết tốt nhất, có nhiều vết tương ứng về màu sắc và Rf

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Nhân trần Ghi chú:

P-1/2: Cốm placebo Nhân trần chiết theo phương pháp 1/2

PT-1/2: Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch chiết theo phương pháp 1/2

C-1/2: Cốm vị thuốc Nhân trần chiết theo phương pháp 1/2

3.2.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu:

Cốm placebo Nhân trần: 4,625 g Cốm vị thuốc Nhân trần: 1 g Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 5,625 g Dược liệu chuẩn Nhân trần: 2 g Chuẩn bị mẫu:

Các mẫu được cân và chiết theo phương pháp đã chọn ở mục 3.2.1

Dược liệu chuẩn Nhân trần: Cân 2 g cho vào bình nón có nút mài, thêm 20 ml nước cất, đun sôi cách thủy 30 phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, thêm 20ml methanol và chiết tiếp theo phương pháp 2 mục 3.2.1

Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc ký theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau:

- Hệ 1: Ethyl aceat – acid formic – nước (7:2,5:2,5)

- Hệ 2: Toluen - ethyl acetat – acid formic (6:4:1)

- Hệ 3: Toluen - ethyl acetat – acid formic (8:4:1)

- Hệ 4: Toluen - ethyl acetat – acid formic (10:4:1)

 Thể tích phun mẫu:

Cốm placebo Nhân trần: 3 µl Cốm vị thuốc Nhân trần: 5 µl Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 3 µl Dược liệu chuẩn Nhân trần: 7 µl Kết quả: (Bảng 3.2 và hình 3.4)

 Chọn hệ 3: Toluen - ethyl acetat – acid formic (8:4:1), hình ảnh trên sắc ký đồ cho vết đặc hiệu và tách vết tốt nhất

 Hiện vết: TT vanillin 2,0 % trong ethanol và acid sulfuric, quan sát dưới ánh sáng

thường

Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính vị dược liệu Nhân

trần trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch sau

khi hiện màu bằng TT vanillin

P-NT: Cốm placebo Nhân trần C-NT: Cốm vị Nhân trần

DDBT: Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch DL-NT: Dược liệu chuẩn Nhân trần

- Cốm phương thuốc DDBT có 5 vết tương ứng với cốm vị thuốc và dược liệu chuẩn Nhân trần (Rf = 0,09; 0,27; 0,31; 0,44; 0,59), trong đó có 3 vết đặc hiệu mà cốm placebo không có (Rf = 0,31; 0,44; 0,59)

3.3 Định tính vị thuốc Uất kim trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Mẫu nghiên cứu:

Cốm placebo Uất kim: 4,875 g

Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 5,625 g

Cốm vị thuốc Uất kim: 0,75 g

- Các mẫu cốm được nghiền nhỏ và cân vào 3 bình nón riêng biệt, chiết trong cùng một điều kiện theo từng phương pháp chiết như sau:

 Phương pháp 1: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn bằng 2 ml methanol thu được dịch chấm

sắc ký

 Phương pháp 2: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 20 ml nước cất rồi chuyển vào bình gạn Dịch nước được lắc 3 lần với ethyl acetat, mỗi lần 20 ml Gộp các dịch chiết

Ethyl acetat, cô cạn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký

 Phương pháp 3: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 1ml acid acetic và 20 ml

methanol, siêu âm trong 30 phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 20 ml nước cất rồi chuyển vào bình gạn Dịch nước được lắc 3 lần với n-butanol bão hòa nước, mỗi lần 20 ml Gộp các dịch chiết n-butanol, cô cạn, hòa tan cắn trong 2 ml

methanol thu được dịch chấm sắc ký

- Các mẫu dịch chiết cốm được triển khai trên cùng một bản mỏng qua hệ pha động: Toluen - ethyl acetat – acid formic (8:4:1) Phát hiện vết bằng phun TT vanillin 2,0 % trong ethanol và acid sulfuric

Kết quả:

- Kết quả khảo sát phương pháp chiết Uất kim được thể hiện ở hình 3.5

- Qua khảo sát chọn chiết cốm theo phương pháp 3: Trên SKĐ, cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch và cốm vị thuốc Uất kim cho kết quả tách vết tốt nhất, có nhiều vết tương ứng về màu sắc và Rf

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Uất kim Ghi chú:

P-1/2/3: Cốm placebo Uất kim chiết theo phương pháp 1/2/3

PT-1/2/3: Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch chiết theo phương pháp 1/2/3 C-1/2/3: Cốm vị thuốc Uất kim chiết theo phương pháp 1/2/3

3.3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu:

Cốm placebo Uất kim: 4,875 g Cốm vị thuốc Uất kim: 0,75 g Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 5,625 g Dược liệu chuẩn Uất kim: 1 g Chuẩn bị mẫu: Các mẫu được cân và chiết theo phương pháp 3 ở mục 3.3.1 Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc ký theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau

- Hệ 1: Toluene - ethyl acetate (93:7)

- Hệ 2: Toluen - ethyl acetat - acid formic (6:4:1)

- Hệ 3: Toluen - ethyl acetat - acid formic (8:4:1)

- Hệ 4: Chloroform - ethanol - acetic acid (95:5:1)

- Hệ 5: Chloroform - acid acetic (9:1)

 Thể tích phun mẫu:

Cốm placebo Uất kim: 3 µl Cốm vị thuốc Uất kim: 7 µl

Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 3 µl Dược liệu chuẩn Uất kim: 7 µl

Bảng 3.3.Kết quả SKLM định tính vị dược liệu

Uất kim trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài

thạch sau khi hiện màu bằng TT vanillin

- Cốm phương thuốc DDBT có 4 vết tương ứng với cốm vị thuốc và dược liệu chuẩn Uất kim, cả 4 vết đều là vết đặc hiệu mà cốm placebo không có (Rf = 0,25; 0,30; 0,37; 0,48)

3.4 Định tính vị thuốc Mộc hương trong cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch

3.4.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Mẫu nghiên cứu:

 Phương pháp 1: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml methanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm

sắc ký

 Phương pháp 2: Cân các mẫu cốm vào bình nón, thêm 20 ml ethanol, siêu âm 30

phút rồi lọc Cô cạn dịch lọc, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm

sắc ký

 Phương pháp 3: Cân các mẫu cốm vào bình nón, 20 ml diethyl ether, ngâm trong 4

giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc nhẹ, rồi lọc Gộp dịch lọc, để bay hơi ở nhiệt

độ phòng đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol thu được dịch chấm sắc ký

- Các mẫu dịch chiết cốm được triển khai trên cùng một bản mỏng qua hệ pha động: Toluen - ethyl acetat – acid formic (6:4:1) Phát hiện vết bằng phun TT vanillin 2,0 % trong ethanol và acid sulfuric

Kết quả:

- Kết quả khảo sát phương pháp chiết Mộc hương được thể hiện ở hình 3.7

- Qua khảo sát chọn chiết theo phương pháp 1: Trên SKĐ, cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch và cốm vị thuốc Mộc hương cho kết quả tách tốt nhất, có nhiều vết tương ứng

về màu sắc và Rf

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết Mộc hương Ghi chú:

P-1/2/3: Cốm placebo Mộc hương chiết theo phương pháp 1/2/3

PT-1/2/3: Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch chiết theo phương pháp 1/2/3

C-1/2/3: Cốm vị thuốc Mộc hương chiết theo phương pháp 1/2/3

3.4.2 Khảo sát hệ dung môi pha động

Mẫu nghiên cứu:

Cốm placebo Mộc hương: 4,125 g Cốm vị thuốc Mộc hương: 1,5 g Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 5,625 g Dược liệu chuẩn Mộc hương: 1 g Chuẩn bị mẫu: Các mẫu được cân và chiết theo phương pháp 1 ở mục 3.4.1

Tiến hành: Phun mẫu và triển khai sắc ký theo điều kiện chung (mục 2.2.3)

 Pha động: Khảo sát trên các hệ dung môi sau

- Hệ 1: Toluen - ethyl acetat – acid formic (10:4:1)

- Hệ 2: Toluen - ethyl acetat – acid formic (6:4:1)

- Hệ 3: Toluen - ethyl acetat – acid formic (8:4:1)

- Hệ 4: Toluen – ethyl acetat (95:5)

 Thể tích phun mẫu:

Cốm placebo Mộc hương: 3 µl Cốm vị thuốc Mộc hương: 5 µl

Cốm phương thuốc Đởm đạo bài thạch: 3 µl Dược liệu chuẩn Mộc hương: 5 µl