NGUYỄN THỊ DIỆU LINH NGHIÊN cứu ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO đặc PHƯƠNG THUỐC TIÊU DAO KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng ..... Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TIÊU DAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DIỆU LINH

Mã sinh viên : 1501277

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TIÊU DAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận, em đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu cùng bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Đại học cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 5 năm học qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường – một người thầy

đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo sát sao và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quá trình nghiên cứu và thực hiện khoá luận này

Em xin chân thành cảm ơn DS Lưu Công Bình – học viên cao học khoá 23, Trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong thời gian em thực hiện khoá luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Trường Đại học Dược Hà Nội, Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế WINSACOM đã cung cấp dược liệu, chất chuẩn và hỗ trợ kinh phí nghiên cứu

Em xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộ môn Dược học

cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới Ba Mẹ, gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn bên cạnh, quan tâm và ủng hộ em trong suốt quá trình học tập dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên khoá luận này còn có những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy

cô, bạn bè để khoá luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Diệu Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan bệnh trầm cảm 2

1.1.1 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học hiện đại 2

1.1.2 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học cổ truyền 2

1.2 Phương thuốc “Tiêu dao” 2

1.2.1 Công thức 2

1.2.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc 3

1.2.3 Định tính, định lượng phương thuốc Tiêu dao 3

1.3 Thông tin cơ bản về các vị thuốc 5

1.3.1 Bạch thược 5

1.3.2 Sài hồ 7

1.3.3 Đương quy 9

1.3.4 Bạch truật 10

1.3.5 Bạch linh 12

1.3.6 Cam thảo 13

1.3.7 Bạc hà 15

1.3.8 Sinh khương 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Thiết bị, máy móc 19

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 20

2.2.2 Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng

phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 25

3.1.1 Định tính dược liệu Bạch thược trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM 25

3.1.2 Định tính dược liệu Sài hồ trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM 27

3.1.3 Định tính dược liệu Đương quy trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM 29

3.1.4 Định tính dược liệu Bạch truật trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM 30

3.1.5 Định tính dược liệu Bạch linh trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM 32

3.1.6 Định tính dược liệu Cam thảo trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM 34

3.2 Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao 37

3.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 37

3.2.2 Thẩm định quy trình định lượng 37

3.2.3 Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao 42

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 43

4.1 Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 43

4.2 Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 45

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.1.1 Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao 46

5.1.2 Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AST Aspartat Transaminase ALT Alanin Amino Transferase

BL Bạch linh BT Bạch thược

BTr Bạch truật CT Cam thảo

DĐTQ Dược điển Trung Quốc DĐVN Dược điển Việt Nam

ĐQ Đương quy HPLC High-performance liquid

chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao)

P-BL Cao đặc placebo Bạch linh PAE Paeoniflorin

P-BTr Cao đặc placebo Bạch truật P-BT Cao đặc placebo Bạch thược P-SH Cao đặc placebo Sài hồ P-CT Cao đặc placebo Cam thảo

SKLM Sắc kí lớp mỏng PL Phụ lục

TD Tiêu dao SH Sài hồ

YHHĐ Y học hiện đại YHCT Y học cổ truyền

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Công thức bào chế các mẫu cao đặc placebo 19

Bảng 3.1 Kết quả SKLM định tính Bạch thược trong cao đặc Tiêu dao 26

Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính Sài hồ trong cao đặc Tiêu dao 28

Bảng 3.3 Kết quả SKLM định tính Đương quy trong cao đặc Tiêu dao 30

Bảng 3.4 Kết quả SKLM định tính Bạch truật trong cao đặc Tiêu dao 32

Bảng 3.5 Kết quả SKLM định tính Bạch linh trong cao đặc Tiêu dao 34

Bảng 3.6 Kết quả SKLM định tính Cam thảo trong cao đặc Tiêu dao 36

Bảng 3.7 Kết quả độ thích hợp hệ thống 39

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng paeoniflorin 39

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ chính xác trung gian 40

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 41

Bảng 3.11 Hàm lượng paeoniflorin trong cao đặc Tiêu dao 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1 Các vị dược liệu trong phương thuốc Tiêu dao 18

Hình 3.1 SKĐ định tính Bạch thược sau khi phun thuốc thử vanilin 2,5% trong ethanol và acid sulfuric 26

Hình 3.2 SKĐ định tính Sài hồ sau khi phun thuốc thử vanilin 2,5% trong ethanol và acid sulfuric 28

Hình 3.3 SKĐ định tính Đương quy soi ở bước sóng 366 nm 30

Hình 3.4 SKĐ định tính Bạch truật soi ở bước sóng 254 nm 32

Hình 3.5 SKĐ định tính Bạch linh soi ở bước sóng 254nm 34

Hình 3.6 SKĐ định tính Cam thảo soi ở bước sóng 366 nm 36

Hình 3.7 Sắc kí đồ các mẫu nghiên cứu 37

Hình 3.8 Phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn paeoniflorin 38

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của PAE 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trầm cảm là một thể của bệnh tâm thần, thuộc phạm vi chứng điên cuồng của YHCT [9], căn bệnh này đã xuất hiện từ lâu Trong xã hội hiện đại với nhiều áp lực thì bệnh trầm cảm trở nên phổ biến và có xu hướng ngày càng gia tăng Theo Tổ chức Y

tế Thế giới (WHO), tính đến tháng 01/2020, có khoảng hơn 264 triệu người bị ảnh hưởng bởi căn bệnh trầm cảm trên toàn cầu, trong đó tỉ lệ phụ nữ mắc phải nhiều hơn

so với nam giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, đa số là ở độ tuổi trưởng thành [52] Ở Việt Nam, theo Bệnh viện Tâm thần Trung ương 1, tỷ lệ mắc 10 chứng rối loạn tâm thần phổ biến trong năm 2014 là 14,2%, trong đó rối loạn trầm cảm chiếm 2,45% [53] Trầm cảm là nguyên nhân hàng đầu gây ra các tình trạng khuyết tật trên toàn thế giới

và là tác nhân chính gây ra gánh nặng bệnh tật toàn cầu Hậu quả nghiêm trọng nhất của trầm cảm chính là hành vi tự sát [38]

Phương thuốc Tiêu dao có xuất xứ từ sách “Thái Bình huệ dân hoà tễ cục phương” với công năng sơ can giải uất, kiện tì hoà dinh [12], chủ trị can uất huyết hư làm cho hai bên sườn đau đớn, lúc rét lúc sốt, đau đầu mờ mắt, miệng táo họng khô, tinh thần mệt mỏi, ăn ít, kinh nguyệt không đều, bầu vú căng chướng, mạch huyền hư [12] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu dược lí hiện đại cho biết bài thuốc có nhiều tác dụng như bảo vệ gan [20], hạ huyết áp [46], tăng cường tiêu hoá [37] Phương thuốc Tiêu dao được sử dụng rộng rãi, phổ biến trong điều trị bệnh trầm cảm tại Trung Quốc, sử dụng một mình hoặc kết hợp với thuốc chống trầm cảm khác để điều trị cho hiệu quả tốt và

ít tác dụng phụ [25], [37] Ngày nay, với nhịp sống hiện đại, việc sử dụng thuốc đông

dược theo cách sắc truyền thống rất bất tiện Cao đặc Tiêu dao là bán thành phẩm trung gian để sản xuất ra các dạng bào chế hiện đại tiện dụng như thuốc cốm, viên nén, viên nang Tuy nhiên, cao đặc Tiêu dao chưa có tiêu chuẩn chất lượng Chính vì vậy, việc khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc nhằm tiêu chuẩn hoá dạng bào chế này là cần thiết

Từ những lí do trên, đề tài “Nghiên cứu định tính, định lượng cao đặc phương

thuốc Tiêu dao” được nghiên cứu với các mục tiêu:

- Khảo sát định tính các vị thuốc trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

- Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc

kí lỏng hiệu năng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh trầm cảm

1.1.1 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học hiện đại

1.1.1.1 Định nghĩa

Trầm cảm là một trạng thái bệnh lý của cảm xúc, biểu hiện bằng quá trình ức chế toàn bộ các hoạt động tâm thần: chủ yếu ức chế cảm xúc, ức chế tư duy, ức chế vận động [2]

1.1.1.2 Nguyên nhân

Trầm cảm do nhiều nguyên nhân gây ra, được chia thành 3 nguyên nhân chính:

- Trầm cảm nội sinh (hay còn gọi là trầm cảm chưa rõ nguyên nhân): trầm cảm trong phân liệt cảm xúc, trầm cảm trong rối loạn cảm xúc lưỡng cực,

- Trầm cảm tân sinh: trầm cảm xuất hiện sau các sang chấn tâm thần hay hoàn cảnh xung đột, trầm cảm phản ứng,

- Trầm cảm thực tổn: trầm cảm do các bệnh thực tổn ở não hoặc các bệnh toàn thân khác, trầm cảm do nhiễm độc ma tuý, rượu, [2]

1.1.2 Bệnh trầm cảm theo quan điểm Y học cổ truyền

- Các bệnh tâm thần được YHCT mô tả trong phạm vi của chứng điên cuồng Điên là trạng thái trầm tĩnh, đần độn tương ứng với thể trầm cảm; hoang tưởng và ảo giác của thể trầm cảm; thể kéo dài [9]

- Nguyên nhân gây ra bệnh: Do tinh thần bị kích động lo nghĩ, giận dữ quá độ gây các rối loạn về hoạt động của các tạng tâm, can, tỳ phát sinh ra đàm, nếu đàm khí uất kết thì sinh chứng trầm cảm (điên) Bệnh được phân loại ra thể chu kì và thể kéo dài, có những biểu hiện trầm cảm có thể kèm hoang tưởng, ảo giác [9]

1.2 Phương thuốc “Tiêu dao”

1.2.1 Công thức [3], [12], [17]

Sài hồ 100 g Bạch linh 100 g

Đương quy 100 g Cam thảo 80 g

Bạch thược 100 g Bạc hà 20 g

Bạch truật 100 g Sinh khương 100 g

Phương thuốc có xuất xứ từ sách “Thái Bình huệ dân hoà tễ cục phương” của Trần

Sư Văn – một danh y Trung Quốc thời nhà Tống [12]

1.2.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc

- Công năng: Sơ can giải uất, kiện tì hoà dinh [3], [12], [17]

- Chủ trị: Can uất huyết hư làm cho hai bên sườn đau đớn, lúc rét lúc sốt, đau đầu mờ mắt, miệng táo họng khô, tinh thần mệt mỏi, ăn ít, kinh nguyệt không đều, bầu vú căng trướng, mạch huyền mà hư [3], [12], [17]

- Giải thích phương thuốc:

Trong bài thuốc, Sài hồ sơ can giải uất, Đương quy, Bạch thược dưỡng huyết nhu can Mà mùi thơm của Đương quy lại có thể hành khí, vị ngọt của nó có thể hoãn cấp,

là vị thuốc rất quan trọng đối với can uất huyết hư Bạch truật, Phục linh kiện tỳ đuổi thấp, khiến cho việc vận hoá có sự linh hoạt, khí huyết có nguồn gốc Chích Cam thảo ích khí bổ trung, hoãn cái gấp gáp ở gan, tuy là các vị tá sứ, nhưng có tác dụng trợ giúp Sinh khương ôn vị hoà trung, Bạc hà giúp Sài hồ để tan can uất Phối ngũ như vậy vừa làm cho gan được bồi bổ lại giúp cho gan được vận dụng tốt, kiêm cố cả khí huyết, đồng thời cả can cả tỳ, phép trị toàn diện, dùng thuốc hết nhẽ, chính là bài thuốc nổi tiếng điều hoà can tỳ [12]

Một số nghiên cứu cho thấy phương thuốc Tiêu dao có tác dụng hỗ trợ và điều trị trầm cảm, có khả năng điều chỉnh các chất dẫn truyền thần kinh để đem lại được đáp ứng điều trị tốt nhất [40] Hiện nay, Tiêu dao đã được sử dụng để điều trị các chứng mất ngủ khác nhau như mất ngủ do tuổi già, mất ngủ ở tuổi vị thành niên, phụ nữ mãn kinh mất ngủ, mất ngủ với chứng rối loạn lo âu và trầm cảm [29]

1.2.3 Định tính, định lượng phương thuốc Tiêu dao

Một số dạng bào chế của phương thuốc đã được tiêu chuẩn hoá và đưa vào Dược điển Trung Quốc 2015, Dược điển Việt Nam V, trong đó, các chỉ tiêu định tính, định lượng được đưa ra như sau:

1.2.3.1 Định tính phương thuốc Tiêu dao

- Định tính Bạch thược: Bằng phương pháp SKLM, so sánh với paeoniflorin chuẩn [17], Bạch thược chuẩn [3]

- Định tính Sài hồ: Bằng phương pháp SKLM, so sánh với Sài hồ chuẩn [17]

- Định tính Đương quy: Bằng phương pháp SKLM, so sánh với Đương quy chuẩn [3], [17]

- Định tính Bạch truật: Soi bột, so sánh với Bạch truật chuẩn [17]

- Định tính Bạch linh: Soi bột (dạng viên hoàn), so sánh với Bạch linh chuẩn [3], [17]

- Định tính Cam thảo: Soi bột (dạng viên hoàn) hoặc bằng phương pháp SKLM, so sánh với Cam thảo chuẩn [3], [17]

1.2.3.2 Định lượng paeoniflorin trong phương thuốc Tiêu dao

Định lượng paeoniflorin bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [17]

- Dung dịch chuẩn: Hoà tan chính xác một lượng chất chuẩn paeoniflorin trong dung

môi thích hợp (methanol hoặc ethanol) để thu được dung dịch paeoniflorin có nồng độ thích hợp

- Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng chế phẩm bài thuốc cho vào bình nón có

nắp, thêm chính xác một lượng dung môi phù hợp, cân, siêu âm trong 30 phút, làm mát và cân lại, bổ sung khối lượng bị mất bằng dung môi trên, lắc đều, lọc, sử dụng dịch lọc làm dung dịch thử

- Cách tiến hành: Tiêm chính xác 10 l mỗi dịch chuẩn và dịch thử tương ứng vào cột

và tính toán lượng paeoniflorin

Yêu cầu: Theo Dược điển Trung Quốc 2015, yêu cầu hàm lượng paeoniflorin trong

một số dạng bào chế như sau: viên nén bao film (Xiaoyao tablets) phải chứa ít nhất 1,8mg paeoniflorin/viên, viên nang cứng (Xiaoyao capsules) phải chứa ít nhất 1,1 mg paeoniflorin/viên, cốm (Xiaoyao granules) phải chứa ít nhất 9,0 mg paeoniflorin/túi, viên hoàn (Xiaoyao pills) phải chứa ít nhất 0,7 mg paeoniflorin/viên nhỏ, ít nhất 6,3mg paeoniflorin/viên lớn, hoàn cô đặc (nongsuowan, concentrated pills) phải chứa ít nhất 4,0 mg paeoniflorin/viên và hoàn nước (shuiwan, watered pills) phải chứa ít nhất 2,5

mg paeoniflorin/viên tính theo Bạch thược [17]

1.3 Thông tin cơ bản về các vị thuốc

1.3.1 Bạch thược

1.3.1.1 Tên khoa học: Radix Paeoniae lactiflorae [3]

1.3.1.2 Bộ phận dùng

Rễ đã cạo bỏ lớp bần và phơi hay sấy khô của cây Thược dược (Paeonia lactiflora

Pall.), họ Hoàng liên (Ranunculaceae) [3], [10]

1.3.1.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng kháng khuẩn: Bạch thược có tác dụng kháng khuẩn trên Shigella, Vibrio

cholerae, Staphylococcus, Salmonella, Corynebacterium diphtheriae, [13]

- Tác dụng kháng cholin: Hoạt chất paeoniflorin trong rễ Bạch thược có tác dụng

anticholinergic trên chuột cống trắng in vivo mà biểu hiện là tác dụng chống co thắt,

chống tiêu chảy [7], [13] Ngoài ra, còn có tác dụng giảm đau, an thần và bảo vệ gan, chống tác dụng hại độc gan của hoá chất trong thực nghiệm trên động vật [31], [50]

Paeoniflorin

1.3.1.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Kiêng kị: Đầy bụng không nên dùng [3], [10]

1.3.1.6 Định tính, định lượng dược liệu Bạch thược

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Bạch thược chuẩn, chất chuẩn paeoniflorin [3], [17]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển:

Cloroform – ethyl acetat – methanol – acid formic (40:5:10:0,2)

- Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 96%, lắc kĩ 5 phút, lọc Bốc hơi dịch lọc đến cắn Hoà tan cắn trong 2 ml ethanol 96% thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Chuẩn bị 0,5 g bột Bạch thược chuẩn trong cùng điều kiện như trên với mẫu thử

- Dung dịch chất chuẩn: Hoà tan paeoniflorin chuẩn trong ethanol 96% thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch thử, dung dịch đối chiếu và dung dịch chất chuẩn Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng Phun dung dịch vanilin 5% trong acid sulfuric Sấy bản mỏng ở 105oC cho tới khi xuất hiện vết Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu và Rf với vết dung dịch đối chiếu và dung dịch chất chuẩn

b Định lượng: Định lượng paeoniflorin (C23H28O11) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [3], [17]

- Pha động: Acetonitril – dung dịch acid phosphoric 0,1% (14:86)

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng paeoniflorin chuẩn hoà tan trong methanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 60 g/ml

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g bột dược liệu vào bình định mức 50 ml, thêm 35 ml ethanol 50%, lắc siêu âm trong 30 phút, để nguội, thêm ethanol 50% đến vạch, lắc đều, lọc qua giấy lọc thường, bỏ 10 ml dịch lọc đầu, lọc dịch lọc sau qua màng lọc 0,45 m được dung dịch thử

- Điều kiện sắc kí:

+ Cột kích thước (25 cm  4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 m)

+ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm

+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút

+ Thể tích tiêm: 10 l

- Cách tiến hành: Tiến hành sắc kí dung dịch chuẩn theo điều kiện đã mô tả, tính số đĩa

lý thuyết của cột Số đĩa lý thuyết tính theo pic paeoniflorin không được dưới 2000 Tiến hành sắc kí dung dịch chuẩn và dung dịch thử theo điều kiện mô tả, sắc kí đồ Căn cứ vào diện tích pic thu được từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng

C23H28O11 của paeoniflorin chuẩn, tính hàm lượng paeoniflorin trong dược liệu

Yêu cầu: Dược liệu phải chứa ít nhất 1,6% paeoniflorin (C23H28O11) tính theo dược liệu khô kiệt

- Saponin: hàm lượng saponin trong rễ là 1,69% [14]

Rễ sài hồ chứa nhiều saponin và sapogenin triterpen (nhóm olean): saikogenin (A, B, C,D, E, F, G), saikosaponin (A, B1-B4, C, D, E và F) [28], [41]

- Tinh dầu: hàm lượng tinh dầu trong rễ là 0,16% và 0,05% trong thân [14], [28]

- Polysaccharid: Rễ sài hồ chứa 2 polysaccharid có hoạt tính sinh học là các bupleuran 2II b và 2II c [14], [28]

1.3.2.4 Tác dụng sinh học

-Tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm: Saikosaponin được coi là thành phần có hoạt tính hạ sốt, chống viêm chủ yếu trong rễ sài hồ bắc [14], [42]

-Hoạt tính an thần: cả phân đoạn saikosaponin thô và phân đoạn saikosaponin A đều

- Liều dùng: Ngày dùng từ 3-9 g, phối hợp trong các bài thuốc [3]

- Kiêng kị: không dùng cho người can dương thượng thăng, âm hư hoả vượng [3]

1.3.2.6 Định tính, định lượng dược liệu Sài hồ

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Sài hồ chuẩn, chất chuẩn saikosaponin A [3], [17], [18]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển: Ethyl acetat – ethanol – nước (8:2:1)

- Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu thô, thêm 20 ml methanol, đem đi siêu âm 10 phút, lọc Bốc hơi dịch lọc trên cách thuỷ đến còn khoảng 5 ml, lọc

- Dung dịch đối chiếu: Chuẩn bị 0,5 g bột Sài hồ chuẩn trong cùng điều kiện như trên với mẫu thử

- Dung dịch chất chuẩn: Hoà tan saikosaponin A chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch thử, dung dịch đối chiếu và dung dịch chất chuẩn Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng Phun dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyd 2% trong acid sulfuric 40% Sấy bản mỏng ở 60 oC cho tới khi xuất hiện vết Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu

và Rf với vết dung dịch đối chiếu và dung dịch chất chuẩn

b Định lượng: Định lượng saikosaponin A (C42H68O13) trong Sài hồ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, hàm lượng không được thấp hơn 0,16% tính theo dược liệu khô kiệt [3]

- Tinh dầu: Myrcen, β-ocimen, allo-ocimen, β-phellandren, p-cymen, [13], [44]

- Các hợp chất phenolic: acetophenon, acid anisic, o,p-cresol, [13], [44]

- Acid hữu cơ: acid vanilic, acid palmitic, acid linoleic, acid rucotinic, acid sucinic, acid protocatechuic [13], [44]

1.3.3.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng trên tử cung và đường ruột:

+ Thành phần tinh dầu có tác dụng ức chế, thành phần không phải tinh dầu và tan trong nước hoặc ethanol có tác dụng kích thích co bóp tử cung [7], [13]

+ Đương quy có tác dụng làm cho ruột trơn và có thể chữa táo bón [7]

- Tác dụng chống viêm: Phân đoạn ethylacetat của Đương quy ức chế hoạt tính của NF-B lucifera và giảm sản xuất NO, PEG2 [19]

1.3.3.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Liều dùng: Ngày dùng 6-12 g dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu [3]

- Kiêng kị: Tỳ vị có thấp nhiệt, đại tiện lỏng không nên dùng [3]

1.3.3.6 Định tính, định lượng dược liệu Đương quy

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với chất chuẩn acid ferulic [3], dược liệu Đương quy chuẩn [3], [17], [18]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển:

Cyclohexan – ethyl acetat (8:2)

Cyclohexan – dicloromethan – ethyl acetat – acid formic (4:1:1:0,5)

Toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1)

- Dung dịch thử: Lấy 4 g bột dược liệu, thêm vào 20 ml ethanol 95% ngâm trong 1 giờ, thỉnh thoảng lắc, lọc Bốc hơi dịch lọc đến còn khoảng 10 ml thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Lấy 4 g bột Đương quy chuẩn, tiến hành chiết như mô tả phần dung dịch thử

- Dung dịch chất chuẩn: Hoà tan acid ferulic chuẩn trong ethanol để thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu và Rf với vết dung dịch đối chiếu và dung dịch chất chuẩn

- Ảnh hưởng đối với chức năng ngoại tiết của gan: không gây biến đổi về lưu lượng mật, nhưng làm tăng một cách có ý nghĩa hàm lượng cắn khô trong mật [13]

- Hoạt tính chống viêm cấp: Các chất atractylenolid I, II, III trong Bạch truật có tác dụng chống viêm cấp và đặc biệt là chống viêm khớp rất rõ rệt [13], [33]

1.3.4.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Liều dùng: Ngày dùng 6-12 g, dạng thuốc sắc hoặc bột [3]

- Kiêng kị: Âm hư nội nhiệt, tân dịch hư hao gây đại tiện táo, không dùng [3]

1.3.4.6 Định tính, định lượng dược liệu Bạch truật

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Bạch truật chuẩn [3], [8], [17], [18]

* Phương pháp 1:

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển: Ether dầu hoả (30-60oC) – ethyl acetat (50:1)

- Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu thô, thêm 5 ml n-hexan cho vào bình nút kín lắc khoảng 30 phút, lọc lấy dịch lọc làm dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Chuẩn bị 0,5 g Bạch truật chuẩn tiến hành chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng rồi phun dung dịch vanilin 1% trong dung dịch acid sulfuric 5% Sấy bản mỏng ở 60 oC trong khoảng 15 phút đến khi các vết xuất hiện rõ Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu và Rf với vết các dung dịch đối chiếu

* Phương pháp 2:

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1)

- Dung dịch thử: Lấy 3 g bột dược liệu thô, cho vào 30 ml methanol, đem đi siêu âm

30 phút, lọc Cô dịch lọc đến cắn, hoà tan cắn trong 2 ml methanol thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Lấy 3 g Bạch truật chuẩn tiến hành tương tự như mô tả ở phần Dung dịch thử

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu và Rf với vết các dung dịch đối chiếu

b Định lượng: Chưa có chỉ tiêu định lượng Bạch truật [3], [17]

1.3.5 Bạch linh

1.3.5.1 Tên khoa học: Poria [3]

1.3.5.2 Bộ phận dùng

Thể quả nấm đã phơi hay sấy khô của nấm Phục linh [Poria Cocos (Schw.) Wolf], họ

Nấm lỗ (Polyporaceae), mọc kí sinh trên rễ một số loài Thông [3], [10]

1.3.5.3 Thành phần hoá học

- Acid pachymic, acid tumulosic, acid eburicoic, acid pinicolic, pachyman [15]

-Chất đường đặc biệt: pachymose, glucose, fructose và chất khoáng [11]

ra ở chuột [45]; Triterpenoids có tác dụng chống viêm [26]

1.3.5.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Liều dùng: Ngày dùng 9-15 g, thường phối hợp với các vị thuốc khác [3]

- Kiêng kị: Âm hư thấp nhiệt không nên dùng [3]

1.3.5.6 Định tính, định lượng dược liệu Bạch linh

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Bạch linh chuẩn [3], [17], [18]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:5:0,5)

- Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 50 ml ether, đem đi siêu âm 10 phút, lọc Bay hơi dịch lọc đến cắn, hoà tan cắn trong 1 ml methanol

- Dung dịch đối chiếu: : Lấy 1 g Bạch linh chuẩn tiến hành tương tự như mô tả ở phần Dung dịch thử

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên Sau khi khai triển sắc kí, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng rồi phun dung dịch vanilin 2% trong hỗn hợp acid sulfuric – ethanol (4:1) Sấy bản mỏng ở 105 oC đến khi các vết xuất hiện rõ Quan sát ở ánh sáng thường Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu và Rf với vết các dung dịch đối chiếu

b Định lượng: Chưa có chỉ tiêu định lượng Bạch linh [3]

1.3.6 Cam thảo

1.3.6.1 Tên khoa học: Radix et Rhizoma Glycyrrhizae [3]

1.3.6.2 Bộ phận dùng

Rễ và thân rễ còn vỏ hoặc đã cạo lớp bần, được phơi hay sấy khô của ba loài Cam

thảo Glycyrrhiza uralensis Fisch., Glycyrrhiza inflata Bat., Glycyrrhiza glabra L., họ

Đậu (Fabaceae) [3], [10]

1.3.6.3 Thành phần hoá học

- Saponin: Saponin quan trọng nhất là acid glycyrrhizic Các dẫn chất triterpenoid khác như acid liquiritic; acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic; [4]

- Flavonoid: điển hình là liquiritin và isoliquiritin [47]

- Ngoài ra trong rễ Cam thảo còn có 20-25% tinh bột; 3-10% glucose và saccharose [4], các hợp chất có nhân estrogen có nhân sterol với hàm lượng thấp [13]

1.3.6.4 Tác dụng sinh học

- Tác dụng chống loét dạ dày, ức chế tác dụng gây tăng tiết dịch vị của histamin,

chống co thắt cơ trơn ruột [4]

- Tác dụng giảm ho, gây trấn tĩnh, ức chế thần kinh trung ương [13]

- Glabridin trong Cam thảo cho thấy hiệu quả in vivo và in vitro trong bảo vệ tế bào

thần kinh, ngoài ra còn được dùng phổ biến trong điều trị bệnh tim mạch [48]

1.3.6.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Liều dùng: Ngày dùng 4 – 12 g, dạng thuốc sắc hoặc bột [3]

- Kiêng kị: Tỳ vị có thấp trệ, sôi bụng, đầy bụng; dùng lâu dễ bị phù nề [3]

1.3.6.6 Định tính, định lượng dược liệu Cam thảo

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Cam thảo chuẩn, chất chuẩn amoni glycyrrhizinat [3], [17], [18]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển:

Ethyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (15:1:1:2)

Toluen – ethyl acetat – acid formic (6:4:1)

- Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu, thêm 20 ml ether ethylic, đun hồi lưu trên cách thuỷ 1 giờ, gạn bỏ dịch ether Thêm vào bã 15 ml methanol, đun hồi lưu trên cách thuỷ 1 giờ, để nguội, lọc lấy dịch chiết Bốc hơi dịch chiết đến cắn, hoà tan cắn trong 20 ml nước Lắc dung dịch thu được với n-buthanol 3 lần, mỗi lần 20 ml Gộp dịch chiết buthanol, rửa 3 lần với nước, bỏ nước rửa Bay hơi dịch chiết buthanol trên cách thuỷ tới cắn, hoà tan cắn trong 5 ml methanol được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Cam thảo chuẩn chiết như mô tả ở phần Dung dịch thử

- Dung dịch chất chuẩn: Hoà tan amoni glycyrrhizinat chuẩn trong methanol để được dung dịch có nồng độ khoảng 2 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, phun dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC trong 5 phút Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở

bước sóng 366 nm, trên sắc kí đồ của dung dịch thử phải có các vết phát quang cùng màu và cùng giá trị Rf với vết amoni glycyrrhizinat và dung dịch đối chiếu

b Định lượng: Định lượng acid glycyrrhizic trong Cam thảo bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, hàm lượng không được thấp hơn 2,0% tính theo dược liệu khô kiệt [3]

1.3.7 Bạc hà

1.3.7.1 Tên khoa học: Herba Menthae [3]

1.3.7.2 Bộ phận dùng

Bộ phận trên mặt đất, thu hái vào thời kì vừa ra hoa, phơi trong râm hoặc sấy nhẹ cho

đến khô của cây Bạc hà (Mentha arvensis L.), họ Bạc hà (Lamiaceae) [3], [10]

- Liều dùng: Ngày từ 12-20 g, dạng thuốc sắc, khi sắc nên cho bạc hà vào sau [3]

- Kiêng kị: Người khi hư huyết táo, mồ hôi nhiều, trẻ em dưới 1 tuổi không nên dùng [3]

1.3.7.6 Định tính, định lượng dược liệu Bạc hà

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Bạc hà chuẩn [3]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển: Cyclohexan – ethyl acetat – aceton (8:1:1)

- Dung dịch thử: Lấy 30 g dược liệu khô đã cắt nhỏ vào bình cầu dung tích 500 ml của

bộ dụng cụ định lượng tinh dầu Thêm 300 ml nước, tiến hành cất trong vòng 3 giờ Lấy 0,2 ml tinh dầu bạc hà hoà tan vào 1 ml cloroform thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Dung dịch menthol 0,1% trong cloroform

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 l mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc kí, lấy bản mỏng ra, phun lên bản mỏng dung dịch vanilin 1% trong acid sulfuric Sấy bản mỏng ở 100 – 105 oC trong khoảng 5 phút Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc kí đồ của dung dịch thử phải có hơn 5 vết màu xanh, tím hay xanh tím, trong đó có một vết to nhất và đậm nhất có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết menthol của dung dịch đối chiếu

b Định lượng: Định lượng tinh dầu trong Bạc hà bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hàm lượng không được thấp hơn 1,0% tính theo dược liệu khô kiệt [3]

- Sinh khương chiết cồn có thể gây hưng phấn trung khu vận động mạch máu, trung khu hô hấp, tim [5], [13]

- Hoạt chất gingerol trong Sinh khương có tác dụng chống đông máu [5], [13]

1.3.8.5 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

1.3.8.6 Định tính, định lượng dược liệu Sinh khương

a Định tính: Phương pháp sắc kí lớp mỏng, so sánh với dược liệu Sinh khương chuẩn [3]

- Bản mỏng: Silicagel GF254

- Dung môi khai triển: n-hexan – aceton – acid acetic (7,5:2,5:4 giọt)

- Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu thô, thêm vào 5 ml aceton, lắc trong 3 phút, lọc thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột Sinh khương chuẩn, thêm vào 5 ml aceton, lắc trong 3 phút, lọc thu được dung dịch đối chiếu

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 5 l mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc kí, lấy bản mỏng ra, phun lên bản mỏng dung dịch thuốc thử vanilin

- acid sulfuric Sấy bản mỏng ở 110 oC cho đến khi xuất hiện vết Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải có ít nhất 10 vết phát quang cùng màu

và cùng giá trị Rf với vết dung dịch đối chiếu

b Định lượng: Định lượng tinh dầu trong Sinh khương bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hàm lượng không được thấp hơn 0,5% tính theo dược liệu khô kiệt [3]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các vị thuốc được cung cấp bởi Công ty cổ phần dược phẩm VCP: Sài hồ, Đương quy, Bạch thược, Bạch truật, Bạch linh, Cam thảo, Bạc hà đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V [3], Sinh khương đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc 2015 [17] Các vị

thuốc trong phương thuốc được trình bày ở Hình 2.1

Bạch thược Cam thảo

Bạch truật Sinh khương

Đương quy Bạc hà

Sài hồ Bạch linh

Hình 2.1 Các vị dược liệu trong phương thuốc Tiêu dao

- Cao đặc Tiêu dao được bào chế từ các vị thuốc đã chế biến theo phương pháp sắc nước 3 lần, mỗi lần 90 phút, cô thành cao đặc Tiến hành bào chế 9 mẻ cao với công thức cho 1 mẻ chiết:

Sài hồ 28,60 g Bạch linh 28,60 g Đương quy 28,60 g Cam thảo 22,88 g Bạch truật 28,60 g Bạc hà 5,72 g Bạch thược 28,60 g Sinh khương 28,60 g

- Các mẫu cao đặc placebo: Bào chế tương tự cao đặc Tiêu dao, bỏ vị thuốc tương

ứng Công thức bào chế các mẫu cao đặc placebo ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức bào chế các mẫu cao đặc placebo Tên vị thuốc Khối lượng (g) P-BT P-SH P-ĐQ P-BTr P-BL P-CT

P-BT: Cao đặc placebo Bạch thược P-SH: Cao đặc placebo Sài hồ

P-ĐQ: Cao đặc placebo Đương quy P-BTr: Cao đặc placebo Bạch truật P-BL: Cao đặc placebo Bạch linh P-CT: Cao đặc placebo Cam thảo

2.1.2 Thiết bị, máy móc

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Bể siêu âm T840DH – Elma (Đức)

 Cân kĩ thuật Precisa (Thuỵ Sĩ) độ chính xác 0,01 g

 Cân phân tích AND GR200 (Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg

 Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (Thuỵ Sĩ) độ chính xác 0,01 mg

 Máy đo độ ẩm Precisa XM 120

 Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 m

 Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzerland)

 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Bơm LC-30AD, detector mảng diod (DAD) SPD-M20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A

 Các dụng cụ thuỷ tinh: bình gạn, bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, và các dụng cụ khác tại phòng thí nghiệm đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích

 Bộ nồi chiết, cô cao inox, bếp hồng ngoại, bếp cách thuỷ, các dụng cụ chế biến thuốc

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn

- Chất chuẩn paeoniflorin (C23H28O11) hàm lượng 99,30% (Chengdu Must Technology Co Ltd, Lot No MUST-17031901)

Bio Dược liệu chuẩn được cung cấp bởi Công ty cổ phần dược phẩm VCP: Sài hồ, Bạch thược, Đương quy, Bạch truật, Bạch linh, Cam thảo

- Bản sắc kí lớp mỏng Silica gel 60 F254 của Merck

- Hoá chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: Methanol, ethanol tuyệt đối, ethyl acetat, n-buthanol, acid formic, acetonitril (Merck), toluen,

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

 Mẫu nghiên cứu:

- Dược liệu chuẩn: Sài hồ, Đương quy, Bạch truật, Bạch thược, Bạch linh, Cam thảo được xay thành bột thô

- Dược liệu nguyên liệu: Sài hồ, Đương quy, Bạch truật, Bạch thược, Bạch linh, Cam thảo được xay thành bột thô

- Cao đặc Tiêu dao

- Các mẫu cao đặc placebo: P-SH, P-ĐQ, P-BTr, P-BT, P-BL, P-CT

- Phun mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag) Chấm các mẫu trên băng dài 6 mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm

- Triển khai:

+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2

+ Kiểm soát độ ẩm: dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút

+ Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 20 phút (giấy lọc) bằng 25 ml dung môi pha động

+ Thể tích dung môi khai triển: 10 ml

+ Khoảng cách triển khai là 85 mm kể từ đáy bản mỏng Sấy khô bản mỏng trong 5 phút

- Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp Camag

- Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan

 So sánh các vết trên sắc kí đồ giữa cao đặc Tiêu dao với các dược liệu nguyên liệu, dược liệu chuẩn, chất chuẩn và các mẫu cao placebo

2.2.2 Định lượng paeoniflorin trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc kí

 Mẫu nghiên cứu:

- Cao đặc Tiêu dao

- Cao đặc placebo Bạch thược( P-BT)

- Chất chuẩn paeoniflorin (PAE)

 Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc PAE có nồng độ khoảng 500 g/ml

trong methanol Pha dãy chuẩn PAE có nồng độ trong khoảng 8-250 g/ml bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng methanol

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,2000 g cao vào bình nón có nút mài 50 ml,

thêm chính xác 25 ml methanol 50%, cân, siêu âm trong 30 phút Để nguội Cân lại, bổ sung khối lượng mất đi bằng methanol 50% Lắc đều, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút Lọc qua màng lọc 0,45 m thu được dung dịch tiêm sắc kí

 Điều kiện sắc kí:

Tham khảo các tài liệu [3], [6], [17], [32] lựa chọn được chương trình sắc kí lỏng với các điều kiện sắc kí phù hợp

Tiêm 10 l dung dịch thử, ghi nhận sắc kí đồ, diện tích của pic PAE Nồng độ PAE trong dung dịch thử (g/ml) được tính theo công thức:

a

b S

C t t

X

cd t

25 (%)

Trong đó:

S t: Diện tích pic PAE trên sắc kí đồ của dung dịch thử

C t: Nồng độ của PAE trong dung dịch thử (g/ml)

a: Giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính

b: Giá trị hệ số chắn của đường hồi quy tuyến tính

mcd: Khối lượng cao đặc (g)

H: Hàm ẩm của cao đặc (%)

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng paeoniflorin trong cao đặc Tiêu dao

Tiến hành sắc kí các dung dịch đã được xử lí theo quy trình xử lí mẫu ở trên theo điều kiện đã chọn, thẩm định phương pháp theo các chỉ tiêu: độ đặc hiệu, độ phù hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng [1], [16], [24]

 Dung dịch chuẩn paeoniflorin

- Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn

hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích,

- Tiến hành: sắc kí 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn paeoniflorin

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích pic ≤ 2,0%

 Độ tuyến tính

- Pha một dãy dung dịch chuẩn paeoniflorin ở các nồng độ thích hợp Tiến hành sắc

kí như điều kiện đã lựa chọn

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ paeoniflorin trong các dung dịch chuẩn

Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,99

 Độ lặp lại trong ngày/khác ngày

Độ lặp lại trong ngày

Tiến hành:

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dùng dãy dung dịch chuẩn trong phần độ tuyến tính

- Chuẩn bị dung dịch thử: Tiến hành trên 6 mẫu thử độc lập rồi chuẩn bị như quy trình phân tích

- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu

ở mỗi ngày và giữa hai ngày

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng mỗi ngày (n=6) và của cả 2 ngày

(n=12) ≤ 2,7% [16]

 Độ đúng

- Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực

- Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm một lượng đã biết chất chuẩn (dung dịch chuẩn gốc) vào nền mẫu không chứa paeoniflorin (mẫu placebo) với 3 nồng độ khác nhau bằng 50%, 100% và 150% so với nồng độ định lượng trong mẫu thử

- Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và sắc kí theo điều kiện đã chọn, mỗi nồng

độ thực hiện 3 lần

- Xác định tỉ lệ (%) tìm lại được so với nồng độ ban đầu

Yêu cầu:

- Tỷ lệ thu hồi đạt 97,0-103,0% ở mỗi mức nồng độ

- RSD (%) của tỷ lệ thu hồi tại mỗi mức nồng độ ≤ 2,7% [16]

2.2.2.3 Tính toán kết quả và xử lí số liệu

Các số liệu nghiên cứu được tính dựa vào các công thức hoặc sử dụng công cụ Data analysis trong Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Định tính các vị dược liệu trong cao đặc phương thuốc Tiêu dao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

3.1.1 Định tính dược liệu Bạch thược trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM

 Mẫu nghiên cứu

- Cân các mẫu với khối lượng đã được tính toán như sau vào 4 bình nón 100 ml riêng biệt:

Bạch thược chuẩn (BT-C) 2 g Cao đặc P-BT 2 g

Bạch thược nguyên liệu (BT) 2 g Cao đặc TD 2 g

- Chuẩn bị cả 4 mẫu với cùng một điều kiện chiết:

Thêm vào 40 ml methanol, siêu âm trong 30 phút và lọc Cho bay hơi dịch lọc đến cắn, hoà tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-buthanol bão hoà nước 3 lần, mỗi lần

20 ml Gộp dịch chiết, rửa bằng nước 3 lần, mỗi lần 20 ml, loại bỏ dịch rửa, bay hơi dịch chiết n-buthanol đến cắn Hoà tan cắn trong 2 ml methanol thu được dung dịch chấm sắc kí

- Dung dịch chất chuẩn paeoniflorin (PAE): Cân chính xác 5,41 mg paeoniflorin (hàm lượng 99,03%) cho vào bình định mức 10 ml, thêm 5 ml methanol, lắc cho tan hết và thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ

537,21 g/ml (Dùng dung dịch chuẩn gốc ở mục 3.2.1)

 Điều kiện sắc kí

- Pha động: Khảo sát các hệ dung môi sau:

Cloroform – ethyl acetat – methanol – acid formic (40:5:10:0,2) (I)

Ethyl acetat – acid acetic – acid formic – nước (15:1:1:2) (II)

Cloroform – ethyl acetat – methanol – amoniac (8:1:4:1) (III)

Toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) (IV)

Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:5:1) (V)

- Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm, phun thuốc thử vanilin 2,5% trong ethanol và acid sulfuric

 Kết quả

Qua khảo sát lựa chọn hệ (III) cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất (Bảng 3.1 và Hình 3.1)

Bảng 3.1 Kết quả SKLM định tính Bạch thược trong cao đặc Tiêu dao

sau khi phun thuốc thử

Vết Rf

Màu sắc

Mẫu nghiên cứu PAE Cao TD P-BT BT BT-C

(*): Vết tạp của chất chuẩn PAE: Chất chuẩn paeoniflorin

Cao TD: Cao đặc Tiêu dao P-BT: Cao đặc placebo Bạch thược BT: Bạch thược nguyên liệu BT-C: Bạch thược chuẩn

- Cao đặc Tiêu dao có 10 vết, trong đó: Có 5 vết tương ứng với Bạch thược nguyên liệu (Rf = 0,14; 0,48; 0,68; 0,79; 0,90) và có 4 vết tương ứng với Bạch thược chuẩn (Rf= 0,14; 0,48; 0,79; 0,90)

- Cao đặc Tiêu dao và Bạch thược nguyên liệu có 1 vết đặc hiệu tương ứng với Bạch thược chuẩn và chất chuẩn PAE mà cao đặc placebo không có (Rf = 0,48)

3.1.2 Định tính dược liệu Sài hồ trong cao đặc Tiêu dao bằng SKLM

 Mẫu nghiên cứu

- Cân các mẫu với khối lượng đã được tính toán như sau vào 4 bình nón 100 ml riêng biệt:

Sài hồ chuẩn (SH-C) 2 g Cao đặc P-SH 2 g

Sài hồ nguyên liệu (SH) 2 g Cao đặc TD 2 g

- Chuẩn bị cả 4 mẫu với cùng một điều kiện chiết:

Thêm vào 40 ml methanol, siêu âm trong 30 phút và lọc Cho bay hơi dịch lọc đến cắn, hoà tan cắn trong 20 ml nước, chiết bằng n-buthanol bão hoà nước 3 lần, mỗi lần

20 ml Gộp dịch chiết, rửa bằng nước 3 lần, mỗi lần 20 ml, loại bỏ dịch rửa, bay hơi dịch chiết n-buthanol đến cắn Hoà tan cắn trong 2 ml methanol thu được dung dịch chấm sắc kí

 Điều kiện sắc kí

- Pha động: Khảo sát các hệ dung môi sau:

Ethyl acetat - ethanol – nước (8:2:1) (I)

Ethyl acetat – acid acetic – acid formic – nước (15:1:1:2) (II)

Cloroform – ethyl acetat – methanol – amoniac (8:1:4:1) (III)

Toluen – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) (IV)

Toluen – ethyl acetat – acid formic (20:5:1) (V)

- Tốc độ phun: 150 nl/s

- Thể tích phun mẫu:

- Tiến hành: Triển khai theo điều kiện chung

- Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm, phun thuốc thử vanilin 2,5% trong ethanol và acid sulfuric

Cao TD 5 l SH 5 l Cao P-SH 5 l SH-C 5 l

 Kết quả

Qua khảo sát lựa chọn hệ (I) cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất (Bảng 3.2 và Hình 3.2).

Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính Sài hồ trong cao đặc Tiêu dao

sau khi phun thuốc thử

Ghi chú: (+): Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm Cao TD: Cao đặc Tiêu dao P-SH: Cao đặc placebo Sài hồ SH: Sài hồ nguyên liệu SH-C: Sài hồ chuẩn

- Cao đặc Tiêu dao và Sài hồ nguyên liệu có 2 vết đặc hiệu tương ứng với Sài hồ chuẩn mà cao đặc placebo không có (Rf = 0,34; 0,48)

Vết Rf

Màu sắc

Mẫu nghiên cứu